Molekylär kloning, uttryck och adjuvanseffekter av interleukin-8 från kanal havskatt (ictalurus punctatus) mot streptococcus iniae | vetenskapliga rapporter

Molekylär kloning, uttryck och adjuvanseffekter av interleukin-8 från kanal havskatt (ictalurus punctatus) mot streptococcus iniae | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • adjuvans
  • DNA-rekombination
  • Proteinvacciner

Abstrakt

Interleukin-8 (IL-8) som ett viktigt cytokin involverat i inflammatoriskt och immunsvar har studerats som effektiva hjälpmedel för vacciner hos däggdjur. Det finns dock färre rapporter om karakterisering och adjuvanseffekter av IL-8 i fisk. I denna studie utfördes kloning och sekvensanalys av IL-8-kodande region av kanalskattkatt ( Ictalurus punctatus ), moget IL-8 (rtIL-8) uttrycktes och utvärderades med avseende på dess adjuvanseffekter på immunskydd av underenhetsvaccin som kodar för a- enolase (rENO) av St reptococcus iniae från flera aspekter i kanal havskatt. Resultaten visade samvaccination av rENO med rtIL-8 förbättrade immunsvar inklusive humoral och cellulär immunitet, med högre relativ procentuell överlevnad (RPS, 71, 4%) jämfört med måttlig RPS för rENO ensam (50%) mot S. iniae- infektion vid 4 veckor efter vaccination. Medan rtIL-8 misslyckades med att upprätthålla långvarigt immunskydd, endast med RPS på 26, 67% i rENO + rtIL-8-vaccinerad fisk jämfört med den för rENO enbart (20%) vid 8 veckor, vilket betyder att IL-8 håller löfte för användning som potentiell immunopotentiator i vacciner mot bakterieinfektioner hos fisk, medan det inte är tillräckligt för att förlänga immunskyddet under lång tid, och ytterligare studier krävs för att förstå mekanismerna för IL-8 som används som ett adjuvans och söka efter ett mer effektivt sätt att stärka adjuvanticity av IL-8.

Introduktion

Vattenbruk känd som en av de mest livliga sektorerna i det globala livsmedelssystemet har gett ett betydande bidrag i produktionen av proteinrika livsmedel för livsmedel 1 . Men vattenbruksmetoder möter många utmaningar under de senaste decennierna, och ett av de mest förödande problemen är sjukdomsutbrott orsakade av mikrobiella patogener. Kanal havskatt ( Ictalurus punctatus ) som den mest omfattande odlade matfiskarten, särskilt i USA och Kina, lider av utbredda sjukdomsutbrott på grund av olika bakteriepatogener 2, 3 . Streptococcus iniae , en Gram-positiv bakterie och en av de ß-hemolytiska Streptococcus-arterna, har orsakat allvarliga skador på fiskodlingen de senaste åren 4, 5, 6, 7 och därmed blivit en viktig fiskpatogen med ett brett värdintervall, inklusive asiatiska seabass 8, Nile tilapia 9, zebrafish 10, Japanese flounder 11, rainbow forel 12 and channel catfish 13 . Förutom fisk är S. iniae också känd för att vara en opportunistisk mänsklig patogen och orsakar sjukdomar hos människa 14, 15, 16 .

Traditionellt beror kontroll av S. iniae- infektion i vattenbruk främst på användning av antibiotika och antimikrobiella föreningar. På grund av den kritiska användningen av antibiotika har emellertid flera problem uppstått, såsom utveckling av resistens mot antibiotika och säkerhetsproblem förknippade med antibiotikarester. Lyckligtvis har vaccin föreslagits som en effektiv metod och ett grönt ingripande för att förhindra infektion med S. iniae . Jämfört med inaktiverade och / eller försvagade levande vacciner är underenhetsvacciner sammansatta av konserverade proteiner säkrare och mer serotypoberoende 17 . Många S. iniae- levererade proteiner identifierades som immunogena 18, och α-enolas (ENO) som ett av de ytutsatta och starkt konserverade proteinerna mellan Streptococcus spp 19, hade rapporterats användas som en effektiv skyddande antigenkandidat mot S infektion hos möss enligt vår tidigare studie 20 . Det bekräftades också att rekombinant ENO (rENO) inducerade korsskyddande immunitet mot S. iniae och Streptococcus parauberi i sebrafisk 10 . Dålig immunogenicitet har emellertid varit den huvudsakliga begränsningen för vaccineutveckling underenheter. Således är användningen av adjuvans i vaccinen under underenheter mycket nödvändig och viktig.

Cytokiner är en familj av lågmolekylära och sekretoriska proteiner som involverar olika pro-inflammatoriska funktioner mot invasiva patogener inklusive bakterier, virus eller parasit. Kemokiner som ett slags cytokiner är bland de adjuvans som används mer allmänt för vaccination mot olika patogener hos däggdjur 21, 22, 23 . Hittills har många cytokiner och kemokiner hittats i benfisk, och deras funktioner och signalering undersöks med stora framsteg 24, 25, 26 . Dessutom har flera cytokiner redan visats vara effektiva adjuvanser som är avgörande för vaccineffektivitet för att uppnå lämpligt immunrespons och säkerställa ett skyddande utfall i fisk 24, 27, 28 . Interleukin-8 (IL-8) är en av de första CXC-kemokinerna som upptäcktes i fisk 29 . Vissa studier har fokuserat på den potentiella användningen av IL-8 som ett adjuvans för genteknikvaccin hos däggdjur, medan hos fisk IL-8 just har klonats och kännetecknats i få arter inklusive lamprey 30, japansk skott 29, regnbågsöring 31 och kanalisk havskatt bara med en rapport om en IL-8-liknande gen 32, och en förståelse för den biologiska rollen för IL-8 har inte uppnåtts i någon av dessa arter.

I den aktuella studien klonade vi IL-8-kodningssekvensen för kanalskattkatt, valde de trunkerade IL-8 (tIL-8, mogna IL-8-regioner) för att uttrycka baserat på sekvensanalysen och utvärderade dess adjuvanseffekter på det skyddande immunitet för ett subenhetsvaccin som kodar för a-enolas (rENO) av St reptococcus iniae från flera aspekter inklusive lysozymaktivitet, alternativ hemolytisk komplementaktivitet (ACH50), antikroppstitrar, uttrycket av immunrelaterade gener och relativ procentöverlevnad (RPS) i kanal havskatt.

Resultat

Kloning, sekvens och fylogenetiska analyser av IL-8-kodande regioner

Den fulla längden av IL-8-kodningssekvensen för kanalskattkatt var 336 bp (GenBank No. KP701473) (fig. 1A), som innehöll en komplett öppen läsram (ORF) och kodade en 111 aa med den förutsagda molekylvikten 12, 20 kDa och det teoretiska pI av 10.08. Aa-sekvensen förutsäktes innehålla en 23 aa signalpeptid (fig. IC). Således spekulerades den mogna peptiden från kanalskattkatt IL-8 (tIL-8) att bestå av 88 aa. Det fanns ett Chemokine_CXC-domän som bevarades i Chemokine superfamily lokaliserande vid N-terminal av 30 ~ 88 aa rester av IL-8 . Tre konsensusmotiv (ELR-motiv, CXC-motiv och GPH-motiv) som fanns i Chemokine_CXC-domänen hittades också i kanalskattkatt IL-8 vid N-terminalen 30–31, 32-34 respektive 56- 58 aa-rester (Fig. 1C).

( A ) PCR-amplifiering av IL-8-genen. M1: DNA-markör (DL2000); spår 1: PCR-produkt av IL-8-genen (336 bp). ( B ) Identifiering av rekombinant plasmid pMD19-T-IL-8 med PCR och enzym-spjälkning. M1: DNA-markör (DL2000); spår 1: PCR-produkt av plasmid pMD19-T-IL-8; spår 2: spjälkning av plasmid med EcoRI och Xho I; spår 3: spjälkning av plasmid med Xhol; M2: DNA-markör (DL10000). ( C ) Aminosyrasekvensanalys av IL-8-sekvens med andra kanal-havskatt IL-8s. Prickade rutor presenterade signalpeptider, skuggregioner presenterade den bevarade Chemokine_CXC-domänen. ELR-motivet, CXC-motivet och GPH-motivet indikerades med blå, röd respektive svart ruta.

Bild i full storlek

Aa-sekvensidentiteten mellan kanal havskatt IL-8 och 15 olika fisk IL-8s beräknades med användning av Clustal W och MegAlign, vilket antydde att IL-8 i detta papper delade hög identitet av 96, 9 ~ 99, 2% till kanal havskatt IL-8 (AAN60105 och AAN41455) med endast 1 aa återstående skillnad från AAN41455 och låg identitet som sträcker sig från 21, 1 till 31, 2% jämfört med andra fiskarter (Fig. 2A). Det fylogenetiska trädet konstruerat med Mega 5.1 visade att IL-8 i denna studie samlades ihop med kanalkatten IL-8 (AAN60105 och AAN41455) som visade det nära förhållandet mellan dem, med 100 stödremsstöd (fig. 2B) och ett avlägset samband existerade mellan kanal havskatt IL-8 med andra fiskarter.

( A ) Flera sekvensers inriktning av IL-8 aa-sekvenser. ( B ) fylogenetiskt träd av IL-8 aa-sekvenser. Siffrorna vid varje gren representerar bootstrap-värdena erhållna med 1000 replikat. "KP701473" representerar aa-sekvensen för kanal havskatt IL-8 i denna studie.

Bild i full storlek

Molekylär kloning, expression och rening av rtIL-8

För att bestämma rollen som mogen peptid av kanal-havskatt IL-8 i immunregleringen amplifierades tIL-8-genen (som inte innehåller signalpeptid) framgångsrikt med PCR och klonades till pMD19-T (fig. 3A, B) följt av förväntat uttryckt med vektorn pET32a (fig. 3C) i inducerat BL21 (P-tIL-8) sediment och renat genom Ni-NTA-metallaffinitetskromatografi. Enstaka band på cirka 29 kDa av rekombinanta proteiner rtIL-8 observerades efter överuttryck och rening med SDS-PAGE (fig. 3D), som var nära den förutsagda molekylvikten. Proteinkoncentrationen för rtIL-8-lösningen bestämdes som 2, 4 mg / ml. Western blot-analys visade att 29 kDa-bandet av rekombinanta proteiner rtIL-8 reagerade specifikt med kanin-anti-6-Histidin-antiserum (fig. 3E).

( A ) M1: DNA-markör (DL2000); spår 1: PCR-produkt av tIL-8-genen med 264 bp. ( B ) M1: DNA-markör (DL2000); spår 1: PCR-produkt av rekombinant plasmid T-tIL-8; spår 2: matsmältning av T-tIL-8 med EcoRI och Xho I; spår 3: matsmältning av T-tIL-8 med Xho I; M2: DNA-markör (DL10000). ( C ) M1: DNA-markör (DL2000); spår 1: PCR-produkt av plasmid P-tIL-8; spår 2: matsmältning av P-tIL-8 med EcoRI och Xho I; spår 3: matsmältning av P-tIL-8 med Xho I; M2: DNA-markör (DL10000). ( D ) M3: proteinmarkör; spår 1 ~ 6: oinducerad BL21 (pET32a), inducerad BL21 (pET32a), oinducerad BL21 (P-tIL-8), inducerad BL21 (P-tIL-8), inducerad BL21 (P-tIL-8) supernatant, inducerad BL21 (P-tIL-8) sediment, spår 7: rening av rekombinant rtIL-8. ( E ) M4: proteinmarkör; spår 1: Specifik bindning mellan rekombinant protein rtIL-8 och kanin anti-6 × Histidin-antikropp.

Bild i full storlek

Immunologisk analys

Serumlysozymaktivitet

Serumlysozymaktiviteten hos vaccinerad fisk bedömdes med en turbidimetrisk analys från 1 till 8 veckors post-sekundär vaccination (sv) (fig. 4A). I allmänhet avslöjade de fyra vaccinerade grupperna (rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763) signifikant högre nivåer av lysozymaktivitet jämfört med de i kontrollgruppen från 1 till 5 veckors sv med toppvärdet som inträffade vid 3 -veckas, 4-veckors, 4-veckors respektive 3-veckors sv, och den högsta lysozymaktiviteten belägen i rENO + ISA763-gruppen vid 3-veckors sv. Dessutom var lysozymaktiviteten för rENO-grupper anmärkningsvärt högre än i rtIL-8 grupp från 1 till 4 veckors sv, och kombinationen av rENO med rtIL-8 förbättrade mer markant effekten av lysozymaktivitet än gjorde rENO från 1 till 5 veckors sv Även om skillnaden mellan rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 inte var signifikant under 1 ~ 4 veckors sv, var det betydande från 5 till 8 veckors sv

Serumlysozymaktivitet ( A ) och ACH50-aktivitet ( B ) hos vaccinerad fisk. Kanalskattkatt vaccinerades två gånger med två veckors intervall med PBS (kontroll), rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763. Sera samlades från fisken vid 1 till 8 veckor sv. Data presenteras som medel ± SD (n = 5). Olika bokstäver ovanför en stapel anger betydande skillnad ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Serum ACH50-aktivitet

Under alla experimentella tidpunkter ökade serum ACH50-aktiviteten hos fyra vaccinerade grupper signifikant jämfört med kontrollgruppen (fig. 4B), och den högsta ACH50-aktiviteten observerades alla vid fyra veckors sv i fyra vaccinerade grupper. rENO inducerade anmärkningsvärt högre ACH50-aktivitet än rtIL-8 från 1 till 7 veckors sv, medan ACH50-aktiviteten för rENO + rtIL-8-gruppen var signifikant högre än den i rENO-gruppen vid 1, 2, 5 och 6 veckor sv. Dessutom var ACH50-aktiviteten i rENO + ISA763-gruppen högre än för rENO + rtIL-8-gruppen vid 1 ~ 8 veckas sv med en signifikant skillnad mellan två grupper från 5 till 8 veckors sv

Specifikt serumantikroppssvar

De specifika antikroppstitrarna i serum från vaccinerad fisk detekterades kontinuerligt av ELISA från vecka 1 till 8 sv (fig. 5). Generellt stimulerade rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 signifikant högre nivåer av antikroppar än PBS och rtIL-8 från 2 till 7 veckors sv med den högsta antikroppsnivån båda toppade vid 4-veckors sv Antikroppsnivåerna för rENO + rtIL -8-vaccinerade fiskar var anmärkningsvärt högre än hos rENO-vaccinerade fiskar från 2 till 5 veckors sv, medan rENO + ISA763 stimulerade produktionen av antikropp signifikant än rENO + rtIL-8 vid 2, 3, 5-8 veckor sv. Dessutom var antikroppnivåerna inducerade av rtIL-8 enbart bara högre än i PBS-vaccinerad fisk vid var och en av de undersökta tidpunkten utom 3, 4 och 5 veckors sv ( P <0, 05).

Havskatris vaccinerades två gånger med 2-veckors intervall med PBS, rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763. Sera samlades upp från fisken vid 1 till 8 veckor sv Data presenteras som medel ± SD (n = 5). Olika bokstäver ovanför en stapel anger betydande skillnad ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Immunskyddande effekt mot S. iniae

Fisk vaccinerad med PBS, rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och / eller rENO + ISA763. uppvisade ackumulerade överlevanden av 6, 67%, 13, 33%, 53, 33%, 73, 33% respektive 80, 00% (fig. 6A) efter utmaning med den patogena S. iniae DGX07 vid 4 veckors överlevnad av rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 var signifikant högre än rENO genom log-rank-test, medan skillnaden i överlevnad för två adjuvansgrupper inte var signifikant (Fig. 6B). Vidare var de immunskyddande effekterna, i termer av RPS, av rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 7, 14%, 50, 00%, 71, 43% respektive 78, 57% jämfört med PBS.

Procent överlevande (Kaplan-Meier) av vaccinerad fisk under utmaningstesterna på 4 veckors sv ( A ) och 8 veckors sv ( C ). Skillnader mellan grupperna testades med användning av log-rank test som visas i ( B ) (4 veckors sv) och ( D ) (8 veckors sv). “*” Betecknar signifikant skillnad ( P <0, 05), “ns” betyder inte signifikant.

Bild i full storlek

För att undersöka skyddets varaktighet utmanades fisk också vid 8-veckors sv, och resultaten antydde att de kumulativa överlevnaden av fisk vaccinerade med PBS, rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 var 0%, 0%, 20, 00%, 26, 67% respektive 60% (Fig. 6C), vilket motsvarar en RPS på 20, 00% för rENO-gruppen, 26, 67% för rENO + rtIL-8-gruppen respektive 60% av rENO + ISA763-gruppen. Dessutom visade resultaten av log-rank-testet att överlevnaden för rENO + ISA763 var signifikant högre än rENO + rtIL-8 och rENO, och skillnaden i överlevnad för rENO + rtIL-8 och rENO var inte signifikant (Fig. 6D ). Dessutom var S. iniae DGX07 den enda typen av bakteriestam som utvanns från levern, och njurarna hos moribund fisk under två utmaningstester, vilket antydde att dödligheten orsakades av S. iniae DGX07-infektion.

Uttryck av immunrelaterade gener

För att undersöka effekten av vaccination på uttrycket av immunrelaterade gener genomfördes qRT-PCR för att analysera uttrycket av generna som kodar för interleukin 1p (IL-1p), tumornekrosfaktor-a (TNF-a), CXC Chemokine Ligand 10 (CXCL10), huvudhistokompatibilitetskomplex klass Ia (MHC Ia) och IIp (MHC IIp), CD4-L2, CD8a och interferon-y (IFN-y) med ACTB som en intern kontroll. Resultaten visade att utom IFN-y inducerades alla andra undersökta gener signifikant i fisk från rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 jämfört med uttrycket i PBS och rtIL-8-gruppen, särskilt MHC II ß och CD4- L2 med mer än fyra gånger uttryck (Fig. 7). Uttrycket av CXCL10, MHC la, MHC IIp, CD4-L2 och CD8a i rtIL-8-vaccinerad fisk uppreglerades signifikant jämfört med kontrollen (PBS) och ett något högre uttryck av IL-1p, TNF-a och IFN-y . Dessutom inducerade både rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 ett signifikant högre uttryck av TNF-a, MHC IIp och CD4-L2 och stimulerade ett något högre uttryck av IL-1p, MHC Ia, CD8a och IFN-y än det från rENO-gruppen. Vaccination med rENO + ISA763 uppreglerade dessutom uttrycket av CD8a och IFN-y särskilt, stimulerade ett högre uttryck av MHC la och ett lägre uttryck för andra undersökta gener, speciellt CXCL10, än det för rENO + rtIL-8.

Kanalskattkatt vaccinerades två gånger med två veckors intervall med PBS (kontroll), rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763. Totalt RNA extraherades från huvudnjurarna 24 timmar efter utmaning av 4-veckors sv och användes för qRT-PCR. För varje gen inställdes mRNA-nivån för den PBS-vaccinerade fisken som 1. Data presenteras som medel ± SD (n = 5). Olika bokstäver ovanför en stapel anger betydande skillnad ( P <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

En effektiv vaccinkandidat består vanligtvis av ett starkt immunogen (antigen) och ett potent adjuvans (immunohancer) som kan utlösa tidiga medfödda försvarsmekanismer för att hjälpa till att generera robusta och långvariga immunsvar 33 . De flesta kända effektiva adjuvans, såsom Freunds kompletta adjuvans (FCA) och Freunds ofullständiga adjuvans (FIA) är emellertid olämpliga för användning av människor och djur på grund av deras toxicitet och biverkningar 24, 34 . Det har rapporterats att samvaccination av antigener med cytokiner är en ny och effektiv strategi för att förbättra immunisering och reglera cellulära och humorala immunsvar för att främja skyddande immunitet mot patogener. Följaktligen har cytokiner som används som potentiella adjuvanser studerats alltmer 22, 23, 24, 35, 36, 37 . IL-8 som CXC-kemokin producerad av flera celltyper var känd för att rekrytera neutrofiler till inflammatoriska ställen. Hos däggdjur har det visat sig att IL-8 var en viktig immunförmedlare för medfödd immunitet involverad i rekrytering och aktivering av olika leukocyter genom modulering av cytokinproduktion 38 och ett potentiellt immunadjuvans för att främja cytokinernas immunsvar och öka antikroppssvaret genom sam- administration med antigen 39, 40 . Det fanns emellertid få rapporter om den potentiella användningen av cytokiner som ett adjuvans i fisk, särskilt IL-8. Channel catfish som en viktig ekonomisk fiskart har fungerat som en klassisk modell för studien av jämförande immunologi. Forskning om dess cytokiners karaktärisering och biologiska roll bör hjälpa till att belysa medfödd immunitet hos havskatt 32 .

I den aktuella studien utfördes molekylär kloning och rekombinationsuttryck av mogna IL-8 av kanalskattkatt, och rENO-vaccination enbart och samvaccination av rENO med rtIL-8 eller kommersiell adjuvans Montanide ™ ISA763 genomfördes för att utvärdera den skyddande effekten av rENO och adjuvanseffekten av rtIL-8 mot S. iniae i kanalskatt . Resultaten visade att kodningssekvensen för kanal havskatt IL-8 med 336 bp i full längd kodad 111 aa som tillhör de kortare alternativt skarvade transkripten av IL-8 enligt Chen et al. 32, som fanns 3 aa (9 bp) skillnad med det längre transkriptet. Emellertid var 3-aa-skillnaden lokaliserad i signalpeptiderna baserad på sekvensanalys (Fig. 1C), vilket ledde till att båda transkripten har samma mogna peptid. Således valde vi den avkortade IL-8 (utan signalpeptider) för att uttrycka den mogna IL-8. Dessutom var det intressant att ELR-motiv som saknade leucinrester visade sig vara lokaliserade omedelbart före CXC-motivet för kanal havskatt IL-8 i vår studie, vilket skilde sig från andra fiskar IL-8 som saknade ELR-motiv, vilket indikerar att likheterna mellan fiskarna IL-8-generna var relativt låga (Fig. 2A, B) och den molekylära utvecklingen av kanalskattkatt IL-8 inträffade under processen för utveckling och fylogeni för att anpassa sig till den speciella miljön eller levande sättet.

Medfödd immunitet som en grundläggande försvarsmekanism för fisk, spelar en lärorik roll i det förvärvade immunsvaret och homeostasen 25, 41 . Lysozymaktivitet och alternativ hemolytisk komplementaktivitet (ACH50) är två viktiga parametrar för att utvärdera det medfödda immunsvaret 41 . Båda är involverade i att aktivera komplementsystemet och spelar en kritisk roll i det medfödda immunförsvaret mot bakteriella och svamppatogener 42, 43, 44 . För att stimulera ett optimalt immunrespons förstärkte vi immunsystemet med samma metod och dosering som första immunisering 2 veckor efter vaccination. Resultaten från den aktuella studien visade att både rENO och rtIL-8 förbättrade serumlysozymaktiviteten och ACH50-aktiviteten och resulterade i att stimulera de medfödda immunsvaren och aktivera skyddsmekanismerna. Lysozymaktiviteten i rENO + rtIL-8-vaccinerad fisk ökade signifikant vid 1 till 5 veckor sv och ökade något vid 6 till 8 veckor sv jämfört med den för rENO-gruppen, medan lysozymaktivitet inducerad av rENO + ISA763 var anmärkningsvärt högre än rENO + rtIL-8 vid 5 till 8 veckors sv och toppvärdet i rENO + ISA763-gruppen var också högre än för rENO + rtIL-8-gruppen. Liknande trender observerades också på ACH50-aktiviteten för rENO respektive rENO + rtIL-8 respektive två adjuvansgrupper.

Studier har föreslagit att produktion av antikroppar som svar på proteinantigener är den grundläggande mekanismen för immunskydd mot S. iniae- infektion 7 . Antikroppssvar inducerade av subenhet eller DNA-vacciner mot S. iniae har observerats i olika fiskmodeller 10, 45, 46, 47, 48 . I japansk flundra som vaccinerats med rekombinant Sip11-subenhetsvaccin mot S. iniae SF1, producerades serumspecifika antikroppar 5 till 8 veckor efter vaccination och högsta antikroppstitrar detekterades vid 6 veckor efter vaccination 46 . På liknande sätt detekterades specifika antikroppsproduktioner i piggvar immuniserade med DNA-vaccin pSia10 mot S. iniae 4 till 7 veckor efter immunisering med toppen av antikroppstitrar som uppträdde 5 och 6 veckor efter vaccination 45 . När det gäller rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763, fann vi att serumspecifika antikroppar båda detekterades vid 1 till 8 veckors sv och toppade vid 4 veckors sv, och antikroppnivåerna för rENO + rtIL-8-gruppen var anmärkningsvärt högre än för rENO-gruppen från 2 till 5 veckors sv, medan rENO + ISA763 inducerade signifikant högre specifik antikropp än rENO + rtIL-8 vid 2, 3 respektive 5 ~ 8w sv, vilket antydde att rtIL-8 förbättrade antikroppnivåerna inducerad av rENO men misslyckades med att hålla denna förbättring under längre tid, och ISA763 ökade inte bara antikroppnivåerna utan upprätthöll också ökningen under lång tid jämfört med rtIL-8 adjuvans. Jämfört med ovanstående andra vacciner mot samma patogen 45, 46, framställdes tiden för antikroppsproduktion och toppen i vår studie, främst på grund av skillnaden mellan vacciner och värdfisken, såväl som olika immunplaner.

Även om specifika antikroppar är viktiga för immunresponsen mot S. iniae- infektion är de inte tillräckliga för fullständigt skydd vilket innefattar både humoral och cellulär immunitet 49 . Därför genomfördes transkriptionell analys av immunrelaterade gener med qRT-PCR i vår studie. Resultaten visade att vaccination med rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 uppvisade jämförbara induktioner i alla undersökta gener som relaterade till inflammatoriskt svar (IL-1p, TNF-a och CXCL10), humoral immunitet (MHC II P och CD4-L2) och cellulär immunitet (MHC Ia, CD8a och IFN-y) jämfört med kontrollen, särskilt MHC IIp och CD4-L2 som deltog i extracellulär antigenpresentation och aktiveringen av T-hjälparceller 50, med mer än fyra gånger uttrycksnivåer i rENO, rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763-gruppen. Jämfört med rENO uppreglerade både rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763 expressionen av alla gener med signifikant högre expression av TNF-a, MHC IIp och CD4-L2, vilket i viss mån var i linje med skyddseffektiviteten som visas av dessa vacciner. Dessutom uppreglerade rENO + ISA763 ett högre uttryck av MHC la, CD8a och IFN-y, och ett signifikant lägre uttryck av CXCL10 än det för rENO + rtIL-8. Dessa resultat antydde att rENO inducerade ett systemiskt immunsvar i kanalskattkatt mot S. iniae- infektion, och rtIL-8 aktiverade inflammatoriskt svar och stärkte immunresponsen och ISA763 kunde främja medfödda immunreaktioner och cellulär immunitet 51, vilket sannolikt resulterade i den högre nivån skydd av rENO + rtIL-8 och rENO + ISA763.

RPS är inte bara ett av de mest visuella indexen för att utvärdera immuneffekten i utmaningstest, utan också ett mått på vaccineffektivitet mot patogeninfektion 52 . Våra resultat antydde att rENO gav ett måttligt immunskydd för kanalskattkatt mot S. iniae- infektion med RPS på 50%, vilket bara var hälften av RPS (100%) av rENO i sebrafisk mot samma patogen 10, främst på grund av de olika fiskarter och infektionsdoser. Dessutom var RPS för rENO ensam i vår studie också lägre än skyddet av andra subenhetsvaccin mot S. iniae inklusive RPS (53, 8%) av Sia10 i piggvar 45, RPS (69, 7%) av Sip11 i japansk skott 46 och RPS ( 66, 9%) av mtsB i tilapia 47, mest på grund av skillnaden mellan vacciner, fiskar och immunplaner. Adjuvans rtIL-8 och ISA763 förbättrade emellertid immunskyddet med RPS på 71, 43% respektive 78, 57% vid 4 veckors sv, vilket inte var signifikant varandra men var signifikant högre än för rENO enbart. Medan rtIL-8 inte lyckades upprätthålla en lång period av immunitet mot S. iniae- infektion, ökade endast RPS för rENO till 26, 67% jämfört med rENO enbart med RPS på 20, 00% vid 8 veckors sv, och båda var signifikant lägre än rENO + ISA763 med RPS på 60, 00%. Med tanke på detta, bör ett mer effektivt sätt, såsom DNA-vacciner som pSia10 med RPS på 73, 9% i piggvar mot S. iniae 45 och pSagF med RPS på 78% i japansk flundra mot S. iniae 48, beaktas.

Sammanfattningsvis föreslog denna studie att rtIL-8 håller löfte för användning som en potent immunopotentator i subenhetsvacciner mot S. iniae- infektioner i kanal havskatt, medan det inte är tillräckligt för att förlänga de skyddande effekterna av rENO som två månader jämfört med den kommersiella adjuvansen ISA763. Således stöder vår studie utvecklingen av IL-8 som ett effektivt adjuvans för vaccinen under subenheter, vilket förbättrar immunresponsen och skyddet mot bakteriella infektioner hos fisk. Emellertid krävs ytterligare studier för att förstå mekanismerna för IL-8 som används som adjuvans och söka efter ett mer effektivt sätt att stärka adjuvanticiteten hos IL-8 såsom samvaccination eller fusion i DNA-vacciner.

Material och metoder

Bakteriestammar, plasmider, reagens och tillväxtbetingelser

S. iniae DGX07 är ett patogent isolat från sjukskalig havskatt i Kina och lagras på vårt laboratorium 13, det odlades i Brain-Heart Infusion (BHI) medium vid 37 ° C. E. coli DH5a och E. coli BL21 (DE3) användes som värdstammar för kloning respektive proteinuttryck. Båda odlades rutinmässigt i Luria-Bertani (LB) medium innehållande 100 μg / ml ampicillin vid 37 ° C. Plasmiderna pMD19-T enkla (Takara, Japan) och pET32a (+) (Merck, Tyskland) användes för TA-kloning respektive proteinuttryck. Rekombinant proteinRENO konstruerades, uttrycktes och lagrades på vårt laboratorium 20 . Montanide ™ ISA763 A VG (Seppic, Frankrike) valdes som ett kommersiellt adjuvans för experimentet.

Kloning av kompletta kodande regioner av IL-8

Totalt RNA extraherades från mjälten från frisk kanal-havskatt med RNAiso Plus Kit (TaKaRa, Dalian, Kina) och omvänd-transkriberades till första sträng cDNA med användning av PrimeScrip t ™ RT-reagenspaket med gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa) enligt till tillverkarens instruktioner. En kanal-havskatt IL-8 fullständig kodande sekvens klonades från cDNA-mallen med användning av primrar IL-8-F1 / IL-8-R1 (tabell 1), som utformades baserat på sekvens publicerad i GenBank (AY145142, motsvarande protein GenBank: AAN60105 ) och av Primer Premier 5.0-programvara under standardparametrar. PCR-amplifiering utfördes under följande betingelser: 1 cykel av 94 ° C under 5 minuter, 30 cykler av 94 ° C under 1 min, 55 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 30 sekunder, följt av en slutlig förlängning av 72 ° C under 10 minuter. PCR-produkterna renades med användning av Agarosgel DNA-extraktionssatsen (TaKaRa) och klonades in i pMD19-T-vektorn, följt av transformation till E. coli DH5a. Den positiva rekombinanta klonen valdes sedan med användning av en Amp / IPTG / X-Gal-agarplatta. Den rekombinanta plasmiden identifierades med PCR under de ovannämnda betingelserna, digererades med restriktionsenzymer EcoRI och Xhol , och fraktionerade på 1% agarosgeler. DNA-sekvensering genomfördes också av TaKaRa Bio Inc.

Full storlek bord

Sekvens- och fylogenetiska analyser

Aminosyrasekvensen (aa) härleddes från nukleotidsekvensen med användning av translate-verktyget, molekylvikten och den isoelektriska punkten (pI) för peptiden beräknades med användning av ProtParam-verktyget, signalpeptiden förutsades med SignalP 4.1-programmet, båda tillgängliga på ExPASy molekylärbiologiserver (//www.expasy.org/tools) 53 . Flera sekvensinställningar och identiteterna mellan varje par av aa-sekvenserna beräknades med Clustal W-metoden 54 med användning av MegAlign-programe 55, och det fylogenetiska trädet konstruerades med hjälp av Neighbour-Joining (NJ) -metoden i MEGA 5.1-programvaran 56, med 1 000 bootstrap replikerar.

Kloning av trunkerad IL-8- gen ( tIL-8 )

Baserat på sekvensanalysen avlägsnades signalpeptiden för att erhålla den mogna IL-8 genom prokaryot uttryck med E. coli BL21 (DE3). Den avkortade IL-8-genen (tIL-8) klonades från cDNA-mallen med användning av degenererade primrar IL-8-F2 / IL-8-R2 (tabell 1) som innehöll EcoRI- och XhoI- restriktionsenzymställen. PCR-amplifiering utfördes såsom beskrivits ovan. De resulterande amplikonerna renades, klonades, transformerades och sekvenserades och den positiva rekombinanta kloningsplasmiden benämnd av T-tIL-8.

Expression och rening av rekombinant trunkerat IL-8 (rtIL-8)

Uttrycket och rening av rekombinant trunkerat IL-8 utfördes såsom beskrivits i vår tidigare studie 57 . Kortfattat digererades plasmiden T-tIL-8 med EcoRI och Xhol och de resulterande produkterna infördes i EcoRI / Xhol-digererade pET32a (+) -vektorn för att konstruera den rekombinanta expressionsplasmiden, benämnd som P-tIL-8. Plasmiden transformerades sedan till E. coli BL21 och inducerades genom tillsats av 1, 0 mM IPTG vid 37 ° C under 4 timmar. cellerna centrifugerades vid 8000 x g under 10 minuter vid 4 ° C och suspenderades med steril fosfatbuffertlösning (PBS), följt av ultraljudsbehandling med en ultraljudscellsstörare (JY92-IIDN, Ningbo Scientz, Kina) och undersöktes med 12, 5% SDS -SIDA. Inklusionsorganen från de olösliga fraktionerna renades med Ni-NTA-Sefinose-kolonn (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) efter upplösning i 8 M urea-lösningar och filtrering med 0, 22 um filter. Återvecklingen av de renade proteinerna genomfördes genom dialysering gradient från 6 M urealösningar till PBS vid 4 ° C och analyserades sedan med 12, 5% SDS-PAGE. The protein was quantified using the Bradford assay with bovine serum albumin (BSA) as standard and a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions. Purified proteins were named as rtIL-8 and stored at 20 °C.

Western-blot analysis

The werstern-blot analysis of rtIL-8 was performed as previously described 57 . Briefly, the purified proteins were separated by 12.5% SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane at 150 V for 2 h. Non-specific binding sites of the membranes were blocked by incubating for 1 h at 37 °C in TBST (containing 3% BSA). Then the membrane was incubated with rabbit anti-6-Histidine antibody (Sangon Biotech, Shanghai, China) diluted 1:100 in TBST (containing 0.5% BSA) for 12 h at 4 °C. After washing 3 times with TBST, the membrane was incubated with goat-anti-rabbit IgG (H + L)-HRP (Sigma, St. Louis, MO, USA) diluted 1:5000 in TBST (containing 0.5% BSA) at 37 °C for 1 h. After washing off unbound secondary antibody, the specific antigen-bound antibody was visualized using DAB (Sigma) for 5 to 15 min, and terminated by rinsing with distilled water.

Preparation of fish and vaccine

All animal experiments were approved by the Committee of the Ethics on Animal Care and Experiments at Sichuan Agricultural University. All experimental procedures were carried out in accordance with the approved guidelines.

Channel catfish (50.0 g ± 5.0 g) were purchased from a fish farm in Chengdu (Sichuan, China) and acclimatized in the laboratory for 2 weeks before experimental manipulation. The fish were fed a commercial diet daily, and water was partly replaced every day, maintaining a temperature of 28 °C ± 1 °C. Before experiments, fish were randomly sampled from blood, liver, kidney, and spleen, the examination of bacterial recovery indicated that no bacteria could be detected and agglutination test showed no reaction between the serum and S. iniae DGX07. Fish were anaesthetized with MS222 (Sigma, Beijing, China) prior to the experiments, which involved manipulations such as injections and serum collection. The purified protein rtIL-8 and recombinant protein rENO were diluted in PBS to 0.5 mg/ml and 1.0 mg/ml, respectively. To obtain rENO + rtIL-8, the recombinant protein rENO was mixed with an equal volumes of purified protein rtIL-8. To obtain rENO + ISA763, the recombinant protein rENO was mixed with adjuvant Montanide™ ISA763 A VG (Seppic, France) at a ratio of 3:7 by ultrasonic disruption (JY92-IIDN, Ningbo Scientz, China).

Vaccination and bacterial challenge

Five hundred channel catfish were divided randomly into five groups (100 fish/group) and injected intraperitoneally (ip) with 0.2 ml of PBS (control group), rtIL-8, rENO, rENO + rtIL-8 and rENO + ISA763. The secondary vaccination were performed to obtain an optimal immune response with the same method and dosage at 2 week post-vaccination. At 4 and 8 weeks post secondary vaccination (sv), 30 fish from each group were randomly selected and challenged by ip injection with 0.2 ml of S. iniae DGX07 that resuspended in PBS to 6 × 10 7 CFU/ml 57 . Mortality was monitored over a period of 14 days after the challenge, and dying fish were randomly selected for the examination of bacterial recovery from liver, kidney, and spleen. Relative percent of survival (RPS) was calculated according to the following formula: RPS = [1− (% mortality of vaccinated fish/% mortality of control fish)] × 100 58 . Serum samples of five fish in each group were collected for assessment of immune related indexes from 1 to 8 week sv and head-kidney of five fish were taken for qRT-PCR at 24 h post-challenge of 4 week sv All vaccination trials were repeated once.

Detection of innate immune parameters

Serum lysozyme activity was measured by the turbidimetric method described by Hutchinson 59 . Briefly, 150 μL Micrococcus lysodeikticus with a concentration of 0.2 mg/mL (in 0.04 M PBS, pH = 6.2) was added to 15 μL sera in a 96-well U-bottom microtiter plate, quickly mixed by vortex, and the OD 450 (UV absorption value at 450 nm) (A 0 ) was assayed at 0.5 and 4.5 min after reaction, respectively. Each test was conducted in triplicate. One activity unit of lysozyme (U) was defined as the amount of serum lysozyme that caused a decrease in absorbancy of 0.001 per min at 450 nm.

Alternative haemolytic complement activity (ACH50) was determined following the method described by Sunyer and Tort 60 based on haemolysis of rabbit red blood cells (RaRBC). The volume of serum yielding 50% haemolysis (ACH50) was determined and used to calculate the complement activity of the samples (value of ACH50 is in units per ml).

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Specific antibody titers for rENO were determined by ELISA as described previously with some modification 57 . Briefly, the rENO was diluted to a concentration of 50 μg/mL in a carbonate buffer (pH = 9.6). Each well of the 96-well plate was covered with 100 μL diluted rENO overnight at 4 °C followed by washing with PBST (0.1% Tween-20 in PBS) and blocking with 3% BSA in PBST for 2 h at 37 °C. Serial 2-fold dilutions of sera were added to the wells in triplicate and subsequently incubated for 2 h at 37 °C. Rabbit anti-channel catfish IgM antibody (prepared in our laboratory) (1:2000) and goat-anti-rabbit IgG (H + L)-HRP (1:2000) were used as the secondary and tertiary antibodies, respectively. Color development was performed with the TMB kit (Tiangen, Beijing, China). The plates were read at 450 nm with a microplate reader (Bio-Rad, Hercules, USA).

qRT-PCR analysis of the expression of immune-related genes

Head-kidney samples were taken from the fish (five in each group) at 24 h post-challenge of 4 week sv Total RNA extraction and cDNA synthesis were carried out as described above. qRT-PCR was performed with the SYBR ® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa) in an ABI StepOnePlus™ System (Applied Biosystems, USA) as described previously. Each assay was performed in triplicate with beta actin (ACTB) as an internal control. The primers used to amplify the immune-related genes are listed in Table 1. All data are given in terms of relative mRNA.

Statistisk analys

All statistical analyses were performed with SPSS 19.0 software (SPSS Inc., USA). Mortality data from the challenge experiments were analyzed by the Kaplan-Meier methods and differences among groups were tested using log-rank test. The difference significance of other data were determined using a one-way analysis of variance (ANOVA). In all cases, the significance level was defined as P < 0.05 and the results were presented as means ± SD (standard deviation).

ytterligare information

How to cite this article : Wang, E. et al. Molecular cloning, expression and the adjuvant effects of interleukin-8 of channel catfish ( Ictalurus Punctatus ) against Streptococcus iniae. Sci. Rep. 6, 29310; doi: 10.1038/srep29310 (2016).

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.