Monocyter och t-celler samverkar för att gynna normal och follikulär lymfom-b-celltillväxt: roll för il-15 och cd40l signalering | leukemi

Monocyter och t-celler samverkar för att gynna normal och follikulär lymfom-b-celltillväxt: roll för il-15 och cd40l signalering | leukemi

Anonim

Abstrakt

Interleukin-15 (IL-15) har studerats omfattande för sin roll i överlevnaden och spridningen av NK- och T-celler genom en unik mekanism för transpresentation av producentceller. Omvänt, medan aktiverade B-celler har beskrivits som IL-15-svarande celler, förblir det cellulära och molekylära sammanhanget som upprätthåller denna effekt outforskat. I denna studie fann vi att även om humana B-celler inte kunde svara på lösliga IL-15, monocyter och lymfoidvävnads-härledda makrofager men inte stromala celler effektivt trans-närvarande IL-15 till normala B-celler och samarbetar med T-cell- härledd CD40L för att främja IL-15-beroende B-cellproliferation. Vidare utlöser CD40L-signalering en Src-oberoende uppreglering av STAT5-uttryck och gynnar en Src-beroende fosforylering av STAT5 som svar på IL-15. Vid follikulärt lymfom (FL) rapporterade immunohistokemiska studier ett starkt samband mellan maligna B-celler, infiltrerande makrofager och T-celler. Vi visar här ett överuttryck av IL-15 i renade tumörassocierade makrofager och STAT5A i renade tumör B-celler. Dessutom svarar FLB-celler på IL-15 trans-presenterade av monocyter / makrofager, i synnerhet i närvaro av CD40L-medierad signalering. Detta samarbete mellan IL-15 och CD40L förstärker vikten av tumörmikromiljö och upptäcker en mekanism för FL-tillväxt som bör övervägas om man använder IL-15 som ett läkemedel vid denna sjukdom.

Introduktion

Follikulärt lymfom (FL) är det vanligaste indolenta lymfom och är resultatet av den klonala expansionen av kärncentrum (GC) -ledda B-celler som behåller typiska egenskaper hos deras normala motsvarighet. 1, 2 Speciellt är FL-celler starkt beroende av både B-cellreceptorsignalering och korsning med deras stödjande mikromiljö, inklusive specialiserade stromalceller, CD4 pos T-celler och makrofager. I överensstämmelse antyder genprofileringsanalyser att FL-patientens resultat korreleras med molekylära signaturer av icke-maligna tumörinfiltrerande celler. 3 Vi har tidigare visat att benmärgs- och lymfkörtel (LN) -ledda stromalceller stödjer FL B-cellmigration och överlevnad. 4 Resident CD4 pos T-celler antas också ha en avgörande roll för att främja malig B-celltillväxt, särskilt genom CD40-medierad signal, 5 och vi avslöjade nyligen att FL-mikromiljö kännetecknas av en stark anrikning i follikulära hjälpar-T-celler (T FH ), den huvudsakliga CD40L-uttryckande T-cell-underuppsättningen. 6 Slutligen antyder mikroarray-genuttrycksstudier, kvantitativa PCR-analyser och immunohistokemiska experiment att ett stort antal CD68 pos eller CD163 pos tumörassocierade makrofager (TAM) är av dålig prognos hos FL-patienter som behandlas med kemoterapi som inte är associerade med antikroppsbaserad immunterapi. . 7, 8, 9, 10, 11 Vid diffusa stora B-celllymfom, det vanligaste aggressiva GC-härledda lymfom, levererar monocyter dessutom överlevnadssignaler till maligna B-celler åtminstone delvis genom produktion av B-cellaktiverande faktor ( BAFF). 12 Hur som helst TAM gynnar FL-B-celltillväxt in situ och vad som kan vara den samarbetsroll som angränsande T-celler i detta sammanhang har inte beaktats.

Interleukin-15 (IL-15), ett pleiotropiskt cytokin främst producerat av monocyter / makrofager och mogna dendritiska celler, 13 är en förmodad TAM-härledd FL-tillväxtfaktor. I själva verket, medan IL-15 inte har någon stimulerande aktivitet på vilande B-celler in vitro, antyder 14 flera studier att IL-15 synergiserar med CpG-oligonukleotider, tvärbindning av B-cellreceptorn eller CD40-signalering för att främja naiv, GC och minne B-cellproliferation och differentiering. 15, 16, 17 Dessa data indikerar att normala B-celler bör betraktas som IL-15-svarande celler, även om IL-15-producerande celler samt transduktionssignalering i detta sammanhang inte har utvärderats. Det är viktigt att IL-15 också har beskrivits som en tillväxtfaktor i icke-GC-härledda mogna B-cellneoplasier. I synnerhet upprätthåller paracrin IL-15 överlevnad och spridning av kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) B-celler genom en stark aktivering av både STAT5- och ERK1 / 2-vägar. 18, 19 Intressant nog förbättras de mitogena och anti-apoptotiska effekterna av IL-15 när CLL B-celler föraktiveras av CD40. Dessa resultat är särskilt relevanta när man tänker på att CLL-celler, liksom FL-celler, är starkt beroende av en specifik mikromiljö inklusive CD4 pos T-celler, stromalceller och myeloida celler. 20

Dessa observationer fick oss att spekulera i att monocyter / makrofager kan stödja tillväxten av normala och FLB-celler, och att IL-15 kan vara involverad i denna process. Med tanke på stromalcells roll i lymfomagenes undersökte vi också deras förmåga att trans-presentera IL-15 till B-celler. Slutligen, i överensstämmelse med den starka infiltrationen av FL-tumörer av T FH, har vi undersökt roll och mekanism för T-cell-härledd CD40-stimulering som en IL-15-kofaktor.

Resultat

Monocyter / makrofager trans-presenterar effektivt IL-15 till B-celler

Praktiskt taget alla renade B-celler i tonsillerna dog under kortvarig in vitro- kultur. Intressant nog utlöste cirkulerande monocyter deras överlevnad effektivt, med en 18-faldig ökning av antalet livskraftiga B-celler på dag 7 (figur la). Löslig IL-15 kunde inte i sig främja överlevnaden av renade B-celler in vitro . Det är emellertid känt att IL-15 väsentligen trans-presenteras som ett bioaktivt IL-15 / IL-15Ra-komplex genom att producera celler till angränsande celler som bär IL-2 / IL-15Rp och yc-kedjorna. 22, 23 I överensstämmelse förstärktes den skyddande effekten av monocyter på B-celler betydligt i närvaro av exogent IL-15, vilket antydde att vilande B-celler direkt skulle kunna svara på IL-15-presenterande celler. För att ytterligare utvärdera den biologiska relevansen av denna process inom sekundära lymfoida organ försökte vi identifiera en tillförlitlig markör för utarmning av makrofag i tonsiller. I själva verket är CD68 övervägande en intracellulär Ag, CD14 uttrycks dåligt på LN-makrofager 24 och färgning av CD163 är för svag för att möjliggöra en effektiv Ab-baserad utarmning. Omvänt uttrycks rensningsreceptorn CD36 specifikt och allmänt på tonsil CD68 pos- makrofager (kompletterande figur S1). I överensstämmelse uppvisade renade CD36- posceller ett homogent CD68-uttryck medan CD36-utarmade celler inte innehöll några återstående CD68- posmakrofager . Intressant nog förstärkte IL-15 antalet livskraftiga B-celler när de tillsattes på hela tonsillcellsodlingar, men denna stödjande effekt avskaffades fullständigt när CD36 pos- makrofager selektivt avlägsnades från tonsillcellsuspensioner (figur Ib). Vi planerade bredvid att ta itu med rollen som endogen IL-15 i monocytdriven B-cellöverlevnad. IL15 och IL15RA målriktades genom en gen-tystnad-metod som ledde till en 53 ± 7% respektive 54 ± 10% minskning av motsvarande genuttryck (figur 1c). Dessa resultat bekräftades på proteinnivån med flödescytometri. IL15 och IL15RA små störande RNA uppvisade ingen korsreaktivitet, vilket avslöjades genom den specifika moduleringen av deras respektive mRNA. Omvänt ledde inriktning av IL15RA till en väsentlig minskning av ytan-IL-15-uttryck som bekräftade att membranbunden IL-15 på monocyter väsentligen laddades på IL-15Ra. Den partiella hämningen av IL-15 och IL-15Ra-uttryck reducerade signifikant de monocytberoende överlevnad B-cellerna (20 ± 12% respektive 31 ± 15%). Dessutom är dessa effekter mycket lik de som tidigare rapporterats för blockad av BAFF-signalering 12 (figur 1d). Sammantaget visade dessa resultat entydigt att även om B-celler inte kunde reagera på löslig IL-15, kunde både monocyter och lymfoida vävnadsmakrofager trans-presentera funktionella IL-15 till B-celler som en del av deras B-cellstödjande kapacitet.

Image

IL-15 är involverad i den B-cellstödjande effekten av monocyter / makrofager. ( a ) Tonsil B-celler odlades ensamma eller med renade monocyter i närvaro eller inte (∅) av IL-15. Efter 7 dagar kvantifierades antalet livskraftiga B-celler genom flödescytometri med användning av kalibrerade mikrokulor. Felrad representerar sd från fyra oberoende experiment. ( b ) Hela tonsiller (odepleterade) eller CD36-utarmade mandlar odlades under 4 dagar i närvaro eller frånvaro av IL-15 före kvantifiering av livskraftiga B-celler. Det godtyckliga värdet på 1 tilldelades antalet erhållet med odepletta mandlar utan IL-15. Felrad representerar sd från sex oberoende experiment. ( c ) IL15 eller IL15RA riktades till monocyter med fördesignat litet interfererande RNA. Effekten av gendämpning validerades 48 timmar efter transfektion vid både mRNA (vänster) och protein (höger) nivåer. RQ-PCR-resultat normaliserades till tre hushållsgener och jämfördes med nivån i monocyter transfekterade med kontroll-litet störande RNA, godtyckligt tilldelat 1. Data uttrycks som medelvärdet +/− sd från fyra oberoende experiment. För färgning av flödescytometri representerar svarta fyllda histogram isotype-matchade kontroller och visas är en representativ för de tre experimenten. ( d ) Renade B-celler odlades ensamma eller med monocyter transfekterade med indikerat litet interfererande RNA, och det absoluta antalet livskraftiga B-celler utvärderades efter 4 dagar. Det godtyckliga värdet på 1 tilldelades det antal som erhölls i kokultur med monocyter transfekterade med liten kontroll av störande RNA. Felrad representerar sd från fyra oberoende experiment. ( * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001).

Bild i full storlek

Eftersom LN-härledda stromceller stödjer överlevnaden av normala och FLB-celler, 4, 21 kontrollerade vi också deras förmåga att utlösa en funktionell IL-15-beroende signal. Vi visade tidigare att tumörnekrosfaktor-a (TNF-a) och lymfotoxin-a1P2 (LT) förstärkte stromalcells förmåga att stödja överlevnad av B-celler. 4 Intressant nog ökade stimulering av stromaceller genom TNF / LT starkt IL-15 / IL-15Ra-uttryck (kompletterande figur S2). Medan kombinationen av anti-IL-15 och anti-IL-15Ra-neutraliserande mAb emellertid minskade 58 ± 5% av överlevnadseffekten av TNF / LT-förbehandlade LN-stromalceller på NK-celler, var deras förmåga att upprätthålla normal B-cellöverlevnad var inte nedsatt. Samma resultat erhölls för både B-celler och NK-celler med användning av liten störande RNA-strategi (data visas inte). LN-stromalceller kunde alltså trans-presentera funktionell IL-15 men tvärtom till monocyter / makrofager var denna egenskap inte involverad i deras B-cellstödskapacitet.

T-cell-härledd CD40L ger IL-15-känslighet för B-celler

IL-15 beskrevs tidigare som ett B-cell-stimuleringsmedel i närvaro av mitogena signaler. 15, 16 I överensstämmelse samarbetade IL-15 med CD40L för att öka B-celltillväxt i tonsill (figur 2a). Intressant nog var detta också fallet för renade GC B-celler, den normala motsvarigheten till FLB-celler (kompletterande figur S3). Observera att IL-15 förstärkte CD40L-beroende B-cellproliferation utan någon reduktion av B-cellens apoptos jämfört med CD40L enbart (data visas inte). Därefter utförde vi rekonstitutionsexperiment med autologa renade T-tonsill-celler som är kända för att innehålla en hög andel CD4 pos CD40L pos T FH- celler. 6 Såsom beskrivits för löslig CD40L-molekyl ökade kokultur med autologa T-celler B-celltillväxt, och IL-15 förstärkte ytterligare denna stödjande effekt (figur 2b). Dessutom reducerade en neutraliserande mAb-målinriktande CD40L 54 ± 12% av denna ytterligare IL-15-medierade B-celltillväxt. Sammantaget indikerade dessa resultat att sekundära lymfoida organ T-celler överförde IL-15-känslighet för B-celler åtminstone delvis genom CD40L-signal.

Image

T-cell-härledd CD40L främjar IL-15-beroende B-cellproliferation. ( a ) Tillväxten av renade B-celler i närvaro eller inte (∅) av CD40L och / eller IL-15 bedömdes genom absolut kvantifiering av livskraftiga B-celler genom flödescytometri på dag 7 (vänster, n = 3) och genom införlivande av tritierad tymidin på dag 3 (höger, n = 6). ( b ) Renade B-celler i tonsiller odlades med eller utan renade autologa T-T-celler i närvaro eller inte (∅) av IL-15, neutraliserande anti-CD40L mAb eller oberoende isotyp-matchad kontroll. Efter 4 dagar kvantifierades antalet TOPRO-3 neg CD19 möjliga B-celler genom flödescytometri och jämfördes med antalet B-celler odlade utan någon stimulering, godtyckligt tilldelat 1. Felstänger representerar sd från tre oberoende experiment. ( * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; NS, inte signifikant).

Bild i full storlek

Vi bestämde oss nu för att avslöja molekylmekanismerna för denna T-cellbaserade licensiering. Den ökade känsligheten hos CD40-aktiverade B-CLL-celler för mitogena effekter av IL-15 var tidigare associerad med ett ökat uttryck av IL-15Ra och IL-2Rp. 19 Men nivån av IL-15Ra påverkades inte av CD40-triggning i normala B-celler vid både mRNA- och proteinnivåer. Dessutom var den svaga uppregleringen av IL-2Rp och IL-2Ry associerad med en mycket begränsad ökning av deras förmåga att binda exogent IL-15 (kompletterande figur S4). Vi studerade således de tidiga signalhändelserna som utlöses av CD40L och IL-15. Först, medan IL-15 endast inducerade en svag STAT5-fosforylering i vilande B-celler, uppvisade CD40L-föraktiverade B-celler en stark STAT5-fosforylering som svar på IL-15 (figur 3a). Nyligen visades CD40L inducera uttryckning och aktivering av c-Src-tyrosinkinas i B-celler som kunde associeras med och fosforylera STAT5a och STAT5b. 25, 26, 27 Vi ansåg således att samarbetet av CD40L och IL-15 för induktion av P-STAT5 kunde förmedlas genom c-Src. Faktum är att PP2, en selektiv hämmare av c-Src, helt avskaffade ökningen av IL-15-beroende STAT5-fosforylering inducerad genom CD40L-förstimulering (figur 3a och b). Intressant nog avslöjade en djupare undersökning av STAT5-uttryck att CD40L också främjade ett IL-15-oberoende överuttryck av totalt STAT5 i B-celler, vilket bevisades efter normalisering till p-aktinnivåer (figur 3c). Denna ökning var associerad med en specifik transkriptionell uppreglering av STAT5A mRNA, medan STAT5B- och STAT3- uttryck inte modifierades efter CD40-ingrepp. Dessutom påverkade inte hämning av Src-kinas induktionen av STAT5-expression genom CD40L-signalering. Sammantaget visade dessa resultat att T-cell-härledd CD40L ökade B-cellrespons på IL-15 med två oberoende mekanismer, det vill säga den Src-oberoende IL-15-oberoende transkriptionell uppreglering av STAT5-uttrycket och den Src-beroende ökningen av IL-15-driven STAT5-fosforylering.

Image

CD40L-signalering gynnar STAT5-aktivering i B-celler. ( a ) Renade B-celler från tonsil förbehandlades eller inte med CD40L under 24 timmar utan någon hämmare (vänster) eller i närvaro av Src-kinasinhibitorn PP2 eller dess lösningsmedel (dimetylsulfoxid) (höger). Cellerna svaltes sedan och stimulerades eller inte med IL-15 under 15 minuter. Proteiner reducerades i SDS-PAGE och STAT5, P-STAT5 och p-aktinuttryck bestämdes med western blot. ( b ) P-STAT5-uttryck kvantifierades genom densitometrisk avsökning av Western blot-band och normaliserades med P-aktin som en belastningskontroll. Felrad representerar sd från fyra oberoende experiment. ( c ) (Vänster) Renade tonsil B-celler förbehandlades eller inte (∅) med CD40L under 24 timmar i närvaro av PP2 eller dess lösningsmedel (dimetylsulfoxid). Totalt STAT5-uttryck kvantifierades och normaliserades med p-aktinuttryck som en lastkontroll. Felrad representerar sd från fyra oberoende experiment. (Höger) Renade B-celler från tonsil behandlades eller inte under 24 timmar med CD40L före kvantifiering av STAT3, STAT5A och STAT5B mRNA med RQ-PCR. Varje prov normaliserades till ABL1 och jämfördes med obehandlade celler. Felstänger representerar sd från sex oberoende sampel. ( * P <0, 05; ** P <0, 01; NS, inte signifikant).

Bild i full storlek

Monocyt-härledda IL-15 och T-cell-härledda CD40L samverkar för att främja B-celltillväxt

För att ytterligare bekräfta att monocyter / makrofager kunde trans-presentera IL-15 direkt till B-celler, försökte vi undersöka endogen IL-15-signalering under kokultur. För det ändamålet använde vi IFN-y-aktiverade monocyter som visade ett högt uttryck av IL-15 / IL-15Ra, som tidigare rapporterats 28 (figur 4a). När vilande B-celler koklades med IFN-y-aktiverade monocyter som uttrycker IL-15, kunde vi inte upptäcka STAT5-fosforylering medan P-STAT5 inducerades starkt av exogent lösligt IL-15 (figur 4b). Det är viktigt att P-STAT5 förblev odetekterbar i renade monocyter stimulerade in vitro med IL-15 under våra förhållanden, vilket tyder på att B-celler är de enda IL-15-svarande cellerna i detta kokultursystem (data visas inte). Intressant nog, när B-celler förprimulerades med CD40L, var övergående kokultur med IFN-y-aktiverade monocyter tillräckligt per se för att inducera STAT5-fosforylering och denna STAT5-aktivering upphävdes fullständigt genom en kombination av anti-IL-15 och anti-IL-15Ra neutraliserande mAb. Sammantaget argumenterade dessa resultat starkt för en direkt trans-presentation av IL-15 till svarande B-celler av aktiverade monocyter.

Image

Monocyt-härledda IL-15 och T-cell-härledda CD40L samverkar för att öka B-celltillväxt i tonsiller. ( a ) Monocyter stimulerades under 24 timmar med eller utan IFNy före färgning för IL-15 och IL-15Ra-uttryck. Fyllda histogram representerar isotyp-matchad kontroll, streckade linjer obehandlade monocyter (MO) och fullständiga linjer IFNy-behandlade MOs. Visat är ett representativt experiment av tre. ( b ) Renade MOs förbehandlades med IFNy- och tonsil B-celler och förbehandlades eller inte med CD40L under 24 timmar. Vilande eller CD40L-aktiverade B-celler kokades sedan med MOs under 15 minuter i närvaro eller inte av neutraliserande antikroppar mot IL-15 och IL-15Ra eller IL-15. STAT5, P-STAT5 och p-aktinuttryck bestämdes sedan med Western blot. Visad är en representant från tre oberoende experiment. ( c ) Renade tonsil-B-celler koklades med renade MOs i närvaro eller inte (∅) av IL-15 och CD40L och deras tillväxt bedömdes genom införlivande av tritierad tymidin på dag 3 (vänster, n = 6) och genom absolut kvantifiering av livskraftiga B-celler genom flödescytometri på dag 7 (höger, n = 4). ( d ) (Vänster) Renade tonsil B-celler färgades med CFSE och odlades med renade MOs i närvaro eller inte (∅) av IL-15 och CD40L. Efter 3 dagar bestämdes antalet CFSE- lo- spridande livskraftiga B-celler genom flödescytometri och jämfördes med antalet B-celler erhållna i kokultur med MOs utan IL-15 och CD40L, godtyckligt tilldelat 1. Felstänger representerar sd från sex oberoende experiment. (Höger) Renade tonsil B-celler odlades med renade MOs i närvaro eller inte (∅) av IL-15 och CD40L. Efter 24 timmar utvärderades antalet apoptotiska B-celler genom aktiv caspase-3-färgning i närvaro av kalibrerade mikrokulor och jämfördes med antalet apoptotiska B-celler odlade med MOs, godtyckligt tilldelade 1. Felstänger representerar sd från sex oberoende experiment. ( * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; NS, inte signifikant).

Bild i full storlek

Inom normala och FL LN finns B-celler i nära interaktion med både CD40L pos T-celler och IL-15-uttryckande makrofager vilket gör det obligatoriskt att utforska den potentiella synergin mellan dessa två signaler för B-celltillväxt. Vi demonstrerade att CD40L-signalering kraftigt förbättrade monocytberoende B-celltillväxt och att IL-15 ytterligare ökade med tvåfaldig tymidininkorporering vid dag 3 i detta trepartsodlingssystem (figur 4c). Samma resultat erhölls med användning av absolut livskraftigt B-cellantal. För att undersöka hur trans-presenterad IL-15-modulerad B-cellproliferation och / eller överlevnad utvärderade vi samtidigt antalet CFSE- lo- prolifererande B-celler och antalet caspase-3 pos apoptotiska B-celler. Medan CD40LCD40L främjade starkt både B-cellproliferation och överlevnad, förstärkte IL-15 presenterad av monocyter ytterligare B-cellproliferation utan ytterligare anti-apoptotisk effekt.

IL-15 stimulerar primär FL B-celltillväxt i närvaro av monocyter och CD40L-signalering

Maligna FLB-celler blandas med CD4 pos CD40L pos T-celler i invaderade LN. Genuttrycksprofilering av FL-cellnisch avslöjar dessutom en stark T- FH- signatur, 6 och en föredragen intrafollikulär fördelning av CD4- pos- T-celler beskrivs som en prediktor för sämre prognos. 29, 30 Slutligen förutsäger ett stort antal CD68 pos TAM ett ogynnsamt resultat hos FL-patienter. 7, 30 Dessa observationer höjer hypotesen att monocyt-härledd IL-15 och T-cell-härledd CD40L skulle kunna samarbeta för att främja malig B-celltillväxt i FL.

För att testa denna hypotese renade vi först CD36 pos- makrofager från tonsiller och FL-prover och jämförde dem för IL-15- expression med RQ-PCR. FL TAM överuttryckte IL-15 signifikant jämfört med makrofager i tonsiller och med renade blodmonocyter (figur 5a). Parallellt genomfördes mikroarray-experiment på CD19 pos B-celler renade från FL och reaktiva LN och avslöjade en uppreglering av STAT5A i maligna B-celler. Vi bekräftade detta resultat med RQ-PCR med användning av cellsorterad CD19 pos CD10 pos GC-härledda B-celler (figur 5b). Dessa data antydde att IL-15-överuttryckande makrofager samexisterar med STAT5A-överuttryckande B-celler inom FL-cellnisch.

Image

IL-15-väg inom FL-cellnisch. ( a ) IL15- mRNA-uttryck mättes med RQ-PCR i sorterad tonsil ( n = 5) och FL ( n = 6) makrofager (M ^) såväl som i blodmonocyter ( n = 4). Varje prov normaliserades till tre hushållsgener och det godtyckliga värdet på 1 tilldelades medianuttrycket i tonsil MΦ. ( b ) (Vänster) LN-biopsier från 23 FL-patienter vid diagnos och 10 icke-maligna inflammerade LN samlades. CD19 pos B-celler från FL (FLB) eller reaktiva LN: er (RLN B) renades med användning av anti-CD19-mikrokulor. RNA extraherades och biotinylerade cDNA amplifierades och hybridiserades till HGU133 Plus 2.0-matriser. Rå data normaliserades med användning av GC-RMA algoritm. (Höger) STAT5A-uttryck bestämdes med RQ-PCR i renade FLB-celler ( n = 9; FLB-celler) eller CD19 pos CD10 pos GC-härledda B-celler i tonsiller ( n = 6; GC B-celler). Varje prov normaliserades till ABL1 och det godtyckliga värdet på 1 tilldelades medianuttrycket i GC B-celler. ( c ) FL-prover färgades med CFSE och odlades i 3 dagar i närvaro eller inte (∅) av IL-15 och / eller CD40L. Antalet prolifererande livskraftiga B-celler bestämdes sedan med flödescytometri med användning av kalibrerade mikrokulor. Varje symbol motsvarar ett individuellt patientprov. ( d ) Renade FLB-celler odlades ensamma eller med eluerade monocyter i närvaro eller inte (∅) av IL-15 och CD40L, och tritierad tymidininkorporering utvärderades på dag 3. Varje symbol motsvarar ett individuellt patientprov. ( e ) Renade FLB-celler från tre olika patienter förbehandlades eller inte med CD40L under 24 timmar före serumsvält och stimulering eller inte med IL-15 under 15 minuter. Proteiner reducerades sedan i SDS-PAGE, och STAT5, P-STAT5 och P-aktinuttryck bestämdes med western blot. ( * P <0, 05; ** P <0, 01; NS, inte signifikant).

Bild i full storlek

Vi försökte sedan utvärdera funktionaliteten för IL-15-signalering i FL. På grund av den lägre andelen CD68 pos- makrofager i de allra flesta FL-prover jämfört med kroniskt inflammerade mandlar, hade 7 IL-15 enbart ingen in vitro- stödjande effekt på FLB-celler när de testades på hela vävnadskulturen (data visas inte). Vi beslutade därför att genomföra CD40L-medierad proliferationsanalys såsom beskrivits ovan för normala B-celler. Intressant nog bekräftade vi vår tidigare studie som visade att en liten men signifikant andel av FLB-celler begick celldelning som svar på CD40-utlösande 21 och visade att IL-15 förstärkte denna effekt (figur 5c). Dessutom uppvisade renade FLB-celler starka likheter med renade normala B-celler inkluderande en brist på svar på fri IL-15 som kunde återställas efter CD40L-stimulering utan någon uppreglering av uttrycket av IL-15Ra, IL-2Rp eller IL-2Ry (Kompletterande figur S3). På liknande sätt främjade IL-15 malig B-cellproliferation i närvaro av monocyter, och CD40L-signalering samarbetade vidare med monocyter för att driva IL-15-beroende FL B-celltillväxt (figur 5d). Slutligen kontrollerade vi STAT5-aktivering i renade FL-celler genom en western-blotting-strategi som avslöjade en stark fosforylering av STAT5 som svar på IL-15 endast i CD40L-förprimerade FL B-celler (figur 5e). Sammantaget antydde dessa resultat att FLB-celler kunde svara på IL-15 presenterade av monocyter / makrofager och att CD40L ökade deras känslighet för IL-15 utan att inducera uttrycket av IL-15-receptorkomponenter.

Diskussion

IL-15 har studerats omfattande för sin förmåga att upprätthålla differentiering, överlevnad och spridning av NK- och T-celler genom en unik cellkontaktberoende mekanism för transpresentation som involverar den högaffinitetsreceptorn IL-15Ra som är associerad med IL-15 vid ytan på producentcellerna. 13 Huvudsyftet med denna studie var att utvärdera förmågan hos IL-15-presenterande celler att stödja tillväxten av normala och maligna B-celler och deras möjliga samarbete med kombinatoriska signaler som uppträder i sekundära lymfoida organ, särskilt de T-cellberoende CD40 / CD40L övergång.

Nyligen genomförda studier har visat att IL-15 trans-presentation bör fungera i samband med andra miljösignaler, såsom CD27 / CD70 och CD137 / CD137 L, för att tillräckligt stödja CD8 pos T-cell homeostase. 31 Dessutom visades fri IL-15 tidigare gynna tillväxten av aktiverade till skillnad från vilande B-celler, även om ingen mekanistisk studie tillhandahölls. 15, 16 Dessutom resulterade ektopiskt uttryck av konstitutivt aktiverad STAT5 i primära humana B-celler i förlängd B-cellöverlevnad och proliferation endast i närvaro av CD40L-signal eller konstitutiv NF-kB-aktivering. 32 Vår detaljerade analys av CD40L- och IL-15-driven signaler ger ledtrådar om deras respektive roller i normalt B-cellbeteende. På ett spännande sätt ger vår studie bevis på att den observerade synergin mellan IL-15 och CD40L i normala och FLB-celler är baserad på en annan mekanism än den som rapporterats i CLL B-celler, som involverade en uppreglering av IL-15Ra-uttryck. 19 Vi visade för första gången att CD40L driver en ökning av uttrycket av total STAT5 i tonsill B-celler. Detta oväntade resultat bekräftar identifieringen av en liten population av aktiverade tonsill-GC B-celler som uppvisar ett ökat uttryck för total STAT5 och som åtagit sig minnescellens öde. Dessutom var aktivering av STAT5 involverad i expansionen av CD40L-stimulerade B-celler. 33 Däremot observerade vi ingen uppreglering av total STAT5 i maligna FLB-celler efter CD40-ingrepp men primära FLB-celler uttryckte högre mängd STAT5A än reaktiva LNs B-celler, ett resultat bekräftades ytterligare med användning av cellsorterad CD19 pos CD10 pos GC -levererade B-celler. Detta resultat överensstämmer med en stark infiltration av neoplastiska folliklar av CD40L pos T FH 6 som kan förse FLB-celler med aktiveringssignaler in vivo . Intressant nog rapporterades både STAT5A- överuttryck och STAT5-aktivering nyligen i FL-prover. 34, 35

Förutom dess effekt på STAT5-uttrycket avslöjar vårt arbete att CD40L samarbetar med IL-15 för att gynna STAT5-aktivering genom en transduktionsväg som involverar Src-tyrosinkinas. Flera andra mekanismer kan stödja samtrafiken mellan IL-15 och CD40L-signaler. I själva verket driver cytokinmedierad STAT5-fosforylering NF-KB-aktivering i pro-B-cellinjen Ba / F3 såväl som i Hodgkins lymfom B-celler. 32, 36 Dessutom gynnar icke-fosforylerad STAT5 också NF-kB-aktivitet som ger en modell där icke-aktiverad STAT5 bidrar till regleringen av lymfoidcelltillväxt. 37 Dessa resultat antyder att CD40L och IL-15 samarbetar för att stödja normal och lymfom B-celltillväxt genom en komplex uppsättning komplementära transduktionsvägar.

En spännande observation var att i närvaro av CD40L-signalering ökar IL-15 väsentligen B-cellproliferation snarare än B-cellöverlevnad. Intressant nog visade IL-15-medierat stöd av överlevnad av NK-celler kontra proliferation nyligen vara separerbara funktioner in vivo. 38 På liknande sätt driver IL-15 i humana intraepitelialymfocyter från patienter med celiaki en cellproliferation och cellöverlevnad med oberoende signalvägar. 39 En annan IL-2-familjemedlem som är involverad i B-cellproliferation och överlevnad är IL-21, som visar positiva eller negativa effekter på B-cellens öde beroende på deras aktiveringsstatus och utvecklingssteg och på närvaron av costimulatoriska signaler. 40 IL-21 uppvisar tillväxtaktivitet på multipelt myelom och Hodgkins lymfom medan det främjar apoptos av B-celler från CLL, diffunderar stora B-celllymfom och FL genom den föredragna aktiveringen av STAT3. Observera att vi aldrig påpekade P-STAT3 i normala eller FLB-celler efter exponering för IL-15 (data visas inte).

När det gäller IL-15-levererande celler stöder vårt arbete hypotesen att IL-15-transpresentation kan ha distinkta funktioner när de tillhandahålls av olika celltyper. I synnerhet reglerar dendriticcell- och makrofagundersättningar differentiellt minne och effektor CD8 pos T-celldifferentiering, underhåll och spridning in vitro och in vivo. 31, 38 Dessutom kunde stromalceller differentiellt trans-närvarande IL-15 beroende på deras ursprung och aktiveringsstatus. Som ett exempel uttrycks funktionell IL-15 konstitutivt på mjällder till skillnad från hudderiverade fibroblaster, och dermala fibroblaster kan upprätthålla IL-15-beroende T-cellproliferation endast efter stimulering av TNF. 41, 42 I vår studie demonstrerar vi att LN-härledda stromalceller effektivt kan trans-presentera IL-15 till NK-celler men inte till B-celler. Även om benmärgsinfiltrering är ett vanligt särdrag i FL, uttrycker inte vilande benmärgs-härledda mesenkymala stromalceller membran IL-15 / IL-15Ra-komplex (data visas inte). Slutligen tillhandahåller inte LN- och benmärgsstromala celler B-celler funktionell IL-15 även efter den samtidigt uppregleringen av IL-15 och IL-15Ra genom TNF / LT-stimulering. Vi kan inte utesluta att follikulära dendritiska celler kan trans-presentera IL-15 till normala och maligna GC-härledda B-celler in vivo , men fullt funktionella humana follikulära dendritiska celler kunde inte upprätthållas in vitro, vilket förhindrar en sådan utvärdering.

Omvänt visade vi för första gången att renad TAM från patienter med FL överuttryckte IL15 . Flera faktorer kan bidra till denna induktion. Först underströk vår tidigare studie en uppreglering av IFNG i FL-mikromiljö, 21 och IFNy är en inducerare av IL-15 i humana monocyter. 28 För det andra är CD40L pos T-celler en av de huvudsakliga icke-maligna cellpartnerna för FLB-celler, och CD40-triggning ökar IL-15Ra-uttrycket på myeloida celler. 43 Slutligen är TNF också uppreglerad inom FL-cellnisch 21 och initierar en interferon-medierad autokrin slinga i primära makrofager associerade med uttrycket av interferon-svargener, inklusive STAT1. 44 Sammantaget visades promotorerna för både IL-15 och IL-15Ra innehålla bindningsställen för IFN-responsfaktorer och NF-KB, och motsvarande stimuli uttrycktes starkt inom kroniskt inflammerade lymfoida organ och FL-biopsier. IL-15 är alltså en bra kandidat som en makrofag-härledd FL-tillväxtfaktor som kan bidra till det dåliga prognosvärdet för TAM i FL-patienter som behandlats med kemoterapi. Intressant nog var närvaron av STAT1 pos CD68 pos- makrofager i närheten av FL-tumörceller också associerad med ogynnsamma resultat. 45 En ny studie har understrukit både TAM: s roll i framställning av B-celllymfom i en elegant xenograftmodell från mus och deras huvudsakliga roll i anti-lymfomaktivitet av terapeutiska antikroppar genom fagocytos av maligna B-celler. 46 Ytterligare transkriptomiska och funktionella studier som är inriktade på tonsill- kontra FL-härledda makrofager pågår och kommer att vara till stor hjälp för att ytterligare avslöja komplexiteten hos normala kontra lymfom B-cellnischer.

Sammantaget ger våra resultat ny insikt om makrofager och T-cellers ömsesidiga roll i normala och maligna B-cellens öde inom sekundära lymfoida organ. Det är viktigt att FL utgör en unik malign inställning där TAM överuttrycker IL-15, maligna celler överuttrycker STAT5 och tumörcellnisch infiltreras kraftigt av T FH- celler som uttrycker en IL-15-stimulerande signal (figur 6). Samarbetet mellan CD40L och IL-15-medierade signaler bör beaktas noggrant när man överväger patogenesen för FL och möjligheten att använda IL-15 som ett nytt läkemedel för att öka NK-cellberoende immunitet i kombination med terapeutiskt mAb.

Image

Modell för cellinteraktioner inom malign nisch i FL. ( a ) Stromceller rekryterar och upprätthåller överlevnaden av maligna FL B-celler. Deras stödjande egenskaper påverkas starkt av det lokala cytokin-sammanhanget, i synnerhet av TNF och LT som är överuttryckta inom FL-mikromiljö och främjar stromal celldifferentiering till funktionella FRC-liknande celler (4, 21). ( b ) FL LN: er kännetecknas av en stark infiltration av CXCR5 hi ICOS hi CD4 pos T FH. FL T FH överuttrycker specifikt IL-4, vilket inducerar STAT6-aktivering i angränsande maligna B-celler (6). ( c ) FL TAM överuttrycker IL-15 som utlöser STAT5-beroende FLB-cellaktivering. Intressant nog kan infiltrerande T FH samarbeta med denna IL-15-medierade signal, i synnerhet genom en CD40L-beroende transkriptionell induktion av STAT5 som finns uppreglerad i maligna B-celler. Figur förberedd med hjälp av verktyg från Servier Medical Art (//www.servier.fr/servier-medical-art).

Bild i full storlek

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

  3. 3.

    Kompletterande figur S3

  4. 4.

    Kompletterande figur S4

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)