Neferin hämmar angiotensin ii-stimulerad proliferation i vaskulära glatta muskelceller genom heme oxygenase-1 | acta Pharmacologica sinica

Neferin hämmar angiotensin ii-stimulerad proliferation i vaskulära glatta muskelceller genom heme oxygenase-1 | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

För att undersöka effekten av neferin på angiotensin II (Ang II) -inducerad vaskulär glatt muskelcell (VSMC) -förökning.

metoder:

Mänskliga navelceller med glattmuskelceller (HUVSMC) användes. Cellproliferation bestämdes med användning av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) -analys och flödescytometri-analys. Heme-oxygenas (HO) -1-proteinuttryck testades genom Western blot-analys. Extracellulär signalreglerad proteinkinas 1/2 (ERK1 / 2) aktivering bestämdes med användning av immunblotting.

Resultat:

Förinkubation av HUVSMC med neferin (0, 1, 0, 5, 1, 0 och 5, 0 μmol / L) hämmade signifikant Ang II-inducerad cellproliferation på ett koncentrationsberoende sätt och neferin 5, 0 μmol / L ökade HO-1-uttrycket med 259% jämfört med kontrollera. Den antiproliferativa effekten av neferin dämpades signifikant genom co-applicering av zinkprotoporfyrin IX (ZnPP IX, en HO-1-hämmare) med neferin. Ang II-förbättrad ERK1 / 2-fosforylering reverserades markant av neferin. Genom att hämma HO-1-aktivitet med ZnPP IX dämpades den inhiberande effekten av neferin på ERK1 / 2-fosforylering signifikant. Koboltprotoporfyrin (CoPP), en HO-1-inducerare, minskade signifikant Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering och inhiberade Ang II-inducerad cellproliferation. ERK1 / 2-vägsinhibitorn PD98059 blockerade signifikant Ang II-förbättrad ERK1 / 2-fosforylering och inhiberade cellproliferation.

Slutsats:

Dessa fynd antyder att neferin kan hämma Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation genom att reglera HO-1, vilket leder till åtminstone partiell nedreglering av ERK1 / 2-fosforylering.

Introduktion

Spridningen och migrationen av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) spelar en viktig roll i patogenesen för ateroskleros och restenos efter angioplastik och eventuellt i utvecklingen av hypertoni. En viktig stimulans för VSMC-spridning är angiotensin II (Ang II), huvudeffektorn i renin-angiotensinsystemet. AT 1, en Ang II-receptor, förmedlar de flesta av de fysiologiska och patofysiologiska verkningarna av Ang II. Aktivering av AT 1 stimulerar olika signalmolekyler, inklusive proteinkinas C, mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) och tyrosinkinaser 1, 2 . Dessutom leder aktivering av tyrosinkinaser genom Ang II också till aktivering av MAPK och främjar följaktligen tillväxtresponsen i VSMCs 3, 4 . Ang II är känt för att stimulera aktiveringen av MAPK: er, inklusive extracellulärt signalreglerat proteinkinas (ERK) 1/2, p38MAPK och stressaktiverat proteinkinas / c-Jun N-terminal kinas (JNK) i VSMC. ERK-vägen är den bäst karakteriserade i MAPK-vägarna. Bindning av Ang II till AT 1 aktiverar ERK1 / 2 inom 5 minuter 2 . Bland MAP-kinasfamiljen har ERK1 / 2 varit inblandad i spridningen av olika celltyper 5 . Vidare har Ang II-inducerad aktivering av ERK1 / 2 också varit inblandad i hypertoni och i mikro- och makrovaskulära målorganskador.

Hemeoxygas (HO) katalyserar hemnedbrytning till kolmonoxid (CO), järn och biliverdin. HO är ett mikrosomalt enzym med en inducerbar isoform HO-1 och konstitutiva former HO-2 och HO-3. Alla HO-isoformer hämmas av metallprotoporfyrinerna zinkprotoporfyrin IX (ZnPP IX) och tennprotoporfyrin IX (SnPP IX). HO uttrycks i många typer av celler, inklusive VSMC: er 6 . HO-1, även känd som värmechockprotein 32, är allmänt distribuerad och mycket inducerbar av en mängd fysiologiska och patofysiologiska stimuli 7 . Ackumulerade bevis tyder på att HO-1 erbjuder skydd mot många vaskulära störningar. Ökat HO-1-uttryck minskar intimal förtjockning efter artärskada och dämpar åderförkalkning i möss med apolipoprotein E-brist 8 . Ökad aktivitet av HO-1 hämmar dessutom spridning av VSMC: er 9, 10, 11 . Intressant nog har det nyligen rapporterats att HO-1 hämmar spridningen av pankreasstellatceller genom förtryck av ERK1 / 2-vägen 12 .

Många traditionella kinesiska läkemedel som används för att behandla hjärt-kärlsjukdomar är mycket effektiva. Bland de komplexa kemiska ingredienserna i traditionella kinesiska läkemedel finns det vanligtvis en huvudingrediens som kan vara användbar för behandling av hjärt-kärlsjukdomar; dessa ingredienser ger en uppenbar utgångspunkt för utvecklingen av nya läkemedel för behandling av hjärt-kärlsjukdomar, liksom för att definiera nya vägar involverade i patogenesen av hjärt-kärlsjukdomar. Neferine (Nef), en viktig biologiskt aktiv förening, extraheras från det gröna fröembryot från Nelumbo nucifera Gaertn . Neferine är en bis-bensylisokinolinalkaloid, och dess kemiska struktur visas i figur 1. Ett brett spektrum av biologiska och farmakologiska verkningar av neferin har undersökts 13, 14 . Det har föreslagits att neferin kan förhindra bildning av skumcell genom att hämma syresättningen av lipoprotein med mycket låg densitet och blodplättaggregation 15, 16 . Dessutom kan neferin skydda vaskulära endotelceller från skador orsakade av syrefria radikaler. Dessutom är neferin effektivt för att förhindra uppkomsten av reentrant ventrikulär takyarytmi 17 . Dessa fynd indikerar att neferin har skyddande effekter på det kardiovaskulära systemet. Effekten av neferin på VSMC-proliferation, nyckelhändelsen i patogenesen för åderförkalkning och restenos, har emellertid förblivit oklar.

Neferins molekylstruktur.

Bild i full storlek

Syftet med denna studie var att undersöka om neferin skulle påverka Ang-inducerad VSMC-spridning genom HO-1-uttryck och undersöka de underliggande signalvägarna.

Material och metoder

material

Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med högt glukos- och fetalt bovint serum (FBS) köptes från Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) respektive Hyclone. Pro-prep-protein-extraktlösning köptes från Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina). De polyklonala anti-fosfo-extracellulära signalreglerade kinaset (ERK) 1/2 och anti-total-ERK1 / 2 kaninantikropparna erhölls från Cell Signaling Technology Inc. Polyklonal kanin anti-HO-1 och monoklonal mus anti-glyceraldehyd 3- fosfatdehydrogenas (GAPDH) -antikroppar erhölls från R&D Systems, Inc (Minneapolis, MN, USA). Den mitogen / extracellulära signalreglerade kinas (MEK) -inhibitorn PD98059 tillhandahölls av Calbiochem (Bad Soden, Tyskland). 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazolium (MTT) köptes från Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Ang II och Zink Protoporphyin IX (Znpp IX) köptes från Merck & Co, Inc (Whitehouse Station, NJ, USA). Kobolt-protoporfyrin (CoPP) var från Porphyrin Products (London, Storbritannien). Neferine köptes från Phytomarker Ltd (Tianjin, Kina). Renens renhet var större än 99, 8%.

Stamlösningar av ZnPP IX och neferin framställdes i en liten volym av 100% dimetylsulfoxid (DMSO, ekvivalent med <1% av den slutliga volymen). Ang II löstes i metanol. Lösningen filtrerades genom ett 0, 22 um membran. Alikvoter lagrades vid -20 ° C i mörkret. Ytterligare utspädning gjordes med cellodlingsmedium. Alla andra reagens köptes från Sigma-Aldrich.

Cell kultur

Den primära cellinjen för mänskliga navelceller med mjuka navelceller (HUVSMC) erhölls från Health Protection Agency (HPA) Culture Collections (UK). HUVSMC odlades i DMEM kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS. Cellerna hölls vid 37 ° C i en 95% 02/5% CO2 inkubator. Mediet byttes varannan dag. Celler digererades med 0, 25% trypsin och 0, 02% EDTA när celldensiteten nådde 80% till 90%. HUVSMC från 4 till 8 passager vid 70% -90% sammanflöde användes i 6-brunnars cellodlingsskålar. HUVSMC inkuberades i serumfritt medium under 24 timmar före tillsatsen av experimentella reagens.

Western blot-analys

HUVSMC pläterades på odlingsplattor med 6 brunnar i 10% FBS / DMEM och odlades till 80% sammanflöde. Efter 24 timmars stillhet i serumfritt medium behandlades celler som indikerats. Totala celllysat framställdes genom tillsats av 100 mikroliter pro-prep proteinextraktlösning. Proteinkoncentrationen kvantifierades med ett proteinanalysreagens från Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Lika stora mängder protein blandades med natriumdodecylsulfat (SDS) provbuffert och inkuberades under 5 minuter vid 100 ° C före belastning. Totala proteinprover (40 ug) utsattes för 10% SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) 18 under 2 timmar vid 100 V. De separerade proteinerna överfördes elektroforetiskt till ett PVDF-membran under 1 timme vid 30 mA. Membran blockerades med 5% mjölk utan fett i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0, 05% Tween 20 (PBS-T) under 2 timmar vid rumstemperatur. Membraner inkuberades med de primära antikropparna vid en utspädning av 1: 1000 i 1% bovint serumalbumin (BSA) över natt vid 4 ° C. Membranen tvättades fyra gånger med PBS-T och testades sedan med IRDye ® 800CW-konjugerade sekundära antikroppar. IRDye 800CW-aktiviteten detekterades med användning av en LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences, USA). För normalisering detekterades den totala mängden GAPDH. Alla visade resultat är representativa för experiment med minst tre olika cellpreparat.

Cellproliferationsanalys

Cellproliferation analyserades med användning av MTT-analysen 19 . HUVSMC utsattes på plattor med 96 brunnar med en densitet av 0, 6-1, 0 × 104 celler per brunn i DMEM kompletterat med 10% FBS. Serumfritt DMEM tillsattes till varje brunn efter 24 timmar och inkuberades under 24 timmar för att synkronisera celler till viloplatsen. Supernatanten avlägsnades och DMEM och 1% FBS innehållande Ang II, Nef och ZnPP IX tillsattes och samodlades i 24 timmar. Detta upprepades fem gånger för varje koncentrationsgrupp. Efter behandlingar med Ang II, neferin och HO-1-hämmare, tillsattes 20 ul 5 mg / ml MTT-lösning till varje brunn och inkuberades under 4 timmar. Supernatanterna aspirerades, och formazankristallerna i varje brunn löstes med 150 mikroliter DMSO. Cellproliferation bedömdes genom att mäta absorbansen vid 490 nm med användning av en mikroplåtläsare. Experimenten upprepades tre gånger.

Cellcykelanalys

Cellcykelstatus analyserades med en FACScan flödescytometer (Becton Dickinson, San Diego, USA) genom att mäta fluorescens från celler färgade med propidiumjodid 20 . Data presenteras som den relativa fluorescensintensiteten för cellunderpopulationer i den 2-dimensionella FACS-profilen eller som procentandelen celler i en given underpopulation. Celler färgades med 10 | ig / ml propidiumjodid (PI) -lösning och RNaseA (Santa Cruz Biotechnology) i PBS i mörkret under minst 30 minuter vid rumstemperatur. Åtminstone 10 000 celler analyserades i varje prov. Procentandelen av celler i de olika faserna av cellcykeln mättes med en FACS-flödescytometer och analyserades med ModFit 3.0-programvaran.

Statistisk analys

Resultaten uttrycks som medel ± SEM för det angivna antalet separata cellpreparat per experimentprotokoll. Data analyserades med användning av envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Student Newman-Keuls post hoc Tukey-test. Skillnader mellan grupperna ansågs vara signifikanta vid P <0, 05. Analyser utfördes med det statistiska mjukvarupaketet SPSS (15.0).

Resultat

Neferin inhiberade Ang II-inducerad spridning av HUVSMC

Först odlades HUVSMC i medium kompletterat med Ang II (0, 001, 0, 01, 0, 1 och 1, 0 μmol / L) under 24 timmar. Som visas i figur 2A resulterade exponering av HUVSMC för Ang II i en signifikant ökning av antalet celler, med maximala nivåer vid 0, 1 μmol / L. Ang II vid 0, 1 μmol / L ökade betydligt spridningen med 51% jämfört med kontrollerna. Cytotoxicitet observerades inte vid 0, 1 μmol / L. Därför valdes 0, 1 μmol / L-koncentrationen för ytterligare studier. Jämfört med kontrollgruppen minskade neferin (0, 1, 0, 5, 1, 0 och 5, 0 μmol / L) cellproliferation på ett koncentrationsberoende sätt och nådde ett maximalt svar vid 5, 0 μmol / L. HUVSMC-proliferation inhiberades signifikant av neferin (5 μmol / L) vid 24 och 48 timmar, var 18% respektive 19% lägre än kontroller (figur 2B). Koncentrationerna som användes för neferin uppvisade inte cytotoxiska effekter på cellviabilitet; därför användes 5, 0 μmol / L neferin i följande studier. Som visas i figur 2C dämpades proliferation av HUVSMC inkuberad med Ang II signifikant i närvaro av neferin, vilket antyder att neferin har en potentiell antiproliferativ effekt på HUVSMC stimulerad av Ang II. Den antiproliferativa effekten av neferin bekräftades genom cellcykelanalys. Såsom beskrivs i figur 2D kan hastigheten för celler som kommer in i mitos uppskattas från proliferationsindex. Efter 24 timmars stimulering med Ang II ökade andelen G2 / M-celler från 14, 42% till 25, 33%. Under samma tidsperiod i närvaro av neferin (5, 0 μmol / L) minskades hastigheten för inträde i mitos hos celler exponerade för Ang II från 25, 33% till 13, 29%. Cellproliferationsindex hänvisar till procentandelen celler i S-fas och G2 / M-fas och är en viktig indikator på proliferation av cellpopulationen. Efter stimulering med Ang II ökade spridningsindexet med 93% jämfört med kontroller, men i närvaro av neferin (5 μmol / L) minskade spridningsindexet för celler exponerade för Ang II till 85% av kontrollerna. ZnPP IX avskaffade signifikant den hämmande effekten av neferin på spridningsindex. Förändringen i procentandelen celler i S-fasen var i överensstämmelse med ovanstående observation. Neferine arresterade HUVSMC vid G 0 / G 1- fasen.

Neferin hämmade Ang II-inducerad proliferation av HUVSMC. (A) HUVSMC-proliferation bestämdes med användning av MTT-analysen. Cellerna behandlades med Ang II (0, 0, 001, 0, 01, 0, 1 och 1, 0 μmol / L) under 24 timmar. (B) Effekten av neferin på HUVSMC-proliferation i närvaro av 1% FBS undersöktes. Neferine (0, 1-5, 0 μmol / L) inhiberade HUVSMC-proliferation på ett dosberoende sätt efter 24 och 48 timmar jämfört med celler behandlade med enbart odlat medium. (C) Neferin hämmade Ang II-stimulerad cellproliferation med 25%; effekten av neferin reducerades genom förbehandling av celler med HO-hämmaren ZnPP IX (10 μmol / L). (D) Effekt av Ang II och ZnPP IX i närvaro eller frånvaro av neferin på cellcykeln i HUVSMC. Cellcykeldistributionen bedömdes med flödescytometri. HUVSMC behandlades med ZnPP IX under 1 timme i närvaro av neferin och stimulerades sedan med Ang II under 24 timmar. Cellproliferationsindexet i histogrammet avser procentandelen celler i S- och G2 / M-faser. b P <0, 05 jämfört med kontroll; e P <0, 05 jämfört med Ang II; h P <0, 05 jämfört med Ang II + neferine.

Bild i full storlek

Neferin ökade HO-1-proteinuttrycket i HUVSMC stimulerat av Ang II

Resultaten som visas i figur 3A indikerade att 5 μmol / L neferine ökade HO-1-uttrycket signifikant med 259% jämfört med kontroller. Närvaron av Ang II ensam inhiberade signifikant HO-1-expression med 44% jämfört med kontroller, medan neferin ökade Ang II-inhiberade HO-1-uttryck med 125% i HUVSMC (figur 3B). Neferine inducerade inte bara anmärkningsvärt uttrycket av HO-1 på ett koncentrationsberoende sätt jämfört med kontroller, utan ökade också uttrycket av HO-1 i celler inhiberade av Ang II (figur 3).

Nefrine ökade HO-1-proteinuttryck i HUVSMC stimulerade av Ang II. HUVSMC behandlade med 1% FBS tjänade som kontroller. Resultaten representerar Western blot-analys för HO-1-proteinuttryck. För att verifiera lika belastning strippades membranen och testades med en anti-GAPDH-proteinspecifik antikropp. (A) Celler behandlades med neferin (0, 0, 1, 0, 5, 1, 0 och 5, 0 umol / l) under 24 timmar. Neferin koncentrationsberoende ökade HO-1 uttryck. (B) Serum-utsultade HUVSMC behandlades med neferin (5 umol / L) och ZnPP IX (10 umol / l) under 1 timme och behandlades sedan med en stimulering med Ang II (0, 1 umol / l) under 24 timmar. bP <0, 05, cP <0, 01 jämfört med kontroll. e P <0, 05 jämfört med Ang II.

Bild i full storlek

Neferin inhiberade Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation genom HO-1

Med tanke på att neferin orsakade uppreglering av HO-1-uttryck, testades huruvida neferin-inducerat HO-1-uttryck kunde underlätta dess antiproliferativa effekt. Det visade sig att koapplicering av neferin och ZnPP IX (10 μmol / L), en HO-1-aktivitetshämmare, inte hade någon signifikant effekt på neferin uppreglering av HO-1-uttryck i HUVSMC behandlade med Ang II (figur 3B); såsom visas i figur 2C var den inhiberande effekten av neferin på Ang II-inducerad cellproliferation emellertid signifikant omvänd med ZnPP IX. Vidare kunde CoPP, en HO-1-inducerare, förhindra Ang II-inducerad spridning (figur 4). Förinkubation med CoPP (20 μmol / L) minskade Ang II-inducerad cellproliferation med 45% i HUVSMC, medan ZnPP IX (10 μmol / L) ökade den med 47%. Förinkubation med PD98059 (20 μmol / L) minskade också Ang II-inducerad cellproliferation med 50% i HUVSMC. Dessutom inhiberade PD98059 ökningen i cellproliferation inducerad av ZnPP IX. Dessa fynd antyder att neferininducerat HO-1-uttryck och den resulterande ökningen i aktivitet av HO-1 är involverad i den antiproliferativa effekten av neferin på HUVSMC inducerad av Ang II.

Neferin inhiberade Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation genom HO-1. Bedömning av rollerna hos PD98059 (en ERK1 / 2-vägsinhibitor), ZnPP IX (en HO-1-hämmare) och CoPP (en HO-1-inducerare) på cellproliferation med MTT-analys före en 24 timmars stimulering med Ang II. b P <0, 05 vs kontroll. e P <0, 05 vs Ang II. h P <0, 05 vs Ang II + ZnPP IX.

Bild i full storlek

Neferininducerad HO-1-uttrycksmodulerad ERK1 / 2-fosforylering

Ang II inducerade ERK1 / 2-fosforylering på ett tidsberoende sätt och nådde 296% av kontrollerna vid 120 minuters tidpunkt (figur 5A). Den Ang II-förbättrade ERK1 / 2-fosforyleringen reverserades markant med neferin (figur 5B), vilket ökade HO-1-uttrycket i Ang II-stimulerade celler (figur 3B). Neferine reducerade signifikant fosforylering av ERK 1/2 inducerad av Ang II med 148%. Tillämpningen av ZnPP IX dämpade signifikant den hämmande effekten av neferin på ERK 1/2 fosforylering (figur 5B). Dessutom minskade CoPP, en HO-1-inducerare, signifikant Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering, vilket antyder att uppreglering av HO-1 undertrycker ERK1 / 2-fosforylering orsakad av Ang II. Förinkubation med CoPP (20 μmol / L) minskade Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering med 74% i HUVSMC, medan ZnPP IX (10 μmol / L) ökade den med 77%. Förinkubation med PD98059 (20 μmol / L) minskade också Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering med 52% i HUVSMC. Dessutom inhiberade PD98059 signifikant ZnPP IX-inducerad ERK1 / 2-fosforylering i HUVSMC (figur 5C).

Neferininducerad HO-1-uttrycksmodulerad ERK1 / 2-fosforylering. Fosforylerade ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2) -nivåer bestämdes genom Western blot-analys. (A) HUVSMC svaldes från serum under 24 timmar före stimulering med Ang II (0, 1 μmol / L) under 15, 30, 60 och 120 minuter. (B) Serum-svält HUVSMC förbehandlades med neferin (5 μmol / L) och / eller ZnPP IX (10 μmol / L) under 1 timme före stimulering med Ang II (0, 1 μmol / L) under 24 timmar. (C) Western blot-analys av ERK1 / 2-fosforylering efter en 120-minuters stimulering med 0, 1 μmol / L Ang II. HUVSMC: erna förbehandlades med olika reagens under 1 timme före stimulering. b P <0, 05, cP <0, 01 vs kontroll. e P <0, 05 vs Ang II. h P <0, 05 vs Ang II + neferine. k P <0, 05 vs Ang II + ZnPP IX.

Bild i full storlek

ERK1 / 2-fosforyleringsmodulerad Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation

Ang II ökade ERK1 / 2-fosforylering och spridning i HUVSMC (figur 2C, 4, 5A – 5C), medan neferin minskade ERK1 / 2-fosforylering och proliferation i HUVSMC behandlad med Ang II (figur 5B, 2C). Dessutom blockerade ERK1 / 2-vägsinhibitorn PD98059 signifikant Ang II-förbättrad ERK1 / 2-fosforylering och inhiberade cellproliferation (figur 4, 5C), vilket bekräftar involvering av ERK1 / 2-vägen i HUVSMC-tillväxtrespons till Ang II.

Diskussion

Den överdrivna tillväxten av VSMC är en avgörande händelse i utvecklingen av hjärt-kärlsjukdomar såsom åderförkalkning och hypertoni. Bland många faktorer som är inblandade i spridningen av VSMC verkar Ang II vara en av de viktigaste 21 . Därför har frågan om hur man kan hämma spridningen av VSMC som utsätts för kronisk eller långvarig stimulering med Ang II varit föremål för terapeutiska strategier för behandling av dessa sjukdomar. Vår studie undersökte effekten av neferin på spridningen av VSMC stimulerade av Ang II. I den aktuella studien visade vi att neferin har en antiproliferativ effekt på Ang II-inducerade VSMC. Föreliggande data utvidgar vår kunskap om effekten av neferin på vaskulära celler.

För att utforska mekanismen som ligger bakom den antiproliferativa effekten av neferin, bestämde vi HO-1-uttryck i HUVSMC. Data från tidigare studier antydde att induktion av HO-1 kunde hämma celltillväxt 12, 22, 23 . VSMC: er från HO-1-bristfälliga möss visar förbättrad DNA-syntes och celltillväxt 24 . Omvänt, överuttryck av HO-1 genom antingen transfektion av HO-1-genen eller genom exogen administration av en viss HO-1-inducerare reducerar överdriven VSMC-proliferation 25 . Emellertid är effekten av HO-1 på cellproliferation mycket varierande och verkar vara celltypspecifik 8, 26, 27, 28, vilket väcker en viktig fråga om huruvida den antiproliferativa effekten av neferin på VSMC kan förmedlas via HO-1 uttryck. För att testa detta bestämdes effekterna på både HO-1-expression och tillväxtinhibering av neferin med samma koncentration av neferin som användes i den aktuella studien. Vi fann att den hämmande effekten av neferin på Ang II-stimulerad HUVSMC-proliferation var associerad med en djupreglering av HO-1-proteinuttryck i dessa celler. Vi fann också att hämningen av HUVSMC-proliferation med neferin delvis, men inte fullständigt, vändes i närvaro av ZnPP IX, en hämmare av hemeoxygasaktivitet. Likaledes förhindrade HO-1-induceraren CoPP signifikant cellproliferation orsakad av Ang II, vilket indikerar ett direkt engagemang av HO-1 i cellproliferationen. Dessutom är det anmärkningsvärt att Ang II själv minskade HO-1-uttrycket betydligt; däremot kan neferin avsevärt öka HO-1-uttrycket på ett koncentrationsberoende sätt i HUVSMC. Således visade ovanstående resultat att det neferininducerade HO-1-uttrycket kan bidra till, i viss utsträckning, till den antiproliferativa effekten av neferin på Ang II-stimulerade HUVSMC: er, som överensstämde med observationer gjorda i andra cellinjer 12, 23 . Därför är det rimligt att spekulera att HO-1 kan vara ett potentiellt mål för den antiproliferativa aktiviteten hos neferin.

Ang II kan stimulera VSMC-spridning som mitogen 29 . Gradvis har olika signalöverföringskaskader implicerats i Ang II-medierade VSMC: s spridning och migration, såsom MAPK 30 och PI3K / Akt 31, 32 . I början av 2001 demonstrerade EI Mabrouk et al att ERK1 / 2-fosforylering är dosberoende ökad med Ang II i VSMC: er från spontana hypertensiva (SHR) och Wistar-Kyoto (WKY) råttor, och ERK1 / 2-hämmaren PD-98059 kan blockera Ang II-inducerad VSMC-tillväxt 21 . I VSMC sker Ang II-typ I-receptorinducerad ERK1 / 2-aktivering via Ca 2+ och Src-beroende transaktivering av EGFR 33, 34 . Ang II kan aktivera ERK1 / 2 via Ras / PKCzeta / MEK-vägen i VSMC 35 . Därför involverar mekanismen för ERK1 / 2-aktivering genom Ang II potentiellt flera signalvägar. I denna studie undersökte vi sambandet mellan Ang II-inducerad VSMC-proliferation och ERK1 / 2-aktivering specifikt. Resultaten från vår studie visade att Ang II ökade fosforylering av ERK1 / 2 och stimulerade cellproliferation; däremot blockerade ERK-hämmaren PD98095 Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering och signifikant inhiberade Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation, vilket indikerar att ERK1 / 2-aktivering fungerar parallellt med HUVSMC-proliferation. Dessa resultat är i linje med EI Mabrouk et al och stöds också av en annan studie där VSMC-proliferation inducerad av PDGF hämmades av corynoxeine genom blockering av ERK1 / 2-fosforylering 21, 36 . Därför bekräftar föreliggande data att aktivering av ERK1 / 2 spelar en viktig roll i HUVSMC-proliferation inducerad av mitogener, såsom Ang II.

Nyligen observerade Schwer et al att den curcumininducerade minskningen av ERK1 / 2-fosforylering var parallell med HO-1-uppreglering och kunde förhindras genom administrering av HO-hämmaren SnPP 12 . I den aktuella studien visade resultaten att neferin signifikant reducerade den Ang II-inducerade fosforyleringen av ERK1 / 2 och cellproliferation, och båda effekterna kunde dämpas i närvaro av HO-hämmaren ZnPP IX. ERK-hämmaren PD98095 kan också minska Ang II-inducerad fosforylering av ERK1 / 2 och hämma cellproliferation; ännu viktigare, förhindrade PD98095 ökningen i cellproliferation inducerad av ZnPP IX (figur 4) och signifikant vänt ZnPP IX-förbättrad ERK 1/2 fosforylering (figur 5C), vilket bekräftade att effekten av HO-1 på HUVSMC-proliferation involverade ERK1 / 2 väg. Våra resultat liknar Schwer et al 12, vilket tyder på att HO-1 uppreglering undertrycker ERK1 / 2 signalvägen. Baserat på ovanstående data avslöjar vår studie att neferin kan verka genom åtminstone delvis uppreglering av HO-1, vilket leder till nedreglering av ERK1 / 2-fosforylering för att hämma Ang II-inducerad HUVSMC-spridning.

Det har rapporterats att uppregleringen av den cyklinberoende kinasinhibitorn p21 WAF1 / CIP1 är involverad i den antiproliferativa effekten av HO-1 25, 37 . CO är en av produkterna från hemnedbrytning. Den antiproliferativa effekten av YS 49 på VSMC reverseras genom förbehandling med hemoglobin, en CO-rensare 38 . Cdk-2 är en nyckelregulator för både G1- och S-fascellsprogression. Duckers et al har visat att CO inducerar expressionen av cdk-2-hämmaren p21 WAF1 / CIP1, vilket antyder att CO kan blockera cdk-2-aktivitet via flera mekanismer för att hämma VSMC-proliferation 8 . Dessutom inducerar Ang II ROS-produktion genom ERK1 / 2-vägen i VSMC: er 39 . Oxidanter, inklusive ROS, är signaler involverade i regleringen av cellproliferation 40 . Resultaten från Taille et al betonar konceptet att de antioxidanta egenskaperna hos HO-bilirubinvägen är relaterade inte bara till dess ROS-rensningsegenskaper utan också till moduleringen av ROS-produktion 27 . Enligt ovanstående studier, även om vi har visat att HO-1-uppreglering av neferin deltog i hämningen av HUVSMC-proliferation via undertryckande av ERK1 / 2-aktivering, uteslutte vi inte möjligheten att neferin också kan inducera uttrycket av andra antiproliferativa enzymer eller att effekten av neferin kan uppnås genom den tätt reglerade processen för de flera vägarna som kan aktiveras eller inaktiveras av neferine. Till exempel kan HO-1 fungera både som en sensor för och som ett mål för redoxbaserade mekanismer som involverar kväveoxid (NO) i råtta H9c2-celler 41 . NO spelar en viktig roll i transmembran signalering i det ischemiska myokardiet; det aktiverar HO, vilket ytterligare stimulerar produktionen av cGMP, förmodligen genom CO-signalering. Således förstärker NO inte bara cGMP-medierad intracellulär signalering utan fungerar också som en retrograd budbärare för CO-signalering i hjärtat 42 . I själva verket fann vi också i denna studie att Ang II orsakade en signifikant minskning av produktionen av NO i HUVSMC; neferine hade ingen signifikant effekt på NO-produktion i celler i frånvaro av Ang II, medan neferine uppvisade en signifikant uppreglerande effekt på produktionen av NO i celler i närvaro av Ang II (data visas inte). Ang II aktiverar membran NAD (P) H-oxidaser i VSMC: er för att producera ROS, som är inblandade i de pleiotropiska effekterna av Ang II 2 . En av de mest väl etablerade konsekvenserna av superoxid genererad av Ang II är inaktivering av NO i VSMC: er 43, 44 . Således förblir det osäkert om den antiproliferativa verkan av neferin också kan förmedlas genom att öka NO-produktion eller minska ROS-produktionen.

Sammanfattningsvis visade vi att neferin kan hämma Ang II-inducerad HUVSMC-proliferation. Därför kan neferin vara ett lovande farmakologiskt medel för förebyggande och behandling av vaskulära obstruktiva sjukdomar förknippade med överdriven VSMC-proliferation, såsom hypertoni och åderförkalkning.

Författares bidrag

Peng CHEN designade forskningen; Xiao-chun LI och Guo-xin TONG utförde forskningen; Yu ZHANG, Shan-xin LIU, Qi-hui JIN och Huai-hong CHEN analyserade data; Xiao-chun LI och Peng CHEN skrev tidningen.

Ordlista

MTT

3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid

CoPP

kobolt-protoporfyrin

ERK

extracellulärt signalreglerat kinas

HO

heme oxygenase

PD98059

2'-amino-3'-methoxyflavone

MAPK

mitogen-aktiverat proteinkinas

MEK

MAP-kinas

ZNPP

zinkprotoporfyrin

GAPDH

glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas

Ang

angiotensin

HUVSMC

mänsklig navelkärl, glatt muskelcell

DMEM

Dulbeccos modifierade Eagles medium

ROS

reaktiva syrearter

Nef

neferine

JNK

Jun N-terminal kinase

SnPP

tennprotoporfyrin

EGFR

epidermal tillväxtfaktorreceptor

PDGF

trombocyt-härledd tillväxtfaktor

cdk-2

cyklinberoende kinas-2