Nanocurcumin – pyrroloquinoline formulering förhindrar hypertrofi-inducerad patologisk skada genom att lindra mitokondriell stress i kardiomyocyter under hypoxiska förhållanden | experimentell & molekylär medicin

Nanocurcumin – pyrroloquinoline formulering förhindrar hypertrofi-inducerad patologisk skada genom att lindra mitokondriell stress i kardiomyocyter under hypoxiska förhållanden | experimentell & molekylär medicin

Anonim

ämnen

  • Hjärthypertrofi
  • Prognostiska markörer

Abstrakt

Denna studie undersöker den terapeutiska effekten av en nanocurcuminformulering (NCF) innehållande nanocurcumin (NC) och pyrroloquinoline kinon (PQQ) på förbättrad hypoxi-inducerad stress i hypertrofierad primär human ventrikulär kardiomyocyter (HVCM) under hypoxiska förhållanden, såsom validerade i en Sprague råttmodell av kronisk hypobarisk hypoxi (cHH) -inducerad höger ventrikulär hypertrofi (RVH). Baserat på våra tidigare fynd har vi här analyserat förbättringen i NCF: s skyddande effekt mot mitokondriell skada. Elektrontransportkedjekomplexens aktiviteter analyserades som ett huvudoperativt centrum för mitokondriell homeostas, tillsammans med nyckelgen- och proteinmarkörer för mitokondriell biogenes, redoxfunktion, fettsyraoxidation, bioenergiskt underskott och cellöverlevnad. NCF-komplettering ger cytoskydd från hypoxiainducerad hypertrofi och skada i både in vitro- och in vivo- modeller samtidigt som mitokondriell homeostas bibehålls bättre än NC och PQQ enbart. Denna studie föreslår användning av NCF som en potentiell kandidatmolekyl för att ge skydd från hög höjd-inducerade sjukdomar i uppstigande.

Introduktion

Långvarig hypoxiinducerad hypertrofi kan orsaka patologisk skada i kardiomyocyter som förekommer i form av nedsatt mitokondriell homeostas. 1, 2, 3, 4 Den optimala funktionen av mitokondrier regleras tätt genom transkriptionell kontroll av kärngenomet, som kodar för mitokondriella regulatoriska proteiner, inklusive de som krävs för drift av elektrontransportkedja ( etc ) Komplex I – V. 5 Funktionerna hos dessa viktiga reglerande proteiner och komplex komprometteras emellertid under stress och orsakar cytoskada genom att främja överdriven läckage av fria radikaler (komplex I och III), 6 metabolisk obalans (komplex II och IV) 7 och bioenergiskt underskott ( Komplex V). 8 Studier har visat nära föreningar av nedsatt osv. Komplex i hjärt- och kärlsskada. 2, 9 Huruvida hypoxisk stress främjar skada på mitokondrier i hypertrofiska kardiomyocyter förblir emellertid oklart.

Flera molekylära vägar är involverade i moduleringen av hjärthypertrofi. Akt / Gsk-3p-medierad signalering förblir bland annat den viktigaste modulatoriska vägen. Akt och Gsk-3p är positiva respektive negativa reglerare för hjärthypertrofi. 10 Akt fosforylering och aktivering är direkt involverad i moduleringen av hjärthypertrofi genom att kontrollera nedströms signaleringskaskader. 11 I motsats till detta främjar fosforylering av Gsk-3p dess deaktivering och modulerar hypertrofi ytterligare. 12 studier har visat att Akt-fosforylering och aktivering främjar de-fosforylering av Gsk-3p, vilket i sin tur främjar hjärthypertrofi. Många studier har visat att den stressinducerade aktiveringen av Gsk-3p och den resulterande induktionen av hjärthypertrofi är skadliga. Vidare är Gsk-3p-aktivering direkt involverad i regleringen av primära transkriptionella regulatorer av hypertrofi, det vill säga GATA-4. 13 På liknande sätt förblir NFκB en viktig redoxkänslig transkriptionsregulator som krävs för att upprätthålla en mängd cellfunktioner, såsom celltillväxt, överlevnad och inflammation. 14 Den kanoniska vägen för signalering av NFκB (NFκB-p65 / RelA) har klargjorts väl som en potentiell regulator för kardiomyocythypertrofi. 15 Studier har visat att NFκB-uttryck är nödvändigt för att främja hypertrofisk tillväxt i kardiomyocyter. 16 Knock-out-studier som förlitar sig på borttagning av funktioner för antingen funktionella enheter eller hämmare av NFKB-stabilisatorer har visat sig vara dödliga i embryonal utveckling och kan modulera hjärtdysfunktion under stress. 17, 18 Förutom agonister, ligander och endotoxin-medierad början av NFKB-signalering är mitokondriella reaktiva syresorter (ROS) också avgörande involverade i cellulär patologi via aktiveringen av NFKB genom att reglera programmerad celldöd. 19, 20, 21 Emellertid är sambandet mellan hypoxi-inducerad NFKB-aktivering och dess potentiella effekt på mitokondriell homeostas i hypertrofiska kardiomyocyter fortfarande okänt.

Användning av naturliga bioaktiva föreningar främjar homeostas under stress med minimala oönskade effekter. I detta avseende har vi tidigare visat att nanotiserad curcumin (NC) förbättrar hypoxi-stress både in vitro och in vivo. 3, 4, 22, 23 Hypoxisk stress framkallar flera fysiologiska skador på normala fysiologiska funktioner. 24 Dessutom förlitar sig den normala funktionen av kardiomyocyter kritiskt på en optimal syretillförsel. Således kvarstår ett behov av mycket potenta bioaktiva terapeutiska föreningar för att avskaffa hypoxiinducerade försämringar. Därför antog vi att en kombination av terapeutiska bioaktiva föreningar kan visa en potentiell strategi för att minska hypoxi-inducerad mångfacetterad patologisk skada. Pyrroloquinoline kinon (PQQ), en naturlig poly-fenolisk, redox-faktor och antioxidantförening med högt näringsvärde, är en potentiell kandidat för att förbättra hypoxi-inducerad skada i kardiomyocyter. 25 PQQ kan reglera biologiska funktioner, 26 inklusive mitokondriell biogenes, 27 redoxfunktioner 28, 29 och reproduktiv hälsa. 30 För att ytterligare förbättra de terapeutiska egenskaperna hos NC föreslår vi att man använder en nanocurcumin-formulering (NCF) bestående av NC och PQQ tillsammans som en potentiell kandidatmolekyl för att förbättra hypoxi-inducerad stress i hypertrofiska kardiomyocyter.

Material och metoder

Ultrena kemikalier av molekylär kvalitet, inklusive PQQ (D7783), anskaffades från Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) eller som på annat sätt anges. Antikroppar köptes från SantaCruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA, eller som annat anges. Nanocurcumin (medelpartikelstorlek 200 nm, zeta-potential -131 mV) erhölls som en vänlig present från professor Santosh Kar (KIIT University, Odisha, Indien).

Studera design

Studien utformades för att förbereda, karakterisera och utvärdera förbättringar i NCF: s skyddande effekt i in vitro- och in vivo- modeller av hypoxiainducerad hypertrofi. Här analyserade vi effekterna av hypoxisk stress på förändringar i mitokondriella regulatorer av homeostas och dess effekter på funktionerna i etc- komplex. Vi bedömde också effekten av NF KB-aktivering på molekylregleringen av hypoxiainducerad hypertrofi. Experimentella djur och cellodlingsstudier utfördes i åtta experimentgrupper, det vill säga normoxia vehikelkontroller (NVC), normoxia plus nanocurcumin (N + NC), normoxia plus PQQ (N + PQQ), normoxia plus nanocurcumin formulering (N + NCF), hypoxi-vehikelkontroller (HVC), hypoxi plus nanokurcumin (H + NC), hypoxi plus PQQ (H + PQQ) och hypoxi plus nanocurcumin-formulering (H + NCF). Steril, neutral fosfatbuffrad saltlösning (PBS) användes som bärare. Alla resultat jämfördes med NC- eller PQQ-behandlade djur för att jämföra förbättringar i den terapeutiska potentialen för NCF under hypoxiska förhållanden.

Förberedelse och karakterisering av NCF

En detaljerad beskrivning av beredningen och karakteriseringen av NCF finns i det kompletterande materialet.

Cellodling, exponering för hypoxi och proteinisolering

HVCM-celler bibehölls under betingelserna för normoxi eller hypoxi såsom tidigare beskrivits. 3 Kärn- och cytoplasmatproteinextrakt och proteinuppskattningar framställdes enligt metoden som beskrivits tidigare. 4

In vitro- upptag och toxicitetsanalys av NCF

NCF suspenderades i steril PBS, och suspensionen stabiliserades via ultraljudbehandling under 15 minuter vid 4 ° C (Sonics Vibra Cell, Sonic and Materials, Inc., Newtown, CT, USA, pulscykel 9 s, amplitud 40%) . Cellupptaget av NCF utvärderades enligt metoden beskriven av Kunwar et al. 31 Kortfattat odlades HVCM-cellerna till sammanflöde i svarta plattor med 96 brunnar och inkuberades med 100 mikrometer NCF under 24 timmar. Odlingsmediet avlägsnades och celler tvättades två gånger med PBS. Spektro-fluorometrisk analys (FLUOStar Omega, BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) utfördes för att utvärdera den cellulära upptagningen av NCF (excitationsvåglängd / emission våglängd, det vill säga λ ex / λ em läst vid 360/420 nm för NC och 360 / 460 nm för PQQ). En ökning av NCF-upptag representerades som en procentuell förändring jämfört med normoxi-vehikelkontrollceller.

En detaljerad beskrivning av cytotoxicitetsanalys in vitro kan hittas i det kompletterande materialet.

Cellulär livskraft och hypertrofi

En detaljerad beskrivning finns i det kompletterande materialet.

Analys av mitokondriell skada under hypoxiska tillstånd i HVCM-celler

Hypoxiainducerade förändringar i mitokondriell membranpotential (ψ m ) analyserades som indikation på mitokondriell skada med användning av ett MitoLight Apoptosis Detection-kit (APT242, Millipore, Billerica, MA, USA), och bilder förvärvades (× 40) med användning av ett fluorescerande mikroskop ( IMAGER.M2, AxioCam MRc5, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Vidare analyserades cellulär oxidativ stress i HVCM-celler under hypoxiska förhållanden för bekräftelse av cytoskada. Mitokondrial redoxbalans bedömdes genom utvärdering av MnSOD (Mangan-superoxid-dismutas) -aktivitet och ROS-läckage såsom tidigare beskrivits. 4, 32

Immunocytofluorescence

En detaljerad beskrivning finns i det kompletterande materialet.

Experimentella djur och etik uttalande

Åldersmatchade vuxna Sprague-Dawley-råttor för vuxna (220 ± 10 g) (6–8 veckor) användes för alla experimenten. Experimentella djur förvarades i institutets experimentella djurfacilitet i rena burar och hade lika tillgång till vatten och standard chow (Lipton India Ltd., Västra Bengal, Indien), varvid en normal 12 timmars ljus och mörk cykel hölls vid 28 ± 2 ° C temperatur och relativ luftfuktighet (55 ± 2%). Alla experiment godkändes av den institutionella djuretiska kommittén i enlighet med kommittén för syfte att kontrollera och övervaka experiment på djur (27/1999 / CPCSEA), Indiens regering.

Toxicitetsbedömning in vivo

Sub-akut toxicitet hos råttor kompletterat med 2000 mg kg -1 per dag NCF, po under 28 dagar utfördes genom att följa OECD: s riktlinjer. Djuren övervakades noggrant för förändringar i kroppsvikt, pälsstruktur och beteende och utveckling av hudinfektioner. Efter genomförandet av experimentet dödades djuren genom en överdosering av ketamin (80 mg kg - 1 vikt) och xylazin (10 mg kg - 1 vikt) som tidigare beskrivits. 23 Blod togs ut genom vänstra ventrikulär punktering och utsattes omedelbart för blodgasinnehållsanalys med användning av en i-STAT-analysator (Abott, IL, USA) och hematologisk profilering (MS-4 Autoanalyzer, Melet Schloesing Laboratory, Osny, Frankrike). Djur efter fixering av blod fixerades i 4% neutral paraformaldehyd (PFA) för histopatologiska analyser av lever, hjärta och lungor.

Farmakokinetisk bedömning av NCF i Sprague-Dawley-råttor

En detaljerad beskrivning finns i det kompletterande materialet.

Morfometri-analys och RVH

Morfometri-analys av höger ventrikulär hypertrofi (RVH) utfördes genom analys av Fultons index (RV / LV + S och RV / BW) och histopatologisk bedömning via Massons trikromfärgning som tidigare beskrivits. 22 Cirkulerande nivåer av förmaks natriuretisk faktor (ANF) (ab108797, Abcam, Cambridge, UK) och natriuretisk peptid i hjärnan (ab108816, Abcam) uppskattades som markörer för hjärthypertrofi med kommersiellt tillgängliga ELISA-satser; analyserna utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Vävnadsfördelning av ANF undersöktes som en markör för hypertrofi genom immunohistokemi, och förändringar i vävnadsarkitektur analyserades genom immunfluorescensfärgning med användning av a-aktin / DAPI. Validering av cHH-inducerad RVH utfördes genom att analysera den viktiga molekylvägen för reglering av hypertrofi, det vill säga den Akt / Gsk-3p-medierade signalkaskaden. 33

Förändringar i lungvaskulärarkitektur och exponering för morfometri efter cHH gjordes i PFA-fixerad lungvävnad genom H&E-färgning. Vävnadssektioner visualiserades mikroskopiskt för steg i medial väggtjocklek i lungarterie och förändringar i lungvaskulär arkitektur. 34

Isolering och funktionell analys av hjärtmitokondrier

För att utvärdera skador på oxidativ fosforylering (OXPHOS) maskiner utfördes kvantitativa analyser av kompletta etc Complexes aktiviteter. I korthet isolerades mitokondrier från HVCM-celler (Mitochondria Isolation Kit, 89879, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) och utsattes för analys av komplex I (AAMT001, Millipore), komplex II och III (ab109905, Abcam), komplex IV ( aktiviteter ab109911, Abcam) och Complex V (AAMT005, Millipore) med kommersiellt tillgängliga kit.

För validering av in vitro- fynd isolerades mitokondrier från högra ventriklar (Mitochondria Isolation Kit, 89801, Thermo Fisher) och utsattes för en kvantitativ utvärdering för förändringar i mitokondriella etc- komplex med Western blot (Total OxPhos Complex Kit, 458099, Invitrogen, Waltham, MA, USA). Analys av komplexa I – V-aktiviteter utfördes som nämnts ovan. Vidare förändringar i gen- och proteinuttrycksnivåer för nyckelregulatorer för mitokondriell biogenes (mtTFA, Nrf1, Nrf2 och PGC1a), fettsyrametabolism (PPARa / β / γ), redox-funktion (Nox-2, Cox-2), bioenergisk funktion (UCP-2, UCP-3) och cellulär spridning (Bcl2 / Bax) undersöktes via polymeraskedjereaktion (PCR) respektive Western blot.

Halvkvantitativ polymeraskedjereaktion

En detaljerad beskrivning finns i det kompletterande materialet och en lista över grundläggare finns i tilläggstabellen T1.

Immunoblot-analys

En detaljerad beskrivning finns i det kompletterande materialet.

Statistisk analys

Data uttrycks som medel ± standardavvikelser (SD) för varje experimentell grupp utförd i tre exemplar. Resultaten analyserades med avseende på statistisk signifikans med användning av envägs ANOVA. Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid * P 0, 05 vs NVC, ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC och ## P 0, 01 mot HVC. Icke-signifikanta förändringar visas som NS.

Resultat

Karaktärisering av NCF

FTIR-spektrumet av NCF förväntades belysa det komplexa utseendet på variabla toppar som egenskaper hos PQQ (innehållande flera bindningar inklusive NH- och CN-grupper) och signaturtoppar av curcumin.

FTIR-spektrumet av NCF avslöjade distinkta mönster av breda och skarpa toppar som sträcker sig från 650 till 4000 cm −1 . Utseendet på tydligt vassa toppar vid 648 respektive 1028 cm −1 visade närvaron av CH-krökningar respektive CN-sträckor. 35 En stark topp på 1280, 7 cm −1 indikerade en CH-vagnstruktur. 36 Det på varandra följande utseendet på starka toppar vid 1371, 3 och 1431, 1 cm −1 indikerade sträckningsvibrationer av CH 3 respektive CC-bindningar. Utseendet på breda toppar vid 1633, 6 cm −1 och en stark topp på 1587 cm −1 visade sträckningsvibrationer av CC- och NH-böjkonstruktioner. 35 En bred topp från 2800 till 3000 cm −1 visade närvaron av HC = O: CH-böjningar tillsammans med CH-sträckor. Toppar i intervallet 3500–3750 cm −1 verkade som karakteristiska för curcumin, med starka toppar vid 3631 och 3745 cm −1, vilket indikerar vibrationer av OH-sträckningar i ringstrukturer 35 (figur 1a).

FTIR-analysen av nanocurcumin-formulering (NCF) ( a ) tillsammans med SEM och TEM ( b ) och plasmainterhållningskinetiken för NCF i råttor ( c ).

Bild i full storlek

DLS-analysen visade konsekvent förbättringar i fysikalisk-kemiska egenskaper hos NCF när det gäller zeta-potential, partikelstorlek, elektroforetisk rörlighet och konduktivitet jämfört med NC. Zeta-potentialen för NCF var −50, 3 mV (−30 mV i NC), med en genomsnittlig partikelstorlek 1955 nm (212 nm i NC). Den elektroforetiska rörligheten och konduktiviteten för NCF var −3.941 μm cm V −1 s −1 (−2.348 μm cm V −1 s −1 i NC) respektive 0.404 mS cm −1 (0.0359 mS cm −1 i NC) ( Bord 1). På liknande sätt var homogena populationer av NCF-partiklar synliga i SEM- och TEM-bilder (figur Ib). DLS-analysen visade verkligen negativ zeta-potential med effektiv elektroforetisk rörlighet och konduktivitet, som representerar bevis på hög NCF-biostabilitet. Detta fynd bekräftades ytterligare med en farmakokinetisk bedömning (figur 1c) av NCF, vilket indikerade en hög genomsnittlig uppehållstid, vilket tydligt antydde förbättrad NCF-biotillgänglighet och biostabilitet (tabell 2).

Full storlek bord

Full storlek bord

Toxicitetsanalys

NCF var fysiologiskt säkert och orsakade inte någon toxicitet i HVCM-celler. HVCM-celler uppvisade inga bevis för mikrokärnor eller DNA-skador och upprätthöll normal celldelning (kompletterande figur S1). Inga signifikanta förändringar i LDH-aktivitet eller cellulär livskraft observerades i HVCM-celler (kompletterande figur S1). På liknande sätt var de fysiska utseendena, kroppsvikt och beteendetrender och blodgasinnehållet och hematologiska parametrar normala i NCF-kompletterade djur jämfört med kontrolldjur (kompletterande tabeller T2 – T4). Ingen kliniskt relevant skada på vitala organ (hjärta, lungor och lever) observerades hos NCF-kompletterade djur jämfört med normala djur (kompletterande figur S2).

NCF ger cytoskydd under hypoxiska förhållanden

Hypoxi-stress minskade HVCM-cellens livskraft (minskade till 20% jämfört med NVC). Hypoxia-medierad celldöd bekräftades med användning av caspase-3, -7-aktivering med FACS och bekräftades vidare genom TUNEL-analys. Betydande NCF-upptag observerades i HVCM-celler (kompletterande figur S3) under hypoxiska förhållanden. NCF-behandling (500 ng ml −1 ) förbättrade signifikant cellförmågan (97%) jämfört med NC- och PQQ-behandlade celler under hypoxiska förhållanden jämfört med HVC (76% respektive 69%). Bekräftande dessa fynd, minskad aktivering av caspase-3, -7 och TUNEL-positivitet i NCF-behandlade celler bekräftade ytterligare förbättringen i cellulär livskraft under hypoxiska förhållanden jämfört med NC- och PQQ-behandlade celler (kompletterande figur S3).

NCF skyddar mot hypoxiainducerad hypertrofi

Induktion av hypertrofi var tydlig i HVCM-celler under hypoxiska förhållanden, vilket indikerades genom morfometrisk analys (med 35%) och ökningarna i FITC-leucin (med 63%) och fenylalanin (med 65%) upptag och bekräftades från ökningarna i ANF (med 85%) och BNP (med 93%) nivåer jämfört med NVC-gruppen (figur 2a – d). Betydande minskningar i cellstorlek (med 30%) och FITC-leucin (med 23%) och fenylalanin (med 24%) upptag förutspådde minskad hypertrofi i NCF-kompletterade celler under hypoxiska förhållanden jämfört med HVC-gruppen (figur 2a – d). Det är viktigt att PQQ-behandling effektivt förbättrade cellens livskraft men kunde inte visa antihypertrofiska effekter.

Effekten av nanocurcuminformulering (NCF) på hypoxiinducerad hypertrofi i humana ventrikulära kardiomyocyter (HVCM) -celler. Ökningar i cellstorlek (× 40) ( a, b ) tillsammans med atrial natriuretisk faktor (ANF) och hjärnan natriuretic peptid (BNP) -nivåer ( c ) avbildade hypertrofisk tillväxt. Ökningar i FITC-leucin och FITC-fenylalaninupptag bekräftade ytterligare hypoxiainducerad hypertrofi ( d ). NCF-komplettering modulerade effektivt hypoxiainducerad hypertrofi in vitro . Data uttrycks som medel ± sd Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid * P 0, 05 vs NVC, ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC och ## P 0, 01 mot HVC. Icke-signifikanta förändringar visas som NS. Skalstång, 20 μm.

Bild i full storlek

På liknande sätt var cHH-inducerad RVH uppenbar hos djur på grund av de mer än fyrfaldiga ökningarna i RV / LV + S och RV / BW-innehåll (figur 3b). Samtidig ökning av kollagenansamling av båda typerna och ANF- och α-aktinuttrycksnivåer i vävnad bekräftade den hypertrofiska tillväxten, tillsammans med de ökade genuttryckningsnivåerna hos myokardiella markörer för matrisuppbyggnad, det vill säga kollagen typ 1 ( Col1a1 och Col3a1) (upp till 1, 8 -fold) och 3 med matrismetallopeptidas (MMP) 2 och 9 (upp till 3, 3-faldigt) jämfört med normoxi-kontrolldjur (figur 3c – g). Ökningar i cirkulerande nivåer av ANF (2, 3 gånger) och BNP (5, 3 gånger) bekräftade cHH-inducerad RVH hos djur (figur 3a och c). Behandling av djur med NCF reducerade effektivt RV / LV + S (1, 2-faldigt) och RV / BW (0, 7-faldigt) innehåll, med parallella minskningar i kollagenansamling, ANF-uttryck och a-aktinnivåer. Dessa fynd validerades genom ytterligare signifikanta minskningar i cirkulerande nivåer av ANF (1, 17 gånger) och BNP (1, 63 gånger) och uttrycksnivåerna för Col1a1 och Col3a1 (upp till 1, 6 gånger) och MMP (upp till 3, 1 gånger) i NCF-kompletterade djur jämfört med fordon-behandlade djur under cHH.

Representativa siffror som visar effekten av tillskott av nanocurcuminformulering (NCF) på cHH-inducerad RVH hos råttor. Kronisk HH-medierad RVH var tydlig hos djur genom ökningar i hjärtstorlek, kollagenansamling (pilar), Fultons index och histopatologiska färgningar (× 40) ( a, b ). Vävnadsuttrycksnivåer av skelett a-aktin och förmaks natriuretisk faktor (ANF) ökades på grund av hypertrofisk tillväxt ( b ). Cirkulerande nivåer av ANF och hjärnnatriuretisk peptid (BNP) bekräftade ytterligare cHH-inducerad RVH hos råttor ( c ). Fosforylering och aktivering av Akt-Gsk-signalering främjade hypertrofisk tillväxt hos råttor under hypoxiska förhållanden ( d, e ). Förändringar i genuttryckningsnivåer för markörer av ombyggnad av myokardmatris ( Col1a1 och Col3a1 , tillsammans med MMP2 och 9 ) ( f, g ) i olika experimentgrupper. Data uttrycks som medel ± sd NCF-kompletteringsmodulerad kronisk hypobarisk hypoxi (cHH) -inducerad höger ventrikulär hypertrofi (RVH) bättre än nanocurcumin (NC) och pyrroloquinoline kinon (PQQ) -behandlingar. Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC och # P 0, 01 mot HVC. Icke-signifikanta förändringar visas som NS. Skala bar, 10 μm.

Bild i full storlek

Förbättringen av NCF-effektiviteten bekräftades ytterligare baserat på Akt / Gsk-3p-signalvägen. cHH främjade p-Gsk-3p / Gsk-3p-uppreglering och nedreglerat p-Akt / Akt-innehåll (figur 3d och e). NCF-tillskott visade signifikant återställande i p-Akt / Akt och p-Gsk-3p / Gsk-3β-innehåll ( P -0, 05) jämfört med NC-behandlade celler under hypoxiska förhållanden, vilket tydligt visade den förbättrade hjärt-skyddande effekten av NCF under cHH .

cHH-inducerad RVH hos djur på grund av ökad lungresistens

Lungvaskulaturen genomgick diskret morfometrisk och arkitektonisk förändring under cHH. H&E-färgning i råtta lungor avslöjade vaskulär ombyggnad av lungbädden. Alveolerna spridda i utseende, färre i antal och större i storlek (figur 4a). Pulmonal arteriell lumen verkade smalare, och pulmonal artial (PA) medialvägg genomgick muskulisering och främjade således resistens mot blodflöde. Exponering för cHH ledde till en ökning i PA-medial väggtjocklek (WT), som ökade med 132% ( P -0, 01) hos försöksdjur jämfört med NVC (figur 4). Det är viktigt att djur kompletterade med NCF uppvisade en kraftig nedgång i WT (2, 8%) ( P -0, 01) och underhåll av den vaskulära arkitekturen jämfört med HVC (2, 8%) (figur 4a och b). WT minskade till 16% respektive 42% i NC- och PQQ-kompletterade djur ( P -0, 01), jämfört med HVC-kontroller. Dessa kvalitativa och kvantitativa data antyder att lungvaskulärresistens ökade under cHH på grund av förträngning av PA. Resultaten häri ger bevis på att NCF-komplettering effektivt inducerade morfometrisk och funktionell modulering i lungkärlsdjur under cHH bättre än NC och PQQ enbart.

Figur som visar förändringar i lunghistologi i olika experimentgrupper ( a ), vilket framgår av morfologiska förändringar i alveolära utrymmen (Al, röd) och bronkioler (Br, röd). Histopatologisk färgning (× 40) avslöjade ökningar i lungartärerna (PA, röd) och medial väggtjocklek (WT) i HVC-grupper, medan tillskott av nanocurcuminformulering (NCF) visade signifikanta minskningar jämfört med HVC, NC och PQQ ( b ). Data uttrycks som medel ± sd Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid ** P P0, 01 vs NVC och ## P 0, 01 mot HVC. Skala bar: 10 μm.

Bild i full storlek

NCF skyddar mot hypoxiinducerad stress genom att bibehålla mitokondriell funktion

Hypoxisk stress främjade skador på HVCM-celler genom att störa mitokondriell membranpotential (ψ m ), vilket således främjade mitokondrielskadmedierad apoptos (figur 5a och b). Överdriven ROS-läckage och minskad MnSOD-aktivitet validerade ytterligare hypoximedierad mitokondriell skada på HVCM-celler (kompletterande figur S4). Vidare resulterade exponering av HVCM-celler och gnagarehjärtor till cHH i minskade aktiviteter av komplex I – V, som visar skador på mitokondriella chefsfunktionella enheter (figur 5c – i). Uppgifterna är i överensstämmelse med tidigare beskrivna skador på etc Komplex i gnagare i skelettmusklerna. 37 Medföljande av dessa fynd fann vi att Nox-2 och Cox-2 uttrycksnivåer ökade under cHH, vilket tyder på komprometterade funktioner för komplex I respektive IV (figur 6a – d och kompletterande figur S5A – H), tillsammans med minskade uttrycksnivåer för etc Komplex i gnagningshjärtor (figur 6e och f). Minskade nivåer av PPARα / β / γ, mtTFA, Nrf1, Nrf2 och PGC1a visar tydligt försämrad mitokondriell biogenes, medan minskade nivåer av UCP-2 och UCP-3 tydligt visar minskad bioenergisk effekt på grund av den försämrade funktionen av komplex V under hypoxisk betingelser.

Figur som visar förändringar i mitokondriell homeostas under hypoxiska förhållanden. Mänskliga ventrikulära kardiomyocyter (HVCM) -celler upplevde apoptotiska celldöd på grund av hypoxi-medierade nedsättningar i membranpotential (× 40) ( a, b ) som visar skada på mitokondriell homeostas. Hypoxiainducerade moduleringar i mitokondriell elektrontransportkedja ( etc ) Komplexens aktiviteter ( c - g ) var också tydliga både in vitro och in vivo. ( h, i ) Effekterna av cHH-inducerad modulering på regulatorer av oxidativ fosforylering. Data uttrycks som medel ± sd Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC och ## P 0, 01 mot HVC. Icke-signifikanta förändringar visas som NS. Skala bar, 10 μm.

Bild i full storlek

Figur som visar förändringar av gen- och proteinuttryck i mitokondriell homeostasregulatorer: kronisk hypobarisk hypoxi (cHH) -medierade minskningar i regulatorer för mitokondriell biogenes (mtTFA, Nrf1, Nrf2 och PGC1a) ( a ), redoxfunktion (Nox-2 och Cox-2) ( b ), fettsyrareglering (PPARa / p / y) ( c ) och cellöverlevnad (Bcl2, Bax) ( d ) var tydliga i både gen- och proteinuttrycksstudier. Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC och ## P 0, 01 mot HVC. Icke-signifikanta förändringar visas som NS.

Bild i full storlek

NCF-behandling återställdes signifikant etc. Komplexa aktivitetsnivåer både in vitro och in vivo bättre än NC eller PQQ enbart (figur 5c – g). Bättre reglering i m var tydlig i NCF-behandlade HVCM-celler under hypoxiska förhållanden jämfört med NC eller PQQ eller vehikel (figur 5a och b). Det är viktigt att markörerna för mitokondriell biogenes och funktionell kontroll (PPARa / β / γ, mtTFA, Nrf1, Nrf2 och PGC1a), tillsammans med bioenergisk effektivitet (UCP-2, -3) och cellöverlevnad (Bcl2, Bax ), restaurerades mer effektivt i NCF-behandlade djur än i de behandlade med NC och PQQ enbart jämfört med vehikel under cHH (figur 6a – d och kompletterande figur S5A – H). NCF-kompletterade djur uppvisade återställande av expressionsnivåerna för komplex I – V tillsammans med deras aktiviteter bättre än antingen behandling ensam (figur 5h och i). Sammantaget visar dessa data kraftiga förbättringar i mitokondriell skyddande effekt av NCF i kardiomyocyter jämfört med NC och PQQ.

NCF-tillskott förhindrar aktivering av NFκB-p65 under hypoxiska förhållanden

Cellulär aktivering och cytoplasmisk ackumulering av NFκB-p65 aktivering och cytoplasmisk ackumulering började så tidigt som 6 timmar efter början av hypoxi och nådde sina toppar med 24 timmar (figur 7a – g och kompletterande figurer S6 och S7) i HVCM-celler. Emellertid observerades kärntranslokation av NFκB-p65 endast i celler exponerade för hypoxi under 24 timmar (figur 7a – g).

Representativ figur som visar NFĸB-aktivering under hypoxiska förhållanden: humana ventrikulära kardiomyocyter (HVCM) -celler upplevde cytoplasmisk NFĸB-aktivering så tidigt som 6 timmar efter början av hypoxi (× 100) ( a - d ), medan kärntranslokation observerades endast 24 timmar efter start ( e, f ). Gnagare till högerventriklar och HVCM-celler visade NFĸB-aktivering under kronisk HH- eller hypoxisk exponering under 24 timmar ( g ). Komplettering av HVCM-celler och råttor med nanocurcuminformulering (NCF) resulterade i markant minskad NFĸB-aktivering, följt av NC och PQQ enbart. Skalstång, 20 μm.

Bild i full storlek

På liknande sätt bekräftade våra in vivo- resultat NFKB-aktivering i de högra ventriklarna under cHH (figur 7f och g och kompletterande figur S8). För att bekräfta patogeniciteten för cHH-inducerad RVH hos råttor jämförde vi NFKB-vävnadsuttryck och förändringar i mitokondriell etc Complexes aktiviteter tillsammans med histopatologiska förändringar i en i förväg fastställd modell av monokrotalin-inducerad RVH. 38 Monokrotalin infusion främjade RVH, minskade osv. Komplexa aktiviteter och ökat NFκB-uttryck i de högra kammarna (figur 8a – d). Tillsammans visar dessa data tydligt cHH-inducerad RVH och skademedierad patogenicitet i råttahjärtor liknande en tidigare etablerad modell av monokrotalininducerad RVH och misslyckande. 39

Den jämförande patogeniciteten i kroniska HH- och monokrotalininducerade RVH-modeller: Kronisk HH- och monokrotalin (Mct) -inducerad RVH främjade ökningar i mitokondriell elektrontransportkedja ( etc ). Komplexa I – V-aktivitetsnivåer ( a ). Båda modellerna visade NFĸB-kärnansamling och vävnadsuttryck, tillsammans med ökad vävnadskollagenansamling (× 40) (pilar) ( b - d ). Data uttrycks som medel ± sd Värden ansågs vara statistiskt signifikanta vid ** P P0, 01 vs NVC och ## P 0, 01 mot HVC. Skala bar, 10 μm.

Bild i full storlek

NCF treatment resulted in significant decreases in cytoplasmic and nuclear levels of NFκB-p65 compared with vehicle/NC/PQQ-treated cells and animals (Figure 7a–f), but NC and PQQ treatments failed. Collectively, the data demonstrate that cHH-mediated RVH and cardiomyocyte damage are dependent on NFκB-p65 activation, similar to monocrotaline-induced RVH (Figure 8b and c).

Diskussion

Cardiac hypertrophy appears as an initial adaptive response to hypoxia, but prolonged stress induces de-compensation and irreversible damage. The increase in systemic oxygen demand under hypoxic stress is well elucidated. 24 To meet this increased demand for oxygenated blood, the heart frequently pumps more blood toward the lungs to improve systemic oxygenation. The heart undergoes hypertrophy under this sustained workload, with special relevance to the right ventricle. 40 However, chronic hypoxic stress also promotes a decline in the oxygenation capacity of the lungs under chronic hypoxic stress due to excessive fluid retention, which causes an increase in the pulmonary resistance to the blood flowing from the right ventricles. However, to ensure an uninterrupted systemic blood supply, the hypertrophied right ventricle continuously pumps blood towards the lungs. Under this state of increased volume and pressure overload, the right side of the heart eventually undergoes de-compensation and suffers from pathological damage. 40, 41 Herein, we observed an increase in the pulmonary artery medial wall thickness and a decrease in the pulmonary artery lumen, which promotes an increase in the pulmonary resistance to blood flow. These changes might have led to sustained pressure and volume overload on the right ventricle, which eventually stimulated de-compensation in the chamber. 40, 41 Thus, the data in the present study provide evidence that the heart undergoes pathological damage due to de-compensation arising in the right ventricle that is secondary to the increased pulmonary vascular resistance. However, increased pulmonary resistance is directly associated with pulmonary hypertension; further investigations are needed to clarify the potential effects of cHH-induced hemodynamic changes on pathological RVH. 40, 41

In the present study, we found that severe damage to Complexes I–V clearly demonstrated that hypertrophied cardiomyocytes underwent mitochondrial stress under hypoxic conditions, both in vitro and in vivo . Previous studies have shown that stress-induced decreases in the functions of these Complexes are inseparably associated with cardiomyopathies and heart failure. 2, 9, 42, 43 However, to the best of our knowledge, this study provides the first report that chronic hypoxic stress promoted mitochondrial stress by impairing etc Complex activities in hypertrophied cardiomyocytes. Since optimal cardiomyocyte functioning relies on a constant supply of the optimum amount of oxygen, hypoxia-mediated oxidative stress might have contributed to such severe damage to the etc complex activities. The smooth flow of electrons through all five Complexes determines optimal cardiomyocyte function. 44 As hypoxic stress promotes severe oxidative damage, excessive free-radical leakage-mediated redox imbalances might have initiated the mitochondrial damaging events that further led to impairments in the etc Complex activities. Further, chronic hypoxic stress impaired not only mitochondrial regulators of cell-survival, redox-maintenance and metabolism, but severe damage to regulators of mitochondrial bio-genesis was also evident. Decreased expression levels of the etc Complexes along with their activities clearly demonstrate that impaired mitochondrial homeostasis remains a critical molecular event behind cHH-induced de-compensatory RVH and damage.

Further molecular investigation suggested that NFκB-p65 activation emerged as a potential regulator of hypoxia-induced hypertrophy, both in vitro and in vivo . Importantly, in vitro activation of NFκB-p65 and stabilization of IKKα/β were observed as early as 6 h following the onset of hypoxia. These data and our previous report strongly suggest that hypoxia-mediated onset of hypertrophy and activation of NFκB-p65 in HVCM cells seems to be synchronous events (6 h). 3 To ensure the role of NFκB-p65 activation in our animal model of RVH, we compared our findings with a previously established model of monocrotaline-induced RVH. Interestingly, monocrotaline-induced RVH was accompanied by NFκB-p65 activation and damage to etc Complex machinery, similar to our model of cHH-induced RVH. 45 These findings suggest that the pathological events arising in the cHH-induced model of RVH show pre-clinical similarity to a drug-induced model of RVH. However, since monocrotaline-induced RVH remains secondary to pulmonary hypertension, it is important to assess quantitative hemodynamic changes in pulmonary arterial pressure in a cHH-induced model of RVH. Collectively, the present study shows that hypoxic stress was sufficient to induce NFκB nuclear translocation and to initiate the transcriptional activation of downstream signaling genes, thus promoting hypertrophy and damage in rats. These damages appeared in the form of de-compensated RVH along with mitochondrial damage and demonstrate the transition of cardiomyocyte hypertrophy from an adaptive physiological state to a maladaptive pathological state.

This information and synchronous molecular events suggest that chronic hypoxia-mediated de-compensatory RVH appeared in animals in response to excessive pressure and volume overload, secondary to enhanced pulmonary vascular resistance. This de-compensation mediated pathological damage in the right heart by impairing etc Complexes. These data suggest that although stress-induced activation of NFκB is necessary for onset of hypertrophy, chronic stress-mediated sustained NFκB upregulation might have promoted de-compensation and pathological damage. 16 However, the exact molecular events behind NFκ-mediated pathology require further investigations.

NCF supplementation was highly effective in modulating hypoxia-induced hypertrophy compared with NC and PQQ alone, clearly depicting an improvement in the cyto-protective efficacy of NCF. Importantly, PQQ treatment showed an improvement in cellular viability under hypoxic conditions but failed to modulate hypertrophy. These findings suggest that though oxidative stress plays a crucial role in the pathogenicity of cardiac hypertrophy, other molecular events might collectively play key regulatory roles in promoting pathogenicity under hypoxic conditions. Similarly, NC supplementation showed modulations of hypertrophy and pathology but did not impart sufficient therapeutic regulation of mitochondrial health under hypoxic conditions. Together, these findings emphasize the inference that NCF supplementation could provide comprehensive therapeutic benefits under stress. NCF supplementation imparted simultaneous protection from cHH-induced damage to pulmonary architecture and damage to the right side of the heart. Robust improvements in etc Complex expression and activity levels with NCF treatment clearly demonstrate improvements in the therapeutic and cyto-protective potentials of NCF under hypoxic conditions compared with NC or PQQ alone. The data collectively suggest the potential efficacy of combinatorial therapeutics to combat multi-factorial pathologies mediated by hypoxic stress and further strengthen our hypothesis that combinatorial therapeutics might be an effective solution to hypoxia-mediated clinical problems.

Publisher's note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Information accompanies the paper on Experimental & Molecular Medicine website (//www.nature.com/emm)