Nf-κb signalering reglerar cell-autonom reglering av cxcl10 i bröstcancer 4t1-celler | experimentell & molekylär medicin

Nf-κb signalering reglerar cell-autonom reglering av cxcl10 i bröstcancer 4t1-celler | experimentell & molekylär medicin

Anonim

ämnen

  • Bröstcancer
  • Extracellulära signalmolekyler

Abstrakt

Chemokinet CXCL10 och dess receptor CXCR3 spelar en roll i bröstcancermetastas till ben- och osteoklastaktivering. Mekanismen för CXCL10 / CXCR3-inducerad intracellulär signalering har emellertid inte undersökts helt. För att utvärdera CXCL10-inducerade cellulära händelser i bröstcancercellinje 4T1 för mus utvecklade vi en ny syntetisk CXCR3-antagonist JN-2. I denna studie observerade vi att utsöndring av CXCL10 i supernatanten från 4T1-celler gradvis ökades under celltillväxt. JN-2 inhiberade basal och CXCL10-inducerad CXCL10-expression och cellmotilitet i 4T1-celler. Behandling av 4T1-celler med CXCL10 ökade uttrycket av P65, en underenhet av NF-KB-banan, via aktivering av NF-KB-transkriptionell aktivitet. Ektopisk överuttryck av P65 ökade CXCL10-sekretion och trubbade JN-2-inducerad undertryckning av CXCL10-sekretion, medan överuttryck av IKBa undertryckte CXCL10-sekretion. Dessa resultat indikerar att CXCL10 / CXCR3-axeln skapar en positiv återkopplingsslinga genom den kanoniska NF-KB-signalvägen i 4T1-celler. Dessutom inhiberade behandling av osteoblaster med konditionerat medium från JN-2-behandlade 4T1-celler uttrycket av RANKL, ett avgörande cytokin för osteoklastdifferentiering, vilket resulterade i en hämmande effekt på osteoklastdifferentiering i samkultursystemet från benmärgs-härledda makrofager och osteoblaster. Direkt intrafemoral injektion av 4T1-celler inducerade allvarlig benförstörelse; emellertid dämpades denna effekt av CXCR3-antagonisten via nedreglering av P65-expression i en djurmodell. Sammantaget antyder dessa resultat att den CXCL10 / CXCR3-medierade NF-KB signaliseringsvägen spelar en roll i kontrollen av autonom reglering av CXCL10 och maligna tumöregenskaper i bröstcancer 4T1-celler.

Introduktion

Tumörens mikromiljö bidrar till de maligna egenskaperna hos cancerceller genom att upprätthålla tumörtillväxt och metastas. Ben kännetecknas väl som ett föredraget metastaserande ställe för bröstcancer, och benmetastas inducerar följaktligen osteolytiska lesioner genom interaktioner mellan cancerceller och benmärgsmikromiljö. 1, 2 Utvecklingen av osteolytisk benmetastas är förknippad med kolonisering av cancerceller till ben och produktion av osteolytiska faktorer av cancerceller, vilket inducerar osteoklastmedierad benresorption och förstörelse. 3, 4 Tillväxtfaktorer från den nedbrutna benmatrisen stimulerar därefter tumörtillväxt, vilket resulterar i en ond cirkel i benmetastas. Benmetastas är en avancerad cancer som inducerar bräckligt ben, smärta och ryggmärgskomprimering. 5

Chemifinätverkets multifunktionella roller i tumörer är väl etablerade. 6, 7, 8 Faktiskt kännetecknades kemokiner ursprungligen inte bara i leukocytadhesion och migration under olika fysiologiska och patologiska tillstånd utan också i hematopoies, lymfocytutveckling och sårläkning. 9, 10 Men ökande bevis tyder på att kemokiner och deras receptorer spelar en roll vid tumörinitiering, progression och metastaser eftersom invasion och metastas av cancerceller delar många likheter med processen för leukocytinfiltrering. 9, 11, 12 Interaktioner mellan kemokiner och deras receptorer, såsom CXCL12 med CXCR4, spelar en avgörande roll för att bestämma det metastatiska stället för bröstcancer för flera organ. 13, 14 På liknande sätt spelar interaktionen mellan CXCL10 och CXCR3 också en viktig roll i metastaser i olika cancerceller, inklusive kolorektal karcinomceller, bröstcancer, koloncancer, melanom och gliom. 15 Uttrycksprofiler för kemokinreceptorer indikerar att både CXCR3 och CXCR4 är signifikant ökade i kolorektal levermetastaser jämfört med motsvarande primär kolorektal cancer. 16 andra par, såsom CCL21 / CCR7, är också etablerade i cancermetastas. 17 Samlade bevis tyder därför på att interaktion mellan kemokiner och deras receptorer främjar maligna tumöregenskaper.

CXCL10, även känt som interferon-gamma-inducerat protein 10 (IP-10), kännetecknas väl som en kemoattraktant för immunceller, såsom T-lymfocyter och monocyter, vid aktivering av dess receptor, CXCR3. 18 Vid inflammatoriska tillstånd utsöndras CXCL10 från olika celler, inklusive monocyter, endotelceller, fibroblaster och keratinocyter, som svar på interferon-gamma. 19 Dessutom observerade vi att melanomceller utsöndrar högre nivåer av CXCL10 än makrofager. 20 Även om interferon-gamma är en viktig inducerare av CXCL10-expression, har mekanismen genom vilken högt uttryck av CXCL10 upprätthålls i cancerceller inte lyckats belyst helt. En tidigare rapport observerade att CXCL10-induktion drivs av tumörnekrosfaktor a (TNFa) -inducerad NF-KB-transkriptionell aktivering i endotelceller. 21 I mikroglia-celler sker CXCL10-expression genom p38 / MAPK, JNK / MAPK och NF-KB-kaskaden. 22 NF-KB binder faktiskt till det KB2-bindande stället för CXCL10-promotorn som innehåller en homodimer av P65. 23

I den aktuella studien syftade vi till att belysa verkan av CXCL10 på CXCR3-medierad NF-kB-signalering i bröstcancer 4T1-celler. Dessutom utvärderade vi vår nyutvecklade CXCR3-antagonist, JN-2, i CXC10 / CXCR3-medierad intracellulär signalering och bedömde dess potential i 4T1-celler. Våra resultat kommer att ge insikt i kemokinernas grundläggande roll i cancer, som senare kommer att belysa vilka kemokinförmedlade cellulära händelser som är viktiga för maligna tumöregenskaper.

Material och metoder

Biologiska föreningar

CXCR3-antagonisten N - (4- (5-klorbenso [d] oxazol-2-ylamino) fenyl) -4-aminobutanamid (JN-2) syntetiserades och renades såsom beskrivits i de kompletterande materialen. AMG 487 erhölls från Tocris Bioscience (Ellisville, MO, USA).

Reagens och antikroppar

Rekombinant mus CXCL10 erhölls från PeproTech EC (London, Storbritannien). För att detektera specifikt proteinuttryck med Western blot köpte antikroppar mot P65 (kat. # 8242), IKBa (kat. # 4812) och a-tubulin (kat. # 2144) från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antikroppar mot Lamin B (kat. # Sc-6217) köptes från Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Antikroppen mot p-aktin (kat. # A5441) erhölls från Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Sekundära antikroppar konjugerade med pepparrotsperoxidas köptes från Sigma-Aldrich.

Djurförsök

Alla djurförfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna från djurvårdskommittén vid Institute of Laboratory Animal Resources vid Seoul National University (Seoul, Korea). Sex veckor gamla BALB / c-möss av honkön (Orient Bio Inc., Seoul, Korea) injicerades intraperitonealt med DMSO eller JN-2 (10 mg kg −1 kroppsvikt) varannan dag med start 7 dagar före 4T1-injektion ( n = 7 per grupp). Sedan uppsamlades 4T1-celler från subkonfluentkulturer, tvättades med PBS två gånger och återsuspenderades i PBS. En mängd av 1 x 104 celler i 5 pl PBS injicerades i femoralmärgsutrymmet genom femoral kondylen med användning av en 30-gauge Hamilton spruta. Alla möss dödades på dag 21 efter 4T1-injektion. Lårbenen frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C för RNA-extraktion eller fixerades i 4% paraformaldehyd för mikrokomputerad tomografi (μCT) och histologiska studier.

Benarkitekturen i lårbenet analyserades med högupplöst μCT (SMX-90CT-system; Shimadzu, Kyoto, Japan). Skannade bilder från μCT rekonstruerades med programmet VG Studio MAX 1.2.1 (Volume Graphics, Heidelberg, Tyskland). De tredimensionella bilderna användes för att mäta benvolym, kortikala benvolym och trabekulärt antal med programmet TRI / 3D-VIE (RATOC System Engineering, Kyoto, Japan).

Histologi

Histomorfometrisk analys utfördes med användning av lårben som avkalificerats med 12% EDTA under 3 veckor och inbäddade i paraffin. Efter att 5 mikrometer histologiska sagittalsektioner gjordes färgades femyr med tartratresistent syrafosfatas (TRAP) -lösning (Sigma-Aldrich) eller hematoxylin och eosin (H&E) -lösning (Sigma-Aldrich). Osteoklastnummer mättes med användning av OsteoMeasure XP-programmet (version 1.01; OsteoMetrics, Decatur, GA, USA).

För immunohistologisk analys delades paraffininbäddade prover i 5 mikrometer tjocklek och monterades på silanbelagda objektglas (Muto-Glass; Tokyo, Japan). Deparaffinisering utfördes i xylen, en xylen / etanolblandning och serieetanolutspädningar. För antigenutvinning inkuberades sektioner med 10 m M citrat (pH 6, 0) innehållande 0, 05% Tween-20 under 20 min vid 80 ° C följt av en PBS-tvätt innehållande 0, 05% Tween-20. Sektioner förinkuberades sedan med blockerande buffert innehållande 5% getserum, 0, 05% natriumazid och 0, 1% Triton X-100 i PBS under 45 minuter vid rumstemperatur och inkuberades över natten vid 4 ° C med anti-P65-antikropp (Cell Signaling Technology i PBS innehållande 1% getserum, 0, 05% natriumazid och 0, 02% Tween-20. Immunfarvning utfördes enligt tillverkarens instruktioner med användning av ChemMate Dako Envision Detection-kit, Peroxidase / DAB, Rabbit / Mouse (DakoCytomation, Glostrup, Danmark).

Celler och kultursystem

4T1-bröstcancercellinjen från mus erhölls från American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) och odlades i RPMI komplett medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 50 enheter ml −1 penicillin och 50 μg ml - 1 av streptomycin. Benmärgsceller erhölls genom spolning av benmärg från femuren gamla BALB / c-möss, och icke-vidhäftande benmärgsceller odlades med M-CSF (60 ng ml-1) under 3 dagar för att generera benmärg -levererade makrofager (BMM) som tidigare beskrivits. 24 För att differentiera osteoklaster odlades BMM (4 × 104 celler per brunn) i vävnadsodlingsplattor med 48 brunnar med a-minimum essentiellt medium (a-MEM) inklusive M-CSF (60 ng ml −1 ) och RANKL (100 ng ml −1 ) i 4 dagar i kulturrätter med 48 brunnar. Det kompletta mediet ändrades den tredje dagen. Osteoklaster tvättades med PBS, fixerades med 3, 7% formalin under 10 minuter, permeabiliserades med 0, 1% Triton X-100 och färgades sedan för TRAP (Sigma-Aldrich). Samodlingssystemet utfördes genom odling av BMM (1 x 105 celler per brunn) och primära osteoblaster (2 × 104 celler per brunn) i 48-brunnars (1 ml per brunn) vävnadskulturplattor under 9 dagar i a- MEM. I slutet av odlingsperioden färgades cellerna av TRAP såsom beskrivits ovan.

Motilitetsanalys

En repande sårläkningsanalys utfördes på monolager av sammanflytande 4T1-celler skrapade med en p200-pipettspets, och sedan ersattes mediet med RPMI komplett medium innehållande den indikerade dosen DMSO eller JN-2 och PBS eller mCXCL10. Faskontrastbilder erhölls efter repning och efter 24 timmars inkubation vid 37 ° C. Transwell-analyser utfördes med användning av den övre kammaren (8 um pormembran; Corning, NY, USA). I korthet sås 4T1-celler (5 x 104) på ​​transwell-övre kammaren med komplett RPMI-medium, och de nedre kamrarna behandlades med DMSO eller JN-2 och PBS eller mCXCL10 med RPMI komplett medium. Efter 24 timmars inkubation avlägsnades icke-migrerade celler från toppen av de övre membranen och migrerade celler fixerades med 3, 7% formalin under 10 minuter och färgades med H&E-lösning under 1 min.

Beredning av konditionerat medium och ELISA

I korthet odlades 4T1-celler (1 x 105 celler per brunn) i kompletta RPMI-media på vävnadsodlingsplattor med sex brunnar under 12 timmar och behandlades sedan med DMSO eller JN-2 såsom indikerades. Efter 24 timmars inkubation skördades supernatanten av konditionerat medium (CM), centrifugerades vid 2000 rpm i 5 minuter och förvarades vid -80 ° C. Det utsöndrade CXCL10 i cellodlingsmediet mättes med användning av motsvarande ELISA-kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Serumpyridinolin (PYD) bestämdes med Metra Serum PYD EIA-kit (Quidel Corporation, San Diego, CA, USA).

Cellviabilitetsanalys

I korthet odlades 4T1-celler (1 x 104 celler per brunn) i kompletta RPMI-medier på odlingsplattor med 96 brunnar under 12 timmar, och mediet utbyttes med DMSO eller de indikerade doserna av JN-2. Efter 24 timmars inkubation tillsattes 10 ul EZ-Cytox-lösning (Daeillab Service, Seoul, Korea) till varje brunn på plattan och inkuberades vid 37 ° C i 2 timmar. Absorbans mättes med spektrofotometri (Mutiskan FC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) vid 450 nm.

Western blot

För Western blot-provframställning lyserades cellerna på is i en buffert innehållande 20 m M Tris-HCl, 150 m M NaCl, 1% Triton X-100, proteasinhibitor och fosfatasinhibitor (Sigma-Aldrich). Efter 30 minuters lysering avlägsnades cellulära skräp genom centrifugering vid 13 200 rpm under 15 minuter. Proteinkoncentrationer av lysater bestämdes med användning av DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De extraherade proteinerna (10-30 μg) separerades genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores och elektrotransfererades till polyvinylidendifluoridmembran (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buckinghamshire, UK). Membran blockerades med 5% skummjölk och proteiner detekterades genom att fästa de indikerade primära antikropparna över natten. Sekundära antikroppar konjugerade med pepparrotsperoxidas användes för blotting och visualiserades genom en kemiluminescensreaktion med användning av ECL-reagens (GE Healthcare). För cytoplasmisk och kärnfraktionering lyserades cellerna på is med 50 m M Tris-Cl, 2 m M EDTA, 0, 1% NP-40, 10% glycerol och proteasinhibitor. Efter 5 minuters lysering centrifugerades proverna under 5 minuter vid 4000 varv per minut. Cytoplasmatiska supernatanter lagrades omedelbart och kärnpellets extraherades ytterligare i lysbuffert innehållande 20 m M Hepes – KOH, 150 m M NaCl, 2 m M EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 25 m M p-glycerofosfat och proteasinhibitor. Efter 10 min lysering centrifugerades kärnor vid 15 000 varv per minut och supernatanten uppsamlades. Kärnfraktioner (5 μg) och cytoplasmatiska (10 μg) fraktioner utsattes för Western blot såsom beskrivits ovan.

Genöverföring och reporteranalys

Gener för human RELA / P65 (NCBI Reference Sequence NM_021975.3) med en FLAG-tagg och human NFKBIA / IKBa (NCBI Reference Sequence NM_020529.2) med en FLAG-tagg klonades in i pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmiderna (1-2 μg) transfekterades transient under 6 timmar med användning av Genjet-transfektionsreagens (SignaGen, Gaithersburg, MD, USA) enligt tillverkarens instruktioner. För reporteranalysen klonades fyra kopior av NF-KB-konsensusstället (5'-GGGAATTTCC-3 ') i pGL3-luciferasreportervektorn (Promega, San Luis Obispo, CA, USA). Dessutom transfekterades 4T1- eller MDA-MB-231 (kompletterande figur 2) celler transient i sex-brunnsodlingsplattor med NF-KB-luciferasreportervektor (1 μg) under 6 timmar. Cellerna behandlades med CXCL10 eller JN-2 under 24 timmar efter transfektion. Luciferasaktivitet mättes med användning av dual-luciferas-analyssystemet (Promega) enligt tillverkarens instruktioner.

PCR i realtid

Totalt cellulärt RNA extraherades med användning av TRIzol-reagens (Invitrogen) och första-strängade cDNA: er syntetiserades från 2 ug RNA med användning av SuperScript II Preamplification System (Invitrogen). Relativa mRNA-nivåer bestämdes med användning av ABI Prism 7500 sekvensdetekteringssystem med SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) såsom tidigare beskrivits. 25 Uttryck av målgener bestämdes enligt 2-ΔΔCT-metoden med användning av GAPDH som referensgen. Följande primersekvenser användes: RANKL F: 5'-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 'och R: 5'-CATTGATGGTGAGGTGTGCA-3'; OPG F: 5′-TGGAACCCCAGAGCGAAACA-3 ′ och R: 5′-GCAGGAGGCCAAATGTGCTG-3 ′; CXCL10 F: 5'-ACTCCCCTTTACCCAGTGGA-3 'och R: 5'-GGACCATGGCTTGACCATCA-3'; GAPDH F: 5′-GAGAGTGTTTCCTCGTCCCG-3 ′ och R: 5′-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3 ′.

Statistisk analys

Alla kvantitativa data representeras som medelvärdet ± sd ( n 3). Tvågruppsjämförelser analyserades med Studentens t- test. P- värden <0, 05 ansågs vara signifikanta.

Resultat

Utformningen av JN-2

Vi utvecklade en ny syntetisk CXCR3-antagonist JN-2 för utvärdering av dess funktion på bröstcancerceller. För att utveckla JN-2 syntetiserade vi bensoxazolderivat och utvärderade deras biologiska aktiviteter som rapporterats i våra tidigare studier. 26, 27, 28, 29 På grundval av resultaten från screening med hög genomströmning 30 från Abbot Laboratories att förening a (figur 1) är effektiv som en CXCR3-antagonist, designade vi vår förening b, där bensoxazol förväntades fungera som en isoster av bensimidazol. Förening b visade effektiv CXCR3-antagonistisk aktivitet. 31 Förening b modifierades ytterligare till JN-2 (förening c), som innehåller en amidsidokedja för att härma den välkända CXCR3-antagonisten AMG 487 (förening d), en liten molekylär antagonist som har utvärderats i kliniska fas IIa-studier. 32

Strukturer för små molekylen CXCR3-antagonister. Strukturerna för de små molekylära CXCR3-antagonisterna förening a, förening b, förening c (JN-2) och förening d (AMG 487) presenteras.

Bild i full storlek

JN-2 hämmar CXCL10-expression i 4T1-celler

Vi mätte först utsöndrat CXCL10, en ligand för CXCR3, innan vi undersökte den biologiska effekten av JN-2 på 4T1-celler. Utsöndrade CXCL10-nivåer ökades i 4T1-celler under celltillväxtperioden (figur 2a). Vi undersökte sedan effekterna av JN-2 på cellviabilitet. Behandling med olika doser av JN-2 under 24 timmar förändrade inte livslängden på 4T1-celler (figur 2b). Därefter ifrågasatte vi om behandling med JN-2 skulle påverka CXCL10-uttryck under en 24-timmars kulturperiod. Intressant nog undertryckte JN-2 CXCL10 mRNA-uttryck på ett dosberoende sätt (figur 2c). Vi observerade faktiskt att den välkända CXCR3-antagonisten AMG 487 också reducerade CXCL10 mRNA-uttryck i 4T1-celler (kompletterande figur 1). För att bekräfta om reducerat CXCL10-mRNA-uttryck påverkar dess sekretionsnivå, mätte vi mängden CXCL10 i den odlade supernatanten från 4T1-celler. JN-2 undertryckte sekretionsnivån för CXCL10 under 12 och 24 timmar av odling (figur 2d). Därefter undersökte vi om CXCL10 utövade en effekt på endogent mRNA-uttryck i 4T1-celler. Stimulering av 4T1-celler med CXCL10 ökade sitt mRNA-uttryck (figur 2e). Vi observerade vidare att ökningen av CXCL10-mRNA-uttryck inducerat genom CXCL10-stimulering effektivt inhiberades av JN-2 (figur 2f). Dessa data antydde att utsöndring av CXCL10 kan bidra till endogent CXCL10-uttryck genom dess receptor CXCR3.

Antagonism av CXCR3 hämmar CXCL10-expression i 4T1-celler. ( a ) 4T1-celler odlades under de angivna tiderna och utsöndrade CXCL10-nivåer mättes med ELISA (* P <0, 05, ** P <0, 01). ( b, c ) 4T1-celler odlades under 24 timmar med DMSO eller olika doser av JN-2. Efter odling analyserades cellviabilitet ( b ) och CXCL10 mRNA-nivåer ( c ) med EZ-Cytox-analyspaket respektive realtids-PCR (* P <0, 05). ( d ) 4T1-celler odlades med DMSO eller JN-2 (10 um) under 12 eller 24 timmar, och CXCL10-produktion mättes (* P <0, 05, ** P <0, 01). ( e ) 4T1-celler odlades med olika doser av mCXCL10 under 24 timmar, CXCL10-mRNA-nivåer analyserades (* P <0, 05). ( f ) 4T1-celler odlades med mCXCL10 (300 ng ml-1) ensam eller tillsammans med JN-2 (10 um) under 24 timmar, och CXCL10-mRNA-nivåer analyserades (* P <0, 05).

Bild i full storlek

Undertryckande av 4T1-rörlighet av JN-2

CXCL10 och dess receptor CXCR3 är avgörande faktorer för migration och metastas i olika cancerceller. 33 För att undersöka den hämmande effekten av CXCR3-antagonisten JN-2 på 4T1-cellens rörlighet utfördes sårläkningsanalysen. Stimulering med CXCL10 ökade 4T1-cellmigrationen till den denuded zonen efter 24 timmars inkubation (figur 3a). Emellertid undertryckte behandling med JN-2 CXCL10-inducerad migration och till och med den basala migrationsförmågan hos 4T1-celler. För att ytterligare undersöka effekten av CXCR3-antagonisten JN-2, bedömde vi migrationspotentialen för 4T1-celler med hjälp av en transwellmigreringsanalys. Medium innehållande CXCL10 i botten av migreringskammaren inducerade effektivt 4T1-cellmigrering vid den övre kammaren (figur 3b). Emellertid inhiberade JN-2-innehållande medium i bottenkammaren 4T1-cellmigrering med eller utan CXCL10. Dessa resultat tyder på att 4T1 bröstcancerceller kräver CXCR3 för att få sin basala rörlighet.

Antagonism av CXCR3 hämmar 4T1-rörlighet. ( a ) Monolager av sammanflytande 4T1-celler repades. Efter odling i 24 timmar med media innehållande DMSO eller JN-2 (10 μM) och PBS eller mCXCL10 (300 ng ml −1 ) analyserades celler som migrerade till den denuded zonen (* P <0, 05). Skalstången är 200 μm. ( b ) 4T1-celler i medium placerades i den övre kammaren och medium innehållande CXCL10 (300 ng ml-1) eller JN-2 (10 μM) placerades i bottenkammaren. Efter 24 timmars inkubation färgades migrerade celler med H&E och analyserades (* P <0, 05). Skalstången är 500 μm.

Bild i full storlek

CXCL10 / CXCR3 inducerar aktivering av NF-KB signalering

För att hantera mekanismen genom vilken 4T1 reglerar CXCL10-uttryck åtföljt av rörlighet undersökte vi effekterna av CXCL10 på uttrycket av NF-kB-underenheten P65, en av de mycket uttryckta transkriptionsfaktorerna i cancerceller. 34, 35 CXCL10 inducerade en uppreglering av P65 i 4T1-celler efter 24 timmars stimulering, medan den hämmande underenheten IBBa nedreglerades (figur 4a). Vi undersökte vidare effekten av CXCL10 på transkriptionell aktivering av NF-kB-aktivitet genom att använda en luciferasreportergen under kB-promotorn. CXCL10-stimulering inducerade transkriptionell aktivitet av NF-KB (figur 4b). För att undersöka om blockering av CXCL10-receptorn CXCR3 av dess antagonister reglerar uttrycket av P65, odlade vi 4T1-celler i närvaro av JN-2 eller AMG 487. Som förväntat, behandlade CXCR3-antagonister under 24 timmar P65-uttryck men ökade IKBa-uttrycket (Figur 4c). Dessutom dämpades både basal och CXCL10-inducerad transkriptionell aktivering av NF-KB med JN-2 (figur 4d). För att undersöka effekten av CXCL10 och JN-2 på den kanoniska NF-KB-vägen, behandlades 4T1-celler med DMSO eller JN-2 i serumfritt medium under 1 timme och stimulerades sedan med CXCL10. DMSO-behandlade 4T1-celler uppvisade ökad P65-kärntranslokation inom 30 minuter som svar på CXCL10-stimulering (figur 4e). Vi observerade dock att förbehandling med JN-2 minskade markant både basal och CXCL10-inducerad kärntranslokation av P65. Detta resultat antyder att CXCL10-inducerad aktivering av NF-KB-banan kräver CXCR3. För att bestämma rollen för p65 i CXCL10-uttryck transfekterade vi transient flagg-taggade pcDNA3 eller pcDNA3-P65 (P65) i 4T1-celler. Behandling med JN-2 under 24 timmar undertryckt P65-uttryck (figur 4f). Tvångsuttryck av P65 upphävde emellertid de hämmande effekterna av JN-2 på P65-expression. Därefter undersökte vi om P65 står för den hämmande effekten av JN-2 på CXCL10-uttryck. Vi fann att den hämmande effekten av JN-2 på CXCL10-utsöndring väsentligen blockerades av tvingat uttryck av P65 (figur 4g). Dessa resultat indikerade att CXCL10-inducerad P65-aktivering stimulerar CXCL10-expression. Dessutom antagade vi att JN-2-inducerat IKBa-uttryck kan undertrycka NF-kB-signalaktivering och P65-inducerat CXCL10-uttryck. Vi undersökte sedan rollen för IκBa i CXCL10-uttryck och NF-KB transkriptionell aktivitet. Övergående transfektion av IBBa inhiberade expression av P65, CXCL10-sekretion och NF-KB transkriptionell aktivitet i 4T1-celler (figur 4h och i). Dessa data antyder att CXCL10-inducerat P65-uttryck reglerar CXCL10-sekretion via kanonisk NF-KB transkriptionell aktivering.

CXCL10 reglerar aktiveringen av kanonisk NF-KB signalering via CXCR3. ( a ) 4T1-celler odlades med de angivna doserna av mCXCL10 under 24 timmar. Totala celllysat utsattes för western blotting med de indikerade antikropparna. ( b ) 4T1-celler transfekterades transient med NF-KB-reportervektor under 6 timmar. Efter inkubering med PBS eller mCXCL10 under 24 timmar utfördes luciferasanalysen (** P <0, 01). ( c ) 4T1-celler odlades med de angivna doserna av JN-2 eller AMG 487 under 24 timmar. Totala celllysat utsattes för western blotting med de indikerade antikropparna. ( d ) 4T1-celler transfekterades med NF-KB reportervektor under 6 timmar. Efter inkubering med DMSO eller JN-2 (10 mikrometer) under 24 timmar utfördes luciferasanalys (* P <0, 05). ( e ) 4T1-celler odlades med DMSO eller JN-2 (10 mikrometer) under 1 timme i serumfritt medium och behandlades med mCXCL10 (300 ng ml-1) under de angivna tiderna. Efter nukleär och cytosolisk fraktionering utsattes lysater för westernblotting med de indikerade antikropparna. ( f, g ) 4T1-celler transfekterades transient med pcDNA3-Flagg-tom eller pcDNA3-Flag-P65 under 6 timmar. Transducerade celler inkuberades ytterligare med DMSO eller JN-2 (10 um) under 24 timmar. Efter odling analyserades celllysat och CXCL10-proteinsekretion genom western blotting med de indikerade antikropparna ( f ) och ELISA ( g ; * P <0, 05). ( h ) 4T1-celler transfekterades med pcDNA3-Flagg-tom (Veh) eller pcDNA3-Flag-IKBa (Flag-IKBa) under 6 timmar. Efter inkubering med färskt medium under 24 timmar analyserades celllysat och CXCL10-proteinsekretion genom western blotting med de indikerade antikropparna (vänster) och ELISA (höger; * P <0, 05). ( i ) 4T1-celler samtransfekterades med NF-KB-reportervektorn med pcDNA3-Flaggtöm (Veh) eller pcDNA3-Flag-IKBa (Flag-IKBa) under 6 timmar. Efter inkubering med färskt medium under 24 timmar utfördes luciferasanalysen (** P <0, 01).

Bild i full storlek

Administration av JN-2 förhindrar 4T1-medierad benförstörelse

CXCR3-uttryck i cancerceller är implicerat i osteolytisk benmetastas. 20 Vi undersökte därför effekterna av CXCR3-antagonisten JN-2 på osteolytisk benmetastas av bröstcancer. Vi utförde en intrafemoral injektion av 4T1 i kvinnliga BALB / c-möss ( n = 7 per grupp) för att generera benmetastaser. H&E-färgning och μCT avslöjade allvarlig förstörelse av ben i 4T1-injicerat femur med DMSO jämfört med kontrollmöss (figur 5a). Dessutom uppvisade DMSO-injicerade möss omfattande tumörspridning även på den yttre ytan av benet. Emellertid inhiberade injektion av JN-2 den omfattande 4T1-inducerade förstörelsen av ben. Vi observerade att 4T1-inducerad förstörelse av kortikalt och trabekulärt ben inhiberades av JN-2 jämfört med DMSO-injicerade möss (figur 5b). I överensstämmelse med detta fynd ökades serum-PYD-nivåer, en markör för benresorption, med 4T1-celler, vilka signifikant hämmades genom JN-2-behandling (figur 5c). Med tanke på att JN-2 reducerade P65-uttryck in vitro , bedömde vi ytterligare P65-uttryck i benområdet i bröstcancerceller. Vi observerade komplexa interaktioner mellan 4T1-celler och benmärgsceller med högt P65-uttryck (brunt) i de DMSO-injicerade mössen (figur 5d, överst). Dessutom fann vi att tumörer i den yttre ytan av kortikala ben uppvisade reducerat P65-uttryck jämfört med tumörer i benmärgen. När det gäller JN-2-injicerade möss såg vi också P65-uttryck i tumörområdet; emellertid delades tumör- och märgsregionen med lägre P65-uttryck i benmärgsområdet jämfört med DMSO-injicerade möss (figur 5d, botten). För att ta itu med om den inhiberande effekten av JN-2 på benförstörelse orsakades av hämning av osteoklastbildning, analyserade vi osteoklastnummer vid tumör-bengränssnittet. Vi observerade ett reducerat antal osteoklaster i JN-2-behandlade möss jämfört med de DMSO-behandlade mössen (figur 5e). Vi undersökte nästa CXCL10 och RANKL-uttryck i benvävnader och observerade den hämmande effekten av JN-2 på 4T1-inducerad uppreglering av CXCL10 och RANKL-uttryck (figur 5f).

JN-2 hämmar 4T1-inducerad benförstörelse. Sex veckor gamla BALB / c ( n = 7) honmöss injicerades intraperitonealt med DMSO eller JN-2 (10 mg kg −1 kroppsvikt) varannan dag före injektion av 4T1. Efter 7 dagar injicerades 4T1-celler (1 x 104 celler i 5 ul PBS) in i femoralmärgsutrymmet genom femoral kondylen med en 30-gauge Hamilton-spruta. Därefter injicerades DMSO eller JN-2 intraperitonealt varannan dag under 21 dagar. ( a ) Lårbenen undersöktes genom histologisk snittning med H&E-färgning (överst) och μCT-analys (botten och höger; * P <0, 05, ** P <0, 01). ( b ) Lårbenen analyserades ytterligare med avseende på kortikal benvolym (vänster) och trabekulärt antal (höger). * P <0, 05, ** P <0, 01. Skalstången är 1 mm. ( c ) Serum PYD-nivåer mättes med ELISA (* P <0, 05, ** P <0, 01). ( d ) Histologiska sektioner av lårbenen immunfärgades med anti-P65-antikropp (brun). T, tumör; M, märg. Skalstången är 500 μm (vänster) och 100 μm (höger). ( e ) Histologiska sektioner färgades för TRAP-aktivitet för att detektera osteoklastceller och TRAP-positiva celler analyserades (* P <0, 05). T, tumör; B, ben. Skalstången är 200 μm. ( f ) Totalt RNA extraherades från lårbenen och CXCL10- och RANKL-mRNA-nivåer analyserades genom realtids-PCR (* P <0, 05).

Bild i full storlek

JN-2 hämmar osteoklastdifferentiering indirekt

Våra resultat av de hämmande effekterna av JN-2 på tumörutveckling och osteoklastbildning i ben ledde till att vi undersökte den mekanism som ligger till grund för den inhiberande verkan av JN-2 på osteoklastbildning. Vi rapporterade tidigare att CXCL10 inte påverkar RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering från dess föregångare. 20 I överensstämmelse med detta konstaterande påverkade JN-2 inte RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering i BMM-kulturer (data visas inte). CM erhållen från 4T1-cellkulturer uppvisade ökad RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering i BMM, som inte påverkades av JN-2 (figur 6a). Dessa resultat höjde möjligheten att JN-2 kan hämma osteoklastdifferentiering indirekt genom att påverka förmågan hos osteoblast-linjeceller att stimulera osteoklastdifferentiering. Således undersökte vi nästa uttrycket av RANKL och dess lokkreceptor OPG i osteoblaster. CXCL10 inducerade RANKL-uttryck i osteoblaster; emellertid påverkade JN-2 inte RANKL- eller OPG-uttrycket (figur 6b). Dessa resultat ledde till att vi undersökte huruvida CM från JN-2-behandlade 4T1-celler skulle hämma osteoklastbildning i samodling av osteoblaster och osteoklast-prekursor-BMM: er. Intressant nog bildade CM från DMSO-behandlade 4T1-celler effektivt osteoklaster, medan CM från JN-2-behandlade 4T1-celler väsentligen undertryckte osteoklastbildning i samodlingssystemet (figur 6c). Därefter undersökte vi om CM från JN-2-behandlade 4T1-celler inhiberade RANKL-uttryck. CM från DMSO-behandlade 4T1-celler stimulerade RANKL-uttryck i osteoblaster och CM från JN-2 (10 och 20 μM) -behandlade 4T1-celler reducerade RANKL-uttryck jämfört med CM från DMSO-behandlade 4T1-celler (figur 6d). Dessa resultat antyder att JN-2 påverkar osteoklastbildningen indirekt genom att hämma förmågan hos 4T1-celler att stimulera RANKL-uttryck i osteoblaster. Dessutom ökar denna upptäckt möjligheten att antagonism av CXCR10 / CXCR3 i cancer kan ha den kliniska potentialen att reglera cancerinducerad RANKL-induktion. 36

JN-2 hämmar osteoklastdifferentiering indirekt. ( a ) BMM odlades i närvaro av M-CSF (60 ng ml −1 ) och RANKL (RL; 100 ng ml −1 ) med eller utan CM + DMSO eller CM + JN-2 (10 μM) under 4 dagar. Differentierade celler färgades för TRAP och celler innehållande 3 eller flera kärnor räknades. Skalstången är 100 μm. ( b ) Muskalvariala osteoblaster odlades med DMSO eller JN-2 (10 μM) i närvaro av PBS eller CXCL10 (300 ng ml −1 ). Efter 24 timmars inkubation analyserades RANKL och OPG mRNA-nivåer med realtids-PCR. ( c ) BMM och muskalvariala osteoblaster odlades i 9 dagar med eller utan CM från 4T1-celler behandlade med DMSO eller JN-2 (10 μM). Cellerna färgades för TRAP och celler innehållande tre eller flera kärnor räknades. Skalstången är 100 μm (* P <0, 05). ( d ) Muskalvariala osteoblaster odlades under 24 timmar med eller utan CM från 4T1-celler behandlade med DMSO eller JN-2. RANKL- och OPG-mRNA-nivåer analyserades med realtids-PCR (* P <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

Nyligen antyder ökande bevis en avgörande roll för CXCR3 vid metastaser, och hämning av CXCR3 har framkommit som ett terapeutiskt mål för cancer. 37, 38, 39, 40, 41, 42 Även om många studier har visat att blockering av CXCR3 har en antimetastatisk effekt på tumörceller fokuserade vi i den aktuella studien på CXCL10 / CXCR3-medierad intracellulär signalering och metastasinducerad benförstörelse . Vi observerade att den murina bröstcancercellinjen 4T1 utsöndrade CXCR3-liganden CXCL10; emellertid inhiberades CXCL10 mRNA-uttryck genom behandling med CXCR3-antagonisterna JN-2 och AMG 487 utan CXCL10-stimulering. Dessutom inhiberades migrationsförmågan hos 4T1-celler av JN-2 oavsett CXCL10-stimulering. Dessa resultat antyder att starkt uttryckt CXCL10 kan bidra till att upprätthålla tumörprogression genom CXCR3 via cell-autonom reglering. Insikt i de fysiologiska verkningarna av CXCL10 tillhandahölls genom data som visade att under påverkan av IFN-y inducerar värdets immunsvar en amplifieringsåterkopplingsslinga av CXCL10-utsöndring av flera celltyper, inklusive Thl-lymfocyter, endotelceller, fibroblaster och keratinocyter. 43 Dessutom visade vi tidigare att cancerceller ökar produktion av CXCL10 från makrofager på ett cell-cellkontakt sätt och att värdbrist på CXCL10 hämmar osteolytisk benmetastas. 20 Dessa resultat tyder således på att autokrinproduktion och paracrinproduktion av CXCL10 underlättar cellrörlighet och osteolytisk benmetastas av cancerceller genom aktivering av CXCR3 i cancerceller.

STAT-1, NF-kB och det transkriptionella koaktiverande CREB-bindande proteinet är involverade i transkriptionell aktivering av CXCL10. 44 NF-kB har klargjorts som en regulator för det inflammatoriska svaret och immuncellens funktion. Det är emellertid nu uppenbart att aktivering av NF-KB i cancer är vanligt. Till exempel kräver oncoproteins, såsom Bcr-Abl och Ras, NF-KB signaleringsaktivering. 45 I denna studie fann vi att CXCL10 ökar uttrycket för NF-κB-underenheten P65 och NF-κB transkriptionell aktivitet i 4T1-celler. Vi observerade också att CXCL10 inducerar NF-KB transkriptionell aktivitet i den humana bröstcancercellinjen MDA-MB-231 (kompletterande figur 2). Dessutom inducerade CXCL10 snabbt kärntranslokation av P65 inom 30 minuter i 4T1-celler. Däremot hämmade CXCR3-antagonisterna AMG 487 och JN-2 uttrycket och kärntranslokationen av P65 oavsett CXCL10-stimulering. Tvångsuttryck av P65 upphävde de inhiberande effekterna av JN-2 på P65-expression och CXCL10-utsöndring. Däremot reducerade överuttryck av IKBa P65-uttryck, utsöndrade CXCL10 och NF-KB transkriptionell aktivitet. Således antyder dessa resultat att CXCL10 / CXCR3-axeln skapar en positiv återkopplingsslinga genom aktivering av den kanoniska NF-kB-signalvägen, vilket resulterar i upprätthållandet av hög NF-kB-aktivitet i 4T1-celler.

Kemokinreceptorer har varit målet för läkemedelsupptäckt med fokus på utvecklingen av ett nytt läkemedel för små molekylantagonister som kan blockera verkan av kemokininducerad receptoraktivering. Den selektiva CXCR3-antagonisten SCH 546738 dämpar utvecklingen av autoimmuna sjukdomar. 46 CXCR3-antagonisten AMG 487 uppvisar hämmande effekter på lungmetastas i bröstcancer. 47 I den aktuella studien demonstrerade vi att JN-2 hämmar osteolytisk benmetastas av 4T1-celler med en minskning av tumörutväxt, P65-uttryck, osteoklastbildning och uttrycket av RANKL och CXCL10. Våra in vitro- experiment visade att JN-2 inte påverkar 4T1 CM-inducerad osteoklastdifferentiering men hämmar osteoklastdifferentiering indirekt genom att undertrycka förmågan hos 4T1-celler att stimulera RANKL-uttryck i osteoblaster. Vi har tidigare visat att hämning av CXCR3 genom genutsläpp i cancerceller minskar osteolytisk benmetastas. 20 Således antyder våra resultat in vitro och in vivo att den direkta hämmande verkan av JN-2 på CXCR3 i 4T1-celler bidrar till dess hämmande effekter på osteolytisk benmetastas av 4T1-celler. Vi kunde dock inte utesluta möjligheten att JN-2 påverkar värdcellerna. Vi observerade faktiskt att JN-2 hämmar 4T1-inducerad uppreglering av P65-expression i benmärgsregionen. Huruvida specifik hämning av CXCR3 i värdceller också påverkar osteolytisk benmetastas bör således bedömas i ytterligare studier.

Faktorerna som utsöndras från bröstcancerceller, inklusive IL-1, IL-6, prostaglandin E2 (PGE2) och TNFa, spelar en avgörande roll i bröstcancermedierad osteoklastaktivering. 48, 49 Dessa utsöndrade faktorer stimulerar osteoblaster att producera RANKL. 2, 36 IL-1 och IL-6 stimulerar RANKL-uttryck via aktivering av gp130-STAT3-signalaxeln i stromal / osteoblastiska celler. 50 PGE2 är en stimulator av benresorption, och den huvudsakliga effekten av PGE2 på resorption anses ske indirekt genom EP4-receptormedierat RANKL-uttryck i osteoblastiska celler. 51 Dessutom inducerar IL-1 och TNFa RANKL-uttryck via P38 MAPK-signalering. 52 Vi har tidigare funnit att CXCL10 ökar RANKL mRNA och proteinuttryck i osteoblaster genom Toll-liknande receptor 4 men inte CXCR3. 20 I överensstämmelse med detta konstaterande påverkade behandling av osteoblaster med JN-2 inte CXCL10-inducerat RANKL-uttryck i osteoblaster. Vi fann också att JN-2 undertrycker CXCL10-sekretion från 4T1-celler och att CM från 4T1-celler behandlade med JN-2 reducerar RANKL-uttryck i osteoblaster jämfört med kontroll 4T1 CM. Dessa fynd indikerar att CXCL10 är en av de faktorer som utsöndras från 4T1-celler som stimulerar RANKL-uttryck i osteoblaster. Våra resultat antyder också att JN-2-inducerad reducerad CXCL10-sekretion från 4T1-celler bidrar, åtminstone delvis, till dess hämmande effekt på RANKL-expression i osteoblaster och osteoklastdifferentiering. Huruvida CXCL10 / CXCR3 / NF-kB-återkopplingsslingan också påverkar andra utsöndrade faktorer från 4T1-celler som stimulerar RANKL-uttryck i osteoblaster är fortfarande oklart.

Sammanfattningsvis visar denna studie att CXCL10 / CXCR3-axeln i bröstcancer 4T1-celler skapar en positiv återkopplingsslinga genom aktivering av den kanoniska NF-κB-signalvägen, som stimulerar cellrörlighet och osteolytisk benmetastas av 4T1-celler. Därför föreslår vi att signalvägen CXCL10 / CXCR3 / NF-KB spelar en grundläggande roll i maligna tumöregenskaper.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande material och metoder

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Experimental & Molecular Medicine (//www.nature.com/emm)