Icke-invasiv, målinriktad och icke-viral ultraljudsmedierad gdnf-plasmidleverans för behandling av parkinsons sjukdom | vetenskapliga rapporter

Icke-invasiv, målinriktad och icke-viral ultraljudsmedierad gdnf-plasmidleverans för behandling av parkinsons sjukdom | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Drogleverans
  • Genetikforskning
  • Molekylär medicin

Abstrakt

Glialcellslinje-härledd neurotrofisk faktor (GDNF) stöder tillväxten och överlevnaden av dopaminerga nervceller. Tillförsel av CNS-gen förlitar sig för närvarande på invasiv intracerebral injektion för att överföra blod-hjärnbarriären. Icke-viral genleverans via systematisk transvaskulär väg är ett attraktivt alternativ eftersom det är icke-invasivt, men en metod med högt utbyte och målinriktat gen saknar fortfarande. I denna studie föreslår vi en ny icke-viral genleveransmetod för att uppnå riktad gentransfektion. Katjoniska mikrobubblor som genbärare utvecklades för att möjliggöra en stabil bildning av ett bubbel-GDNF-genkomplex, och exponering för transkraniellt fokuserad ultraljud (FUS) samtidigt interagerande med bubbelgenkomplexet tillät transient gengenomträngning och inducerad lokal GDNF-expression. Vi demonstrerar att den fokuserade ultraljudutlösta GDNFp-laddade katjoniska mikrobubblplattformen kan uppnå icke-viral målinriktad genleverans via en icke-invasiv administreringsväg, överträffa intracerebral injektion i termer av riktad GDNF-leverans av högtiter GDNF-gener och har en neurobeskyttande effekt i Parkinsons sjukdom (PD) djurmodeller för att framgångsrikt blockera progression av PD-syndrom och återställa beteendefunktion. Denna studie undersöker potentialen att använda FUS- och bubbelgenkomplex för att uppnå icke-invasiv och riktad genleverans för behandling av neurodegenerativ sjukdom.

Introduktion

Parkinsons sjukdom (PD) är den näst vanligaste progressiva neurodegenerativa störningen och med över 70 000 nya fall i USA varje år. Det kännetecknas av djup degenerering av nigrostriatala neuron i mitten av hjärnan (DA) kopplade till allvarliga motoriska symtom. Det finns inga definitiva terapier som kan dämpa utvecklingen av sjukdomen, även om någon invasiv djup hjärnstimulering kan ge rörelsessymptomkontroll 1, 2 . Läkemedel som L-Dopa ger endast symtomatisk lättnad för patienter som hindras av läkemedelsresistens och progressiva biverkningar såsom motoriska komplikationer och dyskinesi och gastrointestinal toxicitet 3 . Det har visats att neurotrofiska faktoruttrycksnivåer minskas hos PD-patienter 4, och det finns starka bevis på att leverans av neurotrofisk faktor kan främja regenerering av DA-neuroner för att lindra syndromen i PD 5, 6, 7 . Till exempel är glialcellslinje-härledd neurotrofisk faktor (GDNF) ett potent medel för PD-terapi på grund av dess neurobeskyttande och neurotrofiska effekter 8, 9 . Kliniskt är GDNF-plasmid (GDNFp) genleverans möjlig när man använder rekombinanta AAV-vektorer som en genvektor 10, 11 .

Trots potentialen att använda GDNF för att behandla tidigt stadium PD, förhindrar molekylstorleken för GDNF penetrering av BBB, och viral och icke-viral genbärande leverans kräver lokal intrakraniell injektion och infusion 12, 13, 14 . Ett alternativt tillvägagångssätt genom systemisk administration, såsom med GDNFp-makrofagbärande system eller GDNFp-belastad bärare, är också begränsad av effekter utanför målet och den låga terapeutiska nivån uppnåddes 15, 16 . En ny metod för icke-invasiv och riktad GDNFp-genterapi krävs kritiskt.

Fokuserad ultraljudsolikering (FUS) i samband med mikrobubblor (MBs) har visat sig kortvarigt störa blod-hjärnbarriären (BBB) ​​för icke-invasiv och riktad leverans av terapeutiska substanser 16 . MB-spelare spelar en nyckelroll genom interaktion med FUS-energi, vilket förbättrar mikrostreaming och akustisk kavitation och därmed inducerar mekanisk stress för att utlösa övergående snävformig morfologisk deformation 17, 18 . Nyligen har det visats att FUS-inducerad BBB-öppning kan underlätta viral genleverans i centrala nervsystemet (CNS) 19 och även framgångsrikt leverera GDNF till hjärnan 20, 21 . För att hantera mellanrummen mellan konceptuell genomförbarhet och användningen av FUS-triggad genterapi måste två problem tas upp: (1) nedbrytning med systemisk administration och (2) tillräckligt högt genuttryck i den riktade positionen.

För (1) har GDNFp-leverans med IV utmärkt retikuloendotelialsystem (RES) utrymningsförmåga samtidigt med god biokompatibilitet. Med tanke på utformningen av ett icke-viralt genleveranssystem krävs en GDNFp-bärande bärare för att ge RES-skydd. För (2) bör nyttolasten för GDNFp-lasten på den konstruerade bäraren vara tillräckligt stor för att uppnå tillräcklig terapeutisk effekt och långsam sjukdomsförlopp. MB: er som fungerar som en katalysator i FUS-BBB-öppningen kan spela en ytterligare roll som en icke-viral GDNFp-genbärare. För att uppnå ovanstående två villkor bör det utformade MB-systemet framgångsrikt utlösa BBB-öppning med FUS, och MB: erna bör vara katjoniska för att ge tillräckligt hög genbärande förmåga eftersom fosfatryggraden i DNA är mycket anjonisk 22 . Även om katjoniska MBs (cMB: er) tidigare har försökts för förbättrad FUS-medierad genleverans i andra organ 23, 24, så vitt vi vet, har det inte funnits några rapporter som visar samtidig FUS-inducerad BBB-öppning och GDNFp-genleverans i CNS eller för neurodegenerativ sjukdomsbehandling. Här föreslår vi ett nytt icke-invasivt, riktat och icke-viralt GDNFp-genleveranssystem med FUS-inducerad BBB-öppning för att behandla PD (fig. 1A). Vår metod använder cMB för att ge höga DNA-nyttolaster och vi visar att det effektivt kan minska celldöd i en djurmodell av PD.

Image

( A ) Schematisk över GDNFp-cMB: er och mekanism för kontrollerad gentransfektion av GDNFp-cMBs i hjärnan utlöst av FUS. ( B ) Vänster: Mikroskop ljusfältbilder; mitt: TEM-bilder; höger: PI-färgning av cMB: er och GDNFp-cMB. ( C ) Storleksfördelningar för cMB: er, GDNFp-cMB: er och nMB: er. ( D ) Zeta-potential för nMB och cMB före och efter tillsats av GDNFp. ( E ) DNA-laddningseffektivitet för GDNFp på nMB och cMB. Den vänstra axeln var mängden GDNFp bunden till MBs (hel linje). Den högra axeln var GDNFp-laddade effektiviteten på MBs (prickad linje). Enstaka asterisk, p < 0, 05 , kontra nMB. Data analyserades med Students parade t-test presenterade som medelvärde ± SEM (n = 6 per grupp).

Bild i full storlek

Resultat

Katjoniska MB: er har bättre GDNF-plasmidbindningsförmåga än neutrala MB: er

Den morfologiska förändringen i cMB efter konjugering med GDNFp observerades först genom ljusfältmikroskopi, kryo-TEM och fluorescerande mikroskopi (fig IB). DNA-bindningen av GDNFp-cMB bekräftades visuellt i fluorescensavbildning via propidinjodid (PI) -färgning, vilket visade ett tätt skikt av sfäriskt DNA (fig. IB). Medeldiametern och koncentrationen av cMB: erna var 0, 9 ± 0, 4 μm och (3, 3 ± 0, 7) × 10 10 MB / ml, och den genomsnittliga positiva zeta-potentialen var +39, 5 ± 9, 2 mV. CMB: erna belastade med GDNFp hade en något större medeldiameter och lägre medelkoncentration (1, 1 ± 0, 1 μm respektive (2, 5 ± 0, 2) × 10 10 MB / ml), men en negativ genomsnittlig zeta-potential (−7, 1 ± 1, 6 mV), vilket indikerar att konjugeringen av GDNFp förorsakade MB: erna att växla från katjoniskt till något anjoniskt (se fig. 1C, D). Dessa resultat visar den framgångsrika konjugeringen av GDNFp till cMB-lipidskalet.

DNA-belastningseffektiviteten baserades på förhållandet mellan bunden DNA-plasmid och ett stort antal MB (10 9 som referens). Detta testades under olika initiala DNA-mängder (intervall, 5-40 μg). Belastningseffektiviteten påverkades signifikant av zeta-potentialnivån, där MB: erna i ett katjoniskt tillstånd visade signifikant högre plasmid-DNA-laddningseffektivitet (upp till 26, 1% ± 1, 6%) på grund av bättre elektrostatiska interaktioner, medan bindningseffektiviteten var 7, 1 gånger högre än i de neutrala MB: erna (nMB: 3, 7% ± 0, 3%) (Fig. 1E). Plasmid-DNA-bindningseffektiviteten i katjoniska MBs var optimal vid 40 ug DNA under blandning. Ytterligare ökande plasmid-DNA-mängd förbättrade inte belastningseffektiviteten.

GDNFp-cMB med FUS inducerade effektiv genleverans och främjade celldifferentiering in vitro

Gentransfektionseffektiviteten för FUS och GDNFp-cMB undersöktes in vitro med PC-12-celler. GDNF utlöser differentiering i PC-12-celler som liknar den som induceras av neurotrofin nervtillväxtfaktor (NGF), och effekten kan utvärderas genom ljusfältmikroskopi. För det första bekräftades den framgångsrika transfektionen av genladdade cMB: er i PC-12-celler med användning av FUS-exponering med eldfluc luciferas-genladdade cMB: er (FLUCp-cMB) via bioluminescensavbildning (fig. S1A, B). FLUCp-genuttryck började 24 timmar efter gentransfektion och ökade med tiden (Fig. S1C). Dessutom ökade koncentrationen av FLUCp-cMBs signalintensiteten för bioluminescensavbildning, vilket bekräftar uttrycksberoendet med total nyttolast (fig. S1D).

Efter att ha bekräftat den inbäddade genen på cMB: er kan utföra gentransfektion efter triggning av FUS, undersöktes bioaktiviteten för GDNFp-cMB med FUS genom följande experiment. NGF tillfördes till PC-12-celler tjänade som en positiv kontroll, och celldifferentiering till neuronal fenotyp bestämdes genom neuritutveckling (Fig. S2; 74, 4 ± 19, 2 um; och 4, 2 ± 0, 8 mikrometer i NGF-frånvaro som negativ kontroll). GDNFp enbart hade en mycket begränsad effekt på celldifferentiering (8, 6 ± 2, 8 um). Endast FUS-exponering ökade neuritutvecklingen något (17, 0 ± 4, 0 um). Effekten av cellväxt förbättrades ytterligare när cMB med FUS-exponering tillsattes samtidigt med GDNFp (33, 8 ± 7, 8 um). Emellertid inducerade GDNFp-cMBs-komplex utlöst av FUS den mest starka GDNFp-gentransfektionen och uttrycket (68, 3 ± 24, 5 μm), vilket resulterade i nästan 2- och 16-faldig ökning i neuritutveckling, jämfört med cMBs + FUS + GDNFp-gruppen och kontrollgrupp. Celldifferentieringseffekten var nästan ekvivalent med den hos NGF-gruppen. Dessa resultat visar den höga genleveranseffektiviteten för GDNFp-cMB och FUS-systemet.

GDNFp-cMB och exponering för FUS ökar lokal BBB-permeabilitet och uppnår lokal gentransfektion in vivo

Nästa undersökte vi förmågan att använda GDNFp-cMBs-komplex utlöst av FUS för att öppna BBB nära substantia nigra (SN) och striatum (Str) (akustisk tryckfördelning av 1-MHz FUS-exponering, Fig. S3; experimentell installation; Fig. S4 ). 0, 7-MPa FUS-exponering inducerade tillräcklig BBB-öppning, vilket visas genom djup Evans-blå (EB) -färgning i det lokala hjärnparenkymet som täckte hela Str och SN (Fig. S5A), men inducerade inte erytrocyt-extravasationer som 1, 0-MPa-sonikering en bekräftad från hematoxylin och eosin (H&E) färgning (fig. S5B). Vi valde därför 0, 7 MPa som FUS-exponeringsnivå för efterföljande gentransfektion in vivo .

Effekten av målinriktad transfektion utvärderades via bioluminescensavbildning av ex vivo- hjärnor. FUS-triggade FLUCp-cMB resulterade i FLUCp-uttryck en 3, 4 gånger högre än samtidig MB / FLUCp-administration utlöst av FUS ((3, 3 ± 0, 2) × 10 4 mot (1, 6 ± 0, 4) × 10 4 fotoner / sek / cm 2 / sr; Fig. 2A – C), och även med ett djupare snabbt svar samt förlängning av uttrycksvaraktighet (24–72 timmar mot 48–54 timmar). I ett separat Western blot-test bekräftade vi också att endast FLUCp-cMB-systemet kan producera tillräckligt högt Lucerfise-genuttryck (Fig. S6).

Image

( A ) Ex vivo bioluminescent avbildning erhållen 6, 24, 30, 48, 54, 72 och 96 timmar efter behandling. Övre: kontrollråttor utan gentransfektion; mitten: cMB + FUS + FLUCp-grupp; nedre: FLUCp-cMB + FUS. ( B ) Tidslinje för bioluminescerande avbildning efter gentransfektion. ( C ) Tidsförlopp med bioluminescerande intensitet. Enstaka asterisk, p < 0, 05 , mot PD obehandlad råtta. Data analyserades med enkelvägs ANOVA (post hoc-test: Dunnett; frihetsgrader: 6; F-värde: 9, 7) och presenterades som medelvärde ± SEM (n = 3 per grupp).

Bild i full storlek

GDNFp-cMB och FUS-behandling återställer GDNF-koncentrationen av PD-råtta

GDNFp-uttryck in vivo analyserades sedan via Western blot och ELISA. Western blot bekräftade att det FUS-triggade GDNFp-cMB-systemet förbättrade GDNF-uttrycket (fig. 3A, B). I jämförelse med normala råttor uppvisar 6-OHDA-injektionsstället i PD-djur ett signifikant reducerat GDNF-uttryck (33, 3% jämfört med det kontralaterala stället). Det noterades att GDNFp-cMBs + FUS-behandling tillhandahöll den mest djupa GDNF-expressionsåterhämtningen (85, 6% jämfört med det kontralaterala stället), vilket är överlägset än cMB + FUS + GDNFp-behandlingen (55, 3% ökning jämfört med det kontralaterala stället). Det förbättrade GDNF-uttrycket via GDNFp-cMBs + FUS bekräftades också i normala råttor, med den alltför uttryckta GDNF uppmätt vid FUS-exponeringshemisfären (167% ökning jämfört med det kontralaterala stället).

Image

( A ) GDNF-uttryck bestämt med Western blot. ( B ) Relativ grå nivåintensitet av Western blot. ( C ) GDNF-koncentration bestämd av ELISA. Enstaka asterisk, p < 0, 05 ; dubbel asterisk , p < 0, 01 , mot höger hjärna. Data analyserades genom studentens parade t-test och presenterades som medelvärde ± SEM (n = 6 per grupp). Alla data jämfördes med höger hjärna.

Bild i full storlek

I ELISA-analys (fig. 3C) var GDNF-nivån i den toxininjicerade hjärnan lägre än i den kontralaterala (vänstra hjärnan: 56, 7 ± 5, 5 ng / g; högerhjärna: 117, 6 ± 12, 9 ng / g). FUS-triggad GDNFp-cMBs genleverans återställde framgångsrikt nivån av GDNF vid den toxininjicerade hjärnhalvan (vänster hjärna: 95 ± 9, 1 ng / g; höger hjärna: 116, 2 ± 7, 3 ng / g) och bekräftades återigen i normalt djur experiment där den behandlade hjärnhalvsfärden framgångsrikt återställde GDNF-expressionsnivån (vänster hjärna: 160 ± 13, 5 ng / g; höger hjärna: 127, 9 ± 5, 3 ng / g). På liknande sätt tillhandahöll FUS-triggad samtidig MBs / GDNFp-administration endast mindre återhämtning av GDNF-uttryck (data visas inte). Dessa data visar att vår föreslagna teknik kan öka och återställa utsöndring av GDNF in vivo .

GDNFp-cMB och FUS förbättrar DA-koncentrationen och motorunderskotten hos PD-råttor

Vi utvärderade slutligen den terapeutiska effekten av den FUS-triggade GDNFp-cMBs genleverans för PD-progressionskontroll. Först mättes utsöndrad DA varje vecka för att bestämma dopaminerge neurons status (fig. S7; grupper beskrivna i metoder). Före behandlingen var nivån av DA i PD-råttor signifikant lägre än hos normala råttor (27, 7 ± 0, 8 ng / μL mot 54, 2 ± 4, 7 ng / μL), vilket tyder på allvarlig dopaminerg neuronförlust orsakad av 6-OHDA (fig. 4A) ). De extracellulära DA-nivåerna återställdes nästan genom FUS-triggad GDNFp-cMBs genlevererad behandling, med en gradvis återhämtningstrend under den 4: e veckan (25, 8 ± 3, 4 ng / μL till 47, 0 ± 2, 4 ng / μL). Direkt GDNFp-injektion och samtidig cMB / GDNFp-administration + FUS-exponering visade endast partiell återställning av DA-nivåer, även med en svarfördröjning fram till den 8: e veckan (22, 9 ± 1, 4 ng / μL till 40, 4 ± 1, 4 ng / μL och 29, 1 ± 4, 2 ng / μL till 37, 6 ± 3, 3 ng / μL respektive). Andra grupper lyckades inte återställa DA-nivåerna alls.

Image

( A ) Förändring i DA-koncentration före och efter behandling. ( B ) Förändring i apomorfininducerat rotationsbeteende före och efter behandling. ( C ) Resultat av stapeltest före och efter behandling. Enstaka asterisk, p < 0, 05. Data analyserades genom enkelriktad ANOVA (post hoc-test: Dunnett; frihetsgrader: 45; F-värde: 76, 149, 120, 7) och presenterades som medelvärde ± SEM (n = 6 per grupp). Alla data jämfördes med PD-obehandlad råtta.

Bild i full storlek

Därefter utfördes ett apomorfininducerat rotationstest parallellt för att utvärdera återhämtning av motorasymmetri (fig. 4B). Medan de normala råttorna uppvisade balanserad motorfunktion utan onormal rotation, visade de inducerade PD-råttorna konsekvent onormal rotation (initialt med ett rotationsnummer på 307, 9 ± 7, 9 rotation / h, vilket ökade till 354, 3 ± 30, 1 rotation / h vid den 8: e veckan) det PD-liknande syndrom utvecklades. FUS-triggad GDNFp-cMB-behandling gav den mest djupgående onormala rotationsreduktionen (169, 3 ± 10, 2 rotation / h eller 54, 1% reduktion vid den första veckabehandlingen och nådde så småningom en nästan helt normal nivå (13, 2 ± 8, 5 rotation / h eller 95, 8% rotationsreduktion )). Film S1 visar en tydlig förbättring av motorfunktionen orsakad av GDNFp-cMB med FUS i PD-råttor. Direkt GDNFp-injektion minskade också den onormala rotationen vid utvärdering under den 8: e veckan (82, 5 ± 14, 8 rotation / h eller 8, 1% reduktion), men det var ingen signifikant förbättring under den första veckan (330 rotation / h eller 7, 5% reduktion). Behandlingen av cMB + FUS + GDNFp, cMB + FUS och FUS enbart ger också en rotationsreduktion (cMB + FUS + GDNFp: 146, 8 ± 20, 6 rotation / h; cMB + FUS: 167, 6 ± 37, 4 rotation / h; FUS ensam: 181, 3 ± 7, 4 rotation / h).

Ett annat motorrelaterat beteendestaveltest användes för att mäta det akinesiska fenomenet hos PD-råttor (Fig. 4C). Hos PD-råttor varierade katalepsitiden från 707, 3 ± 53, 5 s till 973, 3 ± 27, 7 s vid vecka 8. GDNFp-cMBs + FUS-grupperna uppvisade den mest djupgående katalepsiska varaktigheten (515, 2 ± 28, 7 s eller 28, 2% under den 1: a veckobearbetningen, minskat till 78, 2 ± 6, 14 s eller 88, 9% efter den 8: e veckans behandling), vilket tyder på reparation av det motorrelaterade underskottet. Direkt GDNFp-injektion gav också betydande behandlingseffektivitet (204, 6 ± 6, 0 s eller 73, 8% reduktion vid vecka 8), men hade inte en terapeutisk effekt under den första veckan (799, 7 ± 45, 4 s eller endast 2, 4% reduktion). Andra grupper uppvisade ingen förbättring eller obetydlig reduktion av katalepsi (GDNFp enbart: 741, 6 ± 48, 8 s; GDNFp-cMB enbart: 925, 8 ± 18, 1 s), vilket antyder mycket begränsad eller ingen terapeutisk effekt (FUS ensam: 605, 2 ± 54, 3 s; cMB + FUS: 564, 4 ± 6, 13 s; cMB + FUS + GDNFp: 564, 4 ± 6, 1 s). Dessa resultat indikerar att FUS-triggad GDNFp-cMB-genleverans är överlägsen den direkta GDNFp-injektionen för att tillhandahålla neurobeskyttande effekt i PD-råttor både när det gäller snabb botande respons och normal beteendevård.

För att histologiskt bekräfta dopaminerg neuronåterhämtning efter GDNFp-leverans färgades hjärnsektioner via tyrosinhydroxylas (TH) -immunohistokemi för att observera de dopaminerge strukturerna i SN för potent neuro-skyddande och neurotrofisk bedömning (Fig. 5A). Medan TH-frånvaro observerades vid det 6-OHDA-injicerade stället i obehandlade PD-råttor (16, 4% jämfört med kontralateralt ställe), återhämtade GDNFp-cMBs + FUS-behandling framgångsrikt dopaminerge neuroner som kännetecknades av täta TH-fläckar observerade vid SN (80, 2% jämfört med kontralateralt ställe), medan återhämtning av de dopaminerga nervcellerna inte observerades i behandlingsgruppen cMB + FUS + GDNFp (41, 0% jämfört med kontralateralt ställe) (Fig. 5C). En annan analys av att räkna TH-positiva neuroner inom SN efter behandling indikerade också att densiteten för DA-neuron i GDNFp-cMBs + FUS-gruppen var högre än annan grupp (GDNFp-CMB + FUS: 68, 2 ± 18, 7%; cMB + FUS + GDNFp : 41, 4 ± 5, 1%; PD: 18, 8 ± 5, 3%) (Fig. S8).

Image

( A ) Representativa mikrofotografier av SN-sektioner immunfärgade för TH från normal råtta, PD-råtta, GDNFp-cMB + FUS-grupp och cMB + FUS + GDNFp-grupp. ( B ) IHC-distribution av GDNF, GFAP och Tuj1-uttryck i sonikationsregionen efter gentransduktion. Transfekterad GDNF / GFAP / DAPI (överst) och GDNF / Tuj1 / DAPI (botten) för den normala råtta-, PD-råtta- och PD GDNFp-cMB + FUS-gruppen. GDNF: röd; Tuj1: grön; GFAP: grön; DAPI: blå. ( C ) Den optiska densiteten för TH-fibrer i den lesionerade halvklotet jämfört med den icke-lesionerade halvklotet. ( D ) Fluorescensintensiteten för GDNF, GFAP och Tuj1 i det skadade stället jämfört med den normala råtta. Enstaka asterisk, p < 0, 05 ; dubbel asterisk, p < 0, 01 . Data analyserades med enkelriktad ANOVA (post hoc-test: Dunnett; frihetsgrader: 8, 6; F-värde: 46, 9, 39, 2) och presenterades som medelvärde ± SEM (n = 6 per grupp). Alla data jämfördes med PD-obehandlade råttor.

Bild i full storlek

Immunohistokemisk (IHC) fluorescensfärgning identifierade GDNF-uttryck i CNS-celler (fig. 5B). Dubbelmärkt IHC (GFAP för astrocyter (grön) och DAPI för cellkärnor (blå)) användes för att kolokalisera GDNF-uttryck (röd) och dubbelmärkt IHC (Tuj1 för neuroner (grön)) och DAPI för alla cellkärnor ( blå)) genomfördes för att se GDNF-kolokalisering (röd). Normala råttor uppvisade anrikat GDNF-uttryck (rött) intill astrocyter och neuroner. Med injektion av 6-OHDA åtföljde anmärkningsvärd astrocyt- och neurondödande GDNF-uttrycksförlust (GFAP: 14, 6%; Tuj1: 3, 4%; GDNF: 32, 1% jämfört med normala råttor). Behandling med GDNFp-cMB och FUS eliminerade astrocyt / neuronförlusten (GFAP: 105, 1%; Tuj1: 62, 7% med normala råttor). Speciellt visade GDNFp-cMBs + FUS-behandling att överuttryck av GDNF (84, 4% med normala råttor), möjligen på grund av utsöndring av glia-celler, gav neuronalt skydd. Detta bekräftades genom anrikning av nervceller som visas med GDNF / GFAP / DAPI-färgning. Dessa data indikerar att FUS-triggad GDNFp-cMB-genleverans ger den målinriktade frisättningen av GDNFp, vilket återställer GDNF-sekretion i PD-hjärnor.

Diskussion

I denna studie demonstrerar vi att den FUS-triggade GDNFp-cMB-plattformen kan uppnå icke-viral målinriktad genleverans via en icke-invasiv administreringsväg och visa dess överlägsna tillväxtfaktorgenuttryck för att presentera en neurobeskyttande effekt i en djurmodell av PD. De konstruerade cMB: erna är DNA-bärande fordon med hög nyttolast som minskar kravet på dubbel IV-administration av plasmid och MB, och ännu viktigare, har en överlägsen gentransfektionsförmåga och cirkulationsstabilitet in vivo . Vi visar att det föreslagna systemet avsevärt förbättrar riktad GDNFp-genleverans och -uttryck, och därigenom förbättrar effektiviteten av genterapi. Den icke-invasiva metoden via IV-administrering av genbärande cMB-fordon överträffade den traditionella direkta IC-injektionsvägen med en överraskande ekvivalent GDNFp-titer.

MBs och FUS har använts i stor utsträckning för att förbättra genterapi in vivo och in vitro genom att förbättra leveransen av DNA till målceller. Det finns många möjliga mekanismer genom vilka MB-inducerad kavitation modulerar kärlets permeabilitet: (1) bildning av övergående och reversibla porer på cellmembran (membransonoporation) som medierar intracellulär makromolekylleverans 25, (2) förändring av vaskulär endotelintegritet, vilket medger trans- vaskulär makromolekyltransport mellan cellerna 26, eller (3) stimulering av endocytotisk aktivitet, vilket främjar intracellulär leverans 27 . Det finns emellertid inga bevis för att sonoporationsinducerade porer kommer att transfektera vävnad bortom kärlkretsen. I vårt fall inträffade området för gentransfektion i kärlen och hjärnparenkym. Därför kan DNA flytta från kärl till den extrasvaskulära sidan genom intracellulära gapskors eller aktiv exocytos. Dessutom kan kavitationshändelser och FUS-strålningskraft underlätta MB-extravasation i den extrasvaskulära sidan, vilket resulterar i leverans bortom kärlkretsen.

Denna studie använde en procedur med hög kapacitet för att syntetisera DNA-laddade MB-komplex. Den negativt laddade DNA-fosfatryggraden kan elektrostatiskt fästas till de positiva laddningarna på cMBs-skalet (DNA-belastningseffektivitet för nMB: er och cMB: 3, 67 ± 0, 59% mot 23, 96 ± 3, 71%). Även om våra data bekräftade behandlingsförmågan hos denna bärare, kan laddnings- och leveranseffektiviteten för gener med MBs förbättras genom att ändra DNA-belastningsstrategierna på ytan på MBs (såsom icke-viral vektor eller viral partikel) eller genom att modifiera MB struktur 28, 29 . Att skräddarsy storleken på MB: erna påverkar DNA-laddningen. Nya studier har emellertid antytt att större MB: er har en högre risk att orsaka hjärnskador under BBB-öppning 30 . Vidare möjliggör användning av specifika inriktningsligander med de DNA-laddade MB: erna ackumulering av MBs i områden av intresse, vilket förbättrar associeringen mellan MBs och det vaskulära endotelet och potentiellt ökar effekterna av genleverans.

Vårt cellexperiment indikerade att FUS-exponering enbart ökade neuritutvecklingen fyrfaldigt jämfört med kontrollgruppen (17, 0 ± 4, 0 μm mot 4, 2 ± 0, 8 μm). Möjliga mekanismer för detta inkluderar: (1) ultraljudsmedicinerad cellulär NO-frisättning, som påverkar cellproliferation 31 ; (2) FUS-stimulerad intracellulär signalväg aktiverad celldifferentiering 32 ; och (3) FUS kan uppreglera neurotrophin-3 (NT-3), som är en regulator för neurologisk utvecklingsdifferentiering 33 . Framtida studier kan undersöka mer detaljerade mekanismerna genom vilka FUS förbättrar cellneuraldifferentiering.

Tidigare studier har visat att varaktigheten av FUS-inducerad BBB-öppning ökade med de tillämpade parametrarna för FUS- och MBs-dosen 34, 35 . Våra H&E-färgningsresultat indikerar att parametrarna för FUS som används i denna studie är säkra, varför BBB-öppningens längd bör vara några timmar. Lin et al. visade också att genuttryckstoppen inträffade 48 timmar efter BBB-öppningsförfarandet och IV-injektion av genladdad liposom 16 . Sammantaget föreslår vi att den ökade utstrålningen i upp till 54 timmar efter behandling i cMB + FUS + GDNFp och GDNFp-MB + FUS berodde på försenad proteinuttryck.

Våra djuruppgifter illustrerade att kombinationen av GDNFp-cMB med FUS kan leda till framgångsrik behandling av PD. Emellertid observerades en liten förbättring av PD också i FUS-gruppen såväl som cMB + FUS-gruppen, vilket antydde att FUS eller cMB + FUS ytterligare kan stimulera neurogenes av DA-neuroner i SN och Str. De mekanismer som ligger till grund för induktion av neurogenes av FUS med MB måste fortfarande klargöras. Lin et al. har visat att FUS-behandling uppreglerar trofiska faktorer som främjar neurogenes, såsom hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF), vaskulär endotelväxtfaktor (VEGF) och GDNF 36 . Dessutom påpekade nyligen genomförda studier att FUS med MBs kan stimulera neurogenes inom hippocampus och därigenom modulera patologiska avvikelser, plasticitet och beteende i en musmodell av Alzheimers sjukdom 37, 38, 39 . Därför ger kanske FUS-sonikering enbart god behandlingseffektivitet för PD. Framtida studier behövs för att bättre förstå mekanismen för FUS-inducerad neuronell cellreparation och för att optimera parametrarna för FUS för att förbättra behandlingsresultatet av PD.

CMBs + FUS + GDNFp-gruppen visade att IV-administration av GDNFp efter BBB-öppning inte resulterade i en så djup behandlingseffektivitet som i GDNFp-cMB + FUS-gruppen. Injicerad GDNFp via IV-administration kan brytas ned av nukleaser i blodomloppet, vilket således begränsar mängden aktivt GDNFp som kommer in i hjärnans parenkym genom de BBB-öppnade kapillärerna. Den katjoniska beläggningen av cMB: er skyddar det bundna DNA mot nukleaser 22, 23, 24 . Bindning av DNA: t till cMB: erna säkerställer också att plasmiden ligger intill BBB-öppnad kapillärspalt och därför maximalt kan förbättra plasmidpenetrationsfördelarna med FUS-inducerad mikroström- och strålkraft. En annan möjlighet är att FUS-inducerade mikrojetter förbättrar sonoporation och fagocytos som möjliggör geninträde i angränsande neuronceller. Sonoporation inducerar vanligtvis små porer upp till 100 nm genom att implodera MBs med en kort livslängd i millisekundområdet 25 . Det antas därför att genplasmid konjugerad till MB: erna kan förbättra FUS-inducerad sonoporation och fagocytos.

Flera artificiella metoder har lyckats med att öppna BBB för läkemedels- eller genleverans i hjärnvävnaden, inklusive (1) direkt transkraniell injektion av medel, (2) administrering av hypertoniska lösningar och (3) sonikering FUS efter MBs injektion. Dessa metoder har potentiella biverkningar. I (1) måste en invasiv kateter placeras i hjärnan, vilket resulterar i hjärntrauma 40 . Läkemedlet kan också bara tränga in i hjärnvävnaden via diffusion, vilket gör det svårt att täcka hela lesionen från det deponerade stället. I (2) kan en ökning av hjärnvätska leda till afasi, neurologisk toxicitet och hemiparesis 41 . Denna metod inducerar inte bara en icke-lokaliserad läkemedelsadministration utan främjar även penetrering av toxiska ämnen i hjärnvävnaderna. I (3) kan alltför spännande FUS eller hög dos av MB producera intracerebral blödning och skador på hjärnvävnad 30, 42 . I denna studie indikerade de histologiska uppgifterna att våra använda FUS-parametrar öppnade BBB utan hjärnvävnadsskada.

Det finns några begränsningar att övervinna före kliniska tillämpningar av detta tillvägagångssätt: (1) de 6-OHDA-inducerade PD-råttorna återkapitulerade inte alla patologiska avvikelser som observerades i kliniska PD-fall, därför måste dessa experiment utföras i andra PD-modeller för att bekräfta ytterligare effektiviteten hos leveranssystemet; (2) endast GDNF testades. Ytterligare studier behövs för att bedöma effekterna av administration av BDNF, antikroppar eller neurturin, i kombination med FUS till hjärnan; (3) endast FUS-exponering en gång användes. Upprepad FUS-behandling kan ytterligare förbättra effekten av hjärnläkemedelsleverans, så att flera behandlingar kan vara en annan metod i framtida PD-behandlingar.

I denna studie föreslog vi ett icke-invasivt, målinriktat genleveranssystem baserat på kombinationen av cMB-genplasmidkomplex med FUS. Det föreslagna systemet har en hög gen-plasmid nyttolast och cirkulationsstabilitet, hög gentransfektion / -uttryck och ett snabbt svar i sjukdomsprogressionskontroll. Hittills har vi bara undersökt den terapeutiska potentialen i en djurmodell av PD, men resultaten stödjer möjligheten till en ny riktning för icke-invasiv och riktad leverans av genterapi för neurodegenerativa sjukdomar.

Material och metoder

Beredningar av geninsättningsplasmider

Plasmid som kodar för glialcellinje-härledd neurotrofisk faktor (GDNFp, OriGene, MD, USA) eller firefly luciferasgen (FLUCp, OriGene) driven av en cytomegalovirus (CMV) promotor användes båda i denna studie. FLUCp användes för att utvärdera FUS-medierad transfektionseffektivitet in vitro och in vivo via bioluminescensavbildning. Båda plasmiderna förökades i Escherichia coli, extraherades och renades med ett plasmidekstraktionssats (NucleoBond Xtra Maxi EF, Macherey-Nagel, Düren, Tyskland) enligt tillverkarens riktlinjer. Koncentrationen och renheten bestämdes genom att mäta UV-absorbans vid 260/280 nm med en spektrofotometer (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific, IL, USA).

Framställning av GDNFp-cMB: er och FLUCp-cMB: er

CMB: erna tillverkades med tunnfilms hydratiseringsmetod. Dipalmitoyl-fosfatidyl-kolin (DPPC), 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N- [metoxi (poly (etylenglykol)) - 2000] (DSPE-PEG2000) och 1, 2-dipalmitoyl-3- trimetylammonium-propan (DPTAP) (Avanti Polar Lipids, AL, USA) löstes i kloroform i ett molförhållande av 9: 2: 1 och tappades via rotationsindunstare för att bilda en torkad film. Filmen hydratiserades sedan med 5 pl / ml glycerol-PBS. Mekanisk skakning med omrörare under 45 sekunder gav upphov till cMB med en C3F8-gaskärna och ett lipidskal. Sedan separerades cMB från oreagerade lipider genom centrifugering vid 6 000 rpm (2000 g) under 3 minuter. GDNFp / eller FLUCp (500 μg) blandades med 108 cMB, roterades försiktigt under 30 minuter och centrifugerades sedan vid 6 000 rpm (2000 g) under 1 min för att separera oladdad GDNFp / FLUCp från välkonjugerade GDNFp-cMBs / FLUCp- CMBS. De normala MB: erna (nMB) designades av DPPC och DSPE-PEG2000 för jämförelse.

PD djurmodell

Alla djurförsök i denna studie var tillåtna av Institutional Animal Care and Use Committee vid National Tsing Hua University och följde de experimentella riktlinjerna för djurvård (IACUC: s godkännandenummer: NTHU10156). PD-syndrom etablerades i 135 råttor med 6-hydroxydopamin (6-OHDA). 6-OHDA-lösningen (10 μg 6-OHDA upplöst i 4 μL av 0, 9% NaCl och 0, 02% askorbinsyra) injicerades stereotaktiskt IC i det mediala förhjärnbuntet i den vänstra hjärnan (främre-bakre: −4, 3 mm från bregma; lateral: 1, 6 mm med avseende på mittlinjen och ventral 8, 2 mm från skallen) med en sprutpump med en flödeshastighet av 0, 1 μL / min. En vecka efter operationen fick djuren apomorfininducerade rotationstester varje vecka för att bekräfta den framgångsrika PD-lesionen (detaljerad beskrivning i SI). Det konstaterades att djur som roterar totalt> 250 kontralaterala varv / timme hade en maximal (t ex ≥99%) utarmning av striatal DA. Endast djur som manifesterade detta rotationsbeteende genomgick efterföljande behandling.

Experimentell in vivo- installation av FUS-triggad gentransfektion

Innan försöket inleddes bedövades djur genom intraperitonealt injektion (IP) av en blandning av Zoletil och Rompun (30 mg / kg, Virbac Laboratory, Frankrike). En PE50-kateter infördes i halsvenen för intravenös (IV) administrering av gener, MB och färgämnen. Gentransfektion in vivo utfördes genom självintegrerad ultraljudsavbildningsstyrd FUS-system sonikering 29 och FLUCp-cMB / GDNFp-cMB (fig. S2). I korthet arrangerades en 25-MHz-givare (V324, Panametrics, MA, USA) för bildvägledning och 1-MHz-givaren (V302, Panametrics) för överföring av en sonikationspuls av en speciell hållare för att fixera focierna hos givarna vid samma djup. Pulsen av FUS levererades exakt till behandlingsområdet genom vägledning för ultraljudsavbildning.

Verifiering av FUS med GDNFp-cMB inducerade BBB-öppning och hjärnskada

Sex PD-råttor användes för att bedöma framgångsrik FUS BBB-öppning. Råttor exponerades transkraniellt för 1-MHz FUS-bestrålning med det akustiska trycket i intervallet 0, 4–1, 0 MPa med en exponeringstid på 90 s vid Str och SN (5000 cykler, 1-Hz PRF). Varje råtta fick 0, 14 ml GDNFp-cMB utspädd med 0, 36 ml 0, 9% normal saltlösning. Sonication startade 20-tal efter injektion av GDNFp-cMB. BBB-öppningsområdet verifierades genom färgning med EB-färgämne (100 mg / kg) (Sigma-Aldrich, MO, USA), vilket administrerades 10 minuter före FUS-sonikering. Vid slutförandet av experimentet avlivades djuren och perfunderades med 750 ml 0, 9% normal saltlösning genom vänster kammare. Hjärnvävnader samlades, fixerades i 10% formalin (Sigma-Aldrich), inbäddade i en optimal skärningstemperaturförening (Tissue-Tek, Sakura, CA, USA) och lagrades vid -50 ° C. De frysta hjärnvävnaderna skivades i koronalsektioner. EB-extravasation tjänade som ett index för BBB-öppning, där den blåfärgade fördelningen är lätt synlig med det blotta ögat. Vävnadssektioner (tjocklek 15 μm) färgades sedan med H&E för att upptäcka närvaron av erytrocyt extravasationer, en viktig negativ effekt när vävnader upplever överexponering av ultraljud. Histologiska utvärderingar genomfördes under ljusmikroskopet av en person som var blind för ultraljudsparametrarna men informerade om vilken sida av hjärnan som hade blivit utsatt.

Bioluminescenskvantifiering av transfektion hos djur

Aktiviteten och platsen för genleverans identifierades vid 6, 24, 30, 48, 54, 72 och 96 timmar efter behandling via FLUCp-cMB integrerad med bioluminescensavbildning (IVIS-200, Xenogen Corporation, Ca, USA). Som jämförelse delades 63 PD-råttor i tre grupper: kontrollgrupp ( N = 21), FLUCp-cMB + FUS-grupp ( N = 21) och cMB + FUS + FLUCp-grupp ( N = 21). Tjugo sekunder efter FLUCp-cMB-administrering applicerades FUS transkraniellt med ett akustiskt tryck av 0, 7 MPa (MI-värde: 0, 7), cykeltal 5 000, PRF på 1 Hz och varaktighet av 90 sek. FUS levererades i Str och SN i vänster hjärna. Tio minuter före bioluminescensavbildning injicerades råttorna IP med D-luciferin (150 mg / kg; Biosynth AG, Staad, Schweiz) och råttahjärnorna avlägsnades och placerades omedelbart i IVIS-systemet. Signalintensiteten för de förvärvade ramarna kvantifierades av Living Image 3.0-programvaran (Caliper Life Sciences, MA, USA) för att bedöma transgenuttrycksaktivitet.

PD Djurbehandling Effektivitetsutvärdering

Fyra och fyra PD-råttor delades slumpmässigt upp i nio grupper: PD-råttor utan behandling (PD obehandlad, N = 6), IV-injektion GDNFp enbart (GDNFp, N = 6), PD-råttor med direkt GDNFp IC-injektion (direkt GDNFp-injektion; som positivt riktmärke, N = 6), PD-råttor med GDNFp-cMBs IV-administrering enbart (GDNFp-cMB, N = 6), PD-råttor med FUS-exponering ensam (FUS, N = 6), cMB med FUS-exponering (cMB + FUS, N = 6), PD-råttor med samtidig MB / GDNFp-administration och FUS-exponering (cMB + FUS + GDNFp, N = 6), och FUS-triggade GDNFp-cMBs genleverans för att behandla PD-råttor (GDNFp-cMB + FUS, N = 6). Normala råttor utan PD ( N = 6) användes som kontroller. Varje råtta fick 0, 14 ml GDNFp-cMB utspädd med 0, 36 ml 0, 9% normal saltlösning. Sonication startade 20 s efter injektion av GDNFp-cMB. Råttor exponerades transkraniellt för 1-MHz FUS-bestrålning vid Str och SN i den vänstra hjärnan (0, 7 MPa, 90 sektion, 1 Hz PRF, 5 000 cykler). Apomorfininducerade rotationer, klättringstest och mikrodialys in vivo applicerades varje vecka för att spåra motorasymmetri, akinesiafenomen och DA-nivåer under 8 veckor (detaljerad beskrivning i SI).

Enzymbundna immunosorbentanalysbaserade mätningar (ELISA) av GDNF

The brains were removed and homogenized with RIPA buffer (APOLLO, CA, USA) containing protease inhibitors at 54 h after GDNFp-cMB and FUS treatment. The solutions were then centrifuged at 13, 000 g for 30 min at 4 °C. The supernatants of the centrifuged solution were collected and added into the 96-well immunoplate (SPL, Kyounggi-do, South Korea). GDNF was detected with chicken anti-GDNF antibodies (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) and secondary goat anti-rabbit IgG-HRP (horseradish peroxidase) antibody (Thermo Fisher Scientific). The HRP-labeled secondary antibodies were visualized using the TMB peroxidase substrate (Bethyl Laboratories, TX, USA) and ELISA stopping solution (Bethyl Laboratories). These samples were measured at 450 nm on a fluorescence plate reader system (Tecan Infinite M200, Tecan Trading AG, Switzerland) to quantify the concentration of GDNF.

Immunohistochemical Fluorescence Staining

Tissue sections were stained overnight at 4 °C with the following primary antibodies: chicken anti-GDNF, mouse anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein, Dako, CA, USA), and mouse anti-Tuj1 (neuron-specific class III beta-tubulin, Covance, NJ, USA). After rinsing in PBS, the sections were incubated in secondary antibody with goat anti-chicken fluorescence 594 (for GDNF; Molecular Probes, NY, USA) or with donkey anti-mouse fluorescence 488 (for GFAP or Tuj1; Molecular Probes) for 1 h at room temperature. After rinsing in PBS, coverslips were placed on slides with an anti-fade reagent with the nuclear marker DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylinodole, Calbiochem, CA, USA). Finally, the sections were imaged by a confocal microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Counts were multiplied by the series interval to estimate the total number of quantified cells in the stained section with ImageJ. The intensity values for the GDNF, GFAP and Tuj1 on the ipsilateral side were expressed as a percentage of the normal rat, which was set as 100%.

TH immunohistochemistry

The restoration of DA neurons in PD rats following treatment was confirmed by TH immunohistochemical staining. Eight weeks after the treatment, the brains of the rats were removed and post-fixed. Serial coronal sections of the brain (30 μm thickness) were obtained and incubated overnight with a monoclonal rat anti-TH IgG (Millipore Bioscience Research Reagents, MA, USA). After rinsing in PBS, the sections were incubated with secondary goat anti-rabbit IgG-HRP antibody for 1 h at room temperature. The activity of HRP was visualized and counted by DAB substrate (Thermo Fisher Scientific) by optical microscope. The optical density of the TH+ dopaminergic structures was measured by ImageJ. The microscope images of both SN were read as gray level and integrated. The intensity values for the SN on the ipsilateral side were expressed as a percentage of the contralateral non-lesioned side, which was set as 100%.

Statistisk analys

All statistical evaluations including GDNF concentration, luciferase activity, DA concentration, score of behavior tests and number DA neurons were performed using one-way ANOVA. The behavioral assessment data were analyzed using the repeated measures two-way analysis of variance (ANOVA) followed by a post hoc test (Dunnett) for multiple comparisons or student's t-test. The level of statistical significance was set at p value < 0.05 . All data are expressed as mean ± standard error of mean (SEM).

ytterligare information

How to cite this article : Fan, C.-H. et al. Noninvasive, Targeted, and Non-Viral Ultrasound-Mediated GDNF-Plasmid Delivery for Treatment of Parkinson's Disease. Sci. Rep. 6, 19579; doi: 10.1038/srep19579 (2016).

Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film S1

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.