Mitotisk beläggning och avstamningsspecifik transkriptionskontroll av rrna-gener med runx2 | natur

Mitotisk beläggning och avstamningsspecifik transkriptionskontroll av rrna-gener med runx2 | natur

Anonim

Abstrakt

Reglering av ribosomala RNA-gener är en grundläggande process som stöder tillväxten av celler och är tätt kopplad med celldifferentiering. Även om rRNA-transkriptionskontroll med RNA-polymeras I (Pol I) och tillhörande faktorer är väl studerade, förblir de linjespecifika mekanismerna som styr rRNA-uttryck svårfångade 1 . Runt-relaterade transkriptionsfaktorer Runx1, Runx2 och Runx3 upprättar och upprätthåller cellidentitet 2 och förmedlar fenotypisk information genom successiva celldelningar för reglerande händelser som bestämmer cellcykelprogression eller utgång i avkommeceller 3 . Här konstaterar vi att däggdjur Runx2 inte bara kontrollerar avståndsengagemang och cellproliferation genom att reglera gener transkriberade av RNA Pol II, utan också fungerar som en repressor för RNA Pol I-medierad rRNA-syntes. Inom de kondenserade mitotiska kromosomerna finner vi att Runx2 bibehålls i stora diskreta foci vid nukleolära organiserande regioner där rRNA- gener bor. Dessa Runx2-kromosomala foci är associerade med öppen kromatin, samlokaliseras med RNA Pol I-transkriptionsfaktorn UBF1 och genomgår övergång till nukleoli på platser för rRNA-syntes under intervall. Ribosomal RNA-transkription och proteinsyntes förbättras av Runx2-brist som är resultatet av genablation eller RNA-interferens, medan induktion av Runx2 specifikt och direkt undertrycker rDNA-promotoraktivitet. Runx2 bildar komplex innehållande RNA Pol I-transkriptionsfaktorer UBF1 och SL1, samarbetar rRNA -genpromotorn med dessa faktorer in vivo och påverkar lokala kromatinhistonmodifikationer vid rDNA-regulatoriska regioner. Således är Runx2 en kritisk mekanistisk koppling mellan cellens öde, spridning och tillväxtkontroll. Våra resultat antyder att linjespecifik kontroll av ribosomal biogenes kan vara en grundläggande funktion av transkriptionsfaktorer som styr cellens öde.

Huvudsaklig

Runxfaktorer är ställningsproteiner som lokaliseras till subnukleära domäner och integrerar cellsignaler genom bildandet av genpromotorreglerande komplex 4, 5 . En dynamisk intracellulär omorganisation av genregleringsmaskineriet äger rum under mitos. I profas kondenseras kromosomer, isärolin demonteras, kärnan omorganiseras och transkription tystas. Vi har visat störningen av Runx2 subnuclear lokalisering under mitos och restaurering när transkription återupptas i telofas 3 . Även om många transkriptionsfaktorer förskjuts från kromosomer och / eller bryts ned under mitos 6, 7, 8, 9, förblir Runx-proteiner stabila och associeras med mitotisk kromatin 3 .

Immunofluorescensmikroskopi av kromosomspridningar med mänskligt och musmässigt avslöjar att Runx2 är lokaliserat till stora foci som är likvärdigt placerade på systerkromatider (kompletterande figur 1a – d). Mitotiska foci observeras också för en Runx2-mutant (ΔC) med en karboxiterminal trunkering som bibehåller Runt-homologi-DNA-bindningsdomänen (kompletterande fig. 1d), men inte i en cleidokranial dysplasi-relaterad DNA-bindande mutant (data visas inte) . Dessa resultat indikerar att kromosomal förening är oberoende av Runx2 C-terminala funktioner och involverar rekrytering av Runx2 till dess kända DNA-motiv. Kolokaliseringsstudier med antikroppar mot histonmodifieringar och DNaseI-överkänslighetsanalyser som utförts på mitotiska kromosomer indikerar att Runx2-foci finns i områden med öppen kromatin (kompletterande Fig. 1e – i). Denna unika fokala organisation av den linjespecifika Runx2-proteinet på mitotiska kromosomer har inte tidigare dokumenterats för en RNA Pol II-transkriptionsfaktor och föreslår en ny reglerande funktion för Runx2 under mitos.

Storleken och parvis symmetrisk karaktär hos de mitotiska Runx2-fokuserna och deras lokalisering med dekondenserat kromatin antyder att Runx2 är klusterat på genrika kromosomala loci. Från ett cytogenetiskt perspektiv lokaliserar Runx2-foci till pericentromera regioner av humana och muskromosomer och är placerade på humana akrocentriska kromosomer (kompletterande figur 2) som innehåller hundratals tandemiskt arrangerade ribosomala gener 10 . Vi postulerade därför att Runx2 binder rRNA- gener under mitos och kan kontrollera RNA Pol I-transkription. Denna hypotes utmanar den nuvarande modellen att Runx-proteiner bestämmer cellens öde och cellcykelprogression uteslutande genom kontroll av RNA Pol II-transkriberade gener 2, 11, 12 . Det RNA Pol I-regulatoriska proteinet uppströms bindningsfaktor 1 (UBF1) binder direkt till rDNA och till mitotiska nukleolära organiserande regioner, föregångarna till gränssnittet av nukleoli 2, 13, 14, 15 . På mitotiska kromosomer från både mänskliga celler och musceller samverkar Runx2-foci med UBF1 vid aktiva nukleolära organiserande regioner som är berikade för rumsligt klusterade rRNA- gener (fig. 1 och kompletterande fig. 2, 3).

a, b, Immunofluorescensmikroskopi för Runx2 (grön) och UBF1 (röd) med DAPI-färgning (blå) och överlagring för kolokalisering. a, Mitotisk kromosom sprider sig från MCF-10A (överst), Saos (mitten) eller primära muskalvarialceller (botten). b, Interfas Saos-cell med förstorade bilder av kärnan (inlägg). Pilarna indikerar Runx2 och UBF1 och överlappar varandra. c, Epon-sektion immunoelektronmikroskopi av Saos-celler med 5 nm guldpärlor 29 . Överst, Runx2 i kärnan (se kompletterande figur 4 för sammanhang); rutan visas förstorad nedan. Nederst markerar pilhuvuden guld-pärlmärkt Runx2.

Bild i full storlek

När ribosomal biogenes återupptas i mellanfasen, koncentreras rRNA- transkriptionsregulatorn UBF1 vid nukleolära platser för rRNA-syntes 15, 16 . Under interfasen uppvisar Runx2 en punktatfördelning genom däggdjurskärnan och en delmängd är lokaliserad med UBF1 i nukleoli (fig. Ib). Immunogold elektronmikroskopi bekräftar närvaron av Runx2 i nukleoli (fig. 1c och kompletterande fig. 4a – e). Transkriptionell körningsanalys in situ avslöjar att Runx2 och UBF1 samlokaliseras med nukleolära platser för BrUTP-inkorporering i humana Saos-celler även efter specifik hämning av RNA Pol II och III-transkription med a-amanitin (kompletterande figur 5 och data inte visade) . Således kan Runx2 ha en ny och mitotiskt ärftlig roll i transkriptionell reglering av rRNA- gener som är oberoende av dess RNA Pol II-relaterade funktioner.

Flera Runx-bindningsmotiv finns närvarande i mänskliga, mus- och råtta- rDNA- loci (kompletterande figur 6 och data visas inte). Kromatinimmunutfällningar med intervall och mitotiska celler avslöjar direkt bindning av både UBF1 och Runx2 över rDNA- upprepningen, inklusive transkriptionsinitieringsregionen (fig. 2a). Specificiteten återspeglas av frånvaro av Runx2 och UBF1 vid IgH- lokuset och bindning av Runx2, men inte UBF1, till Runx2- promotorn (fig. 2b). Runx2- och UBF1-bindning genom hela rDNA- upprepningen överensstämmer med deras samlokalisering vid nukleolära organiserande regioner och RNA Pol I-transkriptionsställen.

a, b, ChIP med Runx2, UBF1 och IgG-antikroppar visar Runx2-bindning till rDNA- upprepningen, Runx2- genen och inte IgH- genen i MC3T3-celler; qPCR-data normaliseras till icke-specifikt genomiskt DNA och i förhållande till IgG (se kompletterande tabell 1 och kompletterande figurer 6 och 7). c, schematiskt av den rDNA-promotorreporter som används i d och f . Sekvenser av vildtyp (WT) och mutant (MT) oligo som används i e visas med Runx-bindningsställe i fetstil. Dessa sekvenser motsvarar också WT och MT (oberoende kloner A och B) reportrar som används i f . d, RT – qPCR-baserad reporteranalys som visar Runx2-hämning av rDNA-transkription (se kompletterande tabell 1). MC3T3-celler transfekterades med Haemagglutinin (HA) -märkt Runx2 vid de angivna nanogrammängderna (ng) och övervakades med western blot mot Runx2, som en transfektionskontroll och Lamin B, som en belastningskontroll. e, elektroforetisk mobilitetsskiftanalyser med ROS-cellkärnprotein och 32P-märkt rDNA-oligo (se c ). Bindning av Runx2 (nedre pil) visas (spår 1) med specifik antikropp (spår 3; superskift = övre pil), ospecifik (NS) antikropp (spår 2) och oligokonkurrenter (WT, spår 4, 6; MT, spår 5, 7). f, analyser (se d ) med rDNA-reportrar innehållande WT- eller MT Runx2-ställen (A, B, oberoende kloner) och pcDNA-vektorkontroll som visar transkriptionsförhållanden med eller utan Runx2. g, bindningsanalys (se e ) med användning av in vitro- transkriberad och översatt (IVTT) rekombinant WT eller DNA-bindande-mutant (DBM) Runx2. h, Northern blotting (överst) av rDNA-reporter vid samuttryck med WT eller DBM Runx2 eller tom vektor (EV) (GAPDH, kontroll). Western blotting (botten) av epitopmärkta WT- och DBM Runx2-proteiner med användning av aktin som kontroll. Fält anger standardfel ( n = 2) i a, b, d, f .

Bild i full storlek

Vi undersökte interaktionen mellan Runx2 och UBF1 under cellcykeln på flera platser inom rDNA- upprepningen. Ockupationen av proteinerna ökar under G0 / G1 och G1 / S-övergångar (kompletterande figur 7e – i), men inte under mitos / G1 (kompletterande figur 7a – d). Runx2-bindning förflyttas inifrån det transkriptionella initieringsområdet under M / G1 och G1 / S till det 5 ′-transkriberade området under G0 / G1. Den rumsliga organisationen av UBF1 över rDNA- upprepningen är mer statisk under förändringar i rRNA-syntes med föredragen bindning vid förstärkare och transkriptionsinitieringsregioner (kompletterande fig. 7j, k). Våra resultat visar att Runx2 binder till rDNA- upprepningen och uppvisar platsspecifik preferens inom rDNA- upprepningen.

För att bestämma om Runx2 direkt påverkar rDNA- transkription, använde vi en minimal rRNA-promotorreporter 17 från mus som innehåller ett enda proximalt Runx-bindningsställe, vilket framgår av elektroforetisk mobilitetsskiftanalyser (Fig. 2c, e). Ökande nivåer av Runx2 orsakar ett dosberoende repression av vildtyp-rDNA-promotorn (fig. 2d), men inte vid mutation av Runx-elementet (fig. 2f). Vidare kan ett mutant Runx2-protein som är defekt för DNA-bindning (DBM; fig. 2g) inte mediera repression av rDNA-promotorn, såsom visas med Northern blot-analys (fig. 2h). Dessa resultat fastställer att Runx2 direkt reglerar rDNA -gentranskription.

För att fastställa om Runx2 modulerar endogen rRNA-transkription in vivo undersökte vi rRNA-syntes i osteogena mesenkymala prekursorer där Runx2-uttryck har genetiskt ablaterats. Metaboliska märkningsförsök avslöjar förbättrad rRNA-syntes i Runx2-nollceller, men ingen signifikant effekt på rRNA-bearbetning (Fig. 3a, c). Omvänd transkription-kvantitativ polymeras-kedjereaktionsanalys (RT – qPCR) -analys av pre-rRNA (fig. 3b) och kärnkörningsanalys av RNA-transkription (data visas inte) bekräftar ytterligare denna förbättring i rRNA-syntes i Runx2-nollceller. Dessutom ökas pulsmärkning av cellulärt protein med radioaktiv (3H- eller 35S-) metionin i Runx2-nollceller, vilket indikerar ökad kapacitet för proteinsyntes (Fig. 3d, e). Det är viktigt att vi finner att kort störande RNA (siRNA) medierad knockdown av Runx2-proteinnivåer resulterar i förbättrat rRNA-uttryck (Fig. 3f). Sammantaget indikerar våra data att Runx2 fungerar för att hämma rRNA-uttryck.

a - e, Primära kalvariala celler från homozygota musembryon (17, 5 dagar efter coitus) med WT eller null Runx2-alleler. a, Paneler visar rRNA-nivåer genom etidiumbromid (överst till vänster), Runx2-protein genom västlig analys (längst ner till vänster) och 3H-uridinmärkning av RNA-syntes genom autoradiografi (höger). b, Pre-rRNA-syntes i lika cellantal analyserades med RT – qPCR relativt P-aktin i WT- och nollceller (kontroll, Cdk2-nivåer). c, RNA-syntes uppmätt med 3H-metyl-metionininkorporering vid 0, 5, 1, 2 och 4 timmar med användning av autoradiografi (topp) och rRNA-nivåer genom etidiumbromidfärgning (botten). d, e, Inkorporering av 3H-metyl-metionin ( d ) eller 35S-metionin ( e ) i proteiner uppmätt genom scintillationsräkning och normaliserat till totalt protein. f, Saosceller transfekterade med tre oberoende Runx2 siRNA: er (A, B eller C) eller siRNA-kontroller (A, GFP; B, kloramfenikolacetyltransferas (CAT)) undersöktes med avseende på obearbetat rRNA (pre-rRNA-syntes) och p-aktin med RT –QPCR-analys (överst) och Runx2- och LaminB1-proteinuttryck genom Western blot-analys (botten). Fält anger standardfel ( n = 2) i b, f .

Bild i full storlek

Funktionella effekter av Runx2 på rDNA-promotorn och kolokalisering av Runx2 med UBF1 antyder att dessa proteiner interagerar in vivo . I själva verket visar samimmunoprecipiteringsanalyser i flera osteoblastiska cellinjer att endogena Runx2 och UBF1 är en del av samma komplex (Fig. 4a). Noterbart associerar Runx2 den transkriptionellt aktiva delmängden av UBF1 som är fosforylerad på Ser 484 (fig. 4b) såväl som med p48 och p95 / p110-subenheterna i SL1-komplexet som krävs för promotorigenkänning av RNA Pol I (fig . 4b och data visas inte). För att bedöma om Runx2 rekryteras till det rDNA- reglerande området tillsammans med UBF1 och SL1-komplexet utförde vi sekventiella kromatinimmunutfällningsanalyser (det vill säga ChIP-reChIP) (kompletterande figur 8). Våra resultat visar att UBF1 ockuperade rDNA- fragment samtidigt är bundna av både Runx2 och p48 (fig. 4c). I överensstämmelse med våra mikroskopiska observationer (fig. 1a), uppträder samverkan av dessa proteiner vid rDNA- loki också i mitotiska celler (fig. 4c).

Immunutfällning (IP) av endogena Runx2 och UBF1 från osteoblastiska celler ( a ) och HA – Runx2 och Flag – UBF1 uttryckta i NIH-3T3-celler ( b ) reagerar med antikroppar mot Runx2, UBF1, fosfo-UBF1 eller p48-subenheten för SL1-komplex i västra blotting (WB). c, ChIP-reChIP-analyser med proteiner endogena till asynkrona och mitotiska Saos-celler med användning av UBF1-antikropp (primär ChIP) och andra immunutfällning (reChIP) med antikroppar riktade mot UBF1, p48 och Runx2 eller IgG. Kromatinprover analyserades med qPCR med användning av primrar som flankerade rDNA- transkriptionsstartplatsen, hrDNA-7, hrDNA-1, hrDNA-2 (se kompletterande tabell 1 och kompletterande figur 6). d, ChIP från asynkrona Saos-2 förbehandlade med Runx2 siRNA-oligos eller icke-tystande kontroller med användning av antikroppar mot acetylerad-histon H4, acetylerad-histon H3 och K4-dimetylerad-histon H3 analyserades med qPCR och uttrycktes som ett förhållande. Runx2-knockdown bekräftades med western-analys (inset). e, Diagram som visar linjespecifik reglering av rRNA-syntes. Fält anger standardfel ( n = 2) i c, d .

Bild i full storlek

Runxproteiner är kända för att reglera genuttryck genom interaktioner med kromatinombyggnadsenzymer. Vi antog att Runx2 kan dämpa rRNA-uttryck genom att påverka epigenetiska modifikationer vid rDNA- loci. Därför utförde vi siRNA knockdown-experiment för att undersöka om Runx2 kontrollerar post-translationella modifikationer av histoner. Vi utförde kromatinimmunutfällningsanalyser med siRNA-behandlade humana Saos-celler med användning av antikroppar riktade mot K4-dimetylerad histon H3, samt acetylerade histoner H3 och H4, som alla är relaterade till genaktivering 18, 19 . Analys med qPCR avslöjar att knockdown av Runx2-protein signifikant ökar K4-dimetylerad histon H3 och acetylerad histon H4 nära rDNA- transkriptionsstartplatsen (humant rDNA-upprepning 1; fig. 4d). Dessa resultat stöder vårt konstaterande att Runx2-brist ökar rRNA-syntesen (Fig. 3). Följaktligen kan Runx2 dämpa rRNA-transkription delvis genom att påverka modifieringar av kromatin. Vi drar slutsatsen att Runx2 binder till rDNA- loci tillsammans med UBF1 och komponenter i det väsentliga SL1-komplexet för att tillhandahålla celltypspecifik reglering av rRNA-syntes (Fig. 4e).

Vi rapporterar att Runx2 direkt associerar med ribosomal DNA-loci under intervall och mitos, och interagerar med UBF1 och SL1-komplexet för att reglera ribosomal RNA-syntes. Retention av Runx2 vid nukleolära organiserande regioner på mitotiska kromosomer tillhandahåller en grund för att överföra linjespecifik kontroll av rRNA-genuttryck till avkommande celler. Dessa grundläggande fynd har stora biologiska och biomedicinska förgreningar och utökar tidigare studier som implicerar cancerrelaterade gener i RNA Pol I-transkription 12, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 .

Den funktionella kopplingen mellan Runx2-kontroll av rRNA-syntes, proliferation och differentiering ger insikt i den vävnadsspecifika fenotypen associerad med Treacher Collins syndrom. Kraniofaciala benfel och tillväxtfördröjning i Treacher Collins syndrom är kopplade till deregulerad ribosomproduktion 27 och liknar skelettabnormaliteter observerade vid cleidokranial dysplasi, vilket orsakas av Runx2-funktionsförlustmutationer 28 . Den fenotypiska penetransen av dessa sjukdomar kan nu tolkas inom ramen för benlinjebegränsad reglering av ribosomal biogenes genom Runx2.

Vår upptäckt att Runx2 reglerar ribosomal biogenes, som är sammankopplad med celltillväxt, antyder att Runx-proteiner kan etablera cellidentitet genom att koordinera kontrollera tillväxt, spridning och differentiering. Speciellt kan det leukemirelaterade Runx1-proteinet, som krävs för hematopoies, också associeras med rDNA-relaterade nukleolära organiserande regioner (GSS et al. , Opublicerade observationer). Således, från ett bredare biologiskt perspektiv, kan linjespecifik kontroll av ribosomal biogenes vara en grundläggande funktion av transkriptionsfaktorer som styr cellens öde.

metoder

Cellsynkronisering

Cellerna blockerades i mitos genom nokodazolbehandling över natten följt av skakning för att lossa mitotiska celler. Där anges tvättades cellerna och replikerades i tillväxtmedia för mitotisk frisättning. Kromosomspridningar genererades genom kort inkubation av mitotiska celler i hypotonisk KCl-buffert följt av centrifugering på positivt laddade glidglas. G0 / G1 och G1 / S-synkroniseringarna erhölls genom serumberövande och re-stimulering av MC3T3-celler. Mer information finns i tilläggsinformation.

Mikroskopi

Celler odlade på täckglas såväl som kromosomspridningsberedningar behandlades för immunfluorescens in situ såsom beskrivits 4 . Immunoelektronmikroskopi utfördes väsentligen såsom beskrivs 29 . Mer information finns i tilläggsinformation.

Kromatinimmunutfällningsanalys

Kromatinimmunutfällningsanalyser (ChIP) utfördes såsom beskrivits 30 . Primers beskrivs i tilläggstabellen 1. Se tilläggsinformation för ytterligare information.

Samimmunutfällning och Western blot-analys

Samimmunutfällningar utfördes med UBF (F-9 eller H-300, Santa Cruz Biotech), Runx2 (M-70, Santa Cruz Biotech), fosfospecifik UBF (Ser 484, Santa Cruz Biotech) eller TAFI / p48 ( M-19, Santa Cruz Biotech). Western blots utfördes med standardtekniker. Mer information finns i tilläggsinformation.

qPCR-analys av pre-rRNA-expression

Totalt RNA isolerades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen), kolonnrenades och cDNA genererades i en omvänd transkriptionsreaktion med slumpmässiga hexamer eller genspecifika primers. cDNA underkastades sedan PCR i realtid med användning av SYBR-kemi med primrar (se kompletterande tabell 1) som flankerar tidiga rRNA-behandlingsställen.

Metabolisk märkning

3H-Uridine, 3H-metyl-metionin och 35 S-metionin-märkningsexperiment genomfördes väsentligen såsom beskrivits 24 . Mer information finns i tilläggsinformation.

siRNA och plasmid-DNA-transfektion

siRNA-transfektioner utfördes med användning av standardtekniker med följande siRNA-duplex: Runx2-A r (GGU UCA ACG AUC UGA GAU U) d (TT), Runx2-B r (UCU GUU UGG CGA CCA UAU U) d (TT), Runx2 -C r (UGC CUC UGC UGU UUG AAA) d (TT). MR170-BH rDNA-promotorreporterplasmid beskrivs på annat håll 17 . MR170-BH reporter med ett mutant Runx-ställe genererades genom platsriktad mutagenes med användning av följande primer (5'-GTT GTT CCT TTG A AC TCC GGT TCT TT). Reporteruttryck övervakades med qPCR (se kompletterande tabell 1 för primrar) och genom Northern blot-analys med användning av pUC9 DNA-reporter som en hybridiseringssond. Mer information finns i tilläggsinformation.

Analyser av elektroforetisk rörlighet

Se kompletterande information för mer information.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Filen innehåller kompletterande figurer S1 till S8 med motsvarande legender. Dessa siffror är omfattande datauppsättningar som ingick i den ursprungliga inlämningen innan storleksminskningar i antalet och storleken på siffrorna; Kompletterande tabell 1 som innehåller primersekvenser som används för att generera en delmängd av våra data. Filen innehåller också en lista över Runx2-konsensussekvenser som stöder placering av röda diamanter (dvs. Runx2-platser) på diagrammet för mänskliga och musrDNA-upprepningar som presenteras i kompletterande figur S6 och kompletterande primära data. Dessa kompletterande data är digitala genomsökningar av de ursprungliga autoradiogrammen som användes för att generera figur 4.

  2. 2.

    Kompletterande metoder

    Filen innehåller kompletterande metoder och ytterligare referenser.

  3. 3.

    Rättelse

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.