Mitokondriell cereblon fungerar som ett prototyp av ensam typ | vetenskapliga rapporter

Mitokondriell cereblon fungerar som ett prototyp av ensam typ | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Sjukdomar i nervsystemet
  • mitokondrier
  • neuro~~POS=TRUNC
  • proteaser

Abstrakt

Lonproteas spelar en viktig roll i proteinkvalitetssystemet i mitokondrier från däggdjur. Det är närvarande i mitokondrial matris och bryter ned oxiderade och fällbara proteiner, varigenom cellen skyddas från olika extracellulära spänningar, inklusive oxidativ stress. Den intellektuella funktionshinderassocierade och talidomidbindande proteinsereblon (CRBN) innehåller en stor, mycket bevarad Lon-domän. Huruvida CRBN har Lon-proteasliknande funktion förblir emellertid okänd. Här bestämde vi om CRBN har en skyddande funktion mot oxidativ stress, liknande Lon-proteas. Vi rapporterar att CRBN delvis distribuerar i mitokondrier, vilket tyder på att det har en mitokondriell funktion. För att specificera den mitokondriella rollen för CRBN uttryckte vi mitokondriellt CRBN i humana neuroblastom SH-SY5Y-celler. Den resulterande stabila SH-SY5Y-cellinjen visade ingen uppenbar effekt på mitokondriella funktioner för fusion, fission och membranpotential. Emellertid uppvisade mitokondriellt uttryckt CRBN proteasaktivitet och inducerades av oxidativ stress. Dessutom uppvisade stabilt uttryckta celler undertryckt neuronal celldöd inducerad av väteperoxid. Dessa resultat antyder att CRBN fungerar specifikt som ett proteas av Lon-typ i mitokondrier.

Introduktion

Cereblon (CRBN) är en gen på kromosom 3p26.2, som identifierades som en orsakande gen för en mild typ av autosomal recessiv nonsyndrom intellektuell funktionsnedsättning (ID) 1 . CRBN-proteinet är multifunktionella och immunocytokemiska studier indikerar att CRBN upptar flera subcellulära fack 2 inklusive kärnan, cytoplasma 3 och endoplasmatisk retikulum (ER) 4 . Som ett cytosoliskt protein är CRBN ett mål för talidomid och en komponent i Cullin 4-RING E3 ubiquitin ligaskomplex 3 . CRBN interagerar också med proteasomen genom att binda till p7-subenheten 5 . Dessutom identifierade jäst tvåhybrid-screening CRBN som ett potentiellt bindande protein i ClC-2-kanalen, en spänningsgrindad kloridkanal som medierar nedbrytning via den ubiquitin-proteasomberoende vägen 6, 7 . Nyligen rapporterade vi att CRBN rekryteras till aggresomer och funktioner vid cytobeskyddande mot det ubiquitin-proteasome systemet-nedsatt tillstånd 8 . Som ER-protein är CRBN en bindningspartner för den stora ledande kalciumaktiverade kaliumkanalen, som reglerar ytuttryck av funktionella kanaler och därmed förhindrar epileptogenes 4, 9 . Som ett kärnprotein förknippas talidomid och dess analoger med CRBN för att stödja proteasomberoende nedbrytning av transkriptionsfaktorerna, IKZF1 och IKZF3, som båda är väsentliga vid multipelt myelom (MM). Detta leder till tillväxtinhibering och apoptos av MM-celler efter nedreglering av c-Myc och IRF4 10, 11, 12, 13, 14 . Sammantaget visar dessa rapporter att CRBN fungerar i förändring av ubikvitering och nedbrytning av specifika mål.

CRBN innehåller en 237-rest Lon-domän: en bevarad N-terminal domän som återfinns i Lon-proteaset, ett ATP-beroende proteas inom mitokondriell matris 1, vilket antyder att CRBN kan ha en mitokondriell funktion. Mitokondrier är de subcellulära organellerna som ansvarar för att producera intracellulära reaktiva syrearter (ROS), liksom att generera energi i form av ATP via oxidativ fosforylering. Eftersom mitokondriella proteiner och DNA är belägna i närheten av källan till ROS, är de mycket sårbara för oxidativ skada. Därför kan överdriven ROS-produktion inducerad av mitokondriell dysfunktion leda till mitokondriell ansamling av oxiderade proteiner, vilket bidrar till mitokondriell dysfunktion och cytotoxicitet 15, 16 . Ackumulering av dessa proteiner i mänskliga celler förvärrar åldringsprocessen och leder till åldersrelaterade störningar såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom 17, 18, 19, 20 . För att motverka oxiderad proteinansamling har däggdjursceller utvecklat ett mitokondriellt proteinkvalitetssystem för att avlägsna oxiderade proteiner 21, 22 . I mitokondrier från däggdjur bidrar fyra huvudsakliga ATP-beroende proteaser till mitokondriell proteinkvalitetssystem 23 . Specifikt förankras i-AAA- och m-AAA-proteaserna i det inre membranet och utsätter deras katalytiska domäner för respektive intermembranrum och respektive matris. I konstrast är ClpXP- och Lon-proteaserna belägna i matrisen. I överensstämmelse med deras avgörande roller i kontroll av proteinkvalitet är förändringar i deras uttrycksnivåer förknippade med flera mänskliga sjukdomar och åldrandet 24

Lonproteas är ett mycket konserverat ATP-beroende serinpeptidas i både prokaryoter och eukaryoter, och krävs för upprätthållande av mitokondriell homeostas 24 . Det spelar en avgörande roll i mitokondriell proteinkvalitetskontroll genom att bryta ned oxiderade och felvikta proteiner genererade i mitokondriell matris 25, 26, 27 . Lonproteas är också ett stressprotein som induceras av flera stressfaktorer såsom oxidativ stress, värmechock och närings svält 28 . Under dessa påfrestningar regleras Lon- genen och undertrycker celldöd 28 . Tidigare studier har visat att Lon-proteasöveruttryck ger apoptotisk resistens mot oxidativ stress i humana och svampceller 29, 30 . Däremot är reducerade nivåer och aktiviteter av Lon-proteas associerade med åldringsprocessen. Under sådana förhållanden ackumuleras oxiderade proteiner på åldersrelaterat sätt och orsakar mitokondriell dysfunktion, vilket slutligen leder till celldöd 26, 31 . Ackumulering av bevis visar att Lon-proteaset fungerar som en viktig antioxidant i mitokondrier genom att begränsa oxidativ skada till acceptabla nivåer.

Även om CRBN innehåller en stor, mycket bevarad Lon-domän, förblir funktionen av CRBN som ett Lon-proteas i mitokondriell proteinkvalitetskontroll oklar. Här visar vi att liknande Lon-proteas fungerar CRBN i skydd mot oxidativ stress.

Resultat

CRBN lokaliseras delvis till mitokondrier

För att undersöka CRBN-lokalisering i mitokondrier från odlade celler transfekterade vi en HA-märkt CRBN-expressionsvektor 8 i SH-SY5Y-celler. Subcellulär lokalisering av exogent CRBN undersöktes sedan med immunofluorescensmikroskopi. Exogent CRBN färgades delvis av den mitokondriella markören, MitoTracker Red (Fig. 1a), vilket antyder att exogent CRBN delvis lokaliseras till mitokondrier. För att ytterligare karakterisera CRBN-distributionen inom mitokondrier undersökte vi den subcellulära lokaliseringen av exogen CRBN med hjälp av biokemiska metoder. I transfekterade SH-SY5Y-celler detekterades ett CRBN-proteinband vid den förutsagda molekylvikten (51 kDa), såsom tidigare rapporterats 8 . Western blotting av subcellulära fraktioner med användning av anti-HA-antikropp demonstrerade att CRBN huvudsakligen var närvarande i den cytosoliska fraktionen, men också i den mitokondriella rika fraktionen (Fig. 1b).

Image

( a ) Konfokal bildanalys av SH-SY5Y-celler som överuttrycker CRBN. CRBN finns i hela cellen inklusive mitokondrier (skalstång = 20 mikrometer). ( b ) Western blot-analys efter subcellulär fraktionering av SH-SY5Y-celler som uttrycker CRBN visade partiell fördelning av CRBN i mitokondriella fraktioner. a-tubulin och Tom20 användes som cytosoliska respektive mitokondriella markörer.

Bild i full storlek

Mitokondrialspecifikt uttryck av CRBN i SH-SY5Y-celler

För att undersöka mitokondriell funktion av CRBN klonades CRBN- cDNA in i en mitokondriell målsökningsvektor för mitokondriell expression, med användning av en tidigare rapporterad strategi 32 . Konstruktet transfekterades in i SH-SY5Y-celler för att generera en stabil cellinje som uttrycker myc-märkt mitokondriell CRBN (fig. 2a). Western blot-analys med användning av en anti-CRBN-antikropp som känner igen den N-terminala regionen av proteinet visade att exogent uttryckt CRBN var närvarande som två band: ett med den förutsagda molekylvikten på 55 kDa och ett ytterligare band med en högre än förväntad molekylär vikt av 64 kDa (fig. 2b). Dessa band detekterades inte med användning av en myc-tag-antikropp. För att undersöka möjligheten att mitokondriellt riktad CRBN (dvs. MTS-CRBN) försämras av den ubiquitinberoende proteasomvägen, som tidigare rapporterats 8, utförde vi Western blot-analys efter behandling med MG132, en proteasominhibitor. Följaktligen ökade MTS-CRBN-expressionsnivåer detekterade av både CRBN- och myc-taggantikroppar med MG132-behandling på ett tidsberoende sätt (fig. 2b). Därefter undersökte vi den subcellulära lokaliseringen av CRBN med hjälp av biokemiska metoder för att karakterisera MTS-CRBN-distribution inom mitokondrier. För att karakterisera MTS-CRBN-lokalisering utfördes westernblotting av subcellulära fraktioner behandlade med MG132 och MTS-CRBN visade sig specifikt lokalisera till den mitokondria-rika fraktionen (Fig. 2c). Vi undersökte också den subcellulära lokaliseringen av MTS-CRBN genom immunofluorescensmikroskopi och fann att MTS-CRBN färgades tillsammans med den mitokondriella markören, Tom20 (fig. 2d).

Image

( a ) Schematiskt diagram över MTS-CRBN. CRBN innehåller en 237-rest Lon-domän. MTS; Mitokondriell inriktningssignal, Myc; Myc-tagg. ( b ) Expression av MTS-CRBN bekräftades genom western blotting. Två specifika band med molekylvikter på 55 och 64 kDa observerades i MTS-CRBN-stabila kloner, men kontrollerade inte SH-SY5Y-celler. Expressionnivåer av MTS-CRBN detekterade av både CRBN- och myc-taggantikroppar förbättrades av MG132 på ett tidsberoende sätt. ( c ) Western blot-analys efter subcellulär fraktionering av celler som uttryckte MTS-CRBN visade att ett band (indikerat av asterisken) var närvarande i mitokondria-rika fraktionen av MTS-CRBN som uttrycker SH-SY5Y-celler. a-tubulin och Tom20 användes som cytosoliska respektive mitokondriella markörer. ( d ) Konfokal mikroskopi-analys av kontroll- och MTS-CRBN-överuttryckande SH-SY5Y-celler. MTS-CRBN samlokaliserades till mitokondrier färgade med Mito Tracker Red (skalstång = 20 μm).

Bild i full storlek

Mitokondriell morfologi och membranpotential i MTS-CRBN överuttryckte SH-SY5Y-celler

Reglering av mitokondriell dynamik (dvs. fusion och fission) spelar en viktig roll i kvalitetskontroll 33 . Fusion lindrar stress genom att blanda innehållet i försämrade mitokondrier med intakta sådana 34 . Däremot, i fission, är dysfunktionella mitokondrier segregerade för autofagi (mitofagi) 35, 36 . För att bestämma effekten av MTS-CRBN-överuttryck på mitokondriell dynamik undersökte vi mitokondriell morfologi i stabil MTS-CRBN-överuttryckta SH-SY5Y-celler. Följaktligen erhöll vi tredimensionella projicerade Z-stack-bilder av mitokondrier färgade med MitoTracker Red (Fig. 3a, övre panel) och undersökte deras morfologi genom att mäta mitokondriell förlängning och samtrafik med NIH ImageJ (Fig. 3a, nedre panel). Mitokondriell töjning och poäng för samtrafik var inte signifikant olika mellan MTS-CRBN överuttryckt och kontrollerande SH-SY5Y-celler (fig. 3a). Western blot-analys av OPAl- och DLP1-proteinerna, som är involverade i mitokondriell fusion respektive fission, avslöjade liknande expressionsnivåer för båda proteinerna mellan MTS-CRBN överuttryckt och kontrollceller (fig. 3b). Dessa resultat indikerar att MTS-CRBN inte är förknippat med reglering av mitokondriell dynamik. För att undersöka effekten av MTS-CRBN-överuttryck på mitokondriell funktion, mätte vi mitokondriell membranpotential med hjälp av JC-1 fluorescerande färgämne, som uppvisar en mitokondriell protonmotivkraft (PMF) -beroende förändring av fluorescensemission från grönt till rött. Fluorescensspektrofotometeranalys visade att förhållandet mellan röd / grön fluorescensintensitet inte signifikant förändrades av MTS-CRBN-överuttryck (Fig. 3c), vilket antyder att MTS-CRBN inte påverkar mitokondriell membranpotential. Sammantaget har MTS-CRBN ingen uppenbar effekt på mitokondriella funktioner som involverar mitokondriell fusion, fission och membranpotential.

Image

( a ) Tredimensionell rekonstruktion av Z-staplar av mitokondrier märkta med MitoTracker Red CMXRos i kontroll och MTS-CRBN-överuttryckande SH-SY5Y-celler (övre panel, skalfält = 30 μm). Kvantitativ bildanalys av mitokondriell förlängning och samtrafik i kontroll och MTS-CRBN-överuttryckta SH-SY5Y-celler. Medelcirkularitet och förhållande mellan area och perimeter användes som index för töjning respektive samtrafik, såsom beskrivits tidigare 46 . Det fanns inga signifikanta skillnader mellan kontroll- och MTS-CRBN-överuttryckta SH-SY5Y-celler (nedre panel). ( b ) Expressionnivåer av DLP1 och OPA1, proteiner associerade med mitokondriell fission och fusionsprocesser, bekräftades genom western blotting. Expressionsnivåerna för båda proteinerna var likartade i kontroll- och MTS-CRBN-överuttryckta SH-SY5Y-celler. ( c ) Mitokondriell membranpotential mättes med användning av JC-1-reagens. Rött / grönt fluorescensintensitetsförhållande bestämdes i kontroll och MTS-CRBN överuttryckte SH-SY5Y-celler efter JC-1-reagensbehandling. Överuttryck av MTS-CRBN påverkade inte mitokondriell membranpotential. N = 6.

Bild i full storlek

Mitokondriell CRBN fungerar som ett proteas av Lon-typ

Vi undersökte den proteolytiska aktiviteten hos mitokondriellt uttryckt CRBN med användning av FITC-kasein, som har rapporterats som ett substrat för ett brett spektrum av proteaser, inklusive Lon-proteas 31 . Den proteolytiska aktiviteten ökades signifikant i mitokondriafraktionen av MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler jämfört med kontrollcellerna ( * p <0, 05, fig 4a). Lonproteas induceras av flera stressorer, inklusive väteperoxid, och bidrar till skydd mot dessa spänningar 25, 28, vi analyserade därefter proteinuttrycksnivåerna för mitokondriellt riktad CRBN under oxidativt stresstillstånd. Efter behandling av väteperoxid ökade MTS-CRBN-uttrycket tillfälligt i MTS-CRBN-överuttryckta celler (* p <0, 05, fig. 4b). Vi observerade också att endogen CRBN och Lon inducerades på samma nivåer i oxidativa stressbetingelser, och uttrycket av Lon i SH-SY5Y-celler nedreglerades genom ökat uttryck av MTS-CRBN under oxidativ stress (kompletterande figur 1). Oxidativ stress är förknippad med bildandet av oxidativt modifierade biomolekyler, inklusive proteiner, lipider och DNA 15, 16, 17 . Nivån av karbonylerade proteiner, en markör för oxidativ stress, reducerades i totalt cellulärt extrakt av MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler (* p <0, 05, fig. 4c). Nivån av oxiderade proteiner reducerades också i mitokondriell fraktion av MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler (kompletterande figur 2). Sammantaget indikerar dessa resultat att mitokondriellt riktad CRBN uppvisar protonaktiviteter av Lon-typ.

Image

( a ) Proteolytiska aktiviteter av MTS-CRBN mättes med användning av FITC-kasein. Fluorescensintensiteten för FITC-kasein i den mitokondriella fraktionen av MTS-CRBN-överuttryckta celler ökades signifikant jämfört med kontrollcellerna (* p <0, 05). ( b ) Uttrycksnivåer av MTS-CRBN under oxidativa stressbetingelser mättes genom western blotting. Nivån för MTS-CRBN ökades tillfälligt genom behandling av väteperoxid (* p <0, 05). ( c ) Nivån av karbonylerade proteiner, en markör för oxidativ stress, detekterades genom western blotting med användning av antikropp mot 2, 4-dinitrofenol (DNP). Nivån av karbonylerade proteiner producerad genom oxidativ stress undertrycktes i totalt cellulärt extrakt av MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler jämfört med nivån för kontrollceller (* p <0, 05, ** p <0, 01).

Bild i full storlek

Eftersom CRBN innehåller en förmodad Lon-domän bestämde vi om överuttryckande MTS-CRBN-celler visar skydd mot väteperoxid. Celler exponerades för olika koncentrationer av väteperoxid och cellviabilitet bestämdes genom att mäta halterna av intracellulär 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboximetoxifenyl) -2- (4-sulfofenyl) - 2H-tetrazolium, som korrelerar med livskraften i odlade celler. SH-SY5Y-cellviabilitet minskade efter väteperoxidbehandling på ett dosberoende sätt (Fig. 5a), medan MTS-CRBN-överuttryck signifikant ökade cellviabiliteten jämfört med kontroll-SH-SY5Y-celler (* p <0, 05, ** p <0, 01, Fig. 5a). Med användning av laktatdehydrogenas (LDH) -analys undersökte vi dessutom celldöd i MTS-CRBN-överuttryckta celler efter väteperoxidbehandling. Väteperoxidbehandling av SH-SY5Y-celler orsakade ökad LDH-frisättning (fig. 5b), vilket korrelerade med ökad celldöd. Väteperoxidinducerad celldöd i MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler undertrycktes dramatiskt jämfört med kontroll-SH-SY5Y-celler (* p <0, 05, Fig. 5b). Sammantaget indikerar dessa resultat att MTS-CRBN undertrycker cytotoxicitet inducerad av oxidativ stress.

Image

( a ) Cellviabilitet efter behandling med olika koncentrationer (0–700 μM) väteperoxid utfördes genom mätning av intracellulära nivåer av tetrazoliumsaltet. SH-SY5Y-cellviabilitet minskade efter väteperoxidbehandling på ett dosberoende sätt, medan MTS-CRBN-överuttryck signifikant ökade cellviabiliteten jämfört med kontroll-SH-SY5Y-celler (* p <0, 05, ** p <0, 01). ( b ) Celldöd för MTS-CRBN-överuttryckta celler inducerade av olika koncentrationer av väteperoxid mättes med användning av LDH-analysen. Celldöd för MTS-CRBN överuttryckta SH-SY5Y-celler inducerade av väteperoxid undertrycktes jämfört med kontroll-SH-SY5Y-celler (* p <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie har vi visat att CRBN delvis distribuerar inom mitokondrier. CRBN innehåller en mycket bevarad, stor Lon-domän, som finns i N-terminalen av det ATP-beroende Lon-proteaset som lokaliserar till den mitokondriella matrisen och ökar möjligheten att CRBN kan ha en mitokondriell funktion. För att fokusera på den mitokondriella specifika funktionen av CRBN konstruerade vi en expressionsvektor av MTS-CRBN, i vilken en MTS möjliggör exogen CRBN att rikta in mitokondrier. Med hjälp av denna vektor etablerade vi en stabil cellinje som uttrycker MTS-CRBN och bekräftade CRBN-expression i mitokondrier. Uttryck av MTS-CRBN hade ingen uppenbar effekt på mitokondriella funktioner som involverade mitokondriell fusion, fission och membranpotential. Lon-proteaset rapporteras induceras av oxidativ stress och har skyddande effekter mot extracellulär stress, inklusive oxidativ stress inducerad av hydorgenperoxid 25, 28 . Vi fann att MTS-CRBN-uttryck uppvisade den mitokondriella proteolytiska aktiviteten, MTS-CRBN inducerades tillfälligt av oxidativ stress, och MTS-CRBN-uttryck undertryckte bildningen av karbonylerade proteiner producerade av stressen. Med hjälp av den etablerade cellinjen som uttrycker MTS-CRBN fann vi att MTS-CRBN har skyddande funktioner mot oxidativ stress. Våra data antyder att, liknande Lon-proteaset, mitokondriell CRBN har en skyddande funktion mot oxidativ stress.

Det mitokondriella kvalitetskontrollsystemet är avgörande för cellöverlevnad. Tre stora ATP-beroende proteaser (m-AAA, ClpXP och Lon) kan känna igen onormala proteiner genererade i mitokondrial matris och därefter nedbrytas dem 24, 37 . M-AAA-proteaset bäddas in i mitokondrialt inre membran, med dess katalytiska ställen exponerade för mitokondrial matris, medan ClpXP och Lon-proteaser är aktiva inom mitokodnrial matris 24, 38 . ClpXP-proteaset består av en proteolytisk underenhet (ClpP) och en chaperonliknande underenhet (ClpX) som bär en AAA + -domän 39 . Lonproteas består av tre domäner: en N-terminal domän, central ATPas-domän och en C-terminal proteasdomän och bildar vanligtvis en homo-hexamer. CRBN-proteinet innehåller den N-terminala domänen för det ATP-beroende Lon-proteaset utan Walker A- och B-motiv som är nödvändiga för bindning och hydrolys av ATP och ett peptidasdomän för katalytisk aktivitet 1, 9, vilket antyder att CRBN kan fungera som komplex med en annan proteininnehållande ATPas- och proteasdomäner.

Nedsatt underhåll av mitokondriella proteiner av dessa proteaser är förknippat med flera neurodegenerativa och neuro-utvecklingssjukdomar. Till exempel är SCA28 en form av spinocerebellär ataxi, specifikt en progressiv neurodegenerativ störning som kännetecknas av dålig koordination av ben, händer, tal och ögonrörelser. SCA28 orsakas av försämrad nedbrytning av onormala mitokondirala matrisproteiner på grund av en mutation i AFG3L2 , som kodar för en underenhet av det hexameriska m-AAA-proteaset 40 . Vidare har störningar i det mitokondriella proteomkontrollövervakningssystemet orsakat av en mutation i SPG7 som kodar för en m-AAA-subenhet rapporterats för en autosomal recessiv form av ärftlig spastisk paraplegi. Detta är en komplex form av en sen-tidigt progressiv neurodegenerativ störning som involverar progressiv spasticitet, epilepsi och ID 41 . I Drosophila melanogaster visar i-AAA-borttagningsmutanter ökade ROS-nivåer, onormala mitokondrier och neurodegeneration 42 . Dessutom har minskat Lon-proteasuttryck, både på RNA- och proteinnivå, påträffats hos en patient med SPG13, en typ av en autosomal dominatform av ärftlig spastisk paraplegi. Detta antyder att mitokondriell kvalitetskontroll, som utförs av Lon-proteas i mitokondrial matris, kan vara associerad med patogenes av ett brett spektrum av neuronala sjukdomar inklusive neurodegenerativa störningar, epilepsi och ID 43 . Perrault syndrom kännetecknas av sensorinural hörselnedsättning och ovariesvikt och rapporteras orsakas av mutationer i CLpP, som kodar för en proteolytisk CLpXP-underenhet 44 . Nyligen var CODAS-syndrom, en multisystemutvecklingsstörning som kännetecknas av cerebrala, okulära, tand-, aurikulära och skelett-anomalier, associerad med mutationer av LONP1 , kodande mitokondriell AAA + Lon Protease 45 . Således är dessa utvecklingsstörningar associerade med dysfunktion av mitokondriella proteaser. Som med andra mitokondriella proteaser är den förmodade Lon-domänen inom CRBN funktionell, och en defekt i dess funktion kan vara av betydelse för ID-utveckling.

Här ger vi insikt i den fysiologiska funktionen av CRBN vid cytoprotektion mot oxidativ stress, och visar att den liknar Lon-proteas. Således, vad gäller Lon-proteas, kan defekt CRBN-funktion i neuroutvecklingsstadiet bidra till ID-patogenes, såsom ses i andra neuropsykiatriska sjukdomar. Det kommer att vara av intresse att undersöka LON-proteasfunktionen hos CRBN hos modelldjur och humana försökspersoner med neuro-utvecklingsstörningar.

metoder

Reagens

Följande antikroppar användes: mus-anti-hemagglutinin (HA) -antikropp (Covance, Berkley, CA, USA); mus-anti-myc-antikropp (Millipore, Billerica, MA, USA); kanin-anti-CRBN-antikropp (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA); mus-anti-a-tubulin (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, USA); kanin anti-Tom20 (F-10) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); mus-anti-DLP1-antikropp (BD Bioscience, San Jose, CA, USA); mus-anti-OPA1-antikropp (BD Bioscience); anti-kanin IgG, HRP-kopplad hela antikropp, åsna (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA); anti-mus IgG, HRP-länkad hel antikropp, får (GE Healthcare); Alexa Fluor488-märkt anti-mus IgG (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); och Alexa Fluor594-märkt anti-kanin IgG (Life Technologies); kanin polyklonal anti-dinitrofenyl (DNP) antikropp (SHIMA Laboratories, Tokyo, Japan). MG132 (Peptide Institute, Osaka, Japan) löstes i dimetylsulfoxid och lagrades vid -20 ° C.

Konstruktion av CRBN-expressionsvektorer

CRBN cDNA amplifierades från Genome Network Project Human cDNA Clones (IRAL038I16, Riken BioResource Center, Kanagawa, Japan). Sal I / Not I-fragment innehållande CRBN isolerades och ligerades in i däggdjursexpressionsvektorn, pCMV / myc / mito (Life Technologies), som digererades med samma endonukleaser. Konstruktion av plasmiden pRK5-HA-CRBN har beskrivits tidigare 8 . Båda rekombinanta plasmiderna användes för ytterligare studier. Hela nukleotidsekvensen bekräftades genom DNA-sekvensering.

Cellodling och transfektion

SH-SY5Y-cellinjen, en dopaminerg mänsklig neuroblastomcellinje, hölls i Dulbeccos modifierade Eagle-medium med låg glukos (DMEM) (Wako, Osaka, Japan) innehållande 10% (v / v) fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin. För konstruktion av stabila cellinjer transfekterades SH-SY5Y-celler med pRK5-HA-CRBN och pcDNA3.1 (Life Technologies) eller pCMV / myc / mito-CRBN med användning av Lipofectamine 2000 Reagent (Life Technologies), enligt tillverkarens instruktioner. Kloner som överlevde i 1, 0 mg / ml G418 isolerades och hölls i DMEM-medium (Wako) kompletterat med 10% FBS innehållande 1, 0 mg / ml G418 vid 37 ° C i 5% CO2. För att hämma proteasomaktivitet behandlades SH-SY5Y-celler med 5 mikrometer MG132 under 12 timmar.

Biokemiska analyser

Totala proteinextrakt framställdes från SH-SY5Y-celler såsom beskrivits tidigare 8 . Subcellulär fraktionering och western blotting utfördes såsom beskrivits tidigare 32 . I korthet homogeniserades cellerna i iskall buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7, 4 / 150 mM NaCl) med proteasinhibitorblandning (Roche, Bazel, Schweiz) med användning av en motordriven Teflon-homogenisator. Homogenater innehållande lika stora mängder protein centrifugerades vid 1 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C för att erhålla en rå kärnpellet och postnukleär supernatant. Den postnukleära supernatanten centrifugerades vid 13 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C för att erhålla den cytoplasmiska fraktionen (supernatanten) och den råa mitokondriella fraktionen (pellet). Supernatanten anses vara en cytoplasmisk fraktion med anrikad i a-tubulin, och den slutliga mitokondriella fraktionen anses vara en mitokondriell fraktion med anrikad i mitokondriens yttre membranprotein Tom20.

Immunofluorescensmikroskopi

För subcellulär lokalisering av HA-CRBN utfördes ett standardprotokoll med användning av MitoTracker Red (Life Technologies) och HA-tag-antikropp, såsom beskrivits tidigare 32 . För subcellulär lokalisering av myc-CRBN med en mitokondriell målsekvens (MTS-CRBN), var cellerna metanolfixade och samfärgade med MitoTracker Red och mus anti-myc antikropp. Fasta celler inkuberades med Alexa488 get-anti-kanin och monterades sedan i VECTASHIELD med DAPI (Life Technologies) för avbildning. Bilder av dessa prover erhölls genom konfokal mikroskopi (FV1000; Olympus, Tokyo, Japan).

Kvantifiering av mitokondriell morfologi

Fyra μm tjocka Z-staplar med 7–8 skivor för varje bild förvärvades och tredimensionella projektioner genererades av fluorescensmikroskopi (BZ-X700; Keyence, Osaka, Japan). För att kvantifiera parametrar för mitokondriell morfologi inverterades de förvärvade bilderna som svarta pixlar och en tröskel applicerades med användning av NIH ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) för att optimalt lösa individuella mitokondrier. Mitokondrier beskrivs med hjälp av funktionen "analysera partiklar". Cirkularitet och förhållandet mellan area / perimeter användes som ett mått på mitokondriell förlängning respektive samtrafik.

Mitokondriell membranpotentialanalys

Mitokondriell membranpotential bestämdes med användning av JC-1 (Life Technologies). Celler odlades i plattor med 96 brunnar och inkuberades med JC-1 under 30 minuter. Fluorescensemissionskiftet från grönt (529 nm) till rött (590 nm) mättes och membranpotentialen representerade som det röda / gröna fluorescensintensitetsförhållandet.

Proteolytisk aktivitetsanalys

Proteolytiska aktiviteter analyserades med användning av FITC-kasein (Sigma Aldrich) som ett substrat enligt en tidigare publicerad metod 31 med mindre modifieringar. Rå mitokondria-fraktioner bereddes som tidigare beskrivits 32, och mitokondriell pellet suspenderades med 100 | il buffert (50 mM Tris / HCl, pH 7, 9, 10 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, 0, 05% Triton X-100). Proteinkoncentrationen bestämdes med BCA-proteinanalys (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), och samma innehåll av mitokondriella fraktioner (50–100 μg) användes för ytterligare experiment. 5 ug FITC-kasein sattes till mitokondriell suspension. Fluorescens mättes med excitations / emission våglängder av 495/515 nm.

Cellviabilitetsanalys

Cellviabilitet bestämdes med användning av CellTiter 96 ® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay-kit (Promega, Madison, WI, USA), enligt tillverkarens instruktioner. För cytotoxicitetsanalys användes CytoTox 96 ® icke-radioaktiv cytotoxicitetsanalys (Promega) enligt tillverkarens anvisningar.

RNA-extraktion och kvantitativ omvänd transkriptions-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR)

Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) och ReverTra Ace ® qPCR RT Kit (TOYOBO) användes för extraktion av total RNA från SH-SY5Y-celler och cDNA-syntes för qRT-PCR, enligt tillverkarnas instruktioner respektive. qRT-PCR-experiment utfördes med användning av Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO) på StepOne Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Följande primrar användes för CRBN-amplifiering: CRBN: 5'-CAGTCTGCCGACATCACATAC-3 'och 5'-GCACCATACTGACTTCTTGAGGG-3'. Följande primrar användes för humant Lon-proteas och Actin-amplifiering, såsom beskrivits tidigare 28 . Lon: 5'-ATGGAGGACGTCAAGAAACG-3 'och 5'-GATCTCAGCCACGTCAGTCA-3'; aktin: 5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3 ′ och 5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3 ′.

Statistisk analys

I alla experiment uttrycktes data som medelvärde ± SD från tre till fem oberoende experiment. Data analyserades med hjälp av studentens t- test, och skillnader mellan prover ansågs statistiskt signifikanta när p <0, 05.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Kataoka, K. et al . Mitokondriell cereblon fungerar som ett proteas av Lon-typ. Sci. Rep. 6, 29986; doi: 10.1038 / srep29986 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.