Nanogel-baserat pneumokock ytprotein ett nasalt vaccin inducerar mikrorna-associerade th17-cellresponser med neutraliserande antikroppar mot streptococcus pneumoniae i makaker | slemhinneimmunologi

Nanogel-baserat pneumokock ytprotein ett nasalt vaccin inducerar mikrorna-associerade th17-cellresponser med neutraliserande antikroppar mot streptococcus pneumoniae i makaker | slemhinneimmunologi

Anonim

ämnen

  • Bakteriell infektion
  • Biomaterial - vacciner
  • Klinisk farmakologi
  • miRNA i immunceller

Abstrakt

Vi etablerade tidigare ett nanosiserat nasalt vaccin-leveranssystem genom att använda en katjonisk kolesterylgruppbärande pullulan nanogel (cCHP nanogel), som är ett universellt proteinbaserat antigen-leveransmedel för adjuvansfri näsvaccination. I den aktuella studien undersökte vi centrala nervsystemets säkerhet och effekt av nasalvaccination med vår utvecklade cCHP nanogel innehållande pneumokock ytprotein A (PspA-nanogel) mot pneumokockinfektion i icke-mänskliga primater. När [18F] -märkt PspA-nanogel administrerades nasalt till en rhesus macaque ( Macaca mulatta ) noterades långvarig retention av PspA i näshålan jämfört med administration av PspA enbart. Av betydelse sågs ingen avsättning av [18F] -PspA i luktkulorna eller hjärnan. Nasal PspA-nanogel-vaccination inducerade effektivt PspA-specifikt serum IgG med skyddande aktivitet och slemhinnesekretoriskt IgA (SIgA) Ab-svar i cynomolgus macaques ( Macaca fascicularis ). Nasala PspA-nanogel-inducerade immunsvar medierades genom T-hjälper (Th) 2 och Th17 cytokinrespons samtidigt med markanta ökningar i nivåerna av miR-181a och miR-326 i serum- och andningsvävnaderna i makakerna . Dessa resultat visar att nasalt PspA-nanogel-vaccination är en säker och effektiv strategi för utveckling av ett nasalt vaccin för att förebygga lunginflammation hos människor.

Introduktion

Streptococcus pneumoniae är en viktig orsak till bakterieinfektioner över hela världen och är involverad i induktion av en mängd olika infektionssjukdomar, inklusive otitis media, lunginflammation, bakteremi och meningit hos barn och vuxna. Denna organisme är vanligtvis en kommensal bakterie i människans övre luftvägar. För närvarande har fyra pneumokockvacciner, 7-, 10- och 13-valent polysackarid-konjugatvacciner (PCV7, 10, 13) för barn och ett 23-valent pneumokock-polysackaridvaccin (PPV23) för vuxna utvecklats för allmänt bruk och levereras genom intramuskulär injektion. 1, 2, 3 Eftersom konjugatvaccinet emellertid inte skyddar mot andra kapseltyper ger det litet eller inget skydd mot total kolonisering med pneumokocker. 4, 5 Den omfattande transporten med andra pneumokockkapseltyper har lett till att ersättningen av belastningar vid sjukdom med stammar av icke-konjugerade vaccinkapseltyper. 6, 7

Utvecklingen av effektiva proteinbaserade vacciner, som har potential att ge bättre täckning för alla stammar, och att skydda mot kolonisering med alla stammar kräver en grundlig förståelse av roller och relativa bidrag till patogenes av de olika förmodade virulensproteinerna. Det pneumokocka ytproteinet A (PspA) är ett välkänt mycket immunogent ytprotein från S. pneumoniae och anses vara en lovande vaccinkandidat. 8, 9 Det finns på praktiskt taget alla stammar av pneumokocker och PspA-baserade vacciner mot S. pneumoniae inducerar korsreaktiva Abs hos möss 10, 11 och människor. 12 Dessutom induceras PspA-specifika slemhinnor och serum Abs-respons, och dessa svar medieras av både Th1- och Th2-typ cytokinproduktion med CD4 + T-celler hos spädbarnsmöss via moderimmunisering, 13 såväl som i åldriga möss. 14 Dessa fynd indikerar att PspA är ett potent antigen för utveckling av effektiva pneumokockvacciner, inte bara hos vuxna utan också hos barn och äldre.

S. pneumoniae koloniserar vanligtvis näshåligheten, som kan skyddas av slemhinnea IgA. 15, 16, 17 Nasalvaccination inducerar effektiva immunsvar på slemhinnan i luftvägarna, där initiala bakteriella och virala infektioner vanligen förekommer; det kan därför vara en effektiv immuniseringsstrategi för att leverera skydd mot pneumokockinfektion. Emellertid är de flesta vacciner av subenhetstyp dåliga immunogener för induktion av antigenspecifikt immunsvar i både systemiska och mukosala immunfack när de administreras nasalt. Således behövs samadministrering av biologiskt aktiva slemhinnehjälpmedel (t.ex. koleratoxin och värmelabilt toxin) eller ett bättre leveranssystem för att övervinna nackdelarna med exponering av nasalt antigen. Emellertid finns det för närvarande inga säkra näsadjuvans eller leveranssystem, vilket utvärderas genom säkerhetsfarmakologiska studier, såsom absorption, distribution, metabolism och utsöndring i prekliniska studier.

För att övervinna dessa problem utvecklade vi nyligen ett effektivt vaccinleveranssystem med en självmonterad nanosized hydrogel (nanogel), som består av en katjonisk typ av kolesterylgruppbärande pullulan (cCHP). 18 Denna cCHP-nanogel levererar effektivt ett antigen till epitelceller i näshålan såväl som till dendritiska celler (DC) under källarmembranet, och inducerar antigenspecifika immunsvar som ett adjuvansfritt vaccin. 19, 20 Vidare visade en radioisotopräkningsanalys att nasalt administrerat cCHP-nanogel som bär den [ 111 In] -märkta icke-toxiska underenheten av botulinumneurotoxin inte ackumuleras i delar av centrala nervsystemet (CNS) hos möss. 19 I vår separata studie demonstrerade vi att ett nasalt administrerat PspA-nanogel-vaccin är säkert och inducerar starka antigen-specifika systemiska och mukosala Ab-immunsvar, som kan skydda möss från invasiv utmaning med S. pneumoniae . 21

MicroRNA (miRNA) har framkommit som viktiga regulatorer för många biologiska processer associerade med immunsystemet, inklusive funktionen hos både medfödda och adaptiva immunsvar. 22, 23, 24 Ackumulerande bevis tyder på att miRNA har en väsentlig roll för att framkalla immunsvar. Till exempel har möss med T-lymfocyter, i vilka endoribonukleasdicern, vilket är kritiskt för miRNA-biogenes, på ett villkorat sätt utvisats försämrad tymisk utveckling och minskad Th-celldifferentiering. 25, 26 Dicer-brist i B-celler förhindrar också utveckling av B-celler. 27 Dessa fynd indikerar de kritiska funktionerna hos miRNA i biologin hos cellerna som utgör immunsystemet, såsom vid utveckling och differentiering av lymfocyter. Därför är det viktigt att identifiera miRNA-biomarkörer som deltar i både slemhinnor och systemiska antikroppssvar inducerade av nasal immunisering med PspA-nanogel. Tillsammans kommer en bättre förståelse av det exakta engagemanget av miRNA i att förmedla humoral och skyddande immunitet vara fördelaktigt för utvecklingen av effektiva slemhinnevacciner.

Innan vi genomförde en klinisk prövning av ett PspA-nanogel-baserat vaccin, designade vi experiment för att utvärdera dess säkerhet för CNS och dess immunologiska effektivitet, inklusive immunologiskt relevant miRNA-uttryck, och för att demonstrera dess säkerhet och effekt i icke-mänskliga primater.

Resultat

[ 18 F] -PspA-nanogel kvarhålles under lång tid i näshålan men deponeras inte i luktlökarna eller hjärnan efter nasal administrering i makaker

Vi bekräftade initialt den fysisk-kemiska karaktäriseringen av PspA-nanogel-vaccin som användes i denna studie (kompletterande figur S1 online), och undersökte sedan retentionen av nasal PspA-nanogel i näshålan och dess ackumulering i luktlökarna och CNS i icke-humana primater med användning av tre naiva rhesusmakaker. Eftersom resultaten var nästan identiska för de tre makakerna, visar vi resultaten för endast en av makakerna i figur 1 (primat nr 1). Makackens huvud placerades i skannersystemet positron emission tomography (PET) och realtidsavbildning gjordes under 6 timmar. För att bekräfta den exakta positionen för cerebrummet utförde vi en magnetisk resonansavbildning (MRI) och överlagrade sedan PET-bilderna på MR-bilderna. PET-bilderna i realtid visade tydligt att nasalt administrerat [18F] -PspA-nanogel effektivt levererades till nässlemhinnan och hölls kvar i näsvävnaderna i upp till 6 timmar (figur la, c). Däremot hade de flesta av den fria formen av [18F] -PspA utan nanogel försvunnit från näshålan 3 timmar efter nasal administrering (figur la). Vidare detekterades ingen avsättning av [18F] -PspA i cerebrum eller luktkulor av makaker, inte ens 6 timmar efter näsadministrering (figur Ib). Dessa resultat visar att PspA-nanogel är ett CNS-säkert och effektivt nasalvaccinadministrationssystem i icke-mänskliga primater.

Image

PET / MRI-bilder ( a, b ) och TAC ( c ) för nasal administrering av [18F] -PspA-nanogel eller [18F] -PspA-PBS i en naiv rhesus-makak. ( a ) Efter nasal administrering av [18F] -PspA-nanogel eller [18F] -PspA-PBS skannades makakens huvud under 6 timmar med en PET-skanner. PET-bilder i realtid överlagda på MR-bilder visas under de angivna tiderna efter administrering. ( b ) För att ytterligare kontrollera om [18F] -PspA ackumuleras i CNS- eller luktlökorna (indikerade med pilspetsar) förstorades PET-bilder tagna 6 timmar efter administrering av [18F] -PspA-nanogel. ( c ) TAC för näshålan under 6 timmar efter nasal administrering av [18F] -PspA-nanogel eller [18F] -PspA-PBS. Uppgifterna uttrycks som procenttal av den dos som återstår efter nasal administrering. a : Samma makak administrerades nasalt av [18F] -PspA-nanogel eller [18F] -PspA-PBS med ett veckors intervall mellan administreringarna. CNS, centrala nervsystemet; MR, magnetisk resonansavbildning; PET, positronemissionstomografi; TAC: er, tidsaktivitetskurvor.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Nasalvaccination med PspA-nanogel inducerar slemhinnor och systemiska Ab-svar i makaker

Därefter undersökte vi om det nasala PspA-nanogel-vaccinet inducerade PspA-specifika immunsvar i cynomolgus-makaker (primater # 2- # 9). En vecka efter den slutliga immuniseringen ökade PspA-specifikt IgG Ab-svar i serum signifikant i makaker som nasalt immuniserades med 25 μg PspA-nanogel jämfört med makaker immuniserade med PspA enbart eller PBS endast (figur 2a). Undersökning av livslängden hos PspA-nanogel-inducerade serumantigenspecifika IgG Ab-titrar avslöjade att Ab-nivåerna gradvis minskade under en period av 8 månader i makaker som nasalt immuniserats med PspA-nanogel. På liknande sätt uppvisade PspA-specifik bronkoalveolär sköljvätska (BALF) IgG och nasala tvätt-IgA Ab-svar högre nivåer i makaker nasalt immuniserade med PspA-nanogel jämfört med makaker som nasalt immuniserats med PspA enbart eller PBS endast (figur 2b, c), och dessa Ab-nivåerna sjönk också gradvis. Dessutom ökade PspA-specifika BALF IgA Ab-svar något i två av de immuniserade makakerna (nr 3 och # 5) (figur 2c).

Image

Nasal immunisering med PspA-nanogel inducerade PspA-specifika Ab-svar i makaker. Varje cynomolgus-makak immuniserades nasalt med PspA-nanogel (makaker # 2- # 6), PspA ensam (# 7 och # 8) eller endast PBS (# 9) vid de tider som indikerades med pilar. Serum, nästvätt och BALF uppsamlades och nivåerna av PspA-specifikt serum IgG ( a ), nasaltvätt IgA ( b ) och BALF IgG och IgA ( c ) bestämdes med ELISA. BALF, bronkoalveolär sköljvätska.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

När dessa makaker gavs en dos av nasal booster av PspA-nanogel 9 månader efter den slutliga immuniseringen, återhölls nivåerna av PspA-specifikt serum och BALF IgG och nasala tvätt-IgA Ab-svar omedelbart till de som observerades 9 veckor efter det initiala PspA- nanogel-immunisering (figur 2a – c). Av betydelse inducerade en nasal booster högre nivåer av PspA-specifika IgA Ab-svar i BALF av två makaker (# 5 och # 6) än de som observerades efter den primära immuniseringen (figur 2c).

Dessa fynd tyder på att PspA-specifika Ab-svar av minnestyp induceras i icke-mänskliga primater efter näsvaccination med PspA-nanogel. PspA-nanogel är därför en lovande nasal vaccinekandidat som kan inducera långvarig antigen-specifik systemisk och slemhinnorimmunitet och kan framkalla nasal boosteraktivitet i icke-humana primater.

Nasal immunisering med PspA-nanogel inducerar neutraliserande Abs mot S. pneumoniae i makaker

För att undersöka om det nasala PspA-nanogel-vaccinet inducerade neutraliserande Abs, undersökte vi om PspA-specifikt serum Abs från makaker som nasalt immuniserats med PspA-nanogel passivt skulle skydda mot pneumokockinfektion. CBA / N-möss injicerades intraperitonealt med utspädd poolad sera av makaker nasalt immuniserade med PspA-nanogel, endast PspA eller PBS. När alla grupper av möss utmanades med S. pneumoniae Xen10- eller 3JYP2670-stam via den intravenösa vägen, var möss passiva immuniserade med sera från makaker nasalt immuniserade med PspA-nanogel fullständigt skyddade i minst 2 veckor (figur 3a, b). Däremot dog möss som fick sera från makaker som gavs nasal PspA ensam eller PBS endast inom 5 dagar efter utmaning (figur 3a, b). Dessa resultat demonstrerade att skyddande immunitet med korsreaktivitet av subtyp inducerades av nasal PspA-nanogel-vaccination.

Image

Neutraliserande Abs inducerad av nasal immunisering med PspA-nanogel. Serum från var och en av makakerna uppsamlades en vecka efter den slutliga primära nasala immuniseringen med PspA-nanogel, PspA enbart eller PBS endast. CBA / N-möss (10 möss per grupp) överfördes passivt med 100 ul utspädd (1:20) poolad sera via ip-väg. Fyra timmar senare injicerades möss iv med 1, 5 x 104 cfu S. pneumoniae Xen 10 ( a ) eller 1 x 10 ^ cfu S. pneumoniae 3JYP2670 stam ( b ). Mössen övervakades dagligen med avseende på dödlighet. Varje rad representerar medianöverlevnadstiden. cfu, kolonibildande enhet; ip, intraperitoneal; iv, intravenöst.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Nasal immunisering med PspA-nanogel inducerar Th2- och Th17-svar i makaker

Eftersom makaker som nasalt immuniserats med PspA-nanogel visade höga IgG / IgA Ab-svar, bestämde vi nästa nivåer av cytokinproduktion i CD4 + T-celler isolerade från blod från makakerna. De makaker som nasalt immuniserats med PspA-nanogel uppvisade ökade nivåer av IL-4 och IL-17-produktion med CD4 + T-celler jämfört med makaker som gavs PspA enbart eller endast PBS (figur 4b, c). Emellertid producerades väsentligen identiska nivåer av IFN-y av CD4 + T-celler isolerade från makaker nasalt immuniserade med PspA-nanogel, PspA enbart eller PBS endast (figur 4a). Vidare visade vi att nasal immunisering med PspA-nanogel inducerade PspA-specifika IgG1 Ab-svar, vilket är kännetecknet för immunresponsen av Th2-typ (figur 4d). Dessa resultat indikerade att det nasala PspA-nanogel-vaccinet kunde inducera Th2- och Th17-cytokinsvar.

Image

PspA-nanogel-immunisering producerade CD4 + Th2- och Th17-typ cytokinsvar. CD4 + T-celler separerades från PBMC: erna 1 vecka efter boosteren. Renade CD4 + T-celler odlades med bestrålade APC: er och 5 ug ml-1 PspA med antikroppar mot CD28 och CD49d under 5 dagar. Nivåerna av cytokinerna, IFN-y ( a ), IL-4 ( b ) och IL-17A ( c ) i supernatanterna mättes. Detta experiment upprepades i tre exemplar. Värden visas som medel ± sd i varje experimentell grupp. ** P <0, 01 jämfört mellan PspA-nanogel och PspA / PBS-grupper. ( d ) Serum från makaker uppsamlades 1 vecka efter den slutliga primära nasala immuniseringen med PspA-nanogel (# 2- # 6), PspA ensam (# 7, # 8) eller endast PBS (# 9). Uttrycksnivåer av PspA-specifikt serum-IgG-underklass Abs bestämdes med användning av ELISA. APC: er, antigenpresenterande celler; IFN, interferon; IL, interleukin; PBMC, perifera mononukleära blodceller.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Nasal immunisering med PspA-nanogel ökar expressionsnivån för miRNA i serum och andningsvävnader i makaker

För att undersöka rollerna hos miRNA i induktionen av PspA-specifik immunitet utförde vi miRNA-mikroarray-analys för att identifiera immunologiskt associerade skillnader i serum-miRNA-profiler mellan pre-immuniserade och post-boostade makaker (data visas inte). Vi valde några immunologiskt relevanta miRNA, nämligen miR-181a, miR-326, miR-155, miR-17, miR-18a, miR-20a och miR-92a, vars nivåer var uppreglerade i serumprover efter booster jämfört med förimmuniserade serumprover. För att ytterligare bekräfta om dessa immunologiskt relevanta miRNA var uppreglerade eller nedreglerade i serumprov efter booster jämfört med pre-immuniserade eller pre-booster serumprover utförde vi kvantitativa RT – PCR av dem. Uttrycksnivåer av miR-326, Th17-celldifferentieringsrelaterad miRNA och miR-181a, T-cell och B-celldifferentieringsrelaterad miRNA ökades signifikant i serum av makaker med en nasal boosterdos av PspA-nanogel när jämfört med kontrollmakaker som pre-immunisering (figur 5a). Nivåerna för de två miRNA: erna visades också signifikant högre i andningsvävnaderna, inklusive näsvävnader och lungor, hos makaker som gav en boosterdos av PspA-nanogel än nivåerna i motsvarande vävnader i kontrollmakaker med PspA enbart eller PBS endast som sattes till 1 (figur 5b, c). Vidare analyserade vi expressionsnivån för Ets-1, som är en känd negativ regulator av Th17-celler och är det funktionella målet för miR-326. Vi upptäckte en signifikant minskning av expressionsnivån för Ets-1 mRNA i lungorna hos makaker med en boosterdos av PspA-nanogel jämfört med de hos kontrollmakaker som gavs endast PspA eller PBS (figur 5c). Dessa resultat antyder att dessa miRNA har viktiga roller i T-cell- och B-celldifferentiering och i Th17-cytokinrespons efter nasal immunisering med PspA-nanogel i makaker.

Image

MiRNA-expressionsnivåer i sera ( a ), näsvävnader ( b ) och lungvävnader ( c ) av makaker som är nasalt immuniserade med PspA-nanogel, PspA enbart eller PBS. Uttrycksnivåer för det angivna miRNA- och Ets-1-mRNA analyserades med kvantitativ RT – PCR och normaliserades till nivåerna av miR-16 respektive ß-aktin. Värden visas som medel ± sd i varje experimentell grupp. * P <0, 05, ** P <0, 01 jämfört mellan pre-immunisering och post-booster-grupper. b , Jämfört mellan PspA-nanogel och PspA / PBS-grupper i post-booster-makaker. MiRNA, mikroRNA; Pre, pre-immuniserat serum; Post, serum efter booster.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Diskussion

Genom att använda ett icke-mänskligt primatsystem visade vi att det nasala PspA-nanogel-vaccinet inte ackumulerades i CNS och inducerade effektivt både slemhinnor och systemisk immunitet associerad med skydd mot pneumokockinfektion. Så vitt vi vet är denna studie den första som rapporterar säkerheten och effektiviteten hos ett nasalt PspA-vaccin i makaker; därför ger våra resultat en konkret grund för att testa vårt nanogelbaserade PspA-vaccin hos människor.

Nanogelen i sig är icke-immunogent material, och ett cancerspecifikt protein (t.ex. Her 2) komplex med en neutral CHP-nanogel producerad med god tillverkningssed (GMP) har använts som ett injicerbart cancervaccin i klinisk forskning. 28 I vår tidigare studie inducerar nasal immunisering med CHP-nanogel innehållande PspA effektiva antigen-specifika immunsvar hos möss 21 men inte i makaker (data visas inte); därför utvecklade vi i den aktuella studien en cCHP-nanogel innehållande 20 aminogrupper per 100 glukosenheter för att förbättra antigenleveransen till det nasala epitelskiktet av makaker. Vi bekräftade den perfekta komplexbildningen och storleken på PspA-nanogel-komplexet med användning av fluorescensresponsenergi-överföring (FRET) -analys och dynamisk ljusspridning (DLS): cCHP-nanogelen bildade spontant nanopartiklar efter införlivandet av PspA (kompletterande figur S1a, b). 18, 19 Dessutom, i överensstämmelse med dess positiva zeta-potential (kompletterande figur S1b), visade in vivo PET- och MR-avbildning i makaker tydligt att nasalt administrerat cCHP-nanogel som bär [18F] -märkt PspA levererades mer effektivt och kontinuerligt vid nässlemhinnan i makaker jämfört med nasalt levererat [18F] -PspA enbart. Dessa resultat indikerade att den nya katjoniska gruppmodifierade cCHP-nanogelen skulle kunna leverera vaccinantigenet till det anjoniska nasala epitelet efter nasal administrering i makaker. I själva verket har våra tidigare musmodellstudier visat att nanogel-antigenkomplexet bibehålls och tas upp i epitelet genom endocytos, där antigenet frigörs från nanogelen i epitelet genom stark chaperonliknande aktivitet. Antigenet frigörs sedan från nasalt epitel genom exocytos och tas sedan upp effektivt av DC. 19, 21

Nyligen genomförda studier av nasala vacciner har orsakat oro över deponering och ansamling av kandidatvaccinantigener eller samadministrerade slemhinnehjälpmedel i CNS genom direkt transport från näshålan till cerebrum via luktvägarna. 29, 30 Det har också rapporterats att många peptider och proteiner kringgår blod-hjärnan och blod-cerebrospinal vätskebarriärer för att nå CNS efter näsadministrering hos människor. 31 I denna studie visade vi att det inte fanns någon avsättning eller ansamling av [18F] -PspA i CNS under en period av upp till 6 timmar efter nasal administrering av [18F] -PspA-nanogel i makaker. Eftersom vi validerade detektionsgränsen för vårt PET-system för [18F] -protein genom direkt vävnadsräkning i vår tidigare studie, var 32 [18F] radioaktivitet i denna studie <0, 05 SUV i cerebrum och luktkulor i makakerna. Därför visade våra nuvarande resultat att cCHP-levererat nasalt PspA-vaccin inte nådde CNS för makaker, även om det luktande epitelet i näshålan är anslutet till CNS, 31 vilket därmed bekräftar vaccinets säkerhet hos högre däggdjur.

Det mukosala immunsystemet består av både induktiva och effektorställen och har en nyckelroll i induktion och reglering av dynamiska immunsvar, inklusive det Th2-typ-cellberoende SIgA-svaret, det mukosala cytotoxiska T-cell-svaret och Th17- cellmedierat immunreglerande svar. 33 I allmänhet tros IgA i slemhinnevävnad ha en viktig roll i skyddet mot andningspatogener inklusive S. pneumoniae . 15, 16, 17 I den här studien visade vi att PspA-nanogel-vaccinet också inducerade slemhinne-antigenspecifikt slemhinne-IgA och systemiska IgG Ab-svar i makakerna. Speciellt har serum och BALF IgG, den huvudsakliga isotypen av antikroppar i det nedre andningsfacket, nyckelroller i överlevnad mot dödlig utmaning med S. pneumoniae. 34 Det är viktigt att de makakiska IgG-antikropparna mot PspA, som stöds av CD4 + Th2-typ cytokin IL-4, hade skyddande aktivitet mot S. pneumoniae. När möss systemiskt utmanades med S. pneumoniae Xen10 eller 3JYP2670 efter att möss passivt immuniserats med macaques sera innehållande PspA-specifikt Abs visade de fullständigt skydd. Våra resultat tyder på att detta skydd tydligt beror på antikroppsmedierad immunitet mot PspA. Dessa resultat överensstämmer med dem från en tidigare studie på möss som visade att nasalvaccination inducerar funktionella CD4 + Th2-typ cytokinmedierade IgG Ab-svar, som är tillräckliga för att ge lämpligt skydd i frånvaro av Th1-typ cytokin-svar. 16 Dessutom är induktion av BALF-IgG-svar väsentlig, eftersom antigenspecifikt IgG är känt för att utöva skydd på alveolär nivå för att främja fagocytos och förhindrar lokal spridning av pneumokocken och dess passage i blodet. 34 Dessa resultat visade att det nasala PspA-nanogel-vaccinet effektivt inducerade PspA-specifikt serum IgG med skyddande aktivitet utöver SIgA Ab-immunsvar i icke-mänskliga primater.

Nya studier har visat att specifika miRNA: er är involverade i T-cell- och B-cellutvecklings-, differentierings- och regleringsfunktioner. 24, 35 Speciellt uttrycks miR-181a starkt i mogna T-celler och har en viktig effekt på den positiva och negativa selektionsprocessen genom att kontrollera styrkan hos TCR-signalering under tymisk utveckling av T-celler för efterföljande Thl- och Th2-differentiering, vilket indikerar att miR -181a modulerar T-cellutveckling. 36 I denna studie var expressionsnivåerna för miR-181a i serum- och andningsvävnaderna, inklusive näsvävnader och lungor, signifikant högre i makaker som var nasalt immuniserade med PspA-nanogel än endast i de givna PspA enbart eller PBS, vilket indikerade att miRNA är implicerade i adaptiv immunitet genom att kontrollera aktiveringen av T-celler efter nasal immunisering med PspA-nanogel i icke-mänskliga primater. Vidare visade vi att nivåerna av miR-155, som krävs för produktion av IgG1 Abs med hög affinitet, ökades i PspA-nanogel-immuniserade makaker (kompletterande figur S2a – c). 37 Dessa resultat indikerade att PspA-nanogel-inducerad Th2-cytokinrespons medierades genom det ökade uttrycket av miR-155.

MiR-181a uttrycks också starkt i B-celler och inom benmärgsceller och kärncentrum B-celler, där det främjar differentiering av hematopoietiska stamceller till B-celler. 24, 38 För att utforska rollerna hos andra miRNA som också uttrycks starkt i germinala B-celler och är väsentliga för vuxna B-cellutveckling, undersökte vi uttrycket av MiR-17-92 klustret. 39, 40 MiR-17-92-klustret reglerar differentiering av follikelhjälparens T-cell (Tfh-celler) genom att kontrollera migrationen av CD4 + T-celler till B-cellfolliklar, 41 vilket antyder att dessa miRNA har en viktig roll i produktionen av antigen- specifik SIgA Ab. Vi fann här att inte bara miR-181a-uttrycket utan också miR-17-92-klusteruttrycket ökade markant i näsvävnaderna i nasalt PspA-nanogel-immuniserade makaker (kompletterande figur S3). Detektion av dessa slemhinne-IgA-associerade miRNA i näsvävnaderna i nasalt PspA-nanogel-immuniserade makaker indikerar att de bidrar väsentligt till produktionen av slemhinna-IgA.

Det är välkänt att IL-17-medierade CD4 + T-celler är viktiga för generering av resistens mot slemhinnekolonisering genom andningspatogener inklusive S. pneumoniae hos människor och möss. 42, 43 Trzcinski et al. 44 visade att antigenspecifik CD4 + T-cellimmunitet är tillräcklig för att skydda mot nasofaryngeal kolonisering av S. pneumoniae hos möss. Studier på möss indikerade att pulmonala Th17-svar är associerade med migration av B-celler till luftvägar och med främjandet av polymer Ig-receptor (pIgR) -uttryck med luftvägsepitelceller. 45 Dessutom är Th17-celler en avgörande delmängd av Th-celler som är ansvariga för att inducera omkopplingen av germinala B-celler mot T-cellberoende IgA-produktion. 46 Vidare har IL-17-utsöndringsminne Th17-celler ökade genom human pneumokockvagn att rapporteras förbättra den medfödda cellulära immuniteten mot pneumokockutmaning. 47 Därför är det viktigt att bestämma om antigenspecifika CD4 + Th17-svar induceras genom nasal immunisering med PspA-nanogel i icke-mänskliga primater. Nyligen genomförda studier har visat att miR-326-medierad Th17-uppreglering kan ge värden en potentierande effekt för att rekrytera funktionella immunceller till lokala effektorställen som svar på patogenattack. 48 Vi fann här att nasal immunisering med PspA-nanogel i makaker föranledde generering av IL-17-producerande celler i perifera CD4 + T-celler. Dessutom visade vår miRNA-analys att expressionsnivåerna av Th17-associerad miR-326 i serum, näsvävnader och lungor ökade signifikant och att expressionsnivån för Ets-1 mRNA, en negativ regulator för Th17-differentiering, minskade i lungor i PspA-nanogel-vaccinerade makaker. Därför antyder vår upptäckt att miR-326-associerade IL-17-utsöndrande CD4 + T-celler genererades efter nasalvaccination med PspA-nanogel att det skulle vara användbart för utveckling av säkra och effektiva nasala vacciner mot lunginflammation och att serum miR- 326 kan användas som biomarkör för att utvärdera vaccineffektiviteten.

Sammanfattningsvis visade vi för första gången att ett nasalt PspA-nanogel-vaccin inducerade både humorala och cellulära immunsvar i makaker. Dessa resultat stöds av ökade expressionsnivåer av miR-181a och miR-326, vilka är kandidat-miRNA-biomarkörer för induktion av slemhinnorimmunitet. Dessutom visade en [18F] -PspA PET-studie långvarig retention av PspA i näshålan och ingen avsättning av PspA i makanernas CNS. Sammantaget visar dessa resultat effektiviteten och säkerheten hos nasalt PspA-nanogel-vaccin i icke-mänskliga primater. Vi drar slutsatsen att det nasala PspA-nanogel-vaccinet nu bör studeras på människor för dess möjliga användning som ett adjuvansfritt nasalt vaccin.

metoder

djur

Åtta kvinnliga naiva cynomolgusmakaker ( Macaca fascicularis , 5 år, ∼ 3 kg) användes för immuniseringsstudien och hölls vid Tsukuba Primate Research Center for Medical Science vid National Institute of Biomedical Innovation (NIBIO, Ibaraki, Japan). I ett separat experiment användes en naiv manlig rhesus macaque ( M. mulatta , 5–6 år, ∼ 5 kg) för PET-avbildningsstudien, som genomfördes vid PET Center i Hamamatsu Photonics KK för att analysera antikroppsskydd mot S. pneumoniae , kvinnliga CBA / N-möss (6 veckor gamla) köptes från Japan SLC (Shizuoka, Japan). Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för användning och vård av försöksdjur, och protokollet godkändes av djurkommittén för NIBIO, Hamamatsu Photonics KK och University of Tokyo.

Rekombinant PspA

Rekombinant PspA från S. pneumoniae Rx1, som tillhör PspA-familj 1 och clade 2, framställdes såsom beskrivits tidigare med liten modifiering. 10 I korthet användes plasmiden som kodar för PspA / Rx1 (GenBank-anslutning nr M74122; aminosyror 1 till 302, pUAB055) för att transformera E. coli BL21 (DE3) -celler. För att konstruera pUAB055 klonades ett 909-bp stort fragment av PspA från en pneumokockstam Rxl in i pET20b-vektorn (Novagen, Darmstadt, Tyskland) mellan Nco I och Xho I-ställena. Rekombinant PspA / Rx1 innehåller de första 302 aminosyrorna av mogna PspA plus sex polyhistidiner tillsatt genom proteinfusion vid den C-terminala änden. Den sonikerade cellsupernatanten laddades på en DEAE-Sepharose-kolonn (BD Healthcare, Piscataway, NJ) och en nickelaffinitetskolonn (Qiagen, Valencia, CA), följt av gelfiltrering på en Sephadex G-100-kolonn (BD Healthcare).

Beredning av rekombinant PspA – nanogel-komplex

CCHP-nanogelen (~ 40 nm storleken) genererad från katjonisk typ av kolesterylgruppbärande pullulan användes för alla experiment. Denna cCHP-nanogel innehöll 20 aminogrupper per 100 glukosenheter. PspA-cCHP-nanogelkomplexet för varje immunisering framställdes genom att blanda 25 | ig PspA med cCHP i ett molekylförhållande av 1: 5 (59, 45 ul per makak) och inkubera under 1 timme vid 46 ° C. FRET bestämdes med en FP-6500 fluorescensspektrometer (JASCO, Tokyo, Japan) med FITC-konjugerad PspA och TRITC-konjugerad cCHP nanogel. 18, 19 The hydrodynamic radius was assessed by means of DLS and the zeta-potential of cCHP carrying or not carrying, PspA was determined with a Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). 18, 19

Nasal immunization and sample collection

Cynomolgus macaques were nasally immunized five times at 2-week intervals with PspA-nanogel under ketamine anesthesia. For the control group, macaques were nasally administered with 25 μg of PspA alone, or PBS only. Eight months after the final immunization, the macaques were nasally boosted with the same amount of PspA-nanogel, PspA alone or PBS only. Serum, nasal wash, and BALF were collected before primary immunization, 1 week after each immunization, 2, 4, 6, and 8 months after the final immunization, and 2 weeks after receipt of the booster.

PspA-specific ELISA

The antigen-specific Ab responses were analyzed by ELISA as described previously. 21 In brief, 96-well plates were coated with 1 μg ml −1 PspA in PBS overnight at 4 °C. After blocking with 1 % BSA in PBS-Tween, twofold serial dilutions of samples were added and incubated for 2 h at room temperature (RT). After washing of the samples, horseradish peroxidise (HRP)-conjugated goat anti-monkey IgG (Nordic Immunological Laboratory, Tilburg, The Netherlands) or HRP-conjugated goat anti-monkey IgA (Cortex Biochem, San Leandro, CA) diluted 1:1, 000 was added and incubated for 2 h at room temperature. For subclass analysis, sheep anti-human IgG1 and IgG2 (Binding Site, Birmingham, UK) and HRP-conjugated donkey anti-sheep IgG (Rockland, Limerick, PA) were used for detection. The reaction was developed with the use of TMB Microwell Peroxidase Substrate System (XPL, Gaithersburg, MD). End-point titers were expressed as the reciprocal log 2 of the last dilution that gave an OD 450 of 0.1 greater than the negative control.

Passive protection of mice with macaques' serum samples

Pooled serum samples from macaques nasally immunized with PspA-nanogel, PspA alone, or PBS only were diluted with PBS (1:20) and injected into CBA/N mice via the intraperitoneal route (100 μl per mouse). Four hours later, all groups of mice were challenged with 1.5 × 10 4 CFU S. pneumoniae Xen 10 (LD 50 =2 × 10 2 CFU for CBA/N mice) or 1 × 10 3 CFU S. pneumoniae 3JYP2670 strain (LD 50 =7 × 10 2 CFU for CBA/N mice) via the intravenous route and observed daily for death for 2 weeks. Information about S. pneumoniae strains is available in Supplementary Materials.

PspA-specific CD4 + T-cell responses

One week after the macaques had received the booster, lymphocytes were isolated from the peripheral blood by using Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). We could not separate the lymphocytes from two macaques (#3 and #6). After washing of the samples, CD4 + T cells were purified by using CD4 microbeads and magnetic cell sorting (AutoMACS; Miltenyi Biotec, Auburn, CA). The cells remaining after the removal of CD4 + and CD8 + T cells (by using CD8 microbeads) were used as antigen-presenting cells after irradiation at 3, 000 rad. Purified CD4 + T cells (1 × 10 5 cells/well) and antigen-presenting cells (0.5 × 10 5 cells/well) were resuspended in RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) supplemented with 10 % FCS and penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA), and were cultured in 24-well plates for 5 days in the presence of 5 μg ml −1 PspA with anti-CD28 (clone CD28.2) and CD49d (clone 9F10) antibodies (0.5 μg ml −1 each; eBioscience, San Diego, CA) at 37 °C in 5% CO 2 . Supernatants were then collected. The concentrations of the cytokines, IFN-γ, IL-4, and IL-17 in the supernatants were measured with a Monkey Singleplex Bead Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) and Bio-Plex 200 (Bio-Rad, Hercules, CA).

Synthesis of [ 18 F]-PspA

Purified PspA was radiolabeled by conjugation with N -succinimidyl-4-[ 18 F]fluorobenzoate ([ 18 F]SFB), which reacts with free amino groups, including the N-terminal and ɛ-Lys amino groups in the protein, as described previously. 19, 32 The product was purified by gel-permeation chromatography (Superose 12, PBS, 1 ml min −1 ), and the radioactive peak that eluted at 12.7 min was collected. The 615 MBq [ 18 F]-PspA was obtained at 150 min from the end of bombardment. The radiochemical purity and the decay-corrected radiochemical yield were 100 and 2.95%, respectively. The specific activity was 1, 798 to 4, 045 MBq mg −1 protein.

PET/MRI imaging in rhesus macaques

Because the half-life of [ 18 F] is only 110 min, we used the same naive macaque for nasal [ 18 F]-PspA-nanogel or [ 18 F]-PspA-PBS administration with a 1-week interval between administrations. After nasal administration of 50 MBq per 700 μl of [ 18 F]-PspA-nanogel or [ 18 F]-PspA-PBS (350 μl in each nostril), the macaque's head was tilted back for 10 min and then scanned in an upright position. PET scans were conducted for 345 min with frames of 25 × 3 min, followed by 27 × 10 min, with the use of a high-resolution animal PET scanner (SHR-7700; Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan). MRI images were recorded with Signa Excite HDxt (3T; GE Healthcare) to identify the cerebrum regions.

Image data analysis

PET data were analyzed by means of the PMOD software package (PMOD Technologies, Zurich, Switzerland). Each PET image was superimposed on the corresponding MRI data to identify the volume of interest. Time-activity curves (TACs) of PET/MRI images were expressed as % remaining dose.

MiRNA expression levels in serum and respiratory tract tissues

Serum samples were collected before primary immunization and after booster with PspA-nanogel, PspA alone, or PBS only. The respiratory tract tissues, which included nasal epithelial and lung samples, were collected after booster immunization with PspA-nanogel, PspA alone, or PBS only. Total RNAs were isolated from serum by using TRIzol LS reagent, and from nasal tissue or lung by using TRIzol reagent (Invitrogen) following the manufacturer's protocol. All the miRNAs in the sample were polyadenylated by using poly(A) polymerase and ATP (Invitrogen). Following polyadenylation, SuperScript III RT and a specially designed Universal RT Primer (Invitrogen) were used to synthesize cDNA from the tailed miRNA population. Each of the first-strand cDNAs was analyzed by quantitative RT-PCR with Fast SYBR Green Master Mix and Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). The expression levels were normalized to miR-16, which is a commonly used internal control for miRNA expression. 49, 50

Analysis of Ets-1 expression

After total RNAs were isolated from lung tissue, cDNA was synthesized by using PrimeScript RT Master Mix (Takara, Shiga, Japan) following the manufacturer's protocol. The cDNA was analyzed by quantitative RT–PCR with Fast SYBR Green Master Mix and Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). The PCR primers were used as follows: Ets-1: F, 5′-TGGAGTCAACCCAGCCTATC-3′ and R, 5′-TCTGCAAGGTGTCTGTCTGG-3′; β-actin: F, 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′ and R, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. The expression levels were normalized to that of β-actin.

Statistisk analys

The results are presented as means ± sd Student's t -test was used for comparisons among groups. The P values <0.05 or <0.01 were considered to indicate statistical significance.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    TILLÄGGSMATERIAL är länkat till onlineversionen av tidningen på //www.nature.com/mi