Mikrornor i hox-nätverket: en uppenbar länk till posterior prevalens | naturen granskar genetik

Mikrornor i hox-nätverket: en uppenbar länk till posterior prevalens | naturen granskar genetik

Anonim

Abstrakt

Homeobox (Hox) transkriptionsfaktorer ger anterior – posterior (AP) axiella koordinater till ryggradsembryon. Hox-gener finns i kluster som också innehåller gener för mikroRNA (miRNA). Vår analys av förutsagda miRNA-mål indikerar att Hox-klusterinbäddade miRNA: er företrädesvis riktar sig till Hox-mRNA. Dessutom är de antagna Hox-målgenerna huvudsakligen belägna på 3'-sidan av varje Hox miRNA-lokus. Dessa resultat tyder på att Hox miRNA hjälper till att undertrycka mer främre program och därigenom förstärker posterior prevalens, vilket är den hierarkiska dominansen av posterior över den främre Hox-genfunktionen som observeras hos bilaterians. På detta sätt verkar miRNA-medierad reglering återkapitulera interaktioner på andra nivåer av genuttryck, något mer förfäder, inom ett nätverk under stabiliserande urval.

Nyckelord

  • Inom Hox-genkluster finns loki som kodar för mikroRNA (miRNA). Dessa inkluderar: miR-10, som finns i hela Bilateria; miR-196, finns i ryggradsdjur; och miR-iab4, finns i insekter.

  • Hox miRNA riktar sig företrädesvis till mRNA för Hox-transkriptionsfaktorer, med en stark benägenhet att rikta dem från loci som ligger på 3 ′-sidan av varje Hox miRNA-lokus.

  • Dessa inriktningspreferenser tyder på att Hox miRNA hjälper till att undertrycka fler främre program och därigenom förstärker posterior prevalens, vilket är den hierarkiska kontrollen av posterior över anterior Hox-genfunktion.

Huvudsaklig

Som determinanter för regional anatomisk identitet över Bilateria, är genoxider av homeobox (Hox) under stark evolutionär begränsning, med små förändringar som ger upphov till djupa förändringar i kroppsplanerna 1, 2 . Bevarande på grund av renande selektion exemplifieras av homeobox-motivet av Hox-transkriptionsfaktorerna, i vilka 99, 7% av icke-synonyma mutationer elimineras, i kontrast till en genomsnittlig borttagningsberäkning på 85% bland en slumpmässig uppsättning av mänskliga och musgenpar 3 . I förhållande till förfädernas bilaterala Hox-gener är ryggradsuppsättningen också anmärkningsvärt begränsad med avseende på klusterorganisation, genordning, orientering och kompakthet 1 . Å andra sidan inträffar stora avvikelser från starkt ordnade ryggradsliknande kluster i genomar av kladder med allmänt divergerande kroppsplaner - som är fallet i hästdjur, där klustret är förvrängd 4, eller i urochordater, där det har sönderdelats och centrala gener har gått förlorade 5, 6 . Naturlig variation i Hox-regleringselement har använts för att förklara de morfologiska skillnaderna mellan kroppssegment av besläktade arter inom leddjur. Bland ryggradsdjur kan denna typ av variation (såsom förstärkning av en global förstärkare för att driva uttryck längs en sekundär axel) ha möjliggjort utvecklingen av strukturella nyheter, inklusive tetrapod-lemmet 7, 8 .

En iterativ kod längs AP-axeln

De fyra Hox-kluster av däggdjur kartlägger till distinkta kromosomer, sträcker sig i storlek mellan 100 och 200 kb, och vardera innehåller 9 till 11 proteinkodande gener spridda bland 13 paralogösa grupper, alla transkriven från en DNA-sträng. I Hox-gennomenklaturen sjunker paralognumreringningen i riktningen för transkription, med Hox1- paraloger som kartläggs till 3'- kanten av varje kluster (fig. La). Hox-paralogerna härleddes genom tandemduplicering av en initial mall som är närmast relaterad till 3'-slutkodningssekvenser. En parad uppsättning av protoHox1 / 2 och protoHox3- gener som fanns i en tidig metazoan tros ha duplicerat för att generera Hox- och paraHox-föregångarna, som var och en sedan upplevde ytterligare replikering 9 . Det förfäderna kordatklustret förmodligen mest liknade det unika ∼ 450 kb-klustret av det frittlevande marina urochordat-amfioxuset 10 minus dess mest bakre gen Hox14 , vilket troligen kommer att vara produkten från en urochordat linjespecifik dupliceringshändelse 11 . Från denna förfäderprototyp uppstod flera kluster i ryggradsdjur genom en serie större kopior med det omgivande genomet.

a | Musen Hox-kluster. Blå och gröna linjer indikerar förtryck av mikroRNA: er (miRNA: er) miR-10 respektive miR-196. Alla mål bevaras hos människor, utom Hoxd1 och Hoxa4 (streckad linje). b | En modell för Hox miRNA: s roll i modulering av Hox-koden. Hox miRNA placeras inom ett schema för embryonal utveckling längs en segmenterad anteriär-bakre axel. Det mest främre segmentet visar standardutvecklingstillståndet som anges i frånvaro av Hox-uttryck. Detta tillstånd modifieras mot mer bakre öde av miRNA som dämpar aktiviteten hos Hox-gener som ligger 3 ′ från miRNA-lokuset. Det näst främsta segmentet är den främre uttrycksgränsen för Hox-generna som ligger 3 3 av miRNA-lokuset, som specificerar tidigare och mer främre öden. Hox miRNA: er dämpar det bakre uttrycket av deras 3 ′ Hox-mål. På de mer bakre domänerna agerar de parallellt med 5 ′ Hox-gener för att förstärka hierarkin för 5 ′ Hox-funktion. Inom de mest bakre domänerna för Hox miRNA-uttryck ger miRNA: er en misslyckad säker förtryck av avvikande eller låg nivå och experimentellt odetekterbar transkription. Alternativt kan de hålla sig kvar som stabila arter efter borttagningen av 3 ′ Hox-mål. Målen uttrycks vanligtvis före miRNA: erna, och således har den miRNA-medierade moduleringen av expressionsdomäner också en temporär dimension (inte visad).

Bild i full storlek

Hox-gener uttrycks i förskjutna och överlappande domäner i alla embryonala kimlager längs den främre-bakre axeln (AP), även kallad rostrocaudalaxeln, med skarpa främre och diffusa bakre gränser 2 . Den främre uttrycksgränsen är platsen med de högsta transkriptnivåerna och där fenotyper med förlust av funktion är mest öppna, därför definieras det som det funktionella domänet 2, 12 . Genordning inom ett kluster korrelerar med koordinaterna för de funktionella domänerna längs AP-axeln och med den relativa början av genuttryck under ryggradsgastrulering. Dessa konserverade egenskaper, varigenom gener vid Hox-klustrets 3'- ände uttrycks tidigare och mer anteriort och de mer 5'-generna uttrycks senare och längre mot svansen, kallas rumslig och temporär kolinearitet 2, 13, 14 . Det kapslade uttrycket av Hox-gener leder till en modulkod som specificerar rumsliga koordinater längs AP-axeln och bestämmer regionala anatomiska identiteter 15, 16 .

En detaljerad uppsättning globala och lokala transkriptionella regleringsmekanismer verkar vara ansvarig för den rumsliga och temporära kolineariteten hos Hox-uttrycket 17, 18 . Post-transkriptionell reglering observerades också 19, 20, men har fått mindre experimentell uppmärksamhet. Detta inkluderar reglering av mikroRNA (miRNA), som är ∼ 22-nukleotid (nt) icke-kodande RNA som styr den post-transkriptionella förtrycket av proteinkodande gener genom att para ihop med meddelandena från dessa gener, vanligen inom deras 3′UTRs 21 . Det viktigaste för måligenkänning är parning till 5 ′-regionen i miRNA, särskilt till miRNA-nukleotiderna 2–7, som kallas fröet. Konserverade mål för en miRNA kan förutsägas över en bakgrund av falsk-positiva förutsägelser genom att söka efter bevarade 7-nt-matchningar till utsädesregionen 22, 23, 24, 25 . Detta tillvägagångssätt indikerar att över en tredjedel av proteinkodande gener från däggdjur har varit under selektivt tryck för att upprätthålla parning med miRNA 23 . Dessa riktade meddelanden förtrycks genom antingen translationell förtryck, mRNA-destabilisering eller båda. Här betraktar vi känt och förutsagt repression av Hox mRNA genom miRNA och hur detta miRNA-medierade förtryck relaterar till den övergripande regleringen och funktionen av Hox-kluster under embryonal utveckling och evolution.

Genomisk koppling av Hox miRNA och deras mål

Minst 30 av 39 Hox 3 mammUTR: s däggdjur har en eller flera konserverade matchningar till ryggrads-miRNA, varav flera har stöttats experimentellt. Dessa inkluderar Hoxa7 , Hoxb8 , Hoxc8 och Hoxd8 , som har experimentellt stöd som bevarade mål för miR-196 (Refs 26, 27). Hos kycklingen har Hoxb8 en frö-matchad plats men hos de flesta ryggradsdjur är Hoxb8 atypisk som ett miRNA-mål genom att det saknar perfekt fröparning och istället har omfattande komplementaritet till miR-196, vilket gör det till ett substrat för miRNA-riktad klyvning. Expression av mir-196 är lägre i underben än i bakbenet, där miRNA fungerar som en hämmare av Hoxb8 och förhindrar dess induktion med ektopisk retinsyra 28 . Hoxc8 , Hoxd8 och Hoxa7 har kanoniska frömatchningar - den typ av platser som förmedlar translationell förtryck och mRNA-destabilisering utan miRNA-riktad klyvning. 3′UTR-fragmenten som innehåller dessa platser medierar repressionen av reportrar i odlade celler av mänsklig livmoderhalscancer (HeLa) 26 . Liknande experiment stöder inriktningen på Hoxd10 mRNA av miR-10 i odlade humana icke-metastatiska bröstcancerceller (SUM149) celler 29 . Förändrade nivåer av miR-10 i sebrafiskembryon leder till misexpression av Hoxb1a och Hoxb3a , som båda har frömatchningar inom sina 3′UTRs 30 . Dessutom leder blockering av funktionella miR-10 och miR-196 i kycklingembryon till omfattande skelettdefekter, inklusive homeotiska transformationer, i överensstämmelse med regleringen av Hox-gener av dessa två miRNA (E. McGlinn, SY, DPB och CJT, opublicerade observationer). På liknande sätt stöder experiment i flugor det förutsagda förtrycket av Drosophila Hox-gener av miR-10 och miR-iab-miRNA 31, 32, 33, 34, 48 inklusive en förlust av funktionsundersökning som indikerar att miR-iab miRNAs riktar sig mot Ultrabithorax ( Ubx ) för förtryck i mer bakre segment 31 .

Företrädesvis inriktning av Hox-mRNA . Både miR-10 och miR-196, de två ryggrads-miRNA: er som experimentellt är inblandade i att rikta in sig på Hox-mRNA, uttrycks från genfamiljer som själva kodas av sekvenser inom Hox-klusterna 26, 47 (Fig. 1a), vilket leder till frågan om dessa två Hox-miRNA kan företrädesvis rikta in sig på Hox-mRNA. Undersökning av konserverade miRNA-platser som matchade de 73 starkt konserverade ryggradsdjur-myRNA-familjerna 23, 35 avslöjade att 15% av platserna som föll inom Hox 3′UTR matchade de två Hox-miRNA: erna. Dessutom rankades de två Hox-miRNA: erna och tredje högst bland de 73 miRNA-familjerna när bråkdelen av bevarade platser som föll i Hox 3′UTRs övervägs (tabell 1). Även om de Hox-klusterkodade miRNA: erna har många andra konserverade mål än Hox-gener, och även om Hox-mRNA: erna innehåller målsidor till andra miRNA, verkar de två Hox-miRNA: erna företrädesvis reglera Hox-gener.

Full storlek bord

Denna förmånliga inriktning är desto mer slående eftersom miRNA-målförutsägelser är långt ifrån perfekta och utan tvekan ger många falska positiva och falska negativer. Vår analys, som främst fokuserade på 7–8-mer frö-matchade platser som faller i 3′UTR, skulle ha missat platser med icke-kanonisk parning eller webbplatser som finns på andra håll i meddelandet. Effektivitet och förmånskonservering har rapporterats för platser som faller i ORF, men effektiviteten är ungefär en tiondel av den som observerats i 3′UTRs, och bevarandet som beror på kodning leder till sänkt prediktionsspecificitet, vilket motiverar uteslutningen av dessa platser från övervägande 23, 35 . Webbplatser utan perfekt parning med utsädesregionen kan fortfarande fungera om de har omfattande parning till 3 ′-regionen i miRNA, vilket kan kompensera för ett missförhållande eller utbuktning i fröparningen. Faktum är att miR-196-platsen i Hoxb8 3′UTR är ett välkänt exempel på en sådan 3 a-kompensatorisk plats, och liknande miR-196-platser i Hoxc8 och Hoxd8 har föreslagits 26 . Emellertid har experiment som undersöker effekterna av platsstörning på miRNA-mediterat förtryck ännu inte upptäckt ytterligare 3′-kompensatoriska platser i ryggrads-mRNA, även om sådana experiment har stött funktionen av otaliga frö-matchade platser. En systematisk analys av bevarandet av platser indikerar att ytterligare 3′-kompensatoriska platser sannolikt kommer att fungera i ryggradsdjur, men att de är sällsynta och utgör mindre än två procent av alla selektivt underhållna platser för ryggrads-miRNA (R. Friedman, KK Farh, CB Burge och DPB, opublicerade observationer). Av de 30 mest troliga 3′-kompensatoriska platserna, rangordnade efter kvaliteten på 3 ′ parning och omfattning av bevarande, är de enda två som faller i Hox 3′UTRs miR-196-platserna i Hoxb8 (rankad 1) och Hoxc8 (rankad i topp 20). Dessa resultat överensstämmer med experiment som visar att platser som förutses av algoritmer som möjliggör frööverensstämmelse har dålig effektivitet 35 . På grundval av dessa överväganden inkluderade vår analys de tre miR-196 3′-kompensatoriska platserna 26 men beaktade inte andra frösammanpassade platser. Parning i 3 ′-regionen i miRNA kan också komplettera frö-matchade platser för att öka effektiviteten på platsen, men eftersom följd 3′-kompletterande parning verkar vara sällsynt och ger endast en blygsam ökning av platseffektivitet 35, ansågs det inte.

Bevarande av målsidor . Även om bevarande tillhandahåller användbar information om den funktionella relevansen för en reglerande webbplats, har inte alla miRNA-responsiva mRNA: er konserverade platser. Faktum är att icke-konserverade platser medierar ofta miRNA-beroende undertryckning i reporteranalyser, och de flesta meddelanden som förtrycks när ett miRNA införs, liksom de flesta av de som är avtryckta när ett miRNA antingen hämmas eller elimineras, har webbplatser som gör uppfyller inte de bevarandekriterier som vanligtvis används för målförutsägelse 35, 36, 37, 38, 39 . Om det förtryck som dessa miRNA medierar var obetydligt, skulle webbplatser inte förväntas vara under renande urval, och detta kan vara fallet för vissa icke-konserverade målinriktade interaktioner. I vissa fall kan platserna emellertid tillhandahålla nyligen utvecklade men viktiga linjespecifika funktioner, eller de kan vara en form av förfäderreglering som är under renande urval men ändå förlorat (eller som inte kan justeras) i en av referensarten. För att hitta potentiell icke-konserverad inriktning av Hox mRNA av Hox miRNA, undersökte vi oberoende Hox 3′UTR: er av fem representativa ryggradsgenom - mänskliga, mus, kyckling, sebrafisk och pufferfisk - för kanoniska 7–8-mer frö-matchade platser ( se ruta 1 för de metoder som används). Mer än en tredjedel av 3′UTR: n hade minst en och upp till sex kanoniska platser för miR-196 eller miR-10 (fig. 1a; tabell 2). Även om bevarande, lokal 3 alignmentUTR-anpassning eller synteni inte krävdes för deras identifiering, var alla utom tre av platserna närvarande i både mänskligt och musgenom. I dessa tre fall bedömdes platsens historia genom undersökning av flera däggdjursgenomställningar. Hoxa4 och Hoxb13 verkar ha vunnit unika 7-mer frömatchningar till miR-196 i gnagare respektive primatlinjer. Hoxd1 har behållit en 8-mer plats som matchar fröregionen miR-10 i musen, men har tappat den i råtta och i primatlinjen. Opossum, som är basal till eutheriska däggdjur, har inte platsen, men sex andra däggdjur som är basala för både primater och gnagare har en 7-mer plats som matchar fröregionen miR-10. I ett antal fall, inklusive murina Hoxa4 och Hoxa7 , som visar bevis på alternativ polyadenylering, finns miRNA-platser i den längre isoformen och kan bidra till isoformspecifik reglering. Vi drar slutsatsen att huvuddelen av Hox miRNA: s inriktning fanns före uppkomsten av däggdjur och har varit under högt selektivt tryck för att behållas.

Med hjälp av miRNA-inriktning på insikter från Lewis et al . 23, vi förutspådde mål för mil-10 och mil-196 i mänskliga, mus-, brud-, zebrafisk- och Takifugu Hox-kluster utan att ställa bevarandekrav. Ett mål innehöll minst en kanonisk 7–8-mer matchning till miR-196 (8-mer match, ACTACCTA; 7-mer matcher, ACTACCT och CTACCTA) eller till miR-10 (8-mer match, ACAGGGA; 7-mer matchar, ACAGGG och CAGGGA) inom dess 3′UTR. Dessutom ingick de miR-196 3′-kompensatoriska platserna som identifierades i Hoxb8 , Hoxc8 och Hoxd8 UTRs 26 . Hos däggdjur definierades 3′UTR: erna med den längsta RefSeq-anteckningen, med undantag för 3′UTR från Hoxb1 , som förlängdes utöver befintlig annotation på grund av närvaron av överlappande EST: er och bevarande över omgivande intergena sekvens. I kycklingen definierades UTR: er med användning av ortologi för däggdjur, såväl som EST-sekvenser, och i teleas definierades UTR: er som 2 kb-sekvensen 3 'till stoppkodon.

Full storlek bord

Uttryck och funktion i hela Bilateria . Vid utvärdering av den funktionella betydelsen av den föredragna inriktningen av Hox-mRNA med Hox-miRNA, är det användbart att beakta uttrycket och utvecklingen av dessa miRNA. Mir-10- och mir-196- generna transkriberas i samma orientering som de proteinkodande generna i varje kluster, och uttrycks i mönster som ungefärliga det karakteristiska uttrycket för Hox-gener, inklusive de främre expressionsgränserna korrelerade med deras genomiska positioner inom klustret 26, 27, 30, 40, 41 . Båda miRNA-familjerna har högsta uttryck i neuralröret och lägre expressionsnivåer i stammen mesoderm, med dåligt definierade främre gränser och breda bakre uttryck genom svansen. I musembryon är upplösningen av miRNA-uttrycket för låg för att bestämma exakta gränser. Men de observerade uttrycksdomänerna för miRNA är i överensstämmelse med de mönster som förväntas på grundval av deras placering i Hox-klusterna. Till exempel skulle den förutspådda främre gränsen för mir-196- uttryck vara något bakre än Hoxb9 (ref. 27), som ligger intill mir-196 i Hox-klustret. Hoxb9- uttryck har en främre gräns i den paraxiella mesodermen upp till förhinnan 3 i embryonala dag 9, 5 (E9, 5) -möss, som förskjuts försiktigt till den torakala förhinnan 8 av E12.5 (ref. 15). Den främre gränsen för miR-10 är caudal till eller ekvivalent med gränsen för transkript från den angränsande genen Hoxb4 (ref. 27), som har en uttrycksgräns i den paraxiella mesodermen vid förhinnan 2 i E10.5-möss 20 .

Uttryckt från loci mellan Hox4 och Hox5 paralogues (fig. 1a) eller inom intronen från Hoxd4 (till exempel musen miR-10b), är miR-10 bland uppsättningen av kärnbilaterala miRNA med ortologer i insekter 42, nematoder 43 och planaria 44 . RNA-blot-studier antyder möjlig närvaro av en homolog i den starta havsanemonen, Nematostella vectensis , vilket antyder att miR-10-sekvensen kan ha för-daterat den cnidarian-bilaterala split 44, 45 . Ortologen i nematoder, miR-57, delar fröregionen för kordatet miR-10 och förväntas således väsentligen känna igen samma platser. Mir-57 är emellertid inte belägen bland Hox-gener och har inte heller kanonisk frö-parning med Caenorhabditis elegans Hox mRNA. Drosophila mir-10- genen är ovanlig eftersom den producerar mogna, tydligen funktionella miRNA från båda armarna i föregångarens hårnål, vilket utvidgar potentialen för inriktning från detta lokus 33, 46 . Dessutom förflyttas flu-mir-10- homologen av en nukleotid vid dess 5 ′-ände, vilket förväntas ha en djupgående effekt på måligenkänning eftersom den ändrar en av två 7-mer-platser som erkänns av denna miRNA 46 . Icke desto mindre liknar flu-mir-10- genen dess ryggradsmotståndsdel i två aspekter: den finns på ett ortologt lokus inom flugan Antennapedia-komplexet 47, och båda miR-10 miRNA för flugor har den bevarade potentialen att rikta sig till Hox mRNAs 33, 46 .

Den andra Hox miRNA-genen, mir-196 , som är belägen mellan Hox9- och Hox10- paralogerna i alla utom HoxD-klustret (fig. 1a), verkar ha dykt upp nyligen. Frånvaro av mir-196 från icke-ryggradschordater och dess närvaro i den käkelösa lamprey och i flera kotor med ryggradsdjur indikerar ett ursprung i den gemensamma stamfadern till ryggradsdjur, vilket förut daterar den initiala klusterduplikationshändelsen. Även om mir-196- homologer tycks vara frånvarande utanför ryggradsdjur, är en funktionell analog, mir-iab-4 , bosatt på det ortologiska läget i flugan Bithorax-komplexet 26, 32 . Genom transkription från endera DNA-strängen producerar fluganus två alternativa miRNA: miR-iab-4s och miR-iab-4as (ref. 33). Ingen av dessa flyg-miRNA har detekterbar homologi med miR-196, men båda verkar rikta in sig på Hox-mRNA i närheten 26, 31, 32, 33, 34, 48 .

Asymmetrisk fördelning av mål-mRNA-loci

I vår undersökning av konserverade och icke-konserverade platser i de fem representativa ryggradsgenomen fann vi att de förutsagda målgenerna var ojämnt fördelade över klusterna. För denna analys behandlades miRNA-loci som genomiska gränser och Hox-gener delades upp i två grupper, beroende på vilken sida av denna gräns de föll (Fig. 1a). För mir-196- lokuset kallades Hox1–9 paralogues utbytbart om 3 ′ eller anterior, och Hox10–13 paralogues som 5 ′ eller posterior. Oavsett bevarande av enskilda platser, tillhörde en betydande majoritet av mål 3′UTR gener till gener i paralogösa grupper belägna 3 ′ till mir-196 loci, alltså med mer främre uttrycksgränser. Till exempel har människor tio 3 3 mål på miR-196, men endast ett enda mål var beläget på 5 ′-sidan. Inom 3-uppsättningen var mer än hälften av de förutsagda målen i omedelbar närhet av miRNA-lokuset, det vill säga inom de centrala paralogerna i Hox5–9 . Dessutom var fraktionen av 3 "Hox-gener som förutsågs vara mål för miR-196 högre än 5" Hox-gener, med ett ryggradsgenomsnitt på 38% av 3 "gener och 4% av 5" gener (tabell 2). På liknande sätt, i fruktflygningar har miRNA i iab-4- lokuset potentialen att rikta 3′UTR: er av nedströms och mer främre gener abdominal A ( abd-A ), Ultrabithorax ( Ubx ), Antennapedia ( Antp ) och sexkammar reducerade ( Scr ) 32, 48, även om antalet Hox-gener i flugor är för lågt för att testa statistisk signifikans. Dessa tendenser hos ryggradsdjur och flugor antydde en återkommande logik för Hox-geninriktning av miR-iab-4 eller miR-196, där dessa miRNA: er verkar för att undertrycka gener som uttrycks i mer främre domäner.

I ryggradsdjur hittades också en betydande icke-slumpmässig fördelning av förutsagda målgener för den mer forntida Hox miRNA-familjen, miR-10, för vilken Hox1–4 paraloger definierades som 3 ′ till eller främre till mir-10- lokuset, och Hox5–13 paralogues som 5 ′ eller posterior till mir-10 locus. Mir-10 's genomiska position i klustren (mellan Hox4 och Hox5 ) dikterade att det fanns färre 3 "Hox-gener tillgängliga för inriktning. I amfioxus hittades frömatchningar till miR-10 i Hox1 , Hox2 och Hox5 3′UTR. I ryggradsdjur, även om miR-10 verkar rikta in sig mot färre Hox-gener än miR-196, uppvisade det genomiska arrangemanget av målloki samma ensidiga skev. Liksom med miR-196, förutsågs en högre fraktion av 3 "gener jämfört med 5" gener som mål för miR-10 (ett ryggradsmedelvärde på 37% av 3 "gener och 8% av 5" gener; Tabell 2). Denna trend observerades emellertid inte i flugor, i vilka miR-10 verkar också rikta in sig på 5 ′ och mer bakre gener såsom buken B ( Abd-B ) och Scr 46 . Detta tyder på att den förändrade och utvidgade inriktningen på flugor, vilket beror på den förskjutna miRNA-änden och inhämtningen av miRNA från den andra armen på hårnålen, ledde till en divergens i målinriktningen för miR-10 som står i skarp kontrast till mönstret av målinriktning observerad för ryggradsdjur miR-10, ryggradsdjur miR-196 och flyga miR-iab-4.

Posterior prevalens

Inom domäner av samuttryck gör de mer bakre ryggradsdjur av Hox-gener framre Hox-gener irrelevanta i de regioner där deras uttrycksmönster överlappar varandra, ett fenomen som kallas posterior prevalens 12, 16, 49 . Med andra ord är posterior och 5 ′ gener epistatiska till anteriora och 3 ′ gener 50 . Fenomenet beskrevs först som fenotypisk undertryckning på grundval av morfologiska observationer gjorda i fluglarver med mutationer vid de extra sexcombs ( esc ) locus 12, 50 . Sådana mutationer inaktiverar repressorer av polycomb-gruppproteiner och orsakar generell degpression av Hox-uttryck 12, 50 . Det resulterande segmentmönstret i esc- mutanter återspeglar aktiviteten hos den mest bakre verkande Hox-genen, Abd-B , så att huvud-, bröst- och buksegmenten förändras till en fenokopi av A8, det mest bakre buksegmentet. Mutanta esclarver som också saknar Abd-B utvecklas med upprepning av A4-segment, typiskt specificerade av abd-A , den näst mest bakre genen. Mutanta esclarver med borttagning av alla bukshoxgener - Ubx , abd-A och Abd-B - utvecklas med upprepningar av thoraxsegment som normalt specificeras av Scr och Antp . När Scr och Antp elimineras utöver de tre maggenen , har esc- larver cephaliska segment genomgående. Således har en hierarki av homeotisk genfunktion definierats 50 . Ytterligare experiment visade att transkriptionell tvärreglering inte är den främsta drivkraften för fenotypisk undertryckning. Experimentellt härledda allestädes närvarande uttryck av Hox-gener under promotorer som är kända för att vara transkriptionellt irreprimerbara leder till transformationer endast i områden anteri till genens funktionella domän. Exempelvis undertrycker den thoraxiska Antp , när det är allestädes uttryckt, Hox-gener i huvudet, vilket resulterar i posterior transformation av huvudsegment mot en thoraxidentitet medan den inte påverkar buken - här är effekten av Antp fenotypiskt undertryckt av Bithorax-komplexa gener, såsom som Ubx 12, 51 .

Analoga observationer har gjorts i transgena ryggradsembryon för ett antal Hox-gener. Till exempel leder införandet av en Hoxd4- transgen under transkriptionell kontroll av Hoxa1- promotorn till en rostral förskjutning i den främre gränsen för Hoxd4- uttryck 52 ( Hoxd4 är inte ett förutsagt mål för miR-10 eller miR-196). De transgena embryona uppvisar posterior transformation av de occipitala benen vid basen av skallen mot strukturer som visar egenskaper hos den segmenterade ryggraden, särskilt de första två cervikala ryggkotorna. Fenotyperna är emellertid begränsade till den främre domänen av ektopisk expression, även om nivåerna är överuttryckta eller ektopiskt uttryckta någon annanstans i embryot 52 . Den bakre prevalensmodellen förklarar de allmänna trenderna för homeotiska fenotyper, med funktionsförlust som ofta leder till främre transformation vid rostrala uttrycksgränser; i frånvaro av en Hox-gen tillåts nu fler främre verkande gener som typiskt undertrycks. Modellen redogör också för de förändringar som ses efter förstärkning av funktion eller ektopiskt uttryck av en Hox-gen, vilket generellt orsakar posterior transformationer i regioner anterior till det endogena domänet, där det ektopiska uttrycket kan undertrycka effekten av bosatta Hox-gener.

Dessa tendenser gäller i allmänhet i flugor, men inte alltid i ryggradsdjur, där avvikelser från regeln inträffar, liksom andra defekter än homeotiska transformationer (se till exempel ref. 53). Fly Hox-gener verkar vara under kontroll av mer oberoende reglerande element och har distinkta uttrycksdomäner, medan ryggradshox-gener har mer samordnad reglering, redundans bland paraloger och högre överlappning i uttryck. I allmänhet verkar ryggradsdelsystem vara mer känsliga för kvantitativa skillnader i Hox-genuttryck; i dessa system förhållanden av Hox-gener som utgör Hox-koden bestämmer ödet specifikation. Icke desto mindre ändrar 5′-lokaliserade Hox-gener som en generell regel fler främre program.

Det hypotetiska förfäder . Den funktionella hierarkin som förstås som posterior prevalens verkar vara en kvarhållen egenskap hos det förfäderna Hox-klustret, observerat även i frånvaro av absolut rumsliga och temporala kolineariteter, eller av segmentering, som är fallet i den mycket härledda nematoden Hox-kluster 54 . I huvudsak har Hox-masterregulatorer en stigande hierarkisk förmåga, som är colinear med genordning, att modifiera program som specificeras av varandra. Denna hierarki kan ha varit inneboende i tidiga neofunktionaliseringshändelser som följde initiala duplikationer av tandemgen, som förut daterade den cnidarian-bilaterala splittringen och bildandet av ett större kluster. Ett hypotetiskt eubilateriskt embryo kan ha uttryckt åtminstone ett par kopplade Hox-gener för att polarisera dess longitudinella axel 55 och styra differentieringshändelser under utveckling genom upprepning av genetiska program. Ett sådant uttryck skulle leda till specifikationen av främre cellulära öden tidigare än bakre. Denna egenskap har bestått bland basalinsekter 56 och kordater, i vilka celler inom segment specificeras sekventiellt, med anterior-to-posterior progression. Den mest främre bakre rombomeren i zebrafiskembryot specificeras tidigast, en process som inte involverar Hox-uttryck och skiljer sig till att vara standardtillståndet som bakre rombomerer återgår till efter eliminering av Hox-kofaktorfunktion 57 . Under ontogenes kan ett sådant standardtillstånd förändras i utvecklingsmoduler som bildas senare eller mer posterior på grund av hierarkisk molekylär aktivitet och därigenom skapa ett antal möjliga morfologiska utgångar. Förmågan att överdriva och utarbeta ett redan existerande program som en mekanism för att utveckla en ny utvecklingsenhet kan ha varit en drivkraft för att öka kopiaantalet Hox-gener med behållen hierarkisk aktivitet. Således kan posterior prevalens åberopas som en grundläggande egenskap hos förfäder Hox-gener som hjälper till att redovisa deras framgångsrika förökning i djurgenom.

Deriverad förstärkning av etablerade hierarkier

De molekylära mekanismerna som etablerar hierarkisk aktivitet, även om de inte förklarats, tillskrivs främst egenskaperna hos Hox-transkriptionsfaktorer 12 och deras nedströmsmål. I åtminstone vissa fall är bakre verkande Hox-proteiner effektivare än anteriora vid utövande nedströmsfunktion, till exempel genom konkurrens om delade promotorbindningsställen eller för kofaktorer 58 . Dessutom kan bakre Hox-gener utöva dominans genom att rikta uttryck för olika målgener så att ett bakre Hox-nätverk är dominerande i funktion över ett främre. Inom en funktionell domän underlättas dominansen av en gen genom högre nivåer av absolut transkription. Slutligen finns det bevis för hierarki genom transkriptionell tvärreglering, med posterior gener som riktar förtrycket av anteriär 12 .

Den bevarade trenden i den genomiska fördelningen av miRNA-målgenerna inom Hox-klusterna, när de beaktas tillsammans med transkriptionella expressionsmönster som beror på rumslig och temporär kolinearitet, indikerar att Hox miRNA: er dämpar proteinutgången i mer bakre regioner av vertikalt Hox-genuttryck domäner. Dessutom fungerar Hox miRNA som försenade negativa posttranskriptionsregulatorer av deras 3 ′ Hox-mål. Såsom nyligen föreslagits för enskilda exempel 30, 48 verkar Hox miRNA: er således ha en slående allmän benägenhet för att främja posterior prevalens (Fig. 1b). Reglering av Hox-gener med miR-196 är en ryggradsinnovation och därmed ett regulatoriskt tillägg som dök upp efter uppkomsten av funktionell hierarki. I ryggradsdjur verkar båda Hox-miRNA: erna bidra till och förstärka den funktionella hierarkin bland Hox-gener, vilket således stödjer hypotesen att en mängd molekylära metoder kontinuerligt väljs för att behålla denna förfäder.

Bevarandet av mir-10 och mir-196 inom Hox-kluster kan förklaras av deras närhet till andra kodande gener och deras reglerande element, vilket leder till ett koordinerat uttrycksmönster för miRNA: er och deras mål. The Hox clusters might possess properties that enable an active mechanism to avoid genomic rearrangements or insertions and deletions, thus maintaining synteny and overall compactness. Moreover, the presence of miRNAs at regular intervals within the clusters and among their targets results in a shared local DNA environment. This environment can produce coordinated reactions with equal response to non-specific perturbations affecting global transcription, thereby preserving constant transcript ratios. This shared response between the miRNAs and their targets might be among the driving forces to retain the miRNAs within the clusters. The conserved genomic landscape with its non-random distribution of seed matches in transcribed sequences might be indicative of a gradient of constraints on 3′UTR sequences, with faster mutation rates of 5′ genes coinciding with co-option into novel expression in derived cells. Hence, the relative depletion of seed matches among 5′ transcripts, and consequent freedom from the constraints of Hox miRNA repression, might have predisposed this group towards acquisition of secondary functions, consistent with the role of Hoxd9–13 expression in the establishment of the proximal–distal axis of the tetrapod limb.

Not all of the more anterior Hox genes have sites matching the Hox miRNAs (Fig. 1a; Table 2), further implying that other, possibly more ancestral, regulatory mechanisms predominate in establishing and maintaining posterior prevalence. Moreover, sites matching the Hox miRNAs, although more abundant than for most other specific miRNAs, constitute only 15% of the conserved 7–8-mer sites in Hox 3′UTRs. This ratio suggests that when considering Hox gene regulation by all the miRNAs, reinforcing posterior prevalence is less widespread than the broader, more generic role of miRNAs, which is to adjust protein output for many other purposes, thereby sculpting expression patterns with the complexity and precision that would be difficult to create using transcriptional regulation alone 59 . Indeed, the Hox miRNAs probably participate in these other functions in addition to their role in posterior prevalence, as they seem to have many non-Hox targets.

Slutsatser

The ancestral acquisition of hierarchy among Hox genes has allowed for the specification of cellular identities along a regionalized AP axis by reiteration of a genetic programme with unidirectional modifications, and has been reinforced over time by multiple layers of interactions at many levels of gene expression. The contribution of miRNA-mediated repression to the posterior prevalence model adds a layer of regulatory interactions at the post-transcriptional level, which involves the conscription of only a few nucleotides in a region resistant to mutation. The additive layering of complementary regulation might enable a more stable outcome by limiting dependence on any one regulatory mode. Moreover, enlisting miRNA-mediated gene regulation allows for more complex regulatory output, with the consequent potential for the diversification of animal body plans. As more animals with mutations in the Hox miRNAs and their regulatory sites are generated, the functional consequences of these nodes in the Hox regulatory network will be demonstrated.

Glossary

Bilateria

Members of the animal clade that have bilateral symmetry — the property of having two similar sides, with definite upper and lower surfaces, and anterior and posterior ends. Bilaterians include chordates, arthropods, nematodes, annelids and molluscs, among other groups.

Non-synonymous mutation

A change in nucleotide sequence that alters the encoded amino acid.

Paralogous

The homology between two genomic segments in the same organism that arose from a duplication event.

Neofunctionalization

The process whereby a pair of duplicated genes becomes permanently preserved as one copy acquires mutations, conferring a new function.

Rhombomere

Each of seven neuroepithelial segments found in the embryonic hindbrain that adopt distinct molecular and cellular properties, restrictions in cell mixing, and ordered domains of gene expression.

Relaterade länkar

VIDARE INFORMATION

  • The Bartel laboratory
  • The Tabin laboratory
  • MicroRNA target predictions
  • RefSeq