En ny gata6-mutation hos patienter med tetralogi av fallot eller förmaks septal defekt | journal of human genetics

En ny gata6-mutation hos patienter med tetralogi av fallot eller förmaks septal defekt | journal of human genetics

Anonim

ämnen

  • Medfödda hjärtfel
  • Mutation
  • Transkriptionsfaktorer

Abstrakt

GATA6 är en medlem av GATA-familjen av transkriptionsfaktorer, och dess uttryck och funktioner överlappar dem med GATA4 under hjärtutveckling . Mutationer i GATA4 har varit relaterade till mänskliga medfödda hjärtsjukdomar (CHD) i flera studier, medan mutationer i GATA6 endast nyligen har rapporterats hos patienter med ihållande truncus arteriosus. Djurförsök har avslöjat kritiska roller för GATA6 i utvecklingen av myokardiet och hjärtmorfogenesen, varigenom GATA6- defekter potentiellt involverades i patogenesen av CHD: er. Här screenade vi GATA6 hos 270 individer med sporadiska CHD genom direkt sekvensering. Efter identifiering av mutationen utfördes en luciferasreporteranalys och kvantitativ polymeras-kedjereaktion i realtid för att detektera funktionella förändringar i mutanttranskriptionsfaktorn. Samma heterozygot missense-mutation (Ser184Asn) identifierades hos tre patienter, inklusive en med Falletrotogogi och två med förmaks septalsvikt. Denna mutation hittades inte i 500 icke-relaterade etniskt matchade friska försökspersoner. Direkt sekvensering av denna region hos föräldrarna till dessa tre patienter avslöjade samma mutation hos en av föräldrarna för varje patient, och en av föräldrarnas bärare presenterade med en bicuspid aortaklaff. Biologisk analys avslöjade tydligt minskad transkriptionell aktivitet av GATA6 Ser184Asn in vitro . Alla dessa data antyder att GATA6 Ser184Asn är en ny mutation associerad med CHD och har en viktig roll i sjukdomspatogenesen.

Introduktion

Medfödd hjärtsjukdom (CHD) förekommer i 19–75 av varje 1000 levande födda och utgör en stor andel av kliniska födelsedefekter. 1 Det anses också vara en ledande orsak till morbiditet och dödlighet hos spädbarn. CHD uppstår från onormal hjärtautveckling under embryogenes och tros delvis orsakas av genetiska defekter. 2 Nyligen genomförda studier har identifierat en serie gener som bidrar till ärftlig och sporadisk CHD, och de flesta av dessa gener kodar för hjärttranskriptionsfaktorer såsom Nkx2.5 , TBX5 och GATA4 . 3, 4, 5, 6

GATA-familjemedlemmar ( GATA1–6 ) innehåller två zink-finger-domäner som binder till en konsensusplats, (A / T) GATA (A / G) och förmedlar interaktioner med olika faktorer. 7 GATA4 , 5 och 6 uttrycks tidigt i hjärtvävnaden och endodermala derivat. 7, 8 Av dessa tre GATA-transkriptionsfaktorer har GATA4 studerats mest omfattande och tros ha en dominerande roll i hjärtutvecklingen. 9 Många mutationer i GATA4 har erkänts i ett brett spektrum av fall, inklusive tetralogi av Fallot (TOF), lungstenos, atrial septal defects (ASDs), ventricular septal defects, atrioventricular septal defects and patent ductus arteriosus. 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 GATA6 är en annan medlem av GATA-familjen med uttryck och funktioner som överlappar GATA4 under kardiovaskulär utveckling. 7 Nyligen genomförda experiment på djur har avslöjat kritiska roller för GATA6 i utvecklingen av myokardiet och hjärtmorfogenesen, vilket belyser den potentiella involveringen av GATA6- mutationer i patogenesen hos humant CHD. 18, 19, 20, 21 Även om mutationer i GATA6 nyligen har varit relaterade till patienter med ihållande truncus arteriosus, är deras deltagande i och påverkan på olika typer av CHD oklart. 22

För att undersöka denna fråga undersökte vi 270 individer med sporadisk CHD för GATA6- mutationer och identifierade de biologiska funktionella underskotten för en identifierad mutation in vitro .

Material och metoder

Studera befolkning

Totalt identifierades 270 icke-relaterade patienter med sporadisk CHD (tabell 1) i den kinesiska befolkningen. Perifera venösa blodprover erhölls och kliniska data inklusive medicinska journaler, elektrokardiogram, ekokardiografi och hjärtkateterisering rapporterades systematiskt. De flesta av de rekryterade patienterna (102 kvinnor och 168 män) i denna studie genomgick hjärtoperationer eller kateterisering. Patienter med syndrom-CHD såsom Marfan, Noonan, Holt-Oram, Alagille och CHARGE-syndrom samt kromosomavvikelser som är starkt förknippade med CHD, såsom 21 trisomi och 22q11.2 deletion, utesluts från denna studie. Kontrollerna var ursprungligen 300 oberoende etniskt matchade friska försökspersoner som inte hade CHD och utvidgades senare till 500. Alla studiepersoner var av kinesisk Han-nationalitet. Genomiskt DNA från alla deltagare extraherades från blodlymfocyter med användning av ett Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA). Studien utfördes i enlighet med villkoren som krävs av forskningsetiska kommittén vid Tongji University School of Medicine, och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare.

Full storlek bord

Genetiska undersökningar

Primrar för att förstärka den fullständiga kodande regionen och exon / intron-gränserna för GATA6- genen (NM_005257) designades med Primer 3-programvaran online (tabell 2). Polymeraskedjereaktion (PCR) utfördes med användning av HotStar Taq DNA Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) med en glödgningstemperatur av 62 ° C. De amplifierade produkterna renades med ett QIAquick-gelekstraktionssats (Qiagen). Båda strängarna för varje PCR-produkt sekvenserades med ett DYEnamic ET-färgämnesavslutande kit (GE Healthcare, Amersham Place, Buckinghamshire, UK) med användning av ett MegaBACE 500 DNA-sekvenseringssystem (GE Healthcare).

Full storlek bord

Sekvensjämförelse

GATA6- proteinsekvenserna från olika arter justerades med användning av ClustalW-mjukvara.

Plasmider och platsriktad mutagenes

PCDNA3-h GATA6- plasmiden tillhandahölls vänligen av Edwards-Ghatnekar, Angela V, avdelningen för reumatologi och immunologi, Medical University of South Carolina. Den identifierade punktmutationen infördes i en GATA6- klon av vildtyp med användning av en QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Klonerna sekvenserades för att bekräfta den önskade mutationen och för att utesluta alla andra sekvensvariationer. Flaggmarkerade plasmider framställdes sedan för Western blot-analys.

Luciferasanalyser

HEK-293-celler transfekterades transient med 50, 100, 200 eller 400 ng vildtyp eller mutant pcDNA3-h GATA6 ; 400 ng atrial natriuretic factor (ANF) luciferasreporter (−638) (vänligen tillhandahålls av Vidu Garg, Institutionen för pediatrik, UT Southwestern Medical Center); och 40 ng pGL4, 75 [hRluc / CMV] (Promega) med användning av Polyfect Transfection Reagent (Qiagen). PGL4, 75 [hRluc / CMV] -plasmiden infördes som en intern kontroll. Firefly-luciferas- och Renilla-luciferasaktiviteter mättes med Dual-Glo-luciferas-analyssystemet (Promega) vid 48 timmar efter transfektion. Tre oberoende experiment utfördes minst för vildtyp och mutant GATA6 . Proteinuttrycksnivån utvärderades genom Western blot-analys.

Kvantitativ PCR-analys i realtid

H9c2-råttkardiomyoblastceller transfekterades med 400 ng vildtyp eller mutant pcDNA3-h GATA6- eller pcDNA3-kontroll. Totalt RNA isolerades från H9c2-celler med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 48 timmar efter transfektion. Omvänd transkription PCR utfördes med användning av SuperScript II omvänt transkriptas (Invitrogen) med oligo-dT-priming enligt tillverkarens instruktioner. Kvantitativ PCR i realtid utfördes med Mx3000P-systemet (Stratagene) med användning av Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). GAPDH valdes som en intern kontroll. Kvantitativa PCR-primrar för ANF, hjärnan-natriuretisk faktor, ß-myosin tung kedja och GAPDH var som beskrivits tidigare. 23

Statistik

Data ges som medelvärde ± sd Skillnader mellan de två grupperna jämfördes med användning av Student's t- test för kontinuerliga variabler och P- värde <0, 05 definierades som statistiskt signifikant.

Resultat

Identifiering av en GATA6- mutation hos CHD-patienter

Vi identifierade samma heterozygota missensmutation i GATA6- genen i tre CHD-patienter, inklusive en med TOF och två med ASD: er (figur 1a). En av ASD-patienterna var en 3-årig tjej med en ostium secundum ASD (2, 0 cm) och mild pulmonell arteriell hypertoni. Den andra ASD-patienten var en 4-årig pojke med en ostium secundum ASD (0, 33 cm) och en mild tricuspidventil och lungventilersättning. Den tredje patienten var en 7 månader gammal pojke med en överväldigande aorta (50% åsidosättande), lungstenos, en ventrikulär septal defekt och höger förmaks- och ventrikulär hypertrofi. Ingen av patienterna hade några andra avvikelser. Samma substitution upptäcktes också hos far till TOF-pojken, far till ASD-flickan och mor till ASD-pojken. De tre proberna förklarade ingen familjehistoria för CHD, men ekokardiografi visade att mamman till ASD-pojken hade en bicuspid aortaklaff (BAV). Hennes hjärta hade normal form och funktion och inga kliniska symtom hittades. Stamtavlastrukturerna för de tre familjerna illustreras i figur Ib. Samma mutantallel detekterades inte i de andra 267 icke-syndromiska CHD-patienterna eller i 500 etniskt matchade friska kontroller ( P = 0, 04, Fishers exakta test). Den identifierade mutationen (c.551G → A) förutspådde ersättningen av serin (Ser, S) med asparagin (Asn, N) vid kodon 184 (Ser184Asn) lokaliserad i transkriptionsaktiveringsdomänen (TAD) av GATA6- proteinet (figur 1c) . En tvärartlig anpassning av GATA6- proteinsekvenser visade att den förändrade aminosyran (Ser184Asn) var belägen i ett område intill en poly (Ala) -insättning i däggdjur som inte fanns i andra ryggradsdjur (figur 1d). Den höga bevarande av denna region över däggdjur kan antyda en enhetlig funktion hos däggdjur som skiljer sig mellan däggdjur och andra ryggradsdjur.

Image

( a ) En mutation identifierades i GATA6 hos tre CHD-patienter. Ser184Asn och dess motsvarighet av vildtyp visas. ( b ) Stamtavlastrukturer för tre familjer med medfödd hjärtsjukdom. Familjemedlemmar identifieras av generationer och antal: rutor indikerar manliga medlemmar; cirklar anger kvinnliga medlemmar; solida mörka symboler indikerar TOF-patienter; tydliga symboler indikerar opåverkade medlemmar; grå symboler indikerar ASD-patienter; diagonala symboler indikerar BAV-patienter; pilarna indikerar sondar; '+' indikerar bärare av mutationen (Ser184Asn); "-" ange icke-transportörer; till vänster är TOF-pojkens familj; mitten är ASD-flickans familj och rätt är ASD-pojkens familj. ASD, förmaks septal defekt; BAV, bicuspid aortaventil; TOF, tetralogi av Fallot. ( c ) Ser184Asn-mutationen lokaliserades i transkriptionsaktiveringsdomänen (TAD) för GATA6- proteinet. * representerar platsen för mutationen; ZF, zinkfinger. ( d ) En multipel inriktning av GATA6- proteinsekvenser från olika arter indikerade att Ser184Asn var belägen på ett bevarat ställe över däggdjur.

Bild i full storlek

Vår studie avslöjade också en tidigare rapporterad sekvensvariant (c.43G → C) som förutspådde en aminosyraförändring vid kodon 15 (Gly15Arg). 22 Denna nukleotidförändring hittades hos 7 av 270 icke-syndromiska CHD-patienter (2, 6%) och hos 9 av 300 personer i kontrollpopulationen (3, 0%). Fyra andra sekvensvarianter i introner och 3′UTR för GATA6 hittades i både CHD-patienter och kontrollpersoner. Tre av dessa sekvensvarianter har tidigare rapporterats i dbSNP-databasen, och inga signifikanta skillnader observerades mellan CHD-patienterna och kontrollpersonerna i någon av deras allelfrekvenser. Alla sekvensvarianter och deras allelfrekvens sammanfattas i tabell 3.

Full storlek bord

Biologisk studie av den identifierade GATA6- mutationen

Ser184Asn-mutationen lokaliserades i ett konserverat område i TAD för GATA6- proteinet. En tidigare studie av GATA4 indikerade att mutationer i TAD-regionen kan påverka transkriptionell aktivitet utan att påverka DNA-bindande affinitet eller nukleär lokalisering. 15 Därför undersökte vi transkriptionell aktiveringsförmåga för GATA6 i HEK-293-celler med hjälp av ett av dess direkta hjärta nedströmsmål, ANF, som en luciferasreporter. Överuttryck av vildtyp GATA6 aktiverade ANF-promotorn på ett dosberoende sätt, medan mutant GATA6 inte visade några tecken på denna förmåga och hade signifikant avliden transkriptionell aktivitet. Detta fynd antyder minskad aktivitet och en förlust av doskänslighet för GATA6 Ser184Asn i detta system (figur 2a). Western blot-analys indikerade ingen uppenbar skillnad i proteinnivåer mellan vildtyp och mutant GATA6 (figur 2b).

Image

( a ) HEK-293-celler transfekterades med antingen 50, 100, 200 eller 400 ng vildtyp eller mutant GATA6 och 400 ng av en ANF-luciferasreporter. Resultaten visas som vikaktivering orsakad av vildtyp eller mutant GATA6 . I alla fall representerar data medelvärdet ± sd för tre oberoende experiment utförda i duplikat. * representerar en signifikant skillnad i luciferasaktivitet mellan vildtyps- och mutant- GATA6- konstruktionerna ( P <0, 05). ( b ) Proteinnivåerna av vildtyp och mutant GATA6 utvärderades genom Western blot-analys efter att HEK-293-celler transfekterades med 400 ng av antingen flaggmärkt plasmid. Inga uppenbara skillnader observerades mellan de två grupperna.

Bild i full storlek

Ytterligare experiment utfördes med en andra cellinje härrörande från embryonal hjärtvävnad (H9c2-råttkardiomyoblastceller) med användning av kvantitativ PCR i realtid. Även om transkripter av ANF, hjärnnatriuretisk faktor och ß-myosin tung kedja uppreglerades i H9c2-celler transfekterade med vildtyp GATA6 eller GATA6 Ser184Asn jämfört med pcDNA3-kontrollen (figur 3), ökades nivåerna för dessa målgener mer signifikant i H9c2 celler transfekterade med vildtyp GATA6 , vilket indikerar nedsatt transkriptionsförmåga hos GATA6 Ser184Asn i kardiomyocyter.

Image

H9c2-celler transfekterades med 400 ng vildtyp eller mutant GATA6 från pcDNA3-kontrollen. Nivåerna av ANF, hjärnnatriuretisk faktor (BNF) och ß-myosin tung kedja (ß-MHC) mRNA utvärderades genom realtids kvantitativ PCR, och värdena normaliserades till pcDNA3-kontrollen. I alla fall representerar data medelvärdet ± sd för tre oberoende experiment utförda i tre exemplar. * representerar en signifikant skillnad i mRNA-expressionsnivåer mellan vildtyp och mutanta GATA6- grupper ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

Vi identifierade initialt samma nya GATA6- mutation, Ser184Asn, hos tre patienter med CHD, inklusive två ASD-patienter och en TOF-patient. Ytterligare genetisk analys avslöjade att Ser184Asn-mutationen var närvarande hos en av föräldrarna för varje patient. Ekokardiografi visade att mamman till den manliga ASD-patienten hade BAV, men de andra två föräldrarna uppvisade inga strukturella hjärnavvikelser, vilket tyder på måttlig penetrans av denna mutation. Anledningen till denna ofullständiga penetrans var inte klar. Den överlappande funktionen av GATA6 med GATA4 (diskuteras nedan) eller miljömässiga och / eller epigenetiska faktorer kan leda till olika fenotyper. Den identifierade mutationen förändrade en serinrest i position 184 belägen i TAD-regionen i GATA6- proteinet, som är mycket evolutionärt bevarat över däggdjur. Biologisk aktivitetsanalys visade att GATA6 Ser184Asn tydligt hade minskat transkriptionell aktivitet på hjärtgener nedströms i både HEK-293-celler och H9c2-celler som efterliknar kardiomyocyter, vilket indikerar att det kunde bidra till patogenesen av CHD.

Villkorlig inaktivering av GATA6 i celler i glatt muskulatur i kärl och hjärna i nervcancer resulterar i ett spektrum av funktionsfel som påverkar hjärtutflödeskanalen och aortabågen hos möss. 18 Vidare ger mutationer i GATA6- zink-finger- och kärnlokaliseringsdomäner upphov till ett misslyckande med transaktiverande mål-semaforin-plexinvägsgener, vilket leder till hjärtutflödeskanaldefekter hos människor. 22 Jämfört med ovanstående mutationer var mutationen som hittades i denna studie lokaliserad i den N-terminala TAD-regionen, vilket inte har visat sig påverka DNA-bindande affinitet eller nukleär lokalisering. Emellertid observerades också in vitro minskad transkriptionell aktivitet av GATA6 Ser184Asn på vissa nedströms hjärtgener. Det skulle vara intressant att ytterligare undersöka om denna mutation visar samma mekanism för alternativ regleringsaktivitet på semaforin-plexinvägen som kan leda till utflödeskanalens defekter, i detta fall, TOF.

BAV är vanligt förekommande abnormitet hos> 1% av befolkningen, vilket tyder på att dåliga korelationer kan förekomma mellan GATA6- mutation och BAV hos ASD-pojkens mamma. En tidigare studie visade emellertid att hjärtnervcentrumceller bidrar till mognaden av aortaventilen; sålunda kan dysfunktion av semaforin-plexinvägen orsakad av denna GATA6- mutation indirekt undergräva utvecklingen av aortaventilen genom att rikta hjärna neurala crestceller. 25 Intressant nog har BAV också visat koppling till kromosom 18q, där GATA6- genen är belägen. 26 Ovanstående bevis tyder på den potentiella rollen för GATA6 i patogenesen av BAV, som vi tror måste undersökas ytterligare i en stor kohort av BAV-patienter.

Förenad heterozygositet hos GATA4 och GATA6 leder till embryonal letalitet på grund av ett spektrum av kardiovaskulära funktionsfel, vilket indikerar att dessa två GATA-transkriptionsfaktorer samarbetar och synergistiskt reglerar nedströms hjärtgener och att det finns en tröskel för att båda faktorerna fungerar normalt i hjärtutveckling. 20, 21 Därför screenade vi också GATA4 hos de tre patienterna med Ser184Asn-mutationen, men inga icke-synonyma varianter hittades, med undantag för möjligheten till dual-GATA-transkriptionsfaktorfel i patogenesen för CHD-patienterna i vår studie. Relativt bevarade TAD-regioner mellan GATA4 och GATA6 förklarar delvis deras vissa funktionella redundans och likheterna i transkriptionella aktiveringsmekanismer. 27 Mutationer i GATA4 TAD-regioner har varit relaterade till septalfel i olika studier. 10, 17 Denna studie fann att den identifierade mutationen i GATA6 TAD-regionen också var associerad med ASD: er, vilket ytterligare stödjer poängen med en redundant roll mellan GATA4 och GATA6 vid kardiogenes som nämnts tidigare. 7, 20, 21, 27, 28 En störd interaktion mellan GATA4 och TBX5 är involverad i ASD: er i både människor och möss. 4, 19 På liknande sätt har en länk mellan GATA6 och TBX5 erkänts, och sammansatt heterozygositet hos båda generna resulterar i defekter i hjärtutvecklingen. 19 Även om inga direkta interaktioner har rapporterats mellan GATA6 TAD-regionen och andra transkriptionsfaktorer, såsom GATA4 och TBX5 , kan de allmänna interaktionerna mellan dessa transkriptionsfaktorer hjälpa till att förstå den mekanistiska grunden för ASD på grund av GATA6- mutationer.

Homozygota GATA6-nollmöss dör före hjärtutveckling, medan heterozygota GATA6-nollmöss visar inga uppenbara hjärtfenotyper. 29, 30 Under tiden identifierade vi samma heterozygota, icke-synonyma mutation hos tre patienter med olika kliniska manifestationer. Ett viktigt skäl för denna skillnad mellan de två arterna är troligen olika gendoskänslighet hos människa och möss. 1 Människor är mer sårbara för subtila genetiska defekter men kan överleva med olika typer av hjärtabnormiteter, till skillnad från den embryonala dödligheten som vanligtvis ses hos möss med samma hjärtfel. 31 Den underliggande mekanismen för de olika fenotyperna för den identifierade GATA6- mutationen är oklar, men miljöfaktorer, epigenetiska faktorer och andra mediatorer kan vara ansvariga.

Sammanfattningsvis identifierade vi en ny GATA6- mutation hos patienter med TOF och ASD. Den identifierade GATA6- mutationen orsakar försämrad biologisk funktion av proteinet, vilket antyder att det troligtvis kommer att ha en roll i patogenesen av CHD. Studier av effekten av denna GATA6- mutation på specifika hjärtfel kommer att vara nödvändiga för att ytterligare belysa dess påverkan på hjärt-kärlsutveckling.