Mycobacterium llatzerense, ett vattenburen mycobacterium, som motstår fagocytos av acanthamoeba castellanii | vetenskapliga rapporter

Mycobacterium llatzerense, ett vattenburen mycobacterium, som motstår fagocytos av acanthamoeba castellanii | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Parasitutveckling
  • Vattenmikrobiologi

Abstrakt

Nontuberculous mycobacteria (NTM) är miljöbakterier som i allt högre grad förknippas med folkhälsoproblem. I vattensystem matar frittlevande amöben (FLA) på bakterier genom fagocytos, men flera bakterier, inklusive många NTM, är resistenta mot detta predation. Således kan FLA ses som en träningsplats för patogena bakterier. Mycobacterium llatzerense beskrevs tidigare som ofta associerade med FLA i ett dricksvattenätverk. Denna studie syftade till att karakterisera interaktioner mellan M. llatzerense och FLA. M. llatzerense internaliserades genom fagocytos och innehöll lipidinneslutningar, vilket tyder på en subversion av värdresurser. Dessutom överlevde M. llatzerense och multiplicerades till och med i närvaro av A. castellanii . Med användning av ett genomiskt baserat jämförande tillvägagångssätt identifierades tolv gener involverade i fagocytosinterferens, beskrivna i M. tuberculosis , i M. llatzerense genom som sekvenserats i denna studie. Transkriptomiska analyser visade att tio gener var signifikant uppreglerade under infektionens första timmar, vilket delvis kunde förklara M. llatzerense- resistens. Dessutom visade sig M. llatzerense aktivt hämma fagosomförsurning. Sammanfattningsvis presenterar M. llatzerense en hög grad av resistens mot fagocytos, vilket förmodligen förklarar dess ofta förekommande förekomst inom FLA i dricksvattennät. Det understryker att NTM bör övervakas noggrant i vattennätverk för att förhindra människors hälsoproblem.

Introduktion

Mycobacterium är ett släkte som består av minst 170 arter, bland vilka man hittar mycket patogena mykobakterier, såsom M. tuberculosis och M. leprae, vilket orsakar tuberkulos respektive spetälska. Förutom att dessa patogener som orsakar stora hälsoproblem för människor och nötkreatur är icke-överflödiga mykobakterier (NTM), en stor grupp som omfattar alla andra arter från denna släkt. NTM finns överallt på miljöer som mark och vatten 1 . När det gäller folkhälsa är NTM-förekomst i dricksvattennät av särskilt intresse, eftersom det nu är erkänt att flera arter är mänskliga patogener som överförs genom vattensystem 2 . Trots ansträngningar i reningsprocessen för dricksvatten ökade förekomsten av NTM i dricksvattennät stadigt under det senaste decenniet 3 . Samtidigt har förekomsten av NTM-sjukdomar bland allmänheten ökat från 1, 8 fall per 100 000 personer 1980, till 4, 1–7, 2 per 100 000 i 2000: s 4, 5, 6 . Det har föreslagits att den framgångsrika koloniseringen och persistensen av NTM i vattennätverk delvis förklaras av gynnsamma interaktioner med eukaryota värdar, såsom frittlevande amöber 7, 8 . Frilivande amöben (FLA) är encelliga eukaryoter som finns allmänt tillgängliga i dricksvattennät, som främst livnär sig av bakterier genom fagocytos 9, 10 . På grund av deras bakterivorösa aktivitet spelar FLA en viktig roll för bakteriepopulationen 11 . Medan de flesta bakterier som internaliseras av FLA snabbt smälts genom en fagocytisk process, fick vissa andra bakterier utarbetade sätt att överleva detta predation. Dessa så kallade amöba-resistenta bakterier (ARB) innefattar många bakteriella representanter, varvid den mest omfattande studerade är den intracellulära patogenen Legionella pneumophila 12, 13, 14 . Dessa ARB: s förmåga att överleva FLA-fagocytisk process ledde till att betrakta dessa eukaryota mikroorganismer inte bara som rovdjur, utan också som en träningsplats för nya patogener, vilket gynnade utvecklingen av resistensmekanismer för intracellulär persistens 15 . De tuberkulösa och spetälska mykobakterierna visade sig tidigare motstå FLA-fagocytos in vitro , såväl som vissa NTM-arter, och betraktades således som ARB 16, 17, 18, 19, 20 . Undersökningar av miljömässig NTM-resistens mot FLA underströk att de flesta av de testade arterna kunde överleva in vitro inom Acanthamoeba spp. 19 .

Flera Mycobacterium- arter studerades för att dechiffrera cellulära processer involverade i fagocytosresistens, även om de flesta av den befintliga litteraturen är inriktad på den mycket patogena M. tuberculosis, som nyligen granskades 21 . Mest anmärkningsvärt identifierades flera gener som kodar proteiner som interfererar med fagosomförsurning och fagolysosomal fusion i M. tuberculosis 22, 23, 24, 25 . Med fokus på NTM involverade många experiment Mycobacterium marinum som surrogat för patogena M. tuberculosis bacilli. I detta sammanhang visades det att typ 7-sekretionssystemvariant ESX-1 var nödvändig för intracellulär blomstrande, när infekterade Acanthamoeba 26, 27 . Motstånd mot miljömässigt NTM mot FLA undersöktes också med användning av Mycobacterium avium, den viktigaste långsamt växande arten involverad i NTM-sjukdomar 28 . Under infektion av både humana makrofager och FLA demonstrerades det att en artsspecifik patogenicitensö var involverad i den framgångsrika invasionen av värdceller av M. avium 29 . En annan studerad NTM är Mycobacterium abscessus , den största snabbväxande mykobakterien som är involverad i mänskliga sjukdomar 30, 31 . Den senaste sekvenseringen av hela genomet av abscessus markerade närvaron av ett horisontellt förvärvat fosfolipas C (PLC), som var involverat i intracellulär spridning inom A. castellanii 32 .

Vi rapporterade nyligen den ofta förekommande FLA-NTM-föreningen i dricksvattennätet i Paris, Frankrike, och identifierade M. llatzerense som en dominerande NTM-samarbete med FLA 33 . Denna NTM-art, fylogenetiskt besläktad med de opportunistiska patogenerna från M. mucogenicum- gruppen, har upprepats identifierats inom dricksvattenätverk 34, 35, 36, 37, 38 . Intresset av M. llatzerense rapporterades nyligen hos immunsönskade patienter, vilket ökade möjligheten att det också kan vara en opportunistisk patogen 39, 40, 41 .

För att förklara varför och hur denna NTM samexisterar med FLA i vattennät undersökte vi interaktioner mellan M. llatzerense och FLA och antagde att denna art kunde motstå amoebal fagocytos. Därmed syftade vårt arbete till att förstå hur M. llatzerense hanterar amöebemodellen Acanthamoeba castellanii . Denna FLA-art valdes i denna studie eftersom den är bland de vanligaste FLA i dricksvattensystemen samt i samband med mykobakterier 9, 33 . Vi framhävde således M. llatzerense förmåga att bestå och föröka sig i närvaro av A. castellanii . Den subcellulära lokaliseringen av M. llatzerense inom amebebärden kännetecknades. En jämförande genomikmetod, med nyligen sekvenserad M. llatzerense genom, användes för att identifiera bevarade gener baserade på deras roll i mykobakteriell resistens mot fagocytos. Deltagandet av dessa gener övervakades därefter genom att kvantifiera transkriptionsnivåerna under infektionsprocessen. Slutligen tillät en undersökning på fenotypnivå oss att kvantitativt utvärdera närvaron och överlevnad av M. llatzerense i intracellulära sura fack.

Resultat

M. llatzerense är resistent mot A. castellanii predation.

I en tidigare studie visade vi den frekventa förekomsten av Mycobacterium llatzerense (80% till 90% av identifierade NTM-sekvenser) i samband med FLA isolerat från ett dricksvattennät 33 . Detta resultat uppmuntrade till en bättre karaktärisering av M. llatzerense- interaktioner med Acanthamoeba castellanii . I denna studie samlades miljöisolat från M. llatzerense från slutpunktsplatser i det ovan nämnda dricksvattennätet, tillhandahållet av behandlat grundvatten. Deras resistens mot A. castellanii bestämdes genom ett dropptest för att jämföra förmågan hos bakterieisolat att växa i närvaro eller frånvaro av A. castellanii utsäde på agarmediet. Denna förmåga utvärderades med avseende på fem M. llatzerense miljöisolat , liksom en stam av Mycobacterium septicum, måttligt motståndskraftig mot A. castellanii predation, och isolerades från samma dricksvattennätverk. E. coli användes som kontroll, eftersom det är en vanligt förekommande livsmedelskälla för FLA (fig. 1). De fem miljö- M. llatzerense- isolaten utvecklades på liknande sätt med eller utan närvaron av A. castellanii- gräsmatta på näringsmediet (fig. 1). I jämförelse försämrades M. septicums förmåga att växa starkt i närvaro av A. castellanii , medan E. coli- tillväxten helt inhiberades (Fig. 1). Baserat på dessa observationer visade M. llatzerense ett motstånd mot A. castellanii predation. Eftersom ingen skillnad i A. castellanii- resistens observerades mellan M. llatzerense miljöisolat , valdes ett representativt isolat, M. llatzerense EDP_4, för de efterföljande experimenten.

För dropptestet upptäcktes bakteriesuspension (10 mikroliter) på Middlebrook 7H10, 10% OADC, med eller utan en A. castellanii- gräsmatta. Mll: Mycobacterium llatzerense isolerar EDP_1 till EDP_5; Ms: Mycobacterium septicum; Ec: Escherichia coli.

Bild i full storlek

M. llatzerense kvarstår och växer i samkultur med A. castellanii

För att bekräfta M. llatzerense resistensförmåga undersöktes dess öde inom A. castellanii under samkultur som varade upp till 96 timmar. Denna tidskurs valdes eftersom den representerar den längre inkubationstiden som inducerar mindre än 10% A. castellanii- encystment i den icke-näringsrika PAS-bufferten, mediet som används för infektionsförsök. Efter 4 timmars infektion infekterades cirka 10% av A. castellanii och nådde 40% efter 16 timmar (Fig. 2A). Denna infektionshastighet bibehölls utan signifikanta skillnader upp till 96 timmar efter infektion. Under experimentets tid bedömdes M. llatzerense livskraft med CFU-räkning. Viabla mykobakterier utvanns vid alla tidpunkter för experimenten, vilket visade deras resistens mot A. castellanii fagocytos (Fig. 2B). En signifikant tillväxt observerades till och med, börjande vid 72 timmar (P <0, 05; oparat t-test) och nådde en 1, 5 log 10- tillväxt vid 96 timmar efter infektion (P <0, 01; oparad t-test) (fig. 2B).

( A ) Cellantal av A. castellanii infekterat av M. llatzerense över tid. ( B ) CFU-räkningar av M. llatzerense efter A. castellanii- infektion vid en MOI på 1 i 16 timmar. Varje förhållande beräknades med avseende på samma tillstånd utan A. castellanii , där ingen signifikant tillväxt observerades för M. llatzerense ensam (data visas inte). Statistiska test utfördes med användning av flera oparade t-test (P <0, 05 * P <0, 01 **).

Bild i full storlek

M. llatzerense internaliseras av A. castellanii

För att få insikt i interaktionen mellan M. llatzerense och A. castellanii observerades infekterade amebekulturer med användning av transmissionselektronmikroskopi (TEM). M. llatzerense- baciller hittades mestadels intracellulärt i vakuoler, vilket antydde en aktiv internaliseringsprocess (fig. 3). Från och med 4 timmar efter infektion innehöll intracellulär M. llatzerense många inneslutningar i deras cytoplasma, som oftare observerades efter 24 timmar och 72 timmar (fig. 3B – D). Dessa inneslutningar bekräftades vidare att vara av lipidisk natur (kompletterande figur 1). I jämförelse innehöll icke-internaliserade baciller inte sådana inneslutningar (Fig. 3A). Lipiddroppar från värden observerades också i närheten av M. llatzerense- innehållande vakuoler (fig. 3C). Internalisering av bakterier av fagocytiska celler, såsom FLA, medieras mest av fagocytos. Detta bekräftades faktiskt för M. llatzerense , eftersom dess internalisering upphävdes genom behandlingen av A. castellanii med cytokalasin D, en potent hämmare av aktinpolymerisation (fig. 4). Således visades det att M. llatzerense internalisering av A. castellanii verkligen förmedlas av fagocytos. Denna NTM-art kunde bestå intracellulärt i minst 96 timmar.

Överföringselektronmikroskopi av A. castellanii infekterad av M. llatzerense EDP_4 vid en MOI på 1, vid 4 timmar ( A, B ) 24 timmar ( C ) och 72 timmar ( D ) efter infektion. Stängerna representerar 1 mikrometer. Lipidkroppar indikeras med asterisker på mikrografer.

Bild i full storlek

Bild i full storlek

M. llatzerense delar fagosomala resistensgener med M. tuberculosis

För att screena för konserverade proteinkodande gener involverade i fagocytosresistens sekvenserades hela genomet av llatzerense . Samlingen av högkvalitativa baser 72′881′926 tillät att dra 6, 7 ​​Mb draggenomet av M. llatzerense, sammansatt i 235 konturer. Detta genom ligger i storleksområdet för tidigare beskrivna Mycobacteria genomer, innefattande mellan 3, 21 Mb och 7, 3 Mb ( M. leprae respektive M. tusciae ; tabell 1). Genomstorleken för M. llatzerense EDP_4 verkade något större än ett annat tidigare publicerat genom från samma art (stam CLUC14; 6, 1 Mb), medan det innehöll ett liknande högt GC-innehåll på 66, 6%, jämfört med 66, 3% för M. llatzerense CLUC14. Ytterligare analyser mellan de två enheterna indikerade en genomsnittlig nukleotididentitet på 98, 12%, vilket bekräftade att de tillhör samma art (kompletterande figur 2) 42 . M. llatzerense EDP_4- genomet screenades med avseende på gener som kodar proteiner dokumenterade för deras roll i att interferera med fagosommognad vid M. tuberculosis med användning av BLASTp-sökningar. M. tuberculosis H37rv-genomet användes för detta jämförande tillvägagångssätt eftersom det representerar det mest riktade annoterade genomet hittills inom Mycobacterium- släktet. Dessutom undersöktes genfunktioner i stor utsträckning med användning av denna stam, vilket gav en mycket värdefull insikt i involveringen av många gener i patogenicitet och intracellulär överlevnad 21 .

Full storlek bord

Bland en initial uppsättning av tretton kodande gener identifierades elva mycket likartade såväl som en måttligt liknande gener i M. llatzerense genom och beskrivs nedan (tabell 2). Jämförbara resultat erhölls genom att använda M. llatzerense CLUC14-genomet (kompletterande tabell 2). Rv3707c, PPE10, Cut2 och GlyA1 visade sig vara inblandade i blockering av fagosommognad, såsom föreslogs genom transpositionmutagenes i M. bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG); mutant deleterad för dessa gener berikades signifikant i surgjord fagosom 43 . NdK av M. tuberculosis visade sig blockera fagosommognad i murina makrofager genom störning av Rab5 och Rab7 GTPaser, vilket således blockerade fagosomernas fusion med endosomala och lysosomala fack 44 . Utsöndrade fosfataser PtpA och PtpB var involverade i mykobakteriell patogenes; PtpA kännetecknades särskilt för att hämma rekryteringen av vacuolar-H + -ATPases-maskiner vid fagosommembran 25 . SecA2-proteinet, en del av sek-systemet, visades också väsentligt för att blockera fagosommognad för M. tuberculosis som infekterar makrofager. PhoP och FbpA var båda indirekt involverade i blockering av fagosomal mognad, eftersom de oberoende reglerar andra virulensfaktorer såsom typ 7-sekretionssystem (PhoP) eller cellväggslipidkompositionen (FbpA) 23, 45 . Dessutom identifierades typ 7-sekretionssystem locus ESX-3 i M. llatzerense genom, vars heterodimera effektor EsxG-EsxH nyligen var involverad i störning av M. tuberculosis- innehållande fagosomer som adresserar lysosomen 24 .

Full storlek bord

Fagosomala resistensgener induceras vid fagocytos av A. castellanii

För att undersöka den potentiella rollen för dessa gener i M. llatzerense- resistens mot A. castellanii , kvantifierades deras uttryck genom qRT-PCR vid 0 h, 2 timmar, 4 timmar och 8 timmar efter infektion, motsvarande det tidiga stadiet av M llatzerense- internalisering (Fig. 5). Sammantaget påverkade M. llatzerense internalisering signifikant den globala transkriptionella profilen för utvalda gener (ANOVA, F = 85, 608, df = 1–7, P = 0, 001). Efter 2 timmar var endast tre av de utvalda generna signifikant uppreglerade, vilket motsvarade secA2 (8, 23 veck), fbpA (7, 28 veck) och phoP (6, 23 veck). Efter 4 timmar observerades signifikanta uppregleringar av transkriptionsnivåer för 8 andra gener, nämligen cut2, esxG, fbpA, phoP, ptpA, ptpB, rv3707c och secA2 . Efter 8 timmar reglerades alla gener utom glyAl och ppe10 signifikant. Endast gener som var uppreglerade efter 2 timmar nådde mer än 10 gånger gånger förändringar (fbpA, phoP och secA2; Fig. 5). Däremot visade glyAl och ppe10 inte någon signifikant förändring i transkriptionsnivåer under hela experimentet. Det tidiga svaret från M. llatzerense på fagocytos av A. castellanii återspeglas av stimuleringen av fbpA, phoP och secA2- transkription. Efter 4 timmars infektion var M. llatzerense transkriptionellt svar på internalisering framträdande, medan ett sent svar observerades efter 8 timmar genom den betydande uppregleringen av esxH och ndK . Sammantaget är den transkriptionella ökningen av konserverade virulensfaktorer, delade mellan M. tuberculosis och M. llatzerense , för deras delaktighet i resistensen mot A. castellanii phagocytosis.

Statistisk signifikans bedömdes med användning av flera t-test för jämförelse med kontrollgen (16S rRNA) vid varje tidpunkt. (P <0, 05 * P <0, 01 ** P <0, 001 ***).

Bild i full storlek

M. llatzerense försämras inte av A. castellanii och är bosatt i dåligt surgjorda fagosomala fack

För att stärka resultaten som visar betydande förändringar av M. llatzerense- genuttryck under det tidiga infektionssteget syftade vi till att karakterisera dess intracellulära överlevnad. Efter internalisering bedömdes M. llatzerense resistens mot A. castellanii- nedbrytning genom att stimulera den autofagiska maskinerna med användning av rapamycin. Autofagi beskrevs som en huvudväg för att blockera tuberkulös mykobakterieproliferation i värdceller, eftersom dess aktivering i hög grad påverkar mykobakteriens överlevnad 46, 47 . M. llatzerense överlevnad övervakades i upp till fyra timmar efter rapamycinbehandling. Bakteriell livskraft minskade signifikant vid 0, 1 och 4 timmar efter rapamycinbehandling, eftersom hälften av bacillerna överlevde jämfört med kontrolltillståndet (Fig. 6A). Även om det var betydelsefullt, även i tillstånd där bakteriell nedbrytning genom fagocytos och autofagi kraftigt stimulerades, nådde vi inte M. llatzerense total eliminering, vilket bekräftade dess starka förmåga att motstå A. castellanii- nedbrytning.

( A ). Kolokalisering av levande eller värmedödade M. llatzerense i intracellulära sura avdelningar märkta med pHrodo ( B ). Statistiska test utfördes med användning av oparade t-test (P <0, 001 ***).

Bild i full storlek

Dessutom utfördes karakteriseringen av M. llatzerense- innehållande fagosomer för att korrelera mönstret för genuttryck med en observerbar fenotyp. Därför utvärderades försurningen av M. llatzerense- innehållande fagosomer med användning av ett pHrodo-färgämne, som fungerar som en fluorescerande indikator på sur miljö. Vid användning av levande M. llatzerense för infektion av A. castellanii var 40, 52 ± 2, 65% av bakteriecellerna positiva för pH-märkning (fig. 6B, kompletterande figur 3). Däremot resulterade infektion av A. castellanii med värmedödad mykobakterier i en signifikant ökning av pH-märkta bakterieceller (94, 95 ± 2, 25%; P <0, 001, oparat t-test). Dessa resultat, i kombination med tidigare observationer på transkriptionsnivå, tyder starkt på att M. llatzerense aktivt blockerar fagosomal mognad, vilket slutligen resulterar i M. llatzerense persistens i dåligt surgjorda fack.

Diskussion

NTM finns ofta i vattenmiljöer tillsammans med FLA, och står därför inför ett potentiellt starkt rovtryck, vilket antyder att NTM-resistens står som en evolutionär fördel att kvarstå i sådana miljöer 7, 10, 48, 49 . Följaktligen indikerade nyligen genomiska fynd att mykobakterier kan ha upprätthållit en sympatrisk livslängd med protozoer såsom FLA 50 . NTM, som miljörepresentanter för Mycobacterium- släktet upprepade gånger har rapporterats utveckla resistens mot FLA-predation 16, 19, 20 . Som en lämplig illustration av detta uttalande hittades den nyligen karakteriserade arten M. llatzerense återkommande i dricksvatten och i förening med FLA. Därför genomförde vi karakteriseringen av resistensmekanismer som använts av M. llatzerense till A. castellanii phagocytosis.

I den aktuella studien beskrivs förmågan hos M. llatzerense att bestå och till och med växa i närvaro av FLA. När det gäller andra mykobakterier, internaliserade A. castellanii M. llatzerense genom fagocytos. När den var internaliserad hittades M. llatzerense i vakuoler motsvarande fagosomer. Den observerade infektiviteten hos M. llatzerense var jämförbar med den hos M. marinum och M. avium infekterande Acanthamoeba spp., Som tidigare rapporterats 26, 51 . Medan resistensen hos ett brett spektrum av NTM har observerats har deras förmåga att växa i närvaro av amöber beskrivits mycket mindre. Det var ändå möjligt att utvärdera att M. llatzerense- tillväxt i närvaro av A. castellanii var jämförbar med denna av M. avium som infekterade samma FLA-värd, medan den var högre än den tillväxt som observerades för M. fortuitum och M. marinum 52, 53 .

Intressant nog innehöll intracellulär M. llatzerense många intracytoplasmiska lipidinklusioner. Lipidkroppar kan representera en form av energilagring, men tros också vara involverade i värdinflammatoriska och immunsvar 54 . På liknande sätt som observationerna som beskrivs i denna studie visades det att M. marinum aktivt kunde underverka värdens lipidkroppar när de infekterade D. discoideum 55 . Även om denna typ av observation måste observeras upprepade gånger bland olika mykobakterier, är det troligt att värdlipidsubversion representerar en delad mekanism bland släktet Mycobacterium .

För att utforska den genomiska grunden för M. llatzerense- resistens mot A. castellanii genomfördes en jämförande genomisk strategi. M. llatzerense sekvensering av hela genom avslöjade ett stort 6, 7 Mb genom genom, vilket är i enlighet med dess miljö- och generalistiska livsstil 56 . Screening för proteinkodande gener involverade i fagosommognadblockering underströk närvaron av tolv kandidater delade med M. tuberculosis H37rv (granskad i ref. 21). Under M. llatzerense- internalisering av A. castellanii observerades en tidig ökning av fbpA-, phoP- och secA2- transkriptionsnivåer. FbpA är förmodligen involverat i syntes av trehalos 6, 6 ′ dimykolat (TDM), en viktig ytglykolipid som också benämns "sladdfaktor" 45 . Den betydande uppregleringen av fbpA kan leda till en anrikning av TDM, vilket var korrelerat med M. tuberculosis intracellular survival 57 . Det tidiga överuttrycket av phoP- genen i M. llatzerense kan antyda en roll för att blockera fagosomförsurning. För att stödja denna hypotes misslyckades M. tuberculosis- mutanter bristfälliga för PhoP-uttryck att blockera fagosomförsurning, medan de fortfarande kunde förhindra fagolysosomal fusion 23 . SecA2- genen visade en av de tidigaste och starkaste överuttryck efter internalisering. Denna gen, som en del av sek-systemet, föreslogs nyligen att vara involverad i utsöndring av surt fosfatas PtpA och PtpB 22, 25 . I M. llatzerense var uppregleringen av SecA2- transkription parallell med PtpA och PtpB , vilket är i enlighet med den föreslagna hypotesen. Faktum är att en grundlig utredning krävs för att bekräfta Sec-systemets roll i PtpA- och PtpB-sekretion. Transkriptionsanalys av ndk framhöll en sen överreglering. Vid M. tuberculosis visades NdK hämma fagosomal fusion med tidiga endosomer och lysosomer 44 . Aktiviteten för T7SS ESX3-variant övervakades indirekt genom EsxG- och EsxH- transkription, vilka signifikant uppreglerades vid 4 timmar respektive 8 timmar efter infektion. Dessa gener, som kodar en ESX3 heterodimer effekt, kopplades till hämningen av fagolysosomfusion 24 . Strukturella och funktionella analyser av EsxG-EsxH heterodimer antydde också en roll i järn- och zinkupptagning 58, 59, 60 . Cut2- och Rv3707c- transkription uppreglerades också signifikant vid 4 timmar efter infektion, men deras roller är ännu inte tydligt klarlagda 43 .

Till skillnad från de signifikanta förändringarna som observerades i transkriptionsnivåer för de andra utvalda generna, transkriberades inte både glyAl och ppe10 i hela experimentet. Rollerna för dessa gener har identifierats genom karakterisering av mutanter som inte kan förhindra fagosomal försurning 43 . PE-PPE-proteiner tros vara involverade i Mycobacterium pathogenicity 61, därför uttrycktes uttrycksprofilen för PP10 bästa BLAST-hit som identifierats i M. llatzerense överraskande. Det är emellertid värt att notera att endast en måttlig sekvenslikhet (40% identitet) identifierades mellan PPE10 från M. tuberculosis och motsvarande protein i M. llatzerense. Vidare visade sig M. llatzerense EDP_4 ha 27 PE-PPE-gener i dess genom. Det skulle således vara relevant att analysera uttrycket av dessa andra gener under infektion för att utvärdera deras betydelse i FLA-fagocytosresistens. Hittills har det utsöndrade hydroximetyltransferaset GlyA1 endast beskrivits i M. bovis BCG för att blockera fagosommognad. Eftersom ingen signifikant skillnad i uttryck för GlyA1 observerades i vår studie, kan vi inte med säkerhet dra slutsatsen om dess roll i överlevnaden av M. llatzerense som infekterar A. castellanii . Transkriptionsanalyser ger verkligen starka argument för att involvera betydligt modulerade gener. Det måste emellertid hållas i åtanke att funktionella analyser krävs för att bekräfta vikten av sådana gener i M. llatzerense- resistens mot A. castellanii phagocytosis, såsom fenotypisk karaktärisering av M. llatzerense överlevnad inom FLA när det försämras för utvald genuttryck, genom mutagenes eller interferensexperiment.

För att slutföra transkriptionsanalyser genomfördes en undersökning på fenotypisk nivå. Framför allt gavs ett särskilt fokus på den autofagiska maskinens potentiella roll för att modulera infektionen. Autofagi, först beskrivs som en process som upprätthåller cellulär homeostas genom näringsämnen och organell återvinning, kännetecknas också som en antimikrobiell mekanism, vilket tillåter nedbrytning av intracellulära patogener 62 . Den autofagiska maskinen har visat sig spela en roll i nedbrytningen av intracellulär tuberkulös mykobakterier, eftersom den främjar fagosommognad 46 . Det är inte förvånande att autofagiinduktion hos M. llatzerense- infekterade A. castellanii resulterade i en signifikant minskning av bakteriell överlevnad. Effektivt dödande av M. llatzerense verkade emellertid nyanserat, eftersom 50% av de intracellulära mykobakterierna fortfarande var livskraftiga efter autofagiinduktion. Den partiella överlevnaden av M. llatzerense efter autofagi-aktivering kan återspegla dess inneboende motstånd mot annonsförhållanden såsom sura och oxidativa spänningar. Detta fynd är i överensstämmelse med en tidigare studie som beskrev M. aviums förmåga att föröka sig inom fagolysosomer, medan M. tuberculosis endast kunde bestå i ett sådant tillstånd 63 . Genom att använda ett pH-känsligt fluorescerande färgämne var det dessutom möjligt att bevisa att levande mykobakterier fanns signifikant mindre i surgjorda fack än värmedödade mykobakterier. Detta resultat förstärkte bevisen beträffande M. llatzerense förmåga att aktivt blockera A. castellanii- fagocytosprocessen och bekräfta transkriptionsprofilerna för de analyserade generna.

Sammanfattningsvis ger det arbete som presenteras här insikter om mekanismer som används av M. llatzerense , en miljömässig NTM, för att motstå A. castellanii predation. Det visade sig att M. llatzerense smittade effektivt A. castellanii genom fagocytos, förblev livskraftig och kunde växa i upp till 96 timmar. M. llatzerense intracellulär lokalisering inom A. castellanii indikerade persistens i vakuoler, såväl som en potentiell undertryckning av värdlipidmetabolismen. En jämförande genomisk strategi identifierade tolv bevarade virulensfaktorer, delade mellan M. llatzerense och M. tuberculosis . Analyser av transkriptionella profiler framhävde att alla utvalda gener förutom glyA1 och ppe10 signifikant uppreglerades under det tidiga stadiet av A. castellanii- infektion. Detta ledde till att man antydde att M. llatzerense mycket troligt kan hämma phagosomal försurning, samtidigt som det motsätter sig autofagi-inducerade annonsvillkor. Sammantaget definierade denna studie M. llatzerense tydligt som en amebebeständig bakterie. Det visade sig att M. llatzerense upprättade en utarbetad och effektiv strategi, inte bara för att överleva utan också dra fördel av närvaron av FLA för dess tillväxt. Denna kapacitet kan mycket väl förklara den ofta återhämtningen av denna NTM i flera dricksvatten nätverk.

metoder

Isolering och kultur av mikroorganismer

NTM isolerades från Paris dricksvatten nätverk. I korthet filtrerades vattenprover (1 1) genom ett 0, 45 um cellulosamembran, sonikerades under 10 minuter och dekontaminerades med användning av 3% laurylsulfat och 1% NaOH, såsom beskrivits tidigare 64 . Bakteriepellets sprids på Lowenstein Jensen-medium och inkuberades vid 30 ° C. Kolonier subkulturerades på Middlebrook 7H10 agarplattor. För att säkerställa renheten hos isolerade stammar dekontaminerades isolaten återigen enligt Löwenstein-metoden såsom beskrivits tidigare och spriddes på Middlebrook 7H10-plattor kompletterade med 10% OADC (Oleic acid, Albumin, Dextrose, Catalase; Becton-Dickinson) 65 . Ziehl-Neelsen kallfärgning utfördes för att bekräfta närvaron av syrasnabba baciller. I korthet färgades värmefixade prover under 3 timmar i kall karbon Fuchsin. Prover sköljdes och behandlades med 25% svavelsyrabehandling under 45 sekunder följt av absolut etanol under 5 minuter. En motfärgning utfördes genom inkubering av prover med 0, 2% metylenblått under 2 minuter. Alla mycobacteria-isolat bibehölls på Middlebrook 7H10-plattor vid 30 ° C. Escherichia coli- stam K-12-stam odlades och upprätthölls på LB-agar (10 g / L trypton, 5 g / 1 jästextrakt, 10 g / L NaCl, 15 g / L agar) plattor vid 37 ° C. Acanthamoeba castellanii- stam ATCC 30234 odlades axiskt i PYG-medium (20 g / L proteospepton, 1 g / L jästextrakt, 1 g / L natriumcitrat, 0, 1 M glukos, 0, 4 mM CaCl2, 4 mM MgS04, 2, 5 mM Na 2 HPO 4, 2, 5 mM KH2PO4, 50 mikrometer Fe (NH4) 2 (SO4) 2, pH 6, 5) vid 30 ° C.

Samkulturer och fagocytosanalyser

A. castellanii- monolager, odlade i PYG-medium under 3 dagar, uppsamlades, tvättades två gånger med användning av PAS-buffert (Sidas Amoeba saltlösning; 1 g / L natriumcitrat, 0, 4 mM CaCl2, 4 mM MgS04, 2, 5 mM Na2HP04, 2, 5 mM KH2PO4), justerad till en slutkoncentration av 2, 5 x 105 celler / ml och 1 ml fördelades i varje brunn i en 12-brunnars platta. Mykobakterier som odlats under 4 dagar ( dvs tidig stationär fas) användes för att infektera A. castellanii vid en infektionsmultiplikation (MOI) av 1 eller 10 vid 30 ° C.

Dropptest utfördes genom att sådd homogent 4, 10 6 A. castellanii trophozoites på Middlebrook 7H10 agar kompletterat med 10% (v / v) OADC (120X120 mm petriskålar). Mycobacteria suspensions were prepared in PAS buffer, supplemented with 0.005% triton X-100 to avoid clumping, and homogenised by three passages using a 27 gauges needle. The suspension was spotted (from 1 × 10 8 to 1 × 10 3 bacteria/mL) on agar medium in presence or absence of A. castellanii as prepared previously, and incubated at 30 °C or 37 °C for optimal bacterial growth.

For the assessment of mycobacteria viability, A. castellanii monolayers in 12-wells plates were infected at a MOI of 1 for 16 h. Supernatant was discarded, cells washed twice and resuspended in 1 mL of fresh PAS buffer at 0, 24, 72 and 96 hours. Trophozoites were lysed and mycobacteria enumeration was performed as described above.

For evaluating the number of infected cells, A. castellanii monolayers in 12-wells plates were infected at a MOI of 1. Trophozoites were washed three times using PAS buffer before processing. Cells were centrifuged at 800 g for 5 minutes, supernatant was discarded, and the pellet resuspended in 50 μL of PAS, spread on a glass slide, heat-fixed and processed for Ziehl-Neelsen staining. Percentages of infected amoebae were calculated on the basis of at least 200 amoebae cells par slides, in a minimum of five different fields. In order to determine internalisation mechanisms of M. llatzerense, A. castellanii monolayers in 12-wells plates were infected at a MOI 10 for 4 h, in co-incubation with cytochalasin D at 100 μM in PAS buffer. For induction of autophagy A. castellanii trophozoïtes were infected at a MOI of 10 for 4 h, and treated for 1 h using 1 μM or 10 μM rapamycin in PAS.

Evaluation of phagosomal acidification

M. llatzerense suspension prepared as described previously were pre-labelled using pHrodo TM Red succinimidyl ester (ThermoFischer Scientific) following manufacturer recommendations, but excluding the methanol washing step. Briefly, bacterial suspensions were incubated for 1 h in 0.1 M sodium bicarbonate buffer containing 20 μM pHrodo TM Red succinimidyl ester, in the dark. Bacteria were then pelleted by centrifugation at 12000 g for 5 min, and washed twice in PAS buffer supplemented with 0.005% triton X-100. In one condition, mycobacteria were killed before the initial incubation by heating the suspension at 85 °C for 15 min, in order to assess the importance of bacterial viability in subsequent analyses. A. castellanii monolayers were infected by either alive of heat-killed labelled mycobacteria at a MOI of 10, in 6 wells plates. After 2 h of incubation, trophozoites were detached, fixed with 2% paraformaldehyde for 15 min in the dark. Cells were pelleted by centrifugation at 800 g for 10 min, and resuspended in a 30 μL of SlowFade Diamonds antifade mountant (ThermoFischer Scientific) with Hoechst at a concentration of 400 ng/mL. Samples were examined using a confocal laser scanning microscope (SP8, Leica). To estimate the fraction of M. llatzerense residing in acidified phagosomes, a ratio was calculated based on the total number of bacteria (as detected by Hoechst staining) divided by the number of bacteria being labelled as well by pHrodo, which fluoresces only in acidic environment.

Nukleinsyraekstraktion

Isolated M. llatzerense colony was suspended in phosphate buffer saline, subsequently bead-beaten in tubes containing 500 mg of small diameter glass beads (100 μm) and 4 glass beads of 2 mm diameter (Sigma) using Fastprep apparatus for 30 s, put on ice for 1 min, and bead-beaten again using the same parameters. The suspension was then processed for DNA extraction using NucleoSpin Tissue kit (Macherey-Nagel), following manufacturer recommendations for bacterial DNA extraction.

For RNA extraction cells were collected, suspended in 400 μL of resuspension solution (sterile ultrapure water with 10% Glucose, 12.5 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 7.6) and transferred to a tube containing 400 mg of small diameter glass beads (100 μm) and 500 μL of acid phenol. Samples were bead-beaten as described above and centrifuged for 5 min at 14000 g, 4 °C. Supernatants were kept on ice and transferred into clean tubes. 1 mL of TRIzol ® reagent (Life Technology) was added to each sample, and incubated at room temperature for 5 min. 100 μL of chloroform/isoamyl alcohol (24:1 v/v) was added to each sample, shaken vigorously, incubated for 1 min and centrifuged for 5 min at 14000 g. Aqueous phase was transferred into a new tube, treated again with 200 μL of chloroform/isoamyl alcohol as described above. The collected aqueous phase was washed with 500 μL of isopropanol for 1 h on ice and centrifuged at 16000 g for 30 min. Supernatants were discarded and pellets washed with 1 mL of 70% ethanol, centrifuged 15 min at 16000 g. Pellets were air dried and suspended 50 μL of ultrapure water, 7.5 mM sodium acetate, and 150 μL of absolute ethanol. Samples were incubated at −20 °C overnight and centrifuged for 30 min at 16000 g. Pellets were rinsed as described above, let air dried, and suspended in 30 μL of ultrapure water. RNA samples were subsequently treated using TURBO TM DNase (Life Technologies) according to manufacturer recommendations, purified once again using phenol/chloroform and quantified by spectrophotometry. RNA were aliquoted, stored at −80 °C, and one aliquot of each condition was used immediately for reverse transcription, using GoScript TM Reverse transcription System (Promega). The resulting cDNA were used for downstream quantification by qPCR.

DNA amplification and quantification

Amplifications of targeted loci from total DNA were done by PCR. Mixtures were prepared in a final volume of 25 μL, containing 5 μL of 5x GC buffer, 400 nM of each deoxynucleotide triphosphate, 1, 5 mM MgCl2, 500 nM of each primer, 0.5 U of Phusion polymerase (Thermo Scientific), 2.5 μL of template DNA and PCR grade water in sufficient quantity for 25 μL. Primers U341F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′) U926R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′) and Myco F (5′-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3′) Myco R (5′-AGCGGCTGCTGGGTGATC-3′) were used for partial amplification of 16 S and rpoB genes, respectively 66 . PCR were carried out in a Master Cycler Thermocycler (Eppendorf). PCR mixtures were subjected to an initial denaturation at 98 °C for 30 sec, 35 cycles of denaturation at 98 °C for 10 sec, hybridization at 56 °C for 10 sec and elongation at 72 °C for 20 sec. A final extension step was applied at 72 °C for 5 min. Amplicons were checked on 1.5% agarose gel and stained with Midori Green (Nippon Genetics). cDNA was quantified by quantitative PCR (qPCR) using primers pairs targeting specific loci (Supplementary Table 1). Mixtures for quantification were performed in a final volume of 20 μL, containing 10 μL of 2X SYBR ® Green PCR Master Mix (Life Technologies), 250 nM of each primer, 2 ng of cDNA, and molecular grade water in sufficient quantity for 20 μL. Experiments were carried out in a Viia7 real time thermocycler (Life Technologies), consisting in an initial denaturation step at 95 °C for 10 min, 45 cycles of denaturation at 95 °C for 15 sec, annealing for 15 sec at 63 °C to 65 °C, and elongation at 72 °C for 20 sec. Fusion curves were collected for each experiments. Quantification of transcripts were performed by calculating fold changes using 2 −ΔΔCt method, corrected by qPCR efficiency for each gene, and normalised to the control condition at 0 h, as well as the control gene expression of 16S rRNA 67 . Statistical significance was assessed using multiple t-tests coupled with the Holm-Sidak method, as implemented in Graphpad Prism 6.

Whole genome sequencing and annotation

Once identification and purity of mycobacterial isolates were confirmed by both 16 S and rpoB sequencing, total DNA were processed for whole genome sequencing, using GS junior 454 pyrosequencer (Roche). Library preparation, emulsion PCR and sequencing were performed following manufacturer's protocols. Raw sequences were then assembled using GS denovo Assembler software (Roche). The assembly was uploaded for annotation using RAST online annotation tool 68, 69 . Sequences resulting from the assembly are available on the NCBI database under accession number ASM186516v1.

Elektronmikroskopi

The localisation of M. llatzerense inside A. castellanii was investigated using transmission electron microscopy following the protocol described in 70 . Briefly, amoebae were carefully collected at 4 h, 24 h and 72 h after infection by M. llatzerense at a MOI of 1, and fixed in 3% glutaraldehyde and osmium tetroxide. Cells were dehydrated in successive baths of 50%, 70%, 90% and 100% acetone. Cells were embedded in araldite resin, and ultrathin section of 60 nm were cut and stained with uranylacetat and lead salts according to Reynolds. Ultrathin sections were observed using JEOL 1010 transmission electron microscope operating at 75 kV.

ytterligare information

How to cite this article: Delafont, V. et al. Mycobacterium llatzerense , a waterborne mycobacterium, that resists phagocytosis by Acanthamoeba castellanii. Sci. Rep. 7, 46270; doi: 10.1038/srep46270 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Extramaterial

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.