Migrerande oligodendrocytt stamceller sväller före soma-förflyttning | vetenskapliga rapporter

Migrerande oligodendrocytt stamceller sväller före soma-förflyttning | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biofysiska metoder
  • Biofysik
  • Cell migration
  • Glial förfäder

Abstrakt

Migreringen av oligodendrocytprogenitorceller (OPC) till den vita substansen är ett oumbärligt krav för en intakt hjärnfunktion. Mekanismen för cellmigration i allmänhet är ännu inte helt förstått. Trots det ackumuleras bevis för att förutom den koordinerade omarrangemanget av cytoskeletten, är ett fininstämt samspel av jon- och vattenflöden över cellmembranet väsentligt för cellmigrering. En del av den allmänna hypotesen är att en lokal volymökning mot rörelseriktningen utlöser en mekanoaktiverad kalciuminflöde som reglerar olika procedurer i den bakre änden av en migrerande cell. Här undersökte vi cellvolymförändringar för migrerande OPC med hjälp av skannande jonkonduktansmikroskopi. Vi fann att OPC under accelererad migration genomgår en ökning av den främre cellens kroppsvolym. Dessa fynd kompletteras med tidsförfall kalciumavbildningsdata som antyder en ökning av kalciuminnehållet i den främre delen av cell soma.

Introduktion

Cellmigration spelar en viktig roll i en mängd olika celltyper och är avgörande för organogenes, sårläkning, immunövervakning och bildning av tumörmetastaser. Det regleras av ett komplext samspel av aktin-cytoskelettdynamiken, cell-cell- och cell-substrat-interaktioner, transportörer, jonkanaler och akvaporiner 1, 2, 3 .

Migrerande celler är polariserade längs deras rörelseaxel 4, 5, 6 . I de flesta celltyper består framkanten av lamellipodium, en tunn, bred och mycket rörlig cellförlängning 7 . Cellens bakkant består av cellkroppen som innehåller kärnan. Migrerande celler genomgår förändringar i form som undersökts t.ex. genom ljusmikroskopi i Chinese Hamster Ovary (CHO) och transformerade Madin-Darby hundnjurceller (MDCK-F) celler 8, 9 .

Uppfattningen att lokala volymförändringar åtföljer cellrörlighet utvecklades från undersökningen av jonkanalers och akvaporins roll i cellmigrationen 2, 3 . Ionkanaler reglerar cellvolym 10 och i sin tur reglerar cellvolymen integriteten hos cytoskeletten som polymeriseras i lamellipodiumet och därmed skjuter ut cellen mot dess rörelseriktning 11, 12, 13 . Vidare uppvisade migrerande nasofaryngeala karcinomceller ökad volymreglering jämfört med icke-migrerande celler 14 .

Bland jonkanalerna, transporterare och aquaporiner som är implicerade vid cellmigrering är Na + / H + -jonbytaren NHE1, Cl - / HCO 3- anjonbytaren AE2 och aquaporin AQP1 belägen vid cellfronten i fibroblaster, endotel- och CHO-celler, respektive 15, 16, 17 . Aquaporinerna AQP4 och AQP9 har visat sig förbättra lamellipodial aktivitet i astroglialceller och neutrofila granulocyter 9, 18 och AQP3 har visat sig vara väsentligt för migrering av spermierceller 19 . Tillströmningen av Na + och Cl - genomtransportörer har föreslagits orsaka en lokal ökning av osmotiskt tryck som åtföljs av vatteninflöde genom akvaporiner och därmed lokal cellsvällning 2, 3, 9, 17, 20 . Denna ökning i lokal cellvolym leder till dragkrafter i plasmamembranet som kan aktivera mekanosensitiva Ca 2+ -kanaler. Denna hypotes stöds av upptäckten att vid migrerande keratinocyter och fibroblaster Ca 2+ -inflödet medieras av mekanosensitiva kanaler 21, 22, 23 . Kalciumkanaler av den transienta receptorpotentialen (TRP) superfamilj som aktiveras vid mekanisk stimulering har visat sig förbättra migrations- eller migrationsrelaterade processer i epitelceller, ryggmärgsnervor och hepatoblastomceller 24, 25, 26, 27 . Vidare har det visats att lokala kalciumtransienter medierade av TRP-familjemedlemmet TRPM 7 leder migrationen av humana lungfibroblaster 28 .

Olika rapporter tyder på att distributionen av kalciumkoncentration och dess förändringar spelar en roll i cellmigrationen. I granulatceller, som migrerar på ett saltande sätt, korrelerar graden av kalciumtransienter med migrationshastigheten och en försämring av frekvensen eller amplituden hos transienterna försämrar migrationen 29, 30 . Vid migrering av neutrofiler och fiskkeratocyter har dessutom cykliska förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen observerats 31, 32 . I eosinofiler, fibroblaster och MDCK-F-celler distribueras inte det intracellulära kalciumet enhetligt utan som en gradient med högre Ca2 + -koncentration i cellkroppen 33, 34, 35, 36 . Neutrofiler visar en högre kalciumkoncentration vid sidor med starkare vidhäftning 37 och olika regioner i cellen uppvisar olika sönderfallskinetik för kalciumtransienterna 38 .

Vid den bakre kanten av cellen spelar den kalciumreglerade kaliumkanalen K Ca3.1 en viktig roll i cellmigreringen. Dess blockad bromsar migrationen i epitelceller, melanomceller, fibroblaster och mikroglia 5, 39, 40, 41, 42 . Om intern kalciumsignalering stängs av ökar hela cellvolymen, vilket visas genom cellvolymmätningar av fixerade MDCK-F-celler 24 . Kaliumutflödet, föredraget åtföljt av ett utflöde av klorid, leder till en lokal cellkrympning vid bakkanten av cellen, som detekteras med atomkraftmätningar av levande MDCK-F-celler 43 . Vidare inhiberar även volymaktiverade kloridströmmar migration i gliomceller 44, 45 .

Dessutom bidrar teoretiska överväganden till konceptet att volymförändringar inträffar under cellmigrering. Migrering underlättas av en osmotisk gradient 46 och till och med en enkel modell som utelämnar intracellulär reglering och signalvägar men inkluderar hydrodynamiskt tryck och svullnadspänningar visar den framträdande dynamiken i lamellipodium 47 .

Migreringen av OPC: er har redan undersökts i detalj genom videotidsförfallsmikroskopi. OPC: er rör sig på ett saltutbyte som växlar mellan vilande och rörligt tillstånd med en medelhastighet på 10 μm / h ± 7 μm / h och en maximal hastighet på 120 μm / h till 140 μm / h (båda på poly-L-lysin ) 48 . Det har rapporterats att både ökningar och minskningar av den basala inre kalciumnivån försämrar migrationen av OPC: er 49 och att migrationen korrelerar med interna kalciumtransienter 50 . Vidare reglerar golliproteinerna som reglerar migrationen av OPC: er också uttrycket av TRP-familjemedlemmet TRPC 1 51, vilket föreslås vara en komponent i butiksdrivna kalciumkanaler 52 .

För att testa hypotesen att en ytterligare mekanokänslig komponent spelar en roll under migration undersökte vi först de lokala förändringarna i cellvolym under slumpmässig migrering av OPC.

Cellulära volymförändringar bestämdes med användning av skanningjonskonduktansmikroskopi (SICM), ett verktyg för att undersöka topografin hos icke ledande ytor nedsänkta med elektrolyt på ett kontaktfritt sätt 53, 54 . Denna metod använder förändringen i åtkomstmotstånd som uppstår om en elektrolytfylld glasmikroelektrod närmar sig mot en icke ledande yta för att bestämma topografin hos det skannade objektet. Användningen av SICM på levande celler från bilden har införts genom avbildning av melanocyter och humana koloncancerceller 55, 56 . Sedan dess har SICM tillämpats för att undersöka levande celler i mångfaldsstudier 57, 58 . Volymbestämningar av SICM har validerats med konfokal ljusmikroskopi 59 . Förbättrat av ett backstep-läge gör det möjligt att övervaka lokala volymförändringar av hela cellkroppar 60, 61, 62 samt att spåra migrerande celler 63 och är således ett lovande verktyg för att undersöka lokala volymförändringar i rörliga celler.

Med hjälp av denna metod upptäckte vi nu lokala svullnader i intervallet 15% vid den främre delen av den soma föregick framdrivning av snabbcellskroppar.

Vidare övervakade vi om subcellulärt segregerade Ca 2+ -ändringar kan upptäckas under slumpmässig migrering av OPC: er. Även om kalciumkänsliga färgämnen visade sig vara toxiska under långvariga inspelningar av dessa celler eller visade en tendens att hindra OPC-migration, lyckades vi med att upptäcka subcellulära intracellulära kalciumökningar som var lokaliserade mot rörelseriktningen med mycket små färgkoncentrationer.

Våra resultat visar för första gången att lokala vattenflöden som leder till svullnad av celler och därmed framdrivande av kärnan inträffar under saltbildande cellmigrering av OPC. Observationen av lokalt kalcium ökar ytterligare tips på en mekanokänslig komponent i regleringen av den inre kalciumkoncentrationen under OPC-migration.

Resultat

Volymförändringar av mogna oligodendrocyter

På varandra följande skanningar (totalt 127) erhölls från 21 mogna oligodendrocyter för att undersöka volymfluktuationer i stationära celler. Som ett exempel visas tredimensionella plott av fyra på varandra följande skanningar av en oligodendrocyt i fig. LA. Oligodendrocyten förblev stationär (migrationsavstånd 5 var 0, 4 mikrometer, 0, 5 mikrometer respektive 0, 9 mikrometer, indikerade av tomterna i fig IB) under observationstiden på 39 minuter och endast små förändringar i cellformen inträffade. Motsvarande volymer V och relativa volymer V är avbildade i fig IC. En lätt svullnad är synlig mellan skanningarna 1, 2 och 3 (V1 = 1, 79 pL, V2 = 1, 83 pL och V3 = 1, 93 pL) medan cellen hade krympt tillbaka till 1, 76 pL i den senaste visningen. Följaktligen är den dekadiska logaritmen (lg) för de relativa volymerna (avbildade som de svarta staplarna i fig. 1C) positiv mellan de första tre skanningarna och negativa mellan de två sista skanningarna (lg V r = 0, 01; 0, 02 respektive 0, 04, motsvarande + 2%, + 6% och −9% på linjär skala). Fig. 1D visar histogrammet för de relativa volymerna mellan alla på varandra följande skanningar (logaritmisk skala, n = 106, pappersstorlek 0, 011). Medelvärdet är 0, 00 ± 0, 04 vilket indikerar en konstant medelvolym. Den logaritmiska representationen av den relativa volymen valdes eftersom den matchar en gaussisk fördelning (prickad linje i fig. 1D, R2 = 0, 86; i motsats till detta R = 0, 79 när data planeras i en linjär skala). Vidare skulle applicering av en linjär skala anta samma sannolikhet för att cellen sväller med 100% och krymper med 100%, och försvinner därmed helt. Däremot ger hantering av data med hjälp av en logaritmisk skala lika vikt till en ökning och en minskning av cellvolymen med samma faktor som vi antar vara mer realistisk.

Image

(A, B) Tredimensionella (A) och toppvyer (B) av fyra på varandra följande skanningar av en mogen oligodendrocyt. Skanningar erhölls omedelbart efter att den tidigare skanningen var klar. Sidstegsstorlek var 1 um, vertikalt stegstorlek var 0, 1 um, skanningsstorlek var 30 × 30 um 2, data visade interpolerade av kubiska splines. Grå skala indikerar höjd. Observera att oligodendrocyten förblev stationär (dislokationen uppgick till 0, 4 μm, 0, 5 μm respektive 0, 9 μm). (C) Beräknade absoluta (vita staplar) och relativ volym (svarta staplar, logaritmisk skalad axel till höger, för enklare igenkänningsförändringar i procent indikeras av den lilla gråaxeln) för cellen som visas i (A, B). Cellen svällde något mellan skanningarna 1, 2 och 3, vilket gav positiva relativa volymer och krympte ungefär till volymen för skanning 1 i avsökning 4 vilket gav en motsvarande negativ relativ volym. (D) Histogram av relativa volymer av mogna oligodendrocyter. Stänger representerar räkningar av relativa volymer per fack, pappersstorlek är 0, 011; n = 106 beräkningar av relativ volym mellan två på varandra följande skanningar erhållna från 21 olika celler. Observera att fack representerar relativ volym i en logaritmisk skala. Medelvärde är 0, 00 ± 0, 04 (SD). Prickad linje indikerar en gaussisk anpassning till data, R = 0, 86.

Bild i full storlek

Det genomsnittliga migrationsavståndet mellan två på varandra följande skanningar uppgick till 0, 56 μm ± 1, 18 μm. Detta är under den laterala upplösningen av genomsökningarna 64, vilket indikerar att mogna oligodendrocyter upprätthåller stationära.

Volymförändringar av oligodendrocyt-stamceller

161 par på varandra följande skanningar erhölls från 33 olika OPC: er. En sammanfattning av analysen av hastighets- och volymförändringar visas i fig. 2. Histogrammet för hastighetsfördelningen visas i fig. 2A, pappersstorleken är 1 μm / h; n = 161. Medelhastigheten uppgick till 5, 6 μm / h ± 5, 1 μm / h, de fastställda maximala och minimihastigheterna uppgick till 30, 03 μm / h respektive 0, 17 μm / h.

Image

(A) Histogram för hastigheterna bestämda från SICM-skanningar (se avsnittet Material och metoder, pappersstorlek 1 μm / h; n = 161 bestämningar från 33 olika celler; medelhastighet: 5, 6 μm / h ± 5, 1 μm / h (SD), minsta och maximala hastigheter: 0, 17 μm / h respektive 30, 03 μm / h). (B) Histogram för relativa volymmätningar av OPC: er. Stänger representerar räkningar av relativ volym per fack, pappersstorlek är 0, 011 (som i fig. 1D), fack representerar relativa volymer i en logaritmisk skala. Medelvärde: 0, 00 ± 0, 07 (SD). Streckad linje indikerar en gaussisk anpassning till data, R = 0, 93. (C) Normaliserade anpassningar till de relativa volymerna av vuxna oligodendrocyter (OL, streckad linje, se fig. 1D) och OPC: er (streckad linje, se B) på samma x- skala. (D) Medelhastigheter för cellerna klassificerade som rörliga och icke-rörliga. Rörelse: v > 6, 5 μm / h, vilket ger 30% rörliga celler. Felfält indikerar ± SD. (E) Histogram av relativa volymer av icke-rörliga (grå staplar, n = 112) och rörliga (vita staplar, n = 49) celler. Pappersstorlek 0, 05, relativ volym visad i logaritmisk skala. Medelvärden: 0, 02 ± 0, 10 respektive 0, 00 ± 0, 05 för rörliga respektive icke-rörliga celler. Prickade linjer indikerar en gaussisk anpassning till respektive data. R 2 = 0, 98 för båda passningarna.

Bild i full storlek

Histogrammet för de relativa volymerna (ritade i en logaritmisk skala) visas i fig. 2B med en pappersstorlek av 0, 011 som i fig. 1D. Medelvärdet var 0, 00 ± 0, 07. Fördelningarna av de relativa volymerna av OPC: er (streckad linje) och vuxna oligodendroctyes (OL: er, prickad linje) planeras i fig. 2C, vilket tydligt visar de större fluktuationer som observerats i OPC: er. I genomsnitt förblev dock volymen konstant. För att undersöka specifika volymförändringar som potentiellt inträffade i migrerande OPC: er måste vi skilja mellan rörliga och icke rörliga OPC: er. En tidigare undersökning av OPC-migrationen hade rapporterat en medelhastighet på 10 mikrometer / timme ± 7 mikrometer / timme och en bråkdel på cirka 50% av rörliga celler 48 . Därför klassificerade vi celler som rörliga om deras hastighet översteg 6, 5 μm / h. Denna gräns definierades som medel minus hälften av SD för hastigheten för rörliga OPC enligt den föregående rapporten.

Klassificeringen av celler i rörliga och icke rörliga celler gav en bråkdel av 30% rörliga celler med en medelhastighet på 11, 1 um / h ± 5, 7 μm / h. De återstående cellerna visade en medelhastighet på 3, 2 μm / h ± 1, 9 μm / h, se Fig. 2D. De genomsnittliga migrationsavstånden mellan två på varandra följande skanningar uppgick till 1, 82 μm ± 1, 68 μm och 0, 43 μm ± 0, 66 μm för rörliga respektive icke-rörliga celler. Histogrammen av lg V r för rörliga (vita staplar) och icke-rörliga (grå staplar) celler visas i fig. 2E. Medelvärden uppgår till 0, 00 ± 0, 05 för icke-rörande och 0, 02 ± 0, 10 för rörliga celler (0% ± 12%; n = 112 respektive 6% ± 27%; n = 49), vilket indikerar en liten tendens för de rörliga OPC: erna att svälla. Den större variationen av de rörliga cellerna (± 0, 10) jämfört med de stationära cellerna (± 0, 04 för differentierade oligodendrocyter såväl som ± 0, 05 för stamceller) indikerar en större volymfluktuation av migrerande celler.

Lokala volymförändringar av accelererande oligodendrocytprogenitorceller

Hypotesen att cellmigrering åtföljs av en lokal volymökning vid den rörliga fronten av cellen 2, 3, 9, 17, 20 testades genom att beräkna de relativa lokala volymerna av celler före accelererad migration. Cellvolymförändringar för slumpmässigt valda par av migrerande OPC skilde sig inte signifikant från cellvolymförändringar för stationära OPC: er (se fig. 2D), som förväntat om migrerande celler svänger mellan svullnad och krympning. För att undersöka om systematiska volymförändringar inträffar under definierade tidsperioder för saltvandring, undersökte vi nu volymförändringar av celler under migrationsaccelerationen. För att välja accelererande celler analyserade vi uppsättningar av tre på varandra följande skanningar som visas i fig 3A och bestämde motsvarande hastigheter. För exemplet som visas i fig. 3A uppgick motsvarande hastigheter till 6, 6 um / h respektive 10, 8 um / h (svarta staplar i fig. 3B). Såsom definierats i fig. 2 klassificerade vi celler med en hastighet som överstiger 6, 5 mikrometer / timme som rörlig (indikerat av det grå området i det vänstra diagrammet i fig. 3b) vilket gav 32 avsöknings tripplar av rörliga och 96 avsökande trippel av icke rörliga celler. Dessutom klassificerade vi en rörlig cell som accelererande om den andra hastigheten var minst 1, 25 gånger hastigheten mellan de två första skanningarna, motsvarande ungefär 0, 1 i en logaritmisk skala (indikerat av det grå området i det högra diagrammet i fig. 3B; för exemplet uppgick cell lg v r till 0, 22 motsvarande en ökning av hastigheten med 65%). Nio av de 32 undersökta scan-tripplarna av rörliga celler matchade kriteriet för accelererande celler.

Image

(A) Hastighetsbestämning av en typisk cell inkluderad i migrationsanalysen. Tredimensionella plott av en uppsättning av tre på varandra följande skanningar av en rörlig oligodendrocytt stamceller. Data interpolerade med kubiska splines, skanningsstorlek 30 × 30 μm 2, stegstorlek 1 μm i sidled och 0, 1 μm vertikalt. (B) Motsvarande hastigheter mellan skannar en, två och tre (vänster diagram). En cell klassificerades som rörlig om hastigheten mellan skanningar två och tre överskred 6, 5 μm / h (enligt Schmidt et al. 48 ). Dessutom klassificerades en cell som accelererande om den relativa hastigheten överskred 0, 1 i en logaritmisk skala (125% i linjär representation, höger diagram). (C, D) Volymbestämning. (C) Främre och bakre cellkroppsvolymer i cellen som visas i (A). Observera att cellsvällningen från cirka 0, 8 pL till nästan 1 pL domineras av en ökning av frontalvolymen. (D) Motsvarande relativa volymer av cellkroppens främre, bakre och totala indikerande att cellsvällningen domineras av en svullnad av cellens främre del.

Bild i full storlek

Vi undersökte nu om volymförändringar inträffade mellan de två första skanningarna före accelererad migration (se Fig. 3C). För att undersöka volymen på den främre och bakre delen av cellkroppen separat delades cellen upp på nivån C 90, varvid centroiden i området översteg 90% av den maximala cellhöjden, som ungefär är placeringen av kärnan 65 . Cellen som visas i fig. 3A genomgick en ökning av den totala cellsvolumvolymen från 773 fL till 983 fL (se fig. 3C) som dominerades av en ökning av den främre soma-volymen (362 fL till 523 fL, svarta staplar i fig. 3C). Övervägande av den främre volymökningen blir tydligare i kurvan för de relativa volymerna som visas i fig. 3D.

Fig. 4A visar den första avsökningen av en uppsättning av tre skanningar från en annan cell klassificerad som accelererande. Höjdprofilerna för de första två skanningarna ( t = 0 min och t = 12 min) längs den svarta linjen som motsvarar cellens rörelseriktning är ritade i fig 4B (prickad respektive hel linje). Medan profilens höjd nästan förblev konstant, syns en betydande förlängning av cellens framsida på mer än 2 mikrometer mot rörelseriktningen.

Image

(A) Ovanifrån av en SICM-skanning av en oligodendrocytföräldrarcell. Vit lateral skalstång representerar 3 μm, grå lutning indikerar höjd. Svart linje anger positionen för höjdprofilerna som visas i (B). Prickad linje representerar profilen för skanningen erhållen vid t = 0 min, hel linje representerar profilen för skanningen erhållen vid t = 12 min. Observera den avsevärda svullnaden i riktning mot den främre delen av cellkroppen. (C) Schematisk illustration av definitionen av accelererande och vilande celler. Celler klassificerades som accelererande när hastigheten mellan skanningarna två och tre av motsvarande skannings trippel överskred 6, 5 μm / h och den relativa hastigheten logaritmiskt överskred 1, 25 (lg ( v r )> 0, 1). Celler klassificerades som vilande om hastigheten mellan skanningar två och tre av motsvarande uppsättning av tre skanningar var lägre än 6, 5 μm / h och den logaritmiska representationen för dess relativa hastighet varierade mellan −0, 1 och + 0, 1. (D) Relativ volym av accelererande (vita staplar, n = 9) och vilande (grå staplar, n = 12) celler mellan den första och andra genomsökningen av en skannings trippel (logaritmisk representation, felstänger indikerar SEM). Observera att cellkroppens frontala volymer i genomsnitt ökade signifikant ( p <0, 05, indikerat med asterisken) och hela cellkroppsvolymen med en sannolikhet på cirka 93, 5% ( p <0, 065, indikerat med plustecknet) medan volymen av den bakre delen av cellkroppen visade bara obetydliga förändringar.

Bild i full storlek

För att undersöka om denna lokala cellsvällning i allmänhet inträffar före migration accelererade, jämförde vi genomsnittliga soma volymförändringar av accelererande och vilande celler. Vilande celler definierades som alla celler som uppvisar en hastighet under 6, 5 μm / h och en relativ hastighet i intervallet 0, 8 till 1, 25 (−0, 1 ≤ lg v r <0, 1 ungefär, se fig 4C) från vår totala uppsättning av tre skanningar av celler. Tolv av 96 undersökta uppsättningar med tre skanningar matchade kriterierna för vilande celler. Skannatriplar som varken klassificerades som vilande eller accelererande bestod mestadels av celler utan påvisbara ökningar i hastighet och retardationsceller. Dessa celler utesluts från analysen.

Såsom visas i fig. 4D-accelererande celler (vita staplar) visar en signifikant svullnad i frontala celler som jämfört med vilande celler (grå staplar; p <0, 05, indikerat av asterisken). I genomsnitt uppgick svullnaden i den främre delen av soma till 15% ± 7% (0, 05 ± 0, 03 i en logaritmisk skala). Observera att här fel indikerar ± SEM eftersom vi vill illustrera betydelsen snarare än variationen. Däremot visade vilande celler en lokal främre volymminskning på 4% ± 5% (SEM; lg V r = 0, 03 ± 0, 02).

Bakre soma volymförändringar skilde sig inte signifikant från de hos vilande celler (accelererande celler: 9% ± 6%; lg V r = 0, 03 ± 0, 02; vilande celler: 4% ± 3%; lg V r = 0, 02 ± 0, 01; fel indikerar ± SEM) som indikerar att den observerade volymökningen före cellkroppsacceleration mestadels kan tillskrivas en svullnad av den främre delen av cellkroppen.

Förändringar i intracellulär Ca 2+ fluorescens under migration

För att undersöka om de lokala volymförändringarna kan utlösa ökningar i den intracellulära kalciumkoncentrationen, övervakade vi Ca 2+ -transienter med det Ca2 + -känsliga färgämnet Fluo8H-AM med ett epifluorescerande mikroskop. Från 28 experiment visade sju celler som var tydligt identifierbara som OPCs Ca 2+ färgningar som tydligt överskred bakgrunden. Det stora antalet fel beror på den låga färgkoncentration som krävs för att observera OPC-migration, den relativt stora förstoringen som används för att möjliggöra rumslig separering av potentiella Ca2 + -signaler såväl som på grund av drivningar av inkubationskammaren och bristen på fuktning under inspelningar. Detta begränsade de data som analyserades för Ca 2+ -imaging till data registrerade under de första två timmarna av inspelningen. Vi antar att färgämnet vid denna tidpunkt hade mindre sannolikt spridit sig in i de cellulära facken, och att de detekterade signalerna således registrerades från cytosolen. Från de sju celler som analyserades visade fyra migration.

Fig. 5A visar förändringar i Fluo8H-intensiteten integrerad över hela cellen under den slumpmässiga migreringen av en OPC som visade både en icke-migrerande (röd linje) och en migrerande fas (grön linje). Som en kontroll visas intensitetsspåret för en OPC som inte visar någon migration under hela inspelningen i fig. 5B. Ca 2+ -signaländringarna under migreringen överskrider klart de slumpmässiga förändringarna under den icke-migrerande fasen såväl som för den icke-migrerande OPC. Amplituden för de två största signaländringarna för var och en av de sju OPC: erna, indelade i migrerande och icke-migrerande, visas som låddiagram i fig. 5C. Här visas medianen för de analyserade amplituderna som den horisontella linjen som separerar de ljusa och mörkgrå rutorna, som representerar den nedre (mörkgrå) och övre (ljusgrå) kvartilen i data. Således är 50% av de analyserade datana belägna i rutan innefattande både den ljusa och den mörkgråa (interkvartilt intervall, IQR). Viskhåren representerar de minimala eller maximala värdena som ligger inom 1, 5 IQR under respektive över medianen. Medianamplituderna för icke-migrerande (5, 8%) och migrerande OPC: er (16, 5%) skiljer sig klart och den övre kvartilen av icke-migrerande OPC: er (8, 7%) överlappar inte den nedre kvartilen för de migrerande OPC: erna (14, 1%). Medan alla data i migrerande OPC var inom 1, 5 IQR runt median (min: 8, 7%, max: 22, 8%), såg vi en överliggande (13, 8%, punkt i fig. 5C) i icke-migrerande celler (min och max inom ± 1, 5 IRQ: 3, 0% respektive 9, 8%).

Image

(A) Fluorescensintensitetssignal som indikerar cytosolisk fri kalciumbelastning av en OPC under en fas utan migration (röd) och under migrering (grönt; Observera att båda spåren registrerades från samma cell). (B) Representativt spår av en cell som inte visar någon migration under observationsperioden som fungerar som kontroll. (C) Boxdiagram med amplitudhöjden för de två största intensitetsförändringarna i icke-migrerande ( n = 6 från 3 celler) och migrerande ( n = 8 från 4 celler) OPC: er. Rutor indikerar respektive nedre kvartil, median respektive övre kvartil; whiskers anger maximi- och minimivärden inom 1, 5 interkvartilintervall (alla värden utanför detta intervall indikeras med prickar). (D – G) Överlagring av faskontrast och skillnader i fluorescensintensitet. Skillnaderna är tydligt belägna på den sida av cellen som pekar mot rörelseriktningen. Insatser visar motsvarande amplitud för den cytosoliska fria kalciumbelastningen. Skalfält i alla bilder representerar 10 mikrometer, alla bilder vänds så att rörelseriktningen pekar mot bilderna nederst till höger. Skalstänger i insatsen i G gäller alla insatser. Asterisk i färggradientfältet indikerar icke-lineariteten på grund av det applicerade filtret.

Bild i full storlek

Fig. 5D – G visar platsen för Ca 2+ signalamplituder i migrerande OPC: er. Motsvarande amplituder för den integrerade cytosoliska fria kalciumbelastningen visas i insatserna (motsvarande skala visas i fig. 5G). Även om Ca 2+ -signaler i allmänhet var mer homogent fördelade över hela cellen (inte visade), i vissa inspelningar i alla fyra migrerande OPC: er, lokala lokala Ca2 + -signalförändringar lokaliserades vid cellsidan som pekade mot rörelseriktningen.

Diskussion

En lokal volymökning har postulerats för att länka jon- och vatteninflöde vid den främre delen av cellen och jon- och vattenutflöde vid den bakre delen av cellen genom att aktivera sträckningsaktiverade Ca 2+ -kanaler 2, 3 . Här gick vi till för att visa att i oligodendrocytföräldrarceller verkligen en volymförändring på cirka 15% kan observeras vid den främre delen av cellkroppen före accelererad migration.

I motsats till OPC: er förändrade i genomsnitt vuxna oligodendrocyter varken deras position eller volym. Den observerade avvikelsen på ± 0, 04 (fig. 2) i cellvolym inkluderar sannolikt både fysiologiska volymfluktuationer hos oligodendrocyterna och osäkerheter i volymbestämningen av instrumentet. Som nämnts i avsnittet Material och metoder beräknade teoretiska överväganden dessutom felet i bestämningen av förhållandet mellan två volymer till 8%. Således drar vi slutsatsen att volymförändringar som överstiger 10% (det vill säga 0, 04 i logaritmisk skala) i genomsnitt inte är ett resultat av osäkerheten i den tillämpade bestämningsmetoden för volymförändringarna, utan representerar verkliga cellsvällningar.

OPC: er förändrade i genomsnitt inte sin volym systematiskt, men visade större fluktuationer än mogna oligodendrocyter. Eftersom det är känt att endast en bråkdel av OPC: er migrerar 48, 49, 50 delade vi uppsättningen av uppsättningar i migrerande och icke-migrerande celler genom att tillämpa en tröskel på 6, 5 μm / h. Detta ligger inom tröskelvärdet för migrerande celler definierade tidigare 50 och representerar dessutom medelvärdet minus hälften av SD med hastigheten rapporterad av Schmidt et al 48 . Denna tröskel säkerställer att ingen stationär cell räknades som migrerande. Eftersom bestämningen av OPC: s position är baserad på centroiden för flera pixlar, överskrider det systematiska felet inte storleken på en pixel som således tjänade som en övre gräns. En pixelstorlek på 1 um och en motsvarande anskaffningstid på 10 min resulterar i ett maximalt fel på 6 um / h. Denna tröskel gav en något mindre fraktion av migrerande celler än tidigare rapporterats under liknande förhållanden 48 . Den mindre fraktionen av migrerande OPC: er beror på begränsningar av SICM-inställningen som för närvarande används. Eftersom cellerna var placerade i mitten av skanningsramen, kunde ett avstånd på cirka 15 um migreras av en cell utan att lämna observationsområdet (resulterande från halva diagonalen i skanningsområdet minus hälften av cellkroppslängden (ca. 10 μm)). Dessutom undersökte vi bara cellerna som var belägna inom skanningsområdet under en period av minst tre skanningar för att bestämma hastighetsförändringar. Följaktligen kasserades celler snabbare än 30 um / h och bidrar inte till den del av migrerande celler som analyserats här. Denna approximation matchar den maximala hastigheten bestämd av SICM på 30, 03 μm / h. Under våra undersökningar observerade vi ytterligare 19 celler som kasserades på grund av denna gräns.

Medan volymen av icke-migrerande OPC: er i genomsnitt var konstant med en standardavvikelse liknande den för vuxna oligodendrocyter, visade migrerande OPC: er en liten volymökning och en större standardavvikelse. Detta indikerar att vid migrerande OPC: er uppstår större volymfluktuationer.

OPC: er migrerar på ett salterande sätt 48, 50, vilket påskyndar och retarderar. I faser av migration med små förändringar i hastighet kan potentiella volymökningar och kompensationsminskningar kanske inte detekteras med den temporära upplösningen av SICM som för närvarande används. Således utvärderades endast inspelningar av accelererande OPC: er. OPC: er klassificerade som accelererande visade en signifikant volymökning mot rörelseriktningen före accelererad migration jämfört med vilande celler. Så vitt vi vet är våra resultat de första observationerna av en lokal volymökning mot rörelseriktningen som bekräftar förekomsten av de vattenflöden som är postulerade i en allmän modell av cellmigrering 2, 3, 17, 18, 20 .

Om den lokala volymökningen, enligt postulering av modellen, utlöser en mekano-sensitiv tillströmning av Ca 2+, bör en lokal ökning av intracellulär Ca 2+ också observeras. I själva verket kunde ökningar i fluorescensintensiteten hos det kalciumbindande färgämnet Fluo-8H som överskred Ca2 + -signalförändringarna av icke-migrerande celler observeras i slumpmässigt migrerande OPC: er. Detta överensstämmer med tidigare publicerade data som visar att migrationshastighet och intracellulär Ca 2+ -aktivitet korrelerar i OPC: er 50 . In addition, we showed that during the random migration of OPCs, cytosolic free Ca 2+ load increases in the range of 10% to 20% could be observed that were mainly located at the side of the cell body pointing towards the direction of movement.

Since OPCs died within the first hour after staining with the ratiometric dye Fura-2 and showed no migration if stained with a mixture of Fluo8-H and Calcein blue, ratiometric determinations of the calcium signal could not be recorded. In contrast to ratiometric measurements, the observed signal, which was integrated over the entire cell, does not represent the intracellular calcium activity, but the cytosolic free calcium load. Nevertheless, the spatial distribution of the calcium signal most likely comprises both volume changes and thus spatial increases in sample thickness and increases in the cytosolic calcium activity. Since the subcellular increases in cytosolic free calcium load which were located at the side of the cell pointing towards the direction of movement were accompanied by an increase in the cytosolic free calcium load integrated over the entire cell, it can be excluded that they were caused solely by volume changes. A local increase of the Fluo8H signal due to a local volume increase without accompanying calcium fluxes would instead be accompanied by a constant or decreasing signal of the calcium load of the entire cell.

Assuming a volume increase of 11% of the entire cell as determined by the SICM measurements, the observed increases in cytosolic free calcium load of 10% to 20% indicate that the increased volume does not lead to a decreased calcium activity, but is compensated either by Ca 2+ influx or release from internal stores. Furthermore, assuming that the total calcium content increase occurs only at the frontal part of the cell (20% to 40% increase at the frontal part of the cell), which swells by 15% as detected by SICM measurements, the resulting calcium activity increase would be in the range of 4% to 22% (further assuming equal frontal and rear volumes before swelling and a linear relationship between fluorescence intensity and calcium activity). Although this is a very rough estimation, it hints at an increased calcium activity at the frontal part of migrating OPCs that might be mediated via mechano-sensitive channels.

However, since we found that ratiometric measurements with OPCs were not realisable, detailed analysis of the spatial calcium changes during OPC migration would require the development of a more sophisticated instrument combining SICM and confocal methods as well as a migration assay with a lower failure rate.

Furthermore, since OPCs stained with Fluo8H-AM did show practically no migration at room temperature, we observed Ca 2+ fluctuations during random migration at 37°C. Under these conditions and with an increased external calcium concentration as well as supplements of PDGF and bFGF, we observed migration velocities of up to 150 μm/h, which is in good agreement with previous reports 48, 50 . Nevertheless, as explained above, only migration velocities up to 30 μm/h could be recorded with our presently available SICM, rendering simultaneous determination of both internal Ca 2+ and cellular volume changes impossible. Cells which migrated faster than 30 μm/h were not included in our SICM analysis.

Although we could not directly link temporal sequences of local volume and local calcium activity increases with the instrumentation presently available, our data show that both phenomena occur during random migration of OPCs. Since OPC migration has been shown to be correlated with intracellular Ca 2+ alterations mediated by voltage operated calcium channels (VOCCs) 50, our data can be interpreted in two ways: Firstly, the voltage activated increase in intracellular calcium could induce the observed volume increase, secondly, the local increase in intracellular Ca 2+ triggered by the volume increase through mechano-sensitive ion channels might create the initial depolarisation required to trigger a subsequent Ca 2+ influx via VOCCs.

If one considers the ratio of internal Ca 2+ and particularly K + concentration, which is in the range of 10 −3 to 10 −4, an increase of Ca 2+ by several per cent seems unlikely to cause an osmotic effect per se. However, Ca 2+ might induce reactions that increase intracellular osmolarity, either by changing the electric potential which in turn induces ion influxes or via its role as a mediator in manifold biochemical signalling cascades.

The hypothesis that the volume increase triggers a calcium increase via mechano-sensitive ion channels is supported by several observations. Firstly, if VOCCs are blocked using verapamil or nifedipine, a basal movement of OPCs remains, although severely reduced, but blocking external Ca 2+ by the addition of EGTA instead exceeds the effect of VOCC blockers 50 .

Secondly, OPCs are known to express several ion channels and transporters that are supposed to play a role in the regulation of the osmotic pressure during migration (see introduction for details), although one should consider that not all OPCs express the same set of ion channels 66 . OPCs are known to express both a Na + /H + and a Cl /HCO exchanger 67, suggested to be the mediator of a local increase in osmotic pressure 2, 3, 17, 18, 20 . Futhermore, a Ca 2+ dependent potassium outward current is likely to mediate a compensatory volume decrease at the rear end of the cell 5, 39, 40, 41, 42, 68 . Potassium currents have been investigated in OPCs. Both, spindle shaped OPCs as investigated in this study and OPCs in a later phase of development show similar potassium outward currents. In later OPCs, some of these currents have been shown to depend on internal Ca 2+ 69 .

Although a sole efflux of K + might be sufficient to cause a compensatory volume decrease at the rear end of the cell, most likely an accompanying efflux of Cl occurs, since the hyperpolarisation by the K + efflux would support chloride efflux. Virtually nothing is known about chloride currents not activated by ligands in OPCs. Nevertheless, a large intracellular Cl concentration is found in OPC descendants 70 . Furthermore, both astrocytes and glial cell derived tumor cells express volume regulated chloride channels 45, 71, 72 .

In our report, we showed that scanning ion conductance microscopy is an excellent tool to quantify cellular volume changes during cell migration in culture. The application of this emerging technique to observe randomly migrating OPCs revealed for the first time that local volume changes at the frontal part of the cell body, hence in the direction of movement, occur during accelerated migration of OPCs. Recent improvements of this technique 73 allow the observation of flat samples such as the lamellipodium with high spatial and temporal resolution, potentially enabling the observation of volume changes in cellular structures where volume relevant proteins are located.

Furthermore, we observed local increases in the internal calcium activity that, too, were located at the frontal part of the cell body of migrating OPCs. Albeit various interpretations of these observations are conceivable, our findings agree well with the postulated model that a local volume increase triggers a succeeding increase in internal calcium concentration. Notwithstanding that an exact determination of the causal link between volume changes and Ca 2+ surges is still lacking, our data contribute a yet missing aspect to unravel the mechanism of cell migration.

metoder

Cell kultur

Cells were obtained and cultured similarly as described previously 74 . Briefly, after passing the brains of two to four days old Sprague-Dawley (SICM observations) or Wistar (Ca 2+ imaging) rats through nylon meshes of 125 μm and 36 μm pore size, the cells were collected in phosphate buffered saline (PBS, containing in mM: 138 NaCl, 8.1 Na 2 HPO 4, 2.7 KCl, 1.47 KH 2 PO 4 ) and centrifuged for 10 minutes at 900 rpm and 4°C. The cells were then resuspended in glial mixed culture medium (GMM, consisting of a mixture of HAM's F12 and DMEM (1:1) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin) and pre-cultured in cell culture flasks (in humidified air containing 5% CO 2 at 37°C) until a dense layer of cells had grown. Cell debris and the different glial cell types then were separated by their different adherences to the flask: To remove microglia and debris flasks were shaken for 3 hours at 180 rpm. The supernatant was replaced by fresh GMM and the cell culture flasks were shaken for additional 16 to 18 hours. The supernatant now containing OPCs was centrifuged for 5 min at 1700 rpm at 4°C. The pellet was resuspended in GMM and preplated for 45 minutes in uncoated cell culture dishes to remove cells that were not OPCs but had been detached by the shaking procedure. The supernatant containing the non adherent cells was diluted to approximately 50000 cells/mL. In dependence on the further experiments, cells were then treated differently as detailed below.

Scanning ion conductance microscopy

For SICM measurements, 500 μl of the the cell suspension were transferred into removable glas rings (diameter 1.5 cm) which had been placed in the center of poly-L-lysine coated plastic cell culture dishes (diameter 3.5 cm). After one to three hours the rings were removed and medium was exchanged to 1 mL GMM.

SICM measurements were performed using the same instrument as previously described operating in floating backstep mode 60 . Scans were performed in 3.5 cm plastic petri dishes after exchanging the medium to Leibovitz-15. In order to reduce migration speed with the aim of preventing cells from escaping out of the scanning frame, neither basic fibroblast growth factor (bFGF) nor plateled derived growth factor (PDGF) was added to the culture medium.

Scanning electrodes were filled with extracellular saline (containing in mM: NaCl 110, KCl 5.4, CaCl 2 : 1.8, MgCl 2 0.8, Glucose 10, HEPES 10). Inner diameter of the scanning probes was about 1 μm, access resistance was about 4 MOhm, scan size was 30 μm × 30 μm with a lateral step size of 1 μm and a vertical step size of 100 nm. These step sizes allow recordings with a voxel volume in the same range as the volume of the confocal spot of a confocal microscope. Acquisition time was about 10 minutes per scan. Data are shown interpolated by cubic splines.

Volume determination

Volume calculations of mature oligodendrocytes were performed as described previously 60 by calculating the sum of the volumes of each single column above each pixel: V = Δ x Δ y Σ i z i ; where Δ x and Δ y denote the lateral scan step size and z i denotes the detected height of the pixel i . Volume calculations of OPCs were performed by applying a boundary delimitation algorithm (BDA) as detailed in 65 . This method circumvents the problems that occur in the separation of processes from cell somata by defining a certain height threshold 74, 75 . In brief, after aligning the cell parallel to the x -axis polynomials of third degree were fitted along the contour of sections parallel to the x , z -plane of the cell. The cell was subdivided at the level of C 90, a single data point used to approximate the location of the nucleus. It was defined by the centroid of the area covered by the pixels exceeding 90% of the maximal cell height.

Relative volumes were calculated as V r, n = V n +1 / V n where n denotes the scan number. The influence of the lateral step size on the volume determinations was investigated by simulating scans of increasing step sizes on the basis of scans with small step sizes. The use of a step size of 1 μm led to an underestimation of the volume by 8% ± 4%; n = 9. While the underestimation is cancelled when calculating the ratio of two volumes, the error of 4% duplicates. Therefore we estimate that the determination of the ratio of two volumes is subject to a systematic error of 8%.

Velocity determination

Cell body position was approximated by C 20, the centroid of the area exceeding 20% of the maximal cell height. Its coordinates were calculated as described before 65 . Velocities were calculated as v n = d n /Δ t n where d n is the distance between the positions of C 20 of the corresponding scans n and n + 1, Δ t n denotes the time interval between the corresponding scans. For the calculations of the average migration distance, the direction of movement was taken into account. We defined the longest distance that was migrated without a change in direction as positive.

Databehandling

SICM data were processed using Matlab (R2008a) and ImageJ (1.42q) software. Statistical calculations were performed in R (2.7.1). Tests for significance are Welch two sample t -tests. Errors indicate standard deviations ( σ ) unless otherwise noted. Standard error of the mean was calculated as

Image

Before applying the BDA the SICM data was filtered using a threshold filter clipping every z -value below 1 μm to zero and plane corrected when necessary.

Ca 2+ imaging

One milliliter of the cell suspension (see section Cell Culture) was transferred into poly-L-lysine coated plastic cell culture dishes. After adherence of the cells, medium was changed to proliferation medium (PM, containing DMEM, 1 × B27 (Gibco), 10 ng/ml PDGF, 10 ng/mL bFGF, 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin).

We tested ratiometric methods to investigate the calcium activity. However, OPCs stained with both Fluo-8H and Calcein blue did not show migration and OPCs stained with Fura-2 quickly died within one hour after staining. Thus, for Ca 2+ recordings, cells were stained with 0.5 μM Fluo8H-AM in PM for 30 minutes at 37°C, 5% CO 2 in humidified air. After rinsing with PBS, the medium was exchanged to fresh PM. Here, in contrast to SICM investigations, a medium containing growth factors was used since otherwise the Fluo-8H stained cells did not migrate. The intracellular Ca 2+ activity during the random migration of OPCs was observed with an Olympus IX81 inverted microscope (FITC channel) using a 20fold objective, equipped with an incubation chamber (H.Sauer Laborbedarf, Germany), at 37°C and 5% CO 2 . Fluo8H intensity was recorded with a monochrome CCD camera equipped with an ICX 0285 sensor (Sony) featuring 1376 × 1032 pixels. No additional binning was applied. Exposure time was 1000 ms, images were recorded during four to six hours at 30 s intervals.

Fluo-8H intensity was analysed within a ROI comprising the entire cell during the time of observation, thus integrating over the entire cell volume and therefore limiting the volume dependence of the fluorescence signal to the activity depending binding properties of the dye. The fluorescence signal in this case represents the free calcium load of the cell.

The use of a single calcium sensitive dye as well as an epifluorescent microscope limits the interpretation of the Ca 2+ recordings. Under these recording conditions, changes in the fluorescence signal can occur due to several causes: First, a change in intracellular Ca 2+ activity is induced by transmembrane Ca 2+ fluxes or release/uptake from intracellular stores at constant cell volume. Second, a volume change of the cells would affect the fluorescence signal in a ROI comprising the entire cell as follows: A sole redistribution of volume would lead to no changes in the signal since a volume and thus sample thickness increase at one position would be compensated by a local volume and thus sample thickness decrease at a another position. A volume increase without changes of the cytoplasmatic free Ca 2+ load would lead to a dilution of both, Ca 2+ and dye. Even if the activity dependence of the fluorescence intensity is neglected, this could at maximum lead to a constant signal integrated over the entire cell, but not an increase in intensity. Therefore, an increase in the fluorescence signal within a ROI comprising the entire cell can only be interpreted as a net cytosolic increase in free Ca 2+ load. However, these recordings do not allow to determine the contribution of volume and calcium activity changes to the change in the fluorescence intensity signal.

Calcium recordings were corrected for background and bleaching, assuming an exponential decay, calcium signals were normalised to the mean intensity of the entire recording ( F /〈 F 〉). Local alterations in the intracellular calcium level were calculated by subtracting the corrected fluorescence signal of two respective recordings. For easier visualisation of the localisation the differences were filtered by applying a smooth bandpass filter in the frequency domain, cutting off signals the size of which was below 3 px to 15 px and above 40 px to 100 px and subsequently normalised to the maximal difference (Δ F norm, see Fig. 5). Note that after the application of that filter colour gradients do not represent the difference in calcium linearly. Amplitudes (Δ F /〈 F 〉) were determined as the maximum increase between two recordings within a time period of three minutes.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.