Mirna-210 modulerar en nickelinducerad cellulär energimetabolismförskjutning genom att undertrycka järn-svavelklustermonteringsproteinerna iscu1 / 2 i neuro-2a-celler | celldöd och sjukdom

Mirna-210 modulerar en nickelinducerad cellulär energimetabolismförskjutning genom att undertrycka järn-svavelklustermonteringsproteinerna iscu1 / 2 i neuro-2a-celler | celldöd och sjukdom

Anonim

ämnen

  • Energi metabolism
  • miRNA
  • Neurotoxicitetssyndrom

Abstrakt

Den cellulära energimetabolismförändringen, kännetecknad av hämningen av oxidativ fosforylering (OXPHOS) och förbättring av glykolys, är involverad i nickelinducerad neurotoxicitet. MicroRNA-210 (miR-210) regleras av hypoxiinducerbar transkriptionsfaktor-1 a (HIF- 1a ) under hypoxiska förhållanden och kontrollerar mitokondriell energimetabolism genom att undertrycka järn-svavelklustermonteringsproteinet (ISCU1 / 2). ISCU1 / 2 underlättar sammansättningen av järn-svavelkluster (ISC), de protetiska grupperna som är kritiska för mitokondriella oxidationsreduktionsreaktioner. Denna studie syftade till att undersöka om miR-210 modulerar förändringar i energimetabolismen efter nickelexponering genom att undertrycka ISCU1 / 2 och inaktivera ISC-innehållande metaboliska enzymer. Vi bestämde att NiCl2-exponering leder till en signifikant ansamling av HIF-1 a , snarare än HIF-1 P , i Neuro-2a-celler. Överuttrycket miR-210 och ISCU1 / 2-nedregleringen observerades på ett dos- och tidsberoende sätt. Analyserna av funktionsförstärkning och dysfunktionsförlust avslöjade att miR-210 förmedlade ISCU1 / 2-undertrycket, förändringar av energimetabolism och inaktivering av metaboliskt enzym inaktivering efter nickel. Dessutom var påverkan av miR-210 på ISC-innehållande metaboliska enzymer oberoende av cellulär järnreglering. Sammantaget tyder dessa data på att repression av miR-210 på ISCU1 / 2 kan bidra till HIF-1 a- utökade förändringar i energimetabolismen efter nickelexponering. En bättre förståelse av hur nickel påverkar cellulär energimetabolism kan underlätta belysningen av mekanismerna genom vilka nickel påverkar människors hälsa.

Huvudsaklig

Nickelföreningar är allmänt spridda miljöföroreningar och är farliga för folkhälsan. 1 Även om den exakta mekanismen för Ni-inducerad toxicitet inte är okänd, tyder ökande bevis på att de hypoxi-mimiska responserna, som främst medieras av hypoxi-inducerbar faktor- 1a (HIF- 1a ), kan bidra till de negativa effekterna av Ni på människokroppen. 2, 3 Aktiveringen av HIF-1 a -målgener, inklusive plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1), vaskulär endotelväxtfaktor (VEGF) och CXC-kemokin, är involverade i Ni-damminducerade fibrotiska lungstörningar. 4, 5 HIF-1 a- beroende uppreglering av IL-6 i humana primära endotelceller inträffar vid Ni-kontaktallergiska reaktioner. 6 Dessutom kan HIF-1 a- reglerad angiogenes och gendämpning bidra till Ni-inducerad karcinogenes. 2 Ytterligare undersökningar av Ni-inducerade hypoximimiska svar kan belysa mekanismerna för Ni-toxicitet hos människor.

Förändringarna av energimetabolismen, kännetecknad av förtrycket av tricarboxylsyracykeln (TCA), mitokondriell elektrontransport och oxidativ fosforylering (OXPHOS), men förbättringen av glykolys, är typiska anpassningsbara svar under hypoxiinducerad stress. 7 Intressant nog är dessa förändringar HIF-1 a beroende och uppstår under normoxiska förhållanden om cellulär HIF-1 a stabiliseras av kemiska medel. 8, 9 Även om den metaboliska förändringen gynnar resistens och överlevnad av celler under hypoxiska förhållanden, bidrar denna förskjutning till Ni: s skadliga effekter. Chen och Costa 11 rapporterade att Ni minskar aktiviteten hos cellulära järninnehållande enzymer, hämmar OXPHOS och ökar cellulär glykolytisk aktivitet. Den inducerbara anpassningsförmågan hos celler under hypoxiska förhållanden underlättar deras maligna transformation efter kronisk exponering för Ni. 2 Dessutom leder energiförsörjningen till dysfunktion hos vävnader med stort energibehov, inklusive nervsystemet. I vår tidigare studie resulterade intag av lösliga Ni-föreningar i möss i störningen av aerob metabolism åtföljd av neurobeteende förändringar. 12 Därför är undersökning av förhållandet mellan HIF-1 a- stabilisering och förändring av energimetabolism en idealisk strategi för att belysa mekanismen för Ni-toxicitet.

Endogena mikroRNA-molekyler (miRNA) är viktiga mediatorer för många cellulära processer, inklusive svaret på hypoxi. 13 MicroRNA-210 (miR-210), som induceras av HIF-1 a under hypoxi, är en av de mest hypoxikänsliga miRNA: er och är en ideal faktor som modulerar hypoxiasvaret. 14 Nyligen genomförda studier har undersökt förtryckningen av miR-210 på järn-svavelkluster (ISC) -monteringsproteiner, ISCU1 och ISCU2, vars 3′-otranslaterade region (UTR) förutsägs innehålla ett mycket bevarat bindningsställe för miR-210. 15, 16 I däggdjursceller ligger ISCU1 i cytosolen, medan ISCU2 är belägen i mitokondrierna. ISCU1 / 2 är en nyckelperson för montering av cellulära ISC: er och transport till enzymer som ansvarar för mitokondriell andning och energiproduktion. 17 Dessa enzymer inkluderar akonitas, som är integrerat i TCA-cykeln, och de mitokondriella andningsorganen (komplexen I, II och III), som medierar mitokondriell elektrontransport. Därför leder undertrycket av ISCU1 / 2 till inaktivering av ISC-innehållande enzymer genom ISC-metabolisk störning och hämmar slutligen mitokondriell andning. Regleringsaxeln innefattande HIF- 1a , miR-210 och ISCU1 / 2 förmedlar de mitokondriella energimetabolismprocesserna som svarar på hypoxi i olika celltyper. 18, 19, 20, 21 Jämfört med hypoxi kan Ni-exponering störa cellulär järnhomeostas som är avgörande för metabolism av ISC: er. 22 Utvärderingen av om modifieringen av cellulära järntillstånd är involverad i Ni-medierade metaboliska händelser är av intresse.

Därför syftade den här studien till att undersöka om förtrycket av miRNA-210 på ISCU1 / 2 ligger till grund för en Ni-inducerad energimetabolismförändring. Ni-medierad miR-210-uppreglering förtryckte uttrycket av ISCU1 / 2, hämmade de typiska ISC-enzymerna och skiftade nedströms mitokondriell metabolism. Våra resultat indikerar att miR-210 är väsentlig och tillräcklig för att modulera de cellulära energimetabolismförändringar som induceras av Ni.

Resultat

Ni inducerar HIF-1 a- stabilisering och miR-210-expression

Uttryck av HIF och miR-210 inducerade genom NiCl2-behandlingar undersöktes i Neuro-2a-celler. Celler exponerades för olika koncentrationer av NiCl2 (0, 0, 25, 0, 5 och 1 mM) under 4 timmar eller 1 mM NiCl2 under olika tidsperioder (0, 2, 4 och 8 timmar). Western blot-analys avslöjade att Ni-behandling resulterade i uppenbar stabilisering av HIF-1 a men ändrade inte uttrycket av HIF-1 ß (figurerna la och b). Ni-inducerat överuttryck av miR-210, identifierat med qRT-PCR-analys, observerades på dos- och tidsberoende sätt (figur 1c och d). Dessutom ökade de etablerade medlen som stabiliserade HIF-1a, deferoxamin (DFX) och CoCl2, uttryckt miR-210 efter 4 timmars behandling i Neuro-2a-celler, såsom presenterades i figur 1e.

Nickel inducerar HIF-1 a- stabilisering och miR-210-expression. ( a och b ) HIF-1 a- och HIF-1 p- proteinnivåerna detekterades med Western blot efter olika NiCl2-behandlingar. De nickelinducerade HIF-1 a- stabiliseringarna indikeras genom kvantifiering av Western blot-bandintensitet och typiska bilder. ( c och d ) MiR-210-uttrycket efter olika NiCl2-behandlingar analyserades med qRT-PCR. Den nickelinducerade uppregleringen av miR-210 är både dos- och tidsberoende. ( e ) De väletablerade medlen som stabiliserade cellulär HIF- 1a , DFX och CoCl2, ökade också expression av miR-210 efter 4 timmars behandling. Felfältet återspeglar SEM för minst tre oberoende experiment. * P <0, 05 jämfört med kontrollen

Bild i full storlek

Ni-inducerad miR-210-uttryck förtrycker ISCU1 / 2-proteinnivåer

Protein- och transkriptnivåerna för ISCU1 / 2 i celler med olika NiCl2-behandlingar undersöktes. Proteinnivåerna för ISCU1 / 2 minskade på dos- och tidsberoende sätt i celler som exponerades för NiCl2 (figurerna 2a och b). Den Ni-inducerade aktiveringen av HIF-1 a / miR210 / ISCU-reguleringsaxeln, som förkroppsligades som en stabilisering av HIF- 1a , ett överuttryck av miR210 och ett förtryck av ISCU, identifierades i olika celler (tilläggsfigurerna 1, 2 och 3). Transkriptionsnivåerna för ISCU1 / 2 var inte signifikant olika mellan celler med olika NiCl2-behandlingar (figur 2c och d). För att bestämma om ISCU1 / 2 reglerades av miR-210, vildtypen och mutanten (71–77 ACGCACA muterade till AGCGAGA) former av den förutsagda målplatsen i 3 in-UTR av ISCU1 / 2 (//www.targetscan .org / mmu_61 /) klonades in i luciferasreportergenvektorer. Transfektionen av miR-210 efterliknade undertryckte aktiviteten hos luciferas som interagerade med den vilda typen av miR-210 som förutspåddes målplats. Emellertid förändrade den miR-210-mimiska transfektionen inte aktiviteten hos luciferas som interagerade med det mutanta målstället (figur 2e). Dessa resultat verifierade att miR-210 reglerar uttrycket av ISCU1 / 2 genom att binda till det förutsagda målstället i 3′-UTR för ISCU1 / 2. Analysen av proteinnivå i celler som transfekterades med miR-210-mimiken eller hämmaren utfördes för att ytterligare fastställa att ISCU1 / 2 var nedströmsmålet för miR-210. Under icke-Ni-exponeringsförhållanden undertryckte transfektionen av miR-210-mimik (betecknad som M) ISCU1 / 2-proteinnivån jämfört med den för mimic-control (MC). Under Ni-exponeringsförhållanden (1 mM under 4 timmar) dämpade transfektionen av miR-210-hämmaren (I) dessutom den Ni-inducerade ISCU1 / 2-nedregleringen jämfört med den för inhibitor-kontrollen (IC, figur 2f).

Nickelinducerat miR-210-uttryck undertrycker nivån av ISCU1 / 2-protein. ( a och b ) ISCU1 / 2-proteinnivåerna minskade efter olika NiCl2-behandlingar. ( c och d ) Transkriptionsnivåerna för ISCU1 / 2 förändras inte under några exponeringsförhållanden för nickel. ( e ) Effekten av miR-210 på ISCU1 / 2 bedömdes med användning av luciferasreporteranalysen. Minskningen av luciferasaktiviteten i celler som samtransfekterades med vildtypen ISCU1 / 2 3′-UTR innehållande konstruktioner och mim-miR-210 indikerade att ISCU1 / 2 var en målgen för miR-210. ( f ) Western blotting avslöjade effekterna av miR-210-imitering eller hämmartransfektion på ISCU1 / 2-proteinnivåerna. ISCU1 / 2 förtrycks av miR-210-mimik jämfört med mimikontrollen (de två vänstra körfälten). Under nickelexponering bibehåller hämningen av miR-210 bättre nivån på ISCU1 / 2 jämfört med hämmarkontrollen (de två mellersta fälten). Effekten av nickel på ISCU1 / 2-nivån utvärderades också i icke-transfekterade celler (de två högra banorna). Förkortningarna M, MC, I och IC indikerar transfektion av respektive miR-210-mimik, mimic-control, miR-210-inhibitor och inhibitor-control. Skylten '+' indikerar behandlingen av 1 mM NiCl2 under 4 timmar, och skylten '-' indikerar motsvarande skambehandling. Felfältet återspeglar SEM för minst tre oberoende experiment. * P <0, 05 jämfört med kontrollen

Bild i full storlek

Ni-inducerad miR-210-uttryck modulerar förändringen av energimetabolismen

Den Ni-inducerade förändringen av energimetabolism, kännetecknad av hämning av OXPHOS och ökning av glykolys, spelar viktiga roller i Ni-medierad neurotoxicitet och karcinogenes. I vår studie var livskraften hos Neuro-2a-celler som behandlades med 1 mM NiCl2, 10 mM 2-deoxy-D-glukos (2-DG) eller 25 μM bromopyruvic acid (BrPA) motsvarande kontrollnivåer. Emellertid resulterade Ni-exponering i kombination med 2-DG eller BrPA, som båda är hämmare av glykolys, i betydande cytotoxicitet i Neuro-2a-celler (figur 3a). Cellerna exponerade för 1 mM NiCl2 under 4 timmar manifesterade också en låg syreförbrukningshastighet (OCR) (figur 3b). För att bekräfta att den Ni-inducerade energimetabolismskiftet modulerades genom miR-210-uttryck undersökte vi energimetabolismtillståndet för celler som transfekterades med miR-210-mimik eller hämmare och behandlades med NiCl2. Kvantifieringarna av OCR avslöjade att syreförbrukningen inhiberades i celler som transfekterades med miR-210-mimik eller behandlades med NiCl2. Transfektionen av miR-210-hämmare underlättade undertrycket av Ni vid syreförbrukning (figur 3c). Transfektionen av miR-210-efterliknande reducerade koncentrationen av cellulärt adenosin-5'-trifosfat (ATP) under icke-Ni-förhållanden, medan hämning av miR-210 dämpade ATP-utarmningen orsakad av Ni (figur 3d). Hexokinase (HK) är det viktigaste enzymet i glykolys, och en ökning av HK-aktiviteten indikerar förbättringen av glykolys. Transfektion av efterliknande av miR-210 förbättrade aktiviteten hos HK under icke-NiCl2-förhållanden, medan hämning av miR-210 minskade HK-aktivitetsökningen orsakad av Ni (figur 3e). Transfektion av mimic-miR-210 ökade innehållet i cellulär mjölksyra, slutprodukten av glykolys, medan hämningen av miR-210 dämpade mjölksyraansamlingen orsakad av Ni (figur 3f).

Nickel-inducerad miR-210-uttryck modulerar förändringen av energimetabolismen. ( a ) Cellviabilitet bestämdes med CCK8-analysen efter nickelbehandling. Hämmare av glykolys, 2-DG (10 mM) eller BrPA (25 μM ), förvärrar nikkelens cytotoxicitet. ( b ) En representativ syreförbrukningskurva som baseras på realtidsdetekterat partiellt syretryck (mmHg) som omger cellerna indikerar undertryckningen av nickel på cellulär syreförbrukning. ( c ) Transfektion av miR-210-mimik reducerar syreförbrukningstakten (OCR) för celler under icke-NiCl2-förhållanden, och hämning av miR-210 underlättar förtrycket av syreförbrukningstakten orsakad av nickelexponering. ( d ) Transfektion av miR-210-mimik reducerar koncentrationen av cellulärt ATP under icke-NiCl2-tillstånd, och hämning av miR-210 dämpar ATP-utarmningen orsakad av nickelexponering. ( e ) Aktiviteten för hexokinas (HK) mättes baserat på de kopplade reaktionerna av HK och 6-fosfoglukosdehydrogenas och återspeglades genom förändringen av den optiska densiteten vid 340 nm (ΔmOD 340 / min / mg) för att mäta alstring av NADPH. Transfektionen av miR-210 efterliknar förbättrar aktiviteten hos HK under icke-NiCl2-förhållanden, och hämning av miR-210 mildrar HK-aktivitetsökningen orsakad av exponering av nickel. ( f ) Transfektion av miR-210-mimik ökar halten cellulär mjölksyra under icke-NiCl2-förhållanden, och hämning av miR-210 dämpar mjölksyraansamlingen orsakad av exponering av nickel. Förkortningarna M, MC, I och IC indikerar transfektion av respektive miR-210-mimik, mimic-control, miR-210-inhibitor och inhibitor-control. Skylten '+' indikerar behandlingen av 1 mM NiCl2 under 4 timmar, och skylten '-' indikerar motsvarande skambehandling. Felfältet återspeglar SEM för minst tre oberoende experiment. * P <0, 05 jämfört med kontrollen

Bild i full storlek

Ni-inducerat miR-210-uttryck hämmar de ISC-innehållande metaboliska enzymer

Aktiviteten hos två typiska ISC-beroende metaboliska enzymer, aconitas och komplex I, i celler transfekterade med miR-210-mimik och hämmare mättes. Transfektionen av miR-210-efterliknande undertryckte aktiviteten för dessa två enzymer under icke-Ni-förhållanden, medan hämning av miR-210 dämpade undertrycket av enzymer orsakade av Ni. Vidare förändrade transfektionen eller behandlingen inte proteinnivån för den representativa komponenten i aconitas (ACO2) eller komplex I (NDUFA9), såsom visas i figurerna 4c och d.

Nickelinducerat miR-210-uttryck hämmar de ISC-innehållande metaboliska enzymer. ( a och b ) Aconitas och komplex I-aktivitet hos celler transfekterade med miR-210-mimik eller hämmare mättes med användning av en spektrofotometrisk metod och uttrycktes som IMOD 340 / min / mg protein. ( c och d ) De representativa banden genom western blot-analys presenteras för att demonstrera proteinnivåerna av aconitas (ACO-2) eller komplex I (NDUFA9) efter lämpliga behandlingar. Förkortningarna M, MC, I och IC indikerar transfektion av respektive miR-210-mimik, mimic-control, miR-210-inhibitor och inhibitor-control. Skylten '+' indikerar behandling med 1 mM NiCl2 under 4 timmar, och skylten '-' indikerar motsvarande skambehandling. Felfältet återspeglar SEM för minst tre oberoende experiment. * P <0, 05 jämfört med kontrollen

Bild i full storlek

Behandling med 1 mM NiCl2 under 4 timmar stör inte cellularjärnhomeostas

För att bestämma om den Ni-medierade ISC-innehållande enzymundertrycket hänför sig till den Ni-orsakade järnhomeostasstörningen undersöktes järnmetabolismtillstånden hos celler exponerade för 1 mM NiCl2 under olika tider. En signifikant minskning av cellulära järnjoner återfinns endast i 8 timmars exponeringsgrupper (figur 5a). Nivåerna av totalt ferritinprotein, den huvudsakliga formen av lagrat järn i celler, analyserades med Western blot efter Ni-behandling. NiCl2-exponering under 2 eller 4 timmar reducerade inte cellulära ferritinnivåer. Emellertid minskades nivån av ferritin i celler som exponerades för Ni under 8 timmar (figur 5b). Överuttrycket av transferrinreceptorn (TfR), ett viktigt cellulärt svar under järnbristförhållanden, observerades endast i celler exponerade för NiCl2 under 8 timmar (figur 5c).

Nickelbehandlingen innehållande 1 mM NiCl2 utsatt för celler under 4 timmar stör inte cellulär homeostas. ( a ) Cellulära järn (järn och järn) joner mättes med Iron Assay Kit efter exponering för 1 mM NiCl2 under olika tidsperioder (0, 2, 4 och 8 timmar). En signifikant minskning av cellulära järnjoner hittades endast i 8 timmars exponeringsgrupper. ( b ) Proteinhalterna av total ferritin i celler som behandlades med 1 mM NiCl2 under 0, 2, 4 och 8 timmar analyserades med western blot. Exponering för 1 mM NiCl2 under 0, 2 eller 4 timmar förändrar inte den cellulära ferritinnivån. ( c ) Transkriptionsnivåerna för transferrinreceptorn (TfR), TfRl och TfR2, undersöktes med qRT-PCR efter 1 mM NiCl2-exponering i celler under 0, 2, 4 och 8 timmar. Överuttrycket av dessa två gener hittades endast i 8 timmars exponeringsgrupper. Felstegen återspeglar SEM för minst tre oberoende experiment. * P <0, 05 jämfört med kontrollen

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie inducerade behandling med 1 mM NiCl2 under 4 timmar HIF-1 a- stabilisering, överuttryck av miR-210, ISCU1 / 2-proteinreduktion, energimetabolismförändringar och ISC-innehållande metaboliskt enzymundertryckande i Neuro-2a-celler. Även om Ni-nivåerna i vår studie troligen inte uppnås in vivo , används sådana nivåer av Ni-exponering vanligen i in vitro- studie för att undersöka mekanismen för Ni-toxicitet. 23, 24, 25, 26 Vår tidigare studie avslöjade att 1 mM NiCl2-exponering under mer än 12 timmar gav uppenbar cytotoxicitet och mitokondriell dysfunktion i Neuro-2a-celler. 27 Eftersom energimetabolism spelar en viktig roll i fysiologiska processer i hjärnan, kan utredning av energimetabolismförändringar innan celldöd inträffar bidra till att belysa mekanismerna för Ni-inducerad neurotoxicitet.

I likhet med hypoxi undertrycker Ni också aktiviteten för prolylhydroxylas och stör störningen av HIF- 1a . Flera studier avslöjade att korta (2-6 timmar) exponeringar för Ni orsakade ackumulering av HIF-1 a i olika typer av celler och utlöste HIF-1 α- modulerande hypoxi-mimiska svar. 5, 28, 29 Därför tillämpas bevisen på cellulära svar på hypoxi för att förklara Ni: s hälsoeffekter. Upplysningen av miR-210, en HIF-1 a- kontrollerad mikroRNA, klargör i huvudsak naturen hos de olika cellulära responserna på hypoxi. 9, 30 MiR-210 riktar sig mot receptortyrosinkinasliganden EphrinA3 (EFNA3), vilket förbättrar differentieringen av endotelceller från humana navelstrålar och främjar angiogenes i hypoxi. 31, 32 Dessutom deltar hypoxiainducerad miR-210 i cellcykelreglering genom att modulera sina målgener, MNT, en känd MYC-antagonist och E2F3, ett viktigt protein i cellcykelreglering. 33, 34 Under syre / glukosförhållanden undertrycker den överuttryckta miR-210 uttrycket av Bcl-2 och förstärker apoptos av Neuro-2a-celler. 35 I vår studie observerades HIF-1 a- stabilisering och mi-210 överuttryck inducerat av NiCl2 på dos- och tidsberoende sätt. Dessutom ökade CoCl2 och DFX, de väletablerade hypoximimiska föreningarna uttrycket av miR-210. Därför kan miR-210 bidra till de kemiska hypoxisvaren, utöver det låga syreinnehållet.

Skiftet om energimetabolism är ett viktigt cellulärt svar på hypoxi. När syre är rikligt genereras cellulärt ATP primärt genom OXPHOS som genererar 32 mol ATP från 1 mol glukos. Under hypoxiska förhållanden undertrycks OXPHOS och cellulär energiproduktion flyttas till den glykolytiska vägen som endast genererar 2 mol ATP från 1 mol glukos. Även om glykolys inte är ekonomiskt för ATP-generering, ger den det minsta energitillskottet för cellöverlevnad under hypoxiska förhållanden. 36 Nyligen har energimetabolskiftet som regleras av HIF-1 α -miR-210-ISCU1 / 2-vägen visat sig delta i flera hypoxi-relaterade fysiologiska och patologiska processer. 18, 21 I vår studie resulterade Ni-exponering i nedregleringen av ISCU1 / 2-proteinnivåer, som var kopplad till förändringarna i HIF- 1a och miR-210. Resultaten av reportergenanalysen för det förutsagda bindningsstället för miR-210 på ISCU1 / 2 och western blot-analysen av ISCU1 / 2-proteinnivåer efter transfektion av miR-210 stödde ytterligare att ISCU1 / 2 reglerades av miR-210 vid Ni-exponering betingelser. Avsaknaden av förändring i ISCU1 / 2-mRNA-nivåer efter Ni-exponering avslöjade de post-transkriptionella regulatoriska effekterna av miR-210 på ISCU1 / 2. 15 Dessutom var aktiveringen av HIF-1 a / miR-210 / ISCU1 / 2-regleringsvägen universal i olika Ni-behandlade celler. Nedströmseffekterna av denna regleringsväg kan ligga till grund för det Ni-medierade hypoxi-mimiska svaret.

Energimetabolismskiftet, kännetecknat av glykolysförbättring under normoxiska förhållanden, anses vara involverat i toxiciteten för Ni. I det centrala nervsystemet resulterade Ni-medierad hämning av OXPHOS i energitillskottsstress. 12 Hämning av glykolys med 2-DG eller BrPA ökade cytotoxiciteten för NiCl2 i Neuro-2a-celler i den aktuella studien. Dessutom är den cellulära fenotypen av föredragen glykolytisk energiproduktion, känd som Warburg-effekten, inblandad i karcinogenesen av Ni. 2 Förklaringen av Ni-effekterna på cellulär energimetabolism kan vara viktig för att studera Ni-toxicitet. Vi fann att miR-210 var en väsentlig modulator för Ni-inducerad energimetabolismförskjutning, vilket resulterade i minskad syreförbrukning, ATP-underskott, förändring av HK-aktivitet och ansamling av mjölksyra. Nyckelenzymerna för OXPHOS, akonitas för Krebs-cykeln och komplex I för mitokondriell elektronöverföring, dämpades av miR-210 utan en proteinnivåändring av deras komponentelement. Det betyder att inaktiveringen av dessa enzymer står för ISC-underskottet snarare än hämningen av proteinuttryck. Därför ger repressionen av miR-210 på ISCU1 / 2 och nedströms ISC-beroende metaboliska enzymer en logisk förklaring till HIF-1 a- stabiliseringen och energimetabolismskift, som båda observeras under olika Ni-exponeringsförhållanden. 11, 29 Dessutom kan brister i ISC-innehållande metabola enzymer tillskriva generering av reaktiva syresorter (ROS) och mitokondriadysfunktion, genom vilken Ni inducerade signifikant cytotoxicitet i nervceller, som tidigare rapporterats. 27, 37 Förutom Ni inducerar andra tungmetaller, inklusive kobolt, mangan och vanadin, HIF-1 a- stabilisering. 28 Därför kan den funktionella studien av miR-210 vara värdefull för att belysa toxicitet för tungmetaller.

I motsats till förhållanden med låga syre kan det hypoximimiska svar som induceras av Ni åtföljas av förändringar av cellulära järnnivåer. Som tidigare rapporterats, kan Ni tävla med järn för divalent metalltransporter-1 (DMT1) och störa cellulär homeostas. 22, 38 Eftersom cellulära järnnivåer är direkt kopplade till sammansättningen av ISC: er och ISC-beroende enzymaktivitet, bör inte Ni: s inflytande på cellulära järnnivåer uteslutas. Baserat på våra resultat att cellexponering för 1 mM NiCl2 under 4 timmar emellertid inte störde cellulär homeostas, drog vi slutsatsen att miR-210-medierad undertryckning av ISC-innehållande metaboliska enzymer var oberoende av cellulär järnreglering i tidsramen våra Ni-behandlingar. Costa och kollegor 38 har rapporterat effekterna av NiCl 2 på cellulär järnreglering. I deras studie uppstod en serie betydande förändringar som återspeglar aktiveringen av cellulär järnreglering 6–8 timmar efter Ni-exponering, vilket var förenligt med resultaten från vår studie. Endast förändringen i cellulärt järninnehåll efter 4 timmars exponering av Ni var olika mellan de två studierna som kan tillskrivas användningen av olika cellinjer eller metoder för bestämning av järninnehåll. Det verkar som om miR-210 modulerade energimetabolismskiftet före obalans i järnhomeostas. Ytterligare studier behövs för att identifiera de specifika bidragen från dessa mekanismer till toxiciteten för Ni.

Sammanfattningsvis antyder våra resultat att HIF-1 a- kontrollerande mikroRNA, miR-210, modulerade cellulär energimetabolismskiftet genom att undertrycka ISCU1 / 2 efter Ni-exponering. Eftersom energimetabolismen är kritisk i centrala nervsystemet ger våra resultat insikt i förståelsen av Ni-medierad neurotoxicitet. Vidare kan förmågan hos miR-210 att reglera hypoxi-mimisk respons genom att binda till målgener utnyttjas för att belysa hälsoeffekterna av en mängd tungmetaller som inducerar HIF-1 a- stabilisering.

Material och metoder

Cellkultur och behandlingar

Mus-neuroblastomcellinjer (Neuro-2a), erhållna från Institute of Biochemistry and Cell Biology (Chinese Academy of Science, Shanghai, Kina), odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS, HyClone, Logan, UT, USA) och 1% v / v penicillin / streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i en 5% CO 2 -fuktad atmosfär vid 37 ° C. En 1 M stamlösning av Ni-klorid (NiCl2 · 6H20, Sigma-Aldrich) framställdes med steril H20 och späddes till lämpliga koncentrationer för cellbehandling.

Western blot-analys

Från helcellsextrakt upplöstes 40 μg protein med SDS-PAGE och överfördes till ett polyvinylidenfluoridmembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraner undersöktes för olika proteiner med lämpliga primära antikroppar och visualiserades med elektrokemiluminescenssystemet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Bandet avbildades och analyserades med användning av ett ChemiDoc XRS + -system med Image Lab Software (Bio-Rad).

antikroppar

Monoklonal antikropp från mus mot HIF-1 a köptes från Novus Biologs (Littleton, CO, USA). Monoklonala antikroppar från kanin mot HIF-1 P och FTH1 köptes från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Polyklonal antikropp från kanin mot ISCU1 / 2 köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Polyklonal antikropp från kanin mot Aconitase 2 och monoklonal antikropp från mus mot NDUFA9 köptes från Abcam (Cambridge, Storbritannien).

Celltransfektion

MiRNA-imitering (miR10000267) eller hämmare (miR20000267) för celltransfektion köptes från RiboBio (Guangzhou, Kina) och användes enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat, 24 timmar efter cellsådd, ersattes mediet utan penicillin / streptomycin med transfektionsmedium innehållande 100 nM miRNA-mimik eller hämmare och 0, 2% v / v Lipofectamine 2000-transfektionsreagens (Invitrogen). Efter 4 timmar ersattes transfektionsmediet med färskt penicillin / streptomycin frånvarande medium. De övergående transfekterade cellerna uppsamlades efter ytterligare 24 timmars inkubation för ytterligare experiment.

qRT-PCR-analys

Extraktionen av total RNA och kvantifiering av ISCU, TfR1, TfR2 och miR-210 utfördes efter vårt tidigare publicerade protokoll. 27 Bulge-loop miRNA qRT-PCR-primerset (en omvänd transkriptionsprimer och ett par kvantitativa PCR-primrar för varje uppsättning, MQP-0102 och MQP-0201) designades av RiboBio. U6 användes som en intern kontroll för miRNA och p- aktin användes som en intern kontroll för mRNA. Primers som användes i denna studie var följande: ISCU-framåt, 5, -CTCTGCCTGCCGCCTGTG-3 ′ och omvänd, 5′-CTGCTTCTCTGGCTCCTCCTTC-3 ′; TfR1-framåt, 5′-GAGACTACTTCCGTGCTACTTC-3 ′ och bakåt, 5′-TGGAGATACATAGGGCGACAG-3 ′; TfR2-framåt, 5′-AGAGTGGTTGGAGGGCTAC-3 ′ och bakåt, 5′-CAATGAGGCTGACGAGAAGG-3 ′; ß- aktin-framåt, 5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3 ′ och omvänd, 5′-CCTTCTGACCCATTCCCACCATC-3 ′.

Luciferasanalys

3′-UTR-regionerna i ISCU innehållande de förutsagda bindningsställena för miR-210, vilda eller mutanta (71–77 ACGCACA muterade till AGCGAGA), klonades i pmiR-RB-REPORT-vektorer (GUR100509 och GUR100510; RiboBio). Efter samtransfektion med vektorerna och efterliknande av miR-210 mättes brandfly- och Renilla luciferasaktiviteter med användning av Dual-luciferas Reporter Assay (Promega, Madison, WI, USA).

CCK-analys

Celler ympades i en 96-brunnars platta och exponerades för 1 mM NiCl2 under 2 timmar. Därefter tillsattes 2-DG (10 mM) eller BrPA (25 μM ) till det Ni-innehållande mediet och inkuberades under ytterligare 2 timmar. Sedan ersattes mediet i plattan med 96 brunnar med färskt medium innehållande 10% v / v CCK-8-lösning (Dojindo, Kumamoto, Japan) och inkuberades under 2 timmar. Den optiska densiteten (OD) för varje brunn bestämdes vid en våglängd av 450 nm med Infinite M200 Microplate Reader (Tecan, Männedorf, Schweiz). Cellviabilitet rapporteras som en procent av kontrollvärdet.

ATP-analys

ATP-innehållet bestämdes med ATP-bestämningssatsen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Provets luminescens mättes med användning av en Infinite M200 Microplate Reader (Tecan). ATP-standardkurvor fastställdes och ATP-koncentrationerna uttrycktes som nmol / mg protein.

Syreförbrukning

Celler (1 x 105 per brunn) pläterades, transfekterades och exponerades för NiCl2 under 4 timmar före mätning. Hastigheten för syreförändring i media som omger intakta celler mättes med en XF96 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA). OCR för en brunn bestämdes genom att kvantifiera syreberoende förändringar i fluorescens hos ett proprietärt fluoresceinkomplex (pmol / min / brunn).

HK-aktivitetsanalys

Aktiviteten hos HK mättes med användning av Activity of Hexokinase Determination Kit (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina) baserat på en kopplad reaktion av HK och 6-fosfoglukosdehydrogenas. Aktiviteten av hexokinas bestämdes genom alstring av trifoskopyridinnukleotid (NADPH) och mättes som förändring i OD vid 340 nm (ΔOD340) vid 37 ° C under 3 minuter. Aktiviteten för hexokinas uttrycktes som ΔMOD340 / min / mg protein (ΔMOD340 = ΔOD340 / 1000).

Laktatanalys

Det intracellulära laktatinnehållet mättes med användning av Lactate Determination Kit (Nanjing Jiancheng) enligt tillverkarens instruktioner. Standardkurvor fastställdes och laktatkoncentrationerna uttrycktes som μ mol / mg protein.

Akonitas och komplexa I-aktivitetsanalyser

Efter lämplig behandling samlades celler i Eppendorf-rör, återsuspenderades i en hypoton buffert (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2 och 1 mM EGTA, pH 7, 4) och avbröts genom att utföra tio 1-s-pulser med Vibra -Cell ultraljudprocessor (Sonics & Materials, Danbury, CT, USA). De efterföljande bedömningarna av de två typiska ISC-metaboliska enzymerna utfördes enligt det tidigare rapporterade protokollet. 12

Cellulärt järninnehåll

De totala järnjärn (järn och järn) joner mättes med hjälp av Iron Assay Kit (Abcam) enligt tillverkarens anvisningar. Celler ympades i plattor med sex brunnar och exponerades för Ni under olika tidsperioder. Standardkurvor för järnjonerna fastställdes, och det cellulära järninnehållet uttrycktes som nmol per brunn.

Statistisk analys

Värdena uttrycks som medelvärdet ± SEM och analyserades av SPSS (V18.0.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Jämförelser av data avslutades med användning av envägs ANOVA eller parad t- test för att jämföra medel för de olika behandlingsgrupperna. P <0, 05 ansågs statistiskt signifikant.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande legende

Ordlista

OXPHOS

oxidativ fosforylering

miR-210

mikroRNA-210

HIF-1 a

hypoxiainducerbar transkriptionsfaktor-1 a

ISCU1 / 2

järn-svavel kluster montering protein

ISC

järn-svavelkluster

Ni

nickel

TCA

trikarboxylsyra

UTR

oöversatt region

DFX

deferoxamin

2-DG

2-deoxi-D-glukos

BrPA

bromopyruvinsyra

HK

hexokinas

TfR

transferrinreceptor

OD

optisk densitet

ROS

reaktiva syrearter

Kompletterande information åtföljer detta dokument på Cell Death and Disease-webbplatsen (//www.nature.com/cddis)