Nikotinacetylkolinreceptor α1 främjar kalpain-1-aktivering och makrofaginflammation vid hyperkolesterolemisk nefropati | laboratorieundersökning

Nikotinacetylkolinreceptor α1 främjar kalpain-1-aktivering och makrofaginflammation vid hyperkolesterolemisk nefropati | laboratorieundersökning

Anonim

ämnen

  • dyslipidemier
  • Genterapi
  • Inflammation
  • Njursjukdomar

Abstrakt

Den nikotiniska acetylkolinreceptorn α 1 (nAChR α 1) undersöktes som en potentiell proinflammatorisk molekyl i njuren, med tanke på en ny rapport att den är en alternativ urokinasplasminogenaktivator (uPA) receptor, utöver den klassiska receptorn uPAR. Två djurmodeller och in vitro- monocytstudier var involverade: (1) I en ApoE - / - musmodell av kronisk njursjukdom identifierades glomerulära bosatta celler och monocyter / makrofager som de primära celltyperna som uttrycker nAChR α 1 under hyperkolesterolemi / uninefrektomi-inducerad nefropati. Tystnad av nAChR a1- genen i 4 månader (6 månader på västerländsk kost) förhindrade ökningarna i renal monocyt-kemoattraktantprotein-1 och osteopontinuttrycksnivåer och F4 / 80 + makrofaginfiltrering jämfört med de icke-milkade mössen. Dessa förändringar var förknippade med signifikant reducerad transformerande tillväxtfaktor - ß 1 mRNA (50% minskning) och α glattmuskelaktin-positiva ( α SMA +) myofibroblaster (90% minskning), bättre glomerulär och tubulär källarmembran (GBM / TBM) bevarande ( tre gånger mindre sönderfall) och bättre bevarande av njurfunktionen (serumkreatinin 40% lägre) i nAChR a -tystnade möss. NAChR-a1-tystnad förknippades också med signifikant reducerad kaliumdeposition av njurvävnad (78% minskning) och calpain-1 (men inte calpain-2) aktivering (70% minskning). (2) nAChR a ^ uttrycktes in vitro av musmonocytcellinje WEHI-274.1. Tystnad av nAChR a 1 reducerade signifikant både calpain-1 och -2-aktiviteter och minskade nedbrytningen av calpain-substrat-talinet. (3) För att ytterligare undersöka rollen som calpain-1-aktivitet i hyperkolesterolemisk nefropati, jämfördes sjukdomens svårighetsgrad i CAST - / - ApoE - / - (kalpainöveraktiva) möss och ApoE - / - möss som matats med västerländsk diet under 10 månader ( n = 12). Makrofager var den huvudsakliga celltypen för produktion av renal calpain-1 i modellen. Antalet renala F4 / 80 + makrofager var 10 gånger högre i CAST - / - ApoE - / - möss ( P <0, 05) och var associerad med en signifikant högre nivå av a SMA + -celler, ökad GBM / TBM-förstörelse, och högre serumkreatininnivåer. Våra studier antyder att receptorn nAChR α 1 är en viktig regulator för aktivering av calpain-1 och inflammation i den kroniska hyperkolesterolemiska nefropatin. Denna nya proinflammatoriska väg kan också vara relevant för andra störningar utöver hyperlipidemisk nefropati.

Huvudsaklig

Förekomsten av överviktiga och feta individer har ökat snabbt under de senaste två decennierna. 1, 2 Därefter riskerar ett större antal individer att utveckla hypertoni, åderförkalkning, kranskärlssjukdom, diabetes, lipoproteinavvikelser och annan organdysfunktion. 3 Dessutom har nyligen publicerad litteratur visat att kronisk hyperlipidemi, speciellt hyperkolesterolemi, har lipotoxiska effekter i njurarna, vilket leder till njur mesangial och epitelial cellskada och efterföljande fibros genom en komplex inflammatorisk väg. 4, 5, 6 Kännetecknet för hyperlipidemisk kronisk njursjukdom (CKD) är en makrofagdominerad inflammatorisk respons (skumcell) som slutligen utvecklas till glomeruloskleros. Denna process kan vara associerad med mesangial expansion, framträdande mesangiolys, kapillär mikroanurysmer och slutligen skleros. 7 De molekylära mekanismerna som medierar denna serie patologiska händelser i hyperlipidemisk CKD förblir dåligt förstås.

Urokinas plasminogen activator (uPA) är ett tillväxtfaktorliknande protein som produceras i stora mängder av njurarna. Dessutom har uPA och dess klassiska receptor uPAR varit inblandade i olika inflammatoriska-fibrotiska störningar, inklusive CKD. 8 Bevis tyder på att uPA / uPAR-systemet reglerar cellulära svar under inflammation, angiogenes, sårläkning och tumörmetastas. 9, 10, 11, 12, 13 Muskeltyp nikotinacetylkolinreceptorn a 1 (nAChR a 1) har nyligen identifierats som en alternativ urokinasreceptor. Vi rapporterade tidigare att i en mus-obstruktiv uropatimodell av CKD är nAChR a 1-uttrycket uppreglerat på interstitiella fibroblaster under fibrogenes. Tystnad av nAChRa1- genen ledde till signifikant färre interstitiella a- glattmuskelaktin-positiva ( α SMA +) interstitiella myofibroblaster, färre prolifererande fibroblaster, bättre bevarade tubulära celler och minskad total fibrös svårighetsgrad. 14 Denna studie undersöker om nAChR α 1 har en liknande skyddande roll vid hyperlipidemi-associerad CKD.

Den aktiverade nAChR a 1 fungerar också som en ligand-gated jonkanal, känd för att mediera signaltransduktion vid den neuromuskulära korsningen. 15 Förutom muskelceller uttrycks muskeltyp nAChR a 1 också i vaskulärt endotel, makrofager, mesangialceller och fibroblaster. 14, 15 För närvarande finns det två kända endogena nAChR a 1-ligander: acetylkolin och uPA. Vid ligering ändrar receptorn sin konformation och blir permeabel för både kalcium- och natriumjoner. Våra tidigare studier visar att vid uPA-ligering initierar muskeltyp nAChR a 1 intracellulär signalering genom att fungera som en kalciumkanal. Även om specifika nedströms signalvägar återstår att avgränsas antas det att calpains, en klass av cytosoliskt kalciumberoende cysteinproteaser, kan vara involverade. 16, 17 Nya studier tyder på att calpain-1 förmedlar det inflammatoriska svaret genom att ha en roll i inflammatorisk cellmigration och kemotaxi, såväl som i uttrycket av proinflammatoriska cytokiner och vidhäftningsmolekyler. 18, 19, 20 Även om det ännu inte har studerats i någon detalj i CKD, har ökad calpainaktivitet rapporterats i experimentella modeller för njursjukdomar och anses vara skadlig vid immunmedierad akut glomerulonefrit. 17

Denna studie var utformad för att bestämma om calpain-1-aktivering regleras av nAChR α 1 in vivo och in vitro , och för att testa hypotesen att nAChR α 1-calpain-1-axeln deltar i patogenesen av hyperkolesterolemi-inducerad njurinflammation och fibros . Våra fynd indikerar att den in vivo funktionella knockdownen av nAChR α 1 dämpar signifikant calpain-1-aktivitet och njurinflammation i en ApoE - / - musmodell av hyperkolesterolemisk CKD. Data från monocytkulturer validerar vidare att nAChR a 1 är en viktig regulator för kalpainaktivering. Överaktivering av calpain-1 hos möss på grund av frånvaron av dess endogena hämmare, calpastatin, förvärrar dessutom hyperkolesterolemisk nefropati.

MATERIAL OCH METODER

Antikroppar och cDNA-reagens

Antikroppar som användes i denna studie och deras källor är monoklonal antikropp från råttor mot nAChR a 1 subenhet (Covance, Berkeley, CA, USA); get-polyklonal antikropp mot nAChR a 1, antikroppar mot monocyt-kemoattraktantprotein-1 (MCP-1) och osteopontin (OPN; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); monoklonala antikroppar från råtta mot F4 / 80, CD11b (Serotec, Oxford, Storbritannien); EPO pepparrotsperoxidas-konjugerad monoklonal antikropp mot a SMA (Dako Corp., Carpinteria, CA, USA); fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad monoklonal antikropp mot p- aktin, antikroppar mot calpain-1 (klon 15C10 och kaninpolyklon), monoklonal anti-talinantikropp (klon 8d4) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA); och getantikropp mot kollagen av typ IV (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA). CDNA-reagensen som användes i in vitro- och in vivo RNA-interferensstudier (RNAi) -studierna är nAChR a- 1-siRNA-uttryckande konstruktion psir2 och den matchade förvrängning av RNA-uttryckande konstruktion pscr som vi tidigare beskrev. 14

Cellodling och nAChR a 1-RNAi-experiment

WEHI-274.1-celler, en musmonocytcellinje som uttrycker CD11b-antigen, 21 användes som en in vitro- modell för att bestämma om monocyter / makrofager uttrycker nAChR a 1, och för att undersöka regleringsverkan av nAChR a 1 vid calpain-1-aktivering. Celler odlades rutinmässigt vid 37 ° C med 5% CO2 i komplett Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM / F12, 1: 1, pH 7, 35–7, 45) (Mediatech, Manassas, VA, USA) innehållande 10% fetalt bovint serum (vol / volym) och 0, 05 mM 2-merkaptoetanol. För nAChR a- 1-RNAi-experiment transfekterades psir2- och pscr- cDNA: er transient till WEHI-274.1-cellkulturer i 12-brunnars plattor med användning av siPORT XP-1- transfektionsmedel under 24 timmar (Ambion, Austin, TX, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Cellerna odlades sedan i den kompletta DMEM / F12 plus G418 (200 ug / ml) under ytterligare 24 timmar ( n = 6 per grupp, två oberoende experiment). Celler skördades genom att lossa vidhäftande celler genom att skrapa och samla flytande celler i centrifugrör. Efter centrifugering vid 800 rpm i 5 minuter användes 10 | il cellpellets utspädd i normal saltlösning från varje brunn för att göra cellutstryk för utvärdering av nAChR a 1-uttryck genom immunocytokemi. De återstående cellpelletsen lyserades i provbuffert (100 mM Tris (pH 6, 8), 20% glycerol, 0, 75% P- karaptoetanol, 10 mM EDTA). Calpainaktivitet utvärderades med användning av celllysatet med en tidigare avbildad kaseinzymografimetod 22 och talin - ett calpainsubstrat - western blot-analyser.

Djur och experimentell design

In vivo-nAChRa1-RNAi-studie i ApoE - / - möss

ApoE-bristfälliga möss användes i denna studie som modell för hyperlipidemisk nefropati, eftersom njurskada hos dessa möss har karaktäriserats tidigare. 7 kvinnliga ApoE - / - möss på C57BL / 6J-bakgrund köptes från Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) och matades med västtyp som innehöll 21% fett och 0, 15% kolesterol (TD88137; Harlan-Teklad Laboratories, Indianapolis, IN, USA) från 8 veckors ålder. För att funktionellt slå ned nAChR α 1-uttryck började RNAi-ingrepp från två månader på den västra dieten. Naken plasmid-DNA som uttrycker hårnål nAChR a 1-siRNA ( psir2 ) eller kryp RNA ( pscr ) administrerades ( n = 12 per grupp) med användning av ett aorta-renalt hydrodynamiskt protokoll modifierat från en tidigare publikation. 23 Kortfattat utfördes en operation under generell anestesi för att fullständigt exponera abdominal aorta och vänster njurartär. Den distala änden av vänster njurartär ligerades och en lös trådögla placerades i den proximala änden. Aortablodflödet blockerades tillfälligt vid punkter över och under de två njurartärerna. Efter en omedelbar injektion av 100 μg DNA ( psir2 eller pscr ) i 200 μl normal saltlösning banddes den förinställda vänster njurartärslingan omedelbart och de övre och nedre aorta-blockeringspunkterna släpptes därefter. Vänster njure avlägsnades och vävnader lagrades för efterföljande studier (som en baslinjesjukdomskontroll för mössen). 24 Efter operationen hölls mössen på den västerländska dieten i ytterligare fyra månader innan de dödades av exsanguination under generell anestesi. Höger njur- och serumprover samlades och lagrades för ytterligare analyser.

Calpain överaktivitetsstudie i CAST - / - ApoE - / - möss kontra ApoE - / - möss

För att undersöka rollen av kalpainaktivering som nedströms effekter av nAChR α 1-vägen vid progressionen av hyperlipidemisk njurskada, designades en studie för att jämföra graden av njurskada hos ApoE - / - möss och i ApoE - / - möss som saknas calpastatin. Calpainaktiviteten manipulerades med användning av calpastatin (den enda endogena calpaininhibitorn) gen-knockout ( CAST - / - ) -möss som korsades till ApoE - / - -mössen. Båda stammarna var på identisk genetisk bakgrund (96, 3–98, 2% C57BL / 6J, 1, 9–3, 8% 129 / Sv). De resulterande heterozygotmössen i den första generationen korsades över varandra. Efter fem generationer av parning erhölls dubbelpoozygot ( CAST - / - ApoE - / - eller DK) avelspar. ApoE - / - single knockout (SK) -möss som användes i följande experiment härrörde också från den första generationen heterozygote-möss. Som ett resultat av korsavlingen var avelsparna för DK- och SK-möss på liknande genetisk bakgrund. Genotyperna för alla möss verifierades på DNA från svans genom PCR med användning av metoderna tillhandahållna av Dr Saido (för CAST- genotypning) och Jackson Laboratory (för ApoE- genotypning). 25 Kvinnliga möss av DK och SK matades med den västerländska dieten som började vid 5 veckors ålder ( n = 12). Efter tio månader på den västerländska dieten dödades möss och organvävnader skördades (urinprov 24 timmar samlades in i enskilda möss med användning av metaboliska burar innan dödandet) Ytterligare DK- och SK-honmöss ( n = 4 vardera) matades med normal chow under experimentets gång för att tjäna som "normala" kontroller. För att undvika kön som en potentiell förvirrande faktor användes endast kvinnliga möss i våra studier. Alla djurstudier godkändes av IACUC från Seattle Children's Research Institute.

Biokemiska parametrar

Plasmakolesterolnivåerna mättes med en kolorimetrisk analys (kolesterol / kolesteroylester-kvantifieringssats; BioVision Laboratories, Mountain View, CA, USA). Serumkreatininkoncentration bestämdes med användning av Jaffe-reaktionsmetoden som tidigare fastställts av Butler. 26 Urea kvävenivåer i blodet bedömdes med användning av Urea kvävevätskeagens (kinetisk metod) enligt tillverkarens instruktioner (TECO Diagnostics, Anaheim, CA, USA). Urinalbumin mättes med användning av QuantiChrom BCG Albumin Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA).

Northern Blotting

Totalt RNA isolerades från njurarna med användning av Trizol-reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Northern blot-analyser för a SMA, transformerande tillväxtfaktor- p 1 (TGF- p 1), MCP-1 och OPN utfördes som tidigare beskrivits. 13, 14, 24

Western Blotting och Coimmunoprecipitation

Western immunoblotting (IB) och coimmunoprecipitation (IP / IB) experiment utfördes efter standardprotokoll. 27 Specifikt drogs calpain-1 ner från 80 μg njurproteinprover i en icke-reducerande buffert med den monoklonala antikroppen (15C10) specifikt för underenhet p80. Proven separerades sedan med en 10% SDS-PAGE i ett reducerande tillstånd. Blott testades med kaninpolyklonal antikropp för calpain-1 (domän IV) och märktes med den AlexaFluor680-konjugerade sekundära antikroppen (Molecular Probe). För kontroller av Western blot-laddning undersöktes fläckar med den FITC-konjugerade anti- p- aktin monoklonala antikroppen. De färgade fluorescerande intensiteterna skannades och analyserades med en Typhoon TRIO Variable Mode Imager (Amersham Biosciences).

histopatologi

Paraffin-inbäddade njursektioner färgades med primära antikroppar mot nAChR a 1, a SMA, typ IV kollagen, MCP-1 och OPN och märktes med användning av ett standard-ABC-kitprotokoll (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Immunfluorescerande (IF) färgning för F4 / 80 + makrofager utfördes på frysta njurarsektioner, identifierade med den FITC-konjugerade get-anti-råtta IgG sekundär antikropp (Southern Biotechnology Associates). Avsnitt som saknade primära antikroppar kördes parallellt som negativa kontroller. För nAChR a- 1-uttryckande makrofag-dubbla fläckar identifierades F4 / 80 och nAChR a 1 med FITC (grön) respektive AlexaFlour680 (röd) fluorescens. För calpain-1-uttryckande makrofag-dubbla fläckar märktes F4 / 80 och calpain-1 med AlexFlour680 (röd) respektive FITC (grön) fluorescens. Njuralipidavsättningsnivåer detekterades genom oljedöd O-färgning såsom tidigare beskrivits. 28 Vävnadskalciumnivåer mättes på paraffin-inbäddade, Von Kosa-färgade njurarsektioner. 29

Morfometriska analyser

Histologiska bilder fångades med hjälp av en SPOT digital kamera och de färgade områdena kvantifierades med hjälp av Image-Pro Plus-mjukvaran som vi tidigare beskrev (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). 14, 30 För immunohistologi ( a SMA, F4 / 80, MCP-1, OPN och typ IV kollagen) utvärderades färgningen i glomeruli och tubulointerstitium separat. Resultaten uttrycktes som en positiv procentandel av varje intressant område (glomeruli eller tubulointerstitium). Störning av glomerulära och tubulära källarmembran (GBM / TBM) utvärderades genom att mäta färgningsintensiteten för typ IV-kollagenkomponenten i GBM / TBM i kombination med försvinnandet av en typisk slingstruktur. För detta ändamål definierades en specifik färgintensitetströskel härledd från typ IV-kollagenfärgning på baslinjen eller "normala" njurarna av programvaran som en stark färgning (representerar den intakta källarmembrankomponenten) Endast de starkt färgade områdena räknades som positiva med avseende på GBM / TBM: s integritet. För fläckarna med röda O- och Von Kosa-fläckarna kvantifierades inte färgningen separat med glomeruli och tubulointerstitium på grund av de små områdena med positivitet; och resultaten uttrycktes som en positiv procentandel av njurareaområdet.

Statistiska analyser

Data analyserades med hjälp av studentens t- test (parametriska data) eller Mann – Whitney U- test (icke-parametrisk data), och nollhypotesen avvisades vid ett P- värde <0, 05 om inte annat anges. Resultaten presenteras som medelvärde ± 1 sd om inte annat anges.

RESULTAT

NAChR α 1 reglerar aktivering av Calpain-1 i njurar av ApoE - / - möss och i mononukleär cellkultur

I baslinjens njurar (2 månader på västerländsk kost, före DNA-injektion / uninefrektomi), var nAChR α 1 i njuret knappt detekterbart med western blotting i ApoE - / - mössen (figur 1). Efter 6 månader på en fetthaltig diet, efter DNA-injektion / uninefrektomi, var nAChR a 1-proteinuttrycket starkt och signifikant uppreglerat i njurarna hos kontroll pscr- behandlade ApoE - / - möss. Med gen-tystnad undertrycktes nal- nAChR a- uttrycket med 70% ( psir2 kontra pscr , n = 8 per grupp, P <0, 05). Genom immunolokalisering (figur 1) hittades nAChR a 1-proteinet huvudsakligen i de sjuka glomerulierna och på tubulointerstitiella celler. Såsom illustreras med dubbel IF-färgning identifierades majoriteten av nAChR a- 1-uttryckande glomerulära celler som några F4 / 80 + infiltrerade makrofager.

Renal nAChR α 1-uttryck och tystnad i ApoE - / - musmodellen för hyperkolesterolemisk CKD. ( a ) Western blot (WB) -analys för nAChR a 1 visar en signifikant uppreglering efter uninephrectomy och 6-månaders Western diet, och en 70% gen-knockdown med nAChR a 1-siRNA-uttryckande vektorn psir2 . P- aktinbanden användes för att korrigera för proteinbelastning. Histogrammet representerar de relativa bandtätheterna analyserade med NIH-bildprogrammet ( n = 8). * P <0, 05, pscr kontra baslinje eller psir2 . ( b ) Den nAChR- a1- immunohistokemiska (IHC) -färgningen upptäcker ett starkt uttryck i glomeruli och interstitium i modellen för hyperlipidemisk CKD och bekräftar nAChR a- 1-tystnadseffekten. Ibland var intensivt glomerulärt nAChR a 1-uttryck associerat med framträdande mesangiolys i de pscr- behandlade mössen (såsom illustreras av pscr , × 400). ( c ) Dubbel IF-färgning illustrerar infiltrerade glomerulära makrofager som samuttrycker (gul överlappningsbild) F4 / 80 (grön) och nAChR a 1 (röd) i en sjuk njure hos den pscr- behandlade ApoE - / - musen. Originalförstoring: × 400.

Bild i full storlek

Vävnadens kalciumavsättningsnivåer utvärderades genom en Von Kosa-färgning eftersom cellreceptorn nAChR a 1 kan fungera som en kalciumkanal och förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen även om mikromolnivåer kan reglera aktiveringen av calpain-1. Njurkalciumnivåerna förhöjdes till femfaldiga efter 6 månaders västerländsk diet i de pscr- behandlade mössen (0, 75 ± 0, 6 mot 3, 5 ± 1, 1%, vid 6 månader jämfört med baslinjen, n = 6, P <0, 05). NAChR a- 1-störningen sänkte kalciumnivån i de sjuka njurarna med mer än fyrfaldigt (0, 79 ± 0, 6 mot 3, 5 ± 1, 1%, psir2 kontra pscr , n = 6, P <0, 05). Nivån av renal calpain-1-aktivitet ökade 10 gånger jämfört med baslinjenivåer i de pscr- behandlade mössen (6 månader jämfört med baslinjen, n = 8, P <0, 05) (figur 2a). Nedslagningen av nAChR a 1 under 4 månader var associerad med en 70% reduktion i den aktiva calpain-1 (58 kDa) nivån i njurarna hos de psir2- behandlade mössen ( psir2 kontra pscr , n = 8, P <0, 05) (Figur 2a). Ingen skillnad hittades i njuraktiverat calpain-2-protein i psir2- behandlade jämfört med de pscr- behandlade möss (data visas inte), trots signifikant olika calpain-2-aktiviteter som hittades i monocytkulturer (figur 2b). Genom immunohistokemi uttrycktes renal calpain-1-protein av glomerulära och interstitiella celler i de pscr- behandlade mössen, men nästan inte detekterbara i de psir2- behandlade mössen (figur 2a).

NAChR a 1 är en nyckelregulator för cellulär calpain-1-aktivering. ( a ) Coimmunoprecipitation (IP / IB) -studier (detaljer som visas i materialen och metoden) visar signifikant mindre mängd av det aktiverade calpain-1-proteinet (58 kDa) i njurarna hos de psir2- behandlade mössen jämfört med de pscr- behandlade mössen ( n = 6). Antikroppen reagerar med band vid 80 kDa (latent), 58 kDa (aktiverat och funktionellt, indikerat med pilspetsen) och en serie mindre ytterligare nedbrutna produkter av okänd biologisk betydelse. Grafen visar de genomsnittliga aktiva banddensiteterna ± 1 sd, korrigerade för proteinbelastning med användning av ß- aktinproteinbanddensiteter. * P <0, 05, pscr kontra baslinje eller psir2 . Calpain-1 immunohistokemisk (IHC) färgning upptäcker tydligt uttryck i glomeruli (2) och interstitium (1) i en pscr- behandlad musnjur. Det glomerulära och interstitiella uttrycket har till stor del försvunnit i en psir2- behandlad musnjur (3). Originalförstoring: × 250. I ( b ) uttrycker WEHI-274.1 monocyter nAChR a 1 i kulturer såsom visas av IHC (1). En cell som starkt uttrycker nAChR a 1 markeras i (2). NAChR- al- uttrycket tystades effektivt genom transient transfektion av psir2- vektorn (3). Originalförstoringar: (1) och (3), × 250; (2) × 400. NAChR a1- tystnad i monocyterna är associerad med signifikant reducerad calpain-1- och -2-aktiviteter (zymogram) och reducerad calpain-substrat talinklyvning (WB). Talinprotein klyvdes fullständigt in i 190-kDa-fragmentet i de pscr- transfekterade cellerna; signifikant mindre mängd talin klyvdes i de psir2- transfekterade cellerna 48 timmar efter RNAi. Intakt talin = 225 kDa. Histogrammet representerar de relativa bandtätheterna, analyserade med NIH-bildprogrammet. * P <0, 05, psir2 kontra pscr , n = 4 vardera.

Bild i full storlek

In vitro uttrycktes nAChR a 1 med musmonocytcellinjen WEHI-274.1. Tystnad av nAChR- a1- uttryck på cellerna minskade signifikant aktiviteterna för både calpain-1 (60% minskning) och calpain-2 (90% minskning) och minskade klyvningen av calpain-substrat-talin med 20% ( psir2 kontra pscr , n = 4, alla P <0, 05) (figur 2b). Dessa resultat antyder att receptorn nAChR a 1 är en viktig uppströmsregulator för den kalciumberoende aktiveringen av calpain-1 i den hyperkolesterolemiska modellen för CKD.

Njurmakrofaginflammation reduceras i nAChR α 1-tystnad möss

F4 / 80 + njurmonocyter / makrofager, den dominerande inflammatoriska celltypen under hyperkolesterolemisk nefropati, ökades signifikant över tiden i de pscr- behandlade mössen (figur 3a). Antalet F4 / 80 + -celler var 2- och 10-faldigt förhöjda i glomeruli respektive cortical tubolointerstitium i njurarna hos de pscr- behandlade ApoE - / - mössen (6 månader mot baslinjen, n = 6, P < 0, 05). NAChR a 1-knockdown genom psir2- behandlingen förhindrade ökningen av makrofaginfiltrering i både glomerulära och tubulointerstitiella fack (6 månader jämfört med baslinjen, n = 6, P > 0, 05). Den deprimerade makrofagrekryteringen kombinerades med reducerat uttryck av två viktiga monokytkemoattraktantkemokina gener: MCP-1 och OPN. Baslinjens njurnivåer av MCP-1 och OPN mRNA och protein var minimal; uttryck begränsades till de vaskulära väggarna och de interstitiella makrofagliknande cellerna (figur 3b). I de pscr- behandlade mössen ökade mRNA och proteinuttrycket för de två kemokinerna signifikant med tre till femfaldigt i alla fack i njurarna (6 månader jämfört med baslinjen, n = 5, alla P <0, 05). I nAChR a- 1-tystade möss förblev MCP-1 och OPN mRNA och proteinnivåer mycket låga vid 6 månader efter att de hade matats med västerländsk diet (6 månader jämfört med baslinjen, n = 5, mRNA eller protein, allt P > 0, 05). Dessa fynd antyder att aktiveringen av receptorn nAChR a 1 är starkt associerad med regleringen av rekrytering av makrofager i modellen för hyperkolesterolemisk nefropati.

NAChR a 1-RNAi minskar rekryteringen av njurmakrofager. ( a ) F4 / 80 IF-färgning visar en signifikant större närvaro av makrofager i både glomeruli och i tubulointerstitium efter uninefrectomy och 6-månaders västerländsk diet i pscr- behandlade möss, men inte i de psir2- behandlade mössen. Med hjälp av Image-Pro Plus-programmet kvantifierades fackspecifika F4 / 80 + -makrofager och resultaten uttrycktes som ett positivt procentområde av intresse. # P <0, 05, pscr kontra baslinje; * P <0, 05, psir2 kontra pscr , n = 6. Originalförstoring: × 250. ( b ) Analys av Northern blot (NB) illustrerar en signifikant uppreglering i MCP-1 och OPN-mRNA i utvecklingen av hyperkolesterolemisk CKD sett i de pscr- behandlade mössen 6 månader efter att ha fått mat på västerländsk diet, men inte hos de psir2- behandlade mössen ( n = 5). Histogrammet under NB representerar semikvantitativa resultat (medelvärde ± sd) av NB-analys med användning av NIH-bildanalysprogrammet. De lägre glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) mRNA-band användes för att korrigera för RNA-belastning. IHC-mikrofotografier illustrerar skillnader i uttrycket av njur MCP-1 och OPN i möss behandlade med nAChR a1- tystnad ( psir2 ) och förvrängd ( pscr ) siRNA. Grafen nedan sammanfattar resultaten från datorassisterad bildanalys av MCP-1 + eller OPN + glomerulära och interstitiella områden ( n = 5), vilket bekräftar resultaten från NB-analysen.

Bild i full storlek

Tidig profibrotisk njurespons är avstängd i nAChR α 1-tystnad njure

Den hyperlipidemiska nefropatin kännetecknades av ett profibrotiskt njurespons med uppreglering av TGF- p- mRNA (sexfaldigt) i de pscr- behandlade mössen (6 månader jämfört med baslinjen, n = 5, P <0, 05) (figur 4). Den renala TGF- / 1-mRNA-nivån var 50% lägre i de nAChR a- 1-tystade mössen jämfört med de pscr- behandlade mössen ( n = 5, P <0, 05) (figur 4a). I baslinjens njurar hittades ingen α SMA-färgning i glomerulära tuvor eller tubulointerstitium förutom i den glatta muskeln i vaskulära väggar (figur 4b). I den pscr- behandlade gruppen fanns en stark de novo- presentation av α SMA + myofibroblaster i både glomeruli och tubulointerstitium efter 6 månader på Western diet. I den psir2- behandlade gruppen sågs en liten mängd glomerulär a SMA + -färgning i glomeruli och ingen tubulointerstitial myofibroblast observerades. Såsom kvantifierats med Western blot-analyser (figur 3) reducerades a- SMA-proteinnivåerna i den psir2- behandlade gruppen med 90% jämfört med den pscr- behandlade gruppen ( n = 6, P <0, 05). Northern blot-analyser visade 50% reducerade a SMA-mRNA-nivåer i de psir2- behandlade mössen jämfört med de pscr- behandlade mössen ( n = 5, P <0, 05).

Minskat renal TGF- p 1 mRNA och α SMA + myofibroblaster genom nAChR α 1 tystnad. ( a ) Njur Northern blot-analys illustrerar en signifikant tvåfaldig reduktion i a SMA- eller TGF-p1-mRNA på grund av nAChR a1- tystnad sett i psir2- behandlade hyperlipidemiska CKD-möss, men inte i de pscr- behandlade mössen. Histogrammet representerar halvkvantitativa resultat (medelvärde ± sd) av Northern blot-analys. GAPDH-mRNA-band användes för att korrigera för RNA-laddning. # P <0, 05, pscr kontra baslinje, * P <0, 05, psir2 mot pscr , n = 5. ( b ) a SMA IHC-fotomikrografer illustrerar att a SMA + myofibroblaster var frånvarande i både glomeruli och interstitium (exklusive vaskulär glatt muskel) i baslinjens njurar. De novo- uttryck av a SMA observerades i både glomerulära och interstitiella fack 6 månader efter västerländsk diet, men i en särskilt mildare omfattning i de nAChR a 1-tystade mössen. Originalförstoring: × 400. Renal α SMA Western blot-analys illustrerar en signifikant 90% reduktion av totalt a SMA-protein i de psir2- behandlade mössen jämfört med de pscr- behandlade mössen ( * P <0, 05, n = 6). P- aktinbanden användes för att korrigera för proteinbelastning. Histogrammet representerar medelbandtätheter.

Bild i full storlek

Mindre svår källmembranskada och bättre njurfunktioner i nAChR α 1-tystnad möss

De kroniska inflammatoriska – fibrotiska responserna i denna hyperkolesterolemiska CKD-modell ledde till en destruktiv process som kännetecknades av skador på vaskulär, GBM / TBM, deponering av njuralipid och funktionsförlust (figur 5). Såsom illustreras i fig. 5a, visade baslinjenjuren intensiv färgning av kollagen typ IV av källarmembranstrukturerna med intakta kapillärslingor i glomerulära tufter / peritubulära områden och morfologiskt normala rör. Efter 6 månader reducerades området av njurarna som upptogs av källagen av källagen av huvudmembrankomponenttypen kraftigt i de pscr- behandlade mössen (tre till femfaldigt lägre, 6 månader jämfört med baslinjen, n = 6, P <0, 05). Den reguljära kapillärslingstrukturen tycktes skadas och förvrängas, och vissa njurrör utvidgades. Komponenten av kollagen typ IV var signifikant mindre skadad i njurarna hos de psir2- behandlade mössen (två till tre gånger högre, psir2 kontra pscr , n = 6, P <0, 05), vilket resulterade i en bättre morfologi av njurarna (figur 5a) .

NAChR a 1-tystnad skyddar källarmembranintegriteten och minskar lipidavsättning i njurarna. ( a ) Typ IV kollagen IHC-färgning upptäcker ett starkt uttryck i GBM / TBM och interstitiella kapillärer med tydliga slinglika strukturer i baslinjens njurar. Färgningen försvagades signifikant vid utvecklingen av den hyperkolesterolemiska CKD och var associerad med försvinnandet av glomerulära och interstitiella slingstrukturer och tubulär dilatation i de pscr- behandlade mössen. Förändringar i färgningsintensiteten och patologisk morfologi var mindre allvarliga i de psir2- behandlade mössen jämfört med de pscr- behandlade mössen, vilket indikerar att nAChR a 1-tystnad skyddar GBM / TBM från sönderfall. * P <0, 05, pscr kontra baslinje eller psir2 , n = 6. ( b ) Oljröd O-fläckmikrofotografier illustrerar skillnader i nivån av njurlipidavsättning hos möss behandlade med nAChR a1- tystnad ( psir2 ) och förvrängd ( pscr) siRNA. Grafen sammanfattar resultaten från datorassisterad bildanalys av det lipidfärgade området, vilket visar en signifikant 98% reduktion av lipidupptagningen av nAChR a 1-tyst grupp mot den förvrängda gruppen ( n = 6). Originalförstoring: × 400.

Bild i full storlek

Nedsatt lipidavsättning, mätt med oljedöd O-färgning, var minimal vid baslinjen (figur 5b). Efter 6 månader ökade den röda O-fläckpositiva arean kraftigt med 15 gånger i njurarna hos pscr- behandlade möss (6 månader jämfört med baslinjen, n = 6, P <0, 05). Lipidupptagningen och avsättningen i glomerulära och tubulointerstitiella vävnader reducerades signifikant i nAChR a 1-tystade möss (98% lägre, psir2 kontra pscr , n = 6, P <0, 05), trots liknande serumkolesterolnivåer (569, 1 ± 26, 2 mot 549, 4 ±12.4 mg per 100 ml, psir2 versus pscr , n =5, P >0.05). In association with less severe renal pathological changes, the kidney function was better preserved in the psir2 -treated mice (serum creatinine (SCr), 1.95±0.5 versus 3.2±0.7 mg per 100 ml, psir2 versus pscr , n =5, P <0.05).

Increased Endogenous Calpain Activity Promotes Renal Macrophage Inflammation in the CAST −/− ApoE −/− Mice

In the absence of calpastatin (the only known endogenous calpain inhibitor), renal levels of the activated calpain-1 were fivefold higher in the CAST −/− ApoE −/− (DK) mice compared with the ApoE −/− (SK) mice even on normal diet ( n =4, P <0.05) (Figure 6a). Maintained on a Western diet for 10 months, the renal calpain-1 activation was significantly augmented by three- and eightfold in the DK and SK mice, respectively (Western diet versus normal diet, n =4, both P <0.05). The serum or kidney levels of the activated calpain-1 were about twofold higher in the DK mice compared with the SK mice ( n =4, both P <0.05) 10 months on Western diet (Figure 6a). The integrin-to-cytoskeleton anchorage protein talin (a calpain substrate that is thought to be involved in the activation and migration of CD11b+ leukocytes/macrophages) 31 was abundantly expressed—both the intact (225 kDa) and the calpain-cleaved (190 kDa) forms—in the kidneys of the SK mice on normal diet (Figure 6b). In the DK mice, all talin protein detected by western blot was in the calpain-cleaved form and in a significantly smaller quantity (77% decrease, DK versus SK, n =4, normal diet). The talin protein was completely cleaved and degraded to a barely detectable level in both the DK and SK mice 10 months after being fed with Western diet.

Calpain-1 activity was enhanced in kidneys of the CAST −/− ApoE −/− mice. ( a ) Western blot analysis shows significantly higher serum and renal levels of the active form calpain-1 (58 kDa, indicated by arrowheads) in the CAST −/− ApoE −/− double-knockout (DK) mice compared with the ApoE −/− SK mice after 10-month Western diet or normal chow. The albumin or β -actin bands were used to correct for protein loading. The histogram represents the relative band densities (mean±sd, n =4). ( b ) Kidney talin western blot illustrates significantly lower levels in the DK mice versus SK mice on normal diet, indicative of calpain hyperactivity of the DK mice. Kidney talin was fully cleaved into the 190-kDa fragment (lower arrow), and was almost completely degraded into the antibody-undetectable products 10 months after Western diet. Intact talin=225 kDa (upper arrow). The histogram represents the relative band densities ( n =4), analyzed with the NIH image program.

Bild i full storlek

F4/80+ macrophages were rarely seen in the glomeruli and tubulointerstitium of the SK mice that were fed a normal diet (at the age of 11 months). F4/80+ cells were increased in the glomeruli and tubulointerstitium of the same-aged mice that had been on the Western diet for 10 months (Figure 7a). Associated with calpain-1 overactivity in the DK mice, a significantly higher baseline number of the F4/80+ macrophages was present in kidneys of the DK mice on normal diet (threefold higher, DK versus SK, n =4, P <0.05). Renal macrophages recruitment was enhanced by the Western diet in the DK mice (17- and 8-fold increases, in the glomeruli and tubulointerstitium, respectively, Western diet ( n =6) versus normal diet ( n =4), both P <0.05). This resulted in a significantly greater F4/80+ macrophage infiltration of the kidneys of the DK mice compared with the SK mice on the Western diet (10- and 3-fold higher, in the glomeruli and tubulointerstitium, respectively, n =6, both P <0.05) (Figure 7a). The difference in the degrees of the renal inflammatory response following the Western diet was further confirmed by western analysis of the leukocyte/macrophage marker CD11b (2.6-fold higher in the DK mice versus SK mice, n =4, P <0.05) (Supplementary Figure 1). As illustrated by IF double staining of a hypercholesterolemic DK kidney, all F4/80+ macrophages strongly expressed calpain-1 protein, and were the main source of calpain-1 in the inflamed kidney (Figure 7b).

Calpain overactivity promotes renal macrophage infiltration. ( a ) By IF stain, kidney F4/80+ macrophage infiltration was significantly exacerbated by calpain hyperactivity of the DK mice on either normal chow ( n =4) or Western diet ( n =6). Using the Image-Pro Plus program, compartment-specific F4/80+ macrophages were quantified and results were expressed as a positive percent area of interest. * P <0.05, DK versus SK, glomeruli or tubulointerstitium. Original magnification: × 250. ( b ) Double IF staining illustrates infiltrated glomerular macrophages that coexpress (yellow overlap image) F4/80 (red) and calpain-1 (green) in a diseased kidney of the DK mouse fed with high-fat diet for 10 months. Originalförstoring: × 400.

Bild i full storlek

Calpain Hyperactivity Leads to More Severe Inflammatory Destruction and Renal Functional Loss

Intact GBM/TBM structures were clearly demonstrated in baseline kidneys, with no differences in the percentage area of collagen type IV staining between the DK and SK mice. Additional collagen type IV-positive staining appeared in the interstitial compartments in between the basement membrane structures (GBM/TBM) in the Western diet group of SK mice (Figure 8a), perhaps a manifestation of the fibrotic response of the model. This resulted in a slightly increased collagen type IV-stained area in the SK mice fed on Western diet (1.5-fold increase, Western diet versus normal diet, n =4, P <0.05). In contrast, the type IV collagen component of the GBM and TBM was significantly reduced by about 70 and 50%, respectively, in the Western diet group of DK mice (Western diet ( n =6) versus normal diet ( n =4), both P <0.05). The more severe GBM/TBM damage in the DK mice coincided with a stronger α SMA+ myofibroblast response incited by the Western diet (Figure 8b). The de novo appearance of glomerular α SMA+ myofibroblasts was fourfold higher in the DK mice when fed with the Western diet (DK versus SK, n =6, P <0.05). Tubulointerstitial α SMA+ area was also fivefold higher in the DK mice, but did not reach statistical significance (DK versus SK, n =6, P =0.06). These data suggest that calpain-1 hyperactivity promotes renal inflammatory–fibrotic cellular responses and GBM/TBM damage in the hypercholesterolemic mice.

Calpain overactivity accelerates kidney basement membrane destruction and myofibroblast transformation. Type IV collagen IHC staining ( a ) illustrates clear loop-like structures of renal basement membranes in mice fed normal chow (data of DK and SK mice were statistically similar and thus pooled). The type IV collagen expression in SK Western diet fed mice was intensified, with notable new staining in the interstitial area, and was associated with some dilated tubules, perhaps as a result of the early fibrotic response. However, the type IV collagen component of the basement membranes in the DK Western diet-fed mice was significantly lower. The predominant GBM/TBM disruption in the DK mice resulted in greater kidney α SMA+ myofibroblast transformation compared with the SK mice ( b ). # P <0.05, SK versus normal diet, n =4; * P <0.05, DK versus SK ( n =6) or normal diet ( n =4). Originalförstoring: × 400.

Bild i full storlek

In terms of clinical parameters, serum cholesterol levels were above 1000 mg per 100 ml, but similar in the DK and SK mice after 10 months on a Western diet (Table 1). The 24-h urine albumin was 3.5-fold higher in the DK mice (DK versus SK, n =8, P <0.05), consistent with the pathological changes. Kidney function, as measured by SCr and blood urea nitrogen levels, was diminished to a greater extent in the DK mice (DK versus SK, n =8, both P <0.05) (Table 1).

Full storlek bord

DISKUSSION

Hyperlipidemia is thought to accelerate the progression of kidney disease, but the mechanisms by which hyperlipidemia exerts its deleterious effect remains largely unclear. 3, 4, 32 This study specifically addresses the role of the muscle type nicotinic receptor, nAChR α 1, on the progression of hypercholesterolemic nephropathy. Long-term in vivo knockdown of the nAChRα1 gene is renoprotective in the mouse model of hypercholesterolemic CKD. The results suggest that nAChR α 1 mediates the progressive nephropathic inflammatory response by functioning as a regulator of calpain-1 activation. This study has suggested that the nAChR α 1-calpain-1 activation intracellular conduit is involved as a novel proinflammatory pathway in the hypercholesterolemia-induced CKD.

The nAChR family has been shown to serve as a ligand-gated ion channel capable of mediating a variety of physiological activities. They are made up of a group diverse isoforms, each consisting of the specific assembly of five polypeptide subunits (the α 1–10, β 1–4, γ , δ , and ɛ ) in either a homomeric or heteromeric configuration. 33, 34, 35 Although the muscle-type nAChR (( α 1) 2 β 1 γδ / ɛ ) was originally discovered at neuromuscular junctions, it has since been identified in a variety of other cell types ranging from endothelial cells, vascular smooth muscle cells, immune cells, fibroblasts, and cancer cells. 36 We have recently identified the nAChR α 1 as an alternative uPA receptor. It is evident that the distinct structural components of individual nAChR isoforms directly relate to the physiological activity that the receptor regulates. For instance, it is now widely accepted that the nAChR α 7 has an anti-inflammatory role; it is expressed by tubular cells in the kidney ischemia/reperfusion injury model, and is renoprotective. 37 We recently reported that the nAChR α 1 isoform promotes renal fibrosis through a mechanism that involves myofibroblast phenotypic regulation. 14 In the obstructive fibrotic kidney, the uPA rather than acetylcholine may be the dominant endogenous ligand for interstitial nAChR α 1.

Dyslipidemia is considered as a common factor contributing to the severity of renal function loss in patients with preexisting CKD. 38 The ApoE −/− mouse model of hyperlipidemic nephropathy has been well characterized and widely used for mechanistic and interventional studies. 3, 4, 30, 39 Hyperlipidemia is thought to promote chronic macrophage inflammation associated with significant renal-damaging effects in this model. In this study, we report that nAChR α 1 expression is increased in both glomerular and interstitial cells including macrophages, and suggest that downstream calpain-1 activation promotes renal inflammation and chronic kidney injury. The silencing of nAChRα1 gene was associated with a considerable reduction in renal calpain-1 activation levels. The downstream reduction in calpain-1 activity led to a less severe renal inflammatory response, as suggested by our findings in mice with genetically induced calpain-1 overactivity because of the deficiency in the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Calpain hyperactivity promoted 10-fold higher renal F4/80+ macrophage infiltration in the CAST −/− ApoE −/− mice, leading to significantly increased α SMA+ myofibroblasts, increased GBM/TBM destruction, and extensive kidney function loss (Figure 9).

Schematic summary of the nAChR α 1-calpain pathways involved in hypercholesterolemic CKD. The muscle-type nicotinic receptor (nAChR α 1) has two known endogenous ligands: the uPA and acetylcholine. On ligation the receptor transforms into a calcium channel, which subsequently activates the intracellular calcium-dependent cysteine protease calpain-1. The activated calpain-1 promotes cell motility, perhaps by cleaving cytoskeleton–integrin linking proteins such as talin and liberating cell surface integrins (eg, CD11b/CD18). Calpain-1 hyperactivity significantly accelerates renal macrophage recruitment in the mouse model of hypercholesterolemic CKD. The persistently accumulated renal macrophages, through autocrine or interactions with kidney-resident cells (paracrine), produce various destructive molecules such as chemokines (eg, MCP-1 and OPN), cytokines (eg, TGF- β ), and metalloproteinases (eg, MMP-2 and MMP-9). These molecules further enhance renal inflammation, degrade the collagen components of GBM/TBM, and promote the matrix-producing myofibroblasts by transforming mesangial cells and pericytes, or by activating interstitial fibroblasts. The nAChR α 1-regulated calpain-1 activity may also be involved in the lipid-uptake process by macrophages and kidney-resident cells. These destructive events ultimately lead to significant clinical proteinuria and kidney function loss. MCP-1, makrofag-kemoattraktantprotein-1; OPN, osteopontin; TGF- β , transforming growth factor- β ; MMP, metalloproteinase; SCr, serum creatinine; BUN, blood urea nitrogen; GBM/TBM, glomerular and tubular basement membranes.

Bild i full storlek

Calpains are intracellular calcium-activated, nonlysosomal cysteine proteases that cleave cytoskeletal and submembranous proteins. The calpain system consists of two ubiquitous forms of calpain (calpain-1 or μ -calapin and calpain-2 or m-calpain), a tissue specific calpain (n-calpain), and a single known endogenous calpain inhibitor (calpastatin). Calpains participate in a variety of cellular functions, including regulation of cytoskeletal structures, cell-cycle progression, and cell spreading, adhesion and migration. 40, 41, 42, 43 For instance, with the use of in vivo experiments McDonald et al 44 and Chatterjee et al 45 showed that the calpain inhibitor, N -acetyl-Leu-Leu-norleucinal, protected multiple organs from failure following hemorrhagic shock and reduced renal injury induced by ischemia/reperfusion. We have further addressed in this study that renal calpain-1 activation is, at least in part, regulated by the nAChR α 1 receptor, which promotes the macrophage inflammation and disease progression in the experimental model of hypercholesterolemic CKD. The changes in calpain-1 activity, either downregulated by nAChR α 1 silencing, or upregulated by calpastatin deficiency, respectively improved or intensified the macrophage inflammatory response and overall kidney damage. Previous studies suggest that calpain-1 regulates the inflammatory response by promoting inflammatory cell migration and proinflammatory cytokines production. 18, 19, 20 Cell migration is a dynamic process that requires temporal and spatial regulation of integrin activation and focal adhesion assembly/disassembly. Talin is an actin and integrin tail-binding protein found in variety of tissues and cell types. Proteolysis of talin by calpain is essential for integrin activation, including leukocyte/macrophage CD11b/CD18 liberation and focal adhesion formation. 30 Calpain-1 is also vitally involved in endocytosis; 46 the cellular process macrophages and other types of cells use to uptake lipids.

Myofibroblasts are characterized as fibroblasts that have acquired myocyte characteristics such as contractile properties and α SMA expression. They are thought to be the primary source of the scar-forming extracellular matrix proteins in many solid organs, including kidneys. The density of glomerular or interstitial myofibroblasts is highly correlated with the decline of kidney functions in patients with CKD. 47 The de novo appearance of glomerular α SMA+ cells is thought to be due to a transformation of activated mesangial cells. 48 Interstitial myofibroblasts are derived from either activated peritubular/perivascular fibroblasts, or transformed pericytes and tubular epithelial cells. 30 Pericytes are considered tissue-specific mesenchymal stem cells, with the potential to transdifferentiate into other functional mesenchymal cell types, such as the collagen-synthesizing myofibroblasts. 49 It has been argued recently, by a fate-tracing study, 50 that pericytes and perivascular fibroblasts rather than epithelial cells are the primary source of myofibroblasts in kidney fibrosis. The molecular basis of renal myofibroblast accumulation remains poorly understood. Growth factors such as TGF- β and members of the urokinase system have been shown to participate. 8, 47 Disruption of the basement membrane is a key step in initiating the transformative process of glomerular or interstitial cells. 51 This study has shown that cellular receptor nAChR α 1 and its downstream activation of calpain-1 may be implicated in promoting the myofibroblast phenotypic transformation directly or indirectly, through TGF- β production and/or basement membrane destruction. 24, 30, 51

Overall, the study demonstrates a unique relationship between the muscle type nicotinic receptor, nAChR α 1, and the downstream activation of calpain-1 on the development of the hypercholesterolemia-induced nephropathic inflammatory response. Developing a more thorough understanding of the inflammatory-promoting mechanism by which the nAchR α 1-calpain-1 activation conduit acts will better our understanding of CKD, and could lead to more targeted anti-inflammatory pharmaceuticals. In addition, as both the receptor and calpain-1 are involved in other disease pathologies, continued research on this new inflammatory-promoting pathway will be relevant to inflammatory disorders beyond the scope of CKD.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen för laboratorieundersökningar (//www.laboratoryinvestigation.org)