Metamfetamin inducerar frisättning av dopamin i nucleus accumbens genom en sigmareceptormedierad väg | Neuropsychopharmacology

Metamfetamin inducerar frisättning av dopamin i nucleus accumbens genom en sigmareceptormedierad väg | Neuropsychopharmacology

Anonim

ämnen

  • Missbruk
  • Basala ganglierna
  • Handlingsmekanism
  • Molekylär neurovetenskap
  • Signalsubstanser
  • Pris

Abstrakt

Methamphetamine (METH) är ett läkemedel med en hög beroendeframkallande potential som utsätts för övergrepp över hela världen. Även om det är känt att METH disreglerar både dopaminöverföring och återupptag av dopamin, förblir den specifika verkningsmekanismen oklar. Ett lovande mål för METH är sigma-receptorn, ett chaperonprotein beläget på membranet i endoplasmatisk retikulum. Med hjälp av snabbskannad cyklisk voltammetri visar vi att METH-förbättring av framkallad dopaminfrisättning och basal utflöde är beroende av sigma-receptoraktivering. METH-inducerad aktivering av sigma-receptorer resulterar i oxidation av en cysteinrest på VMAT2, vilket minskar transportörens funktion. Unilaterala injektioner av sigma-receptorantagonisten BD-1063 före METH-administrering ökade dopaminrelaterat ipsilateralt cirklande beteende, vilket indikerar involvering av sigma-receptorer. Dessa fynd antyder att interaktioner mellan METH och sigma-receptorn leder till oxidativa arter (troligen superoxid) som i sin tur oxiderar VMAT2. Sammantaget visar dessa fynd att sigma-receptorn har en nyckelroll i METH-dysregulering av dopaminfrisättning och dopaminrelaterat beteende.

Introduktion

Methamphetamine (METH) är en otroligt beroendeframkallande psykostimulant med missbruk som utgör ett växande problem i hela världen. Att förstå mekanismerna bakom METH: s förstärkande egenskaper hjälper till att identifiera läkemedelsmål för mer effektiva behandlingsalternativ för drabbade individer och förebyggande. Det mesolimbiska dopaminsystemet (DA), bestående av DAergiska nervceller som projicerar från mellanhjärnan till målområdena i striatum och nucleus accumbens (NAc), har varit inblandat i belöning och motivation för missbruksläkemedel inklusive METH (Robinson och Berridge, 1993; Sulzer et al, 2005).

Ett mål med hög affinitet för METH är sigma-1-receptorn ( σ 1R). Σ 1R är ett ligand-gated chaperonprotein som vid aktivering translokaliseras till olika cellkammare i endoplasmatisk retikulum (ER) där det tros påverka proteinvikning, jon-kanal och G-proteinkopplad receptor (GPCR) -funktion, vilket resulterar i bildandet av mitokondriell-framställda reaktiva syrespecies (ROS) (Fukunaga et al, 2015; Katz et al, 2011; Nguyen et al, 2014; Su et al, 2010). Blockering av σ 1Rs förhindrar både METH-inducerad ROS-generering och DA-frisättning i odlade NG108-celler (Kaushal et al, 2012). Således kan METH: s åtgärder vid σ 1Rs vara en möjlig underliggande mekanism bakom bildandet av METH-genererad ROS och efterföljande DA-frisättning in vivo . Dessutom ersätter många σ 1R-agonister både METH och kokain i självadministrationsparadigmer (Hiranita et al, 2013; Katz et al, 2011), vilket ytterligare implicerar detta protein och dess nedströmsvägar i de förstärkande effekterna av METH.

METH är en kraftfull modulator av DA-systemet och har en mängd effekter som påverkar DA-frisläppande. Det stör DA-återupptagnings- och förpackningssystem, troligen genom direkta effekter på DA-transportören (DAT) (McFadden et al, 2015; Siciliano et al, 2014) och den vesikulära monoamintransportören 2 (VMAT2) (Chu et al, 2008; Fleckenstein et al, 2014; al, 2009; Siciliano et al, 2014). Genom denna process tros METH öka cytoplasmatiska nivåer av DA som överväger den aktiva transporten av DAT, vilket leder till omvänd transport av DA (cytoplasma till synaptisk klyftan) och eventuellt utarmning av DA-butiker (Eshleman et al, 1994; Han och Gu, 2006; Jones et al, 1998a; 1998b; Rothman och Baumann, 2003; Sitte et al, 1998). METH kan också påverka frisläppande av DA genom sina pro-oxidantåtgärder och nedströmseffekter av resulterande ROS. Till exempel inducerar en dos av METH som leder till generell DA-uttömning (10 mg / kg) också bildning av den friradikala peroxynitriten (Imam et al, 2001b), en reaktiv kväveart bildad genom interaktionen mellan superoxid och kväveoxid. Vidare skyddar överuttryckning av en koppar-zink-superoxiddismutas mot både peroxynitritbildning och METH-inducerad DA-utarmning (Imam et al, 2001b), vilket indikerar att superoxid är involverat i METH: s DA-utarmande effekter. Det är viktigt att vi tidigare har visat att ROS-rensare också har visat sig vara effektiva för att dämpa METH: s DA-förbättrande effekter (Jang et al, 2017). I den här rapporten undersöker vi rollen och nedströmsmekanismen för σ 1Rs i METHs exciterande effekter på DA-frisläppande och METH-inducerat cirklingbeteende.

Material och metoder

Djurämnen

Manliga C57BL / 6-möss (PND 30−120) och Wistar-råttor (PND 80−120) uppföddes och vårdades i enlighet med National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Vid avvänjning (PND 21) höll djuren in i en omvänd ljus / mörk cykel (ljus tändes från 2000 timmar till 0800 timmar) i grupper om 2–5 per bur och gav ad libitum tillgång till mat och vatten. Experimentella protokoll godkändes av Brigham Young University Institutional Animal Care and Use Committee enligt NIH-riktlinjerna.

Förberedelse av hjärnskiva

Koronala hjärnskivor erhölls som tidigare beskrivits (Steffensen et al, 2008). Djur bedövades med isofluran (5%), halshuggades och hjärnor dissekerades och delades upp i 400 um skivor i iskall skärningslösning bestående av (i mM): 220 sackaros, 3 KCl, 1, 25 NaH2PO4, 25 NaH2 CO 3, 12 MgS04, 10 glukos och 0, 2 CaCl2. Skivor överfördes sedan till rumstemperatur konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) bestående av (i mM): 124 NaCl, 2 KCl, 1, 25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12 glukos, 1, 2 MgS04, 2 CaCl2, pH 7, 3, som bubblades med 95% 02/5% CO2. Skivor överfördes sedan till en inspelningskammare med kontinuerligt ACSF-flöde (2, 0 ml / min) hölls vid 34-36 ° C. Om inte annat anges köptes alla läkemedel från Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). För skivberedningsexperiment löstes METH, lidocaine, GBR-12909 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), BD-1063 (Cayman Chemical), CPA (Cayman Chemical), TEMPOL och GSH i lagerlösningar och späddes sedan ut till ACSF vid specificerade koncentrationer.

Snabbskanning Cykliska voltammetry-inspelningar

Kolfiberelektroder (CFE) placerades i en vinkel, ~ 75 um under skivans yta i NAc. DA-frisättning framkallades varannan minut genom bifasisk elektrisk stimulering (4 ms pulser, 10 puls, 350 μA, 20 Hz) från en ACSF-fylld mikropipett (5-10 mikrometer spetsdiameter), placerad 100 -200 mikrometer från CFE. CFE-potentialen skannades linjärt från 0, 4 till 1, 2 V och tillbaka till 0, 4 V mot Ag / AgCl (skanningshastighet = 400 V / s). Cykliska voltammogram registrerades varje 100 ms (10 Hz) med ChemClamp-potentiometrar (Dagan Corporation, Minneapolis, MN, USA). Inspelningar utfördes och analyserades med användning av Demon Voltammetry-programvara (Yorgason et al, 2011).

För DA-avloppsexperiment detekterades först stimulerad DA-frisättning för att verifiera placering av CFE. När elektriskt framkallade DA-frisättning inte varierade med mer än 5% för fem på varandra följande samlingar stängdes den elektriska stimuleringen av och voltammogram registrerades vid 0, 5 Hz under 3 timmar. Om inte annat anges utfördes alla andra inspelningar med det farmakologiska medlet tillsatt efter 30 minuter och METH vid 60 min från inspelningens början. DA-frisättning och utflöde uttrycks som en förändring i μM DA, inte absolut extracellulär DA-koncentration, på grund av subtraherad natur av voltammetriska inspelningar.

VMAT2 Co-Immunoprecipitation Assay and Immunoblot

Äldre matchade försökspersoner delades in i tre grupper som sedan dubbelinsprutades intraperitonealt med saltlösning / saltlösning, saltlösning / METH (10 mg / kg) och BD-1063 (30 mg / kg) / METH (10 mg / kg), respektive. Injektionerna var ~ 10 min från varandra. NAc-vävnad skördades omedelbart och kyldes snabbt 30 minuter efter den andra injektionen. Vävnadsproven lyserades i iskall TNTE-buffert (i mM: 50 Tris pH 7, 4, 150 NaCl och 1 EDTA förutom 0, 5% Triton X-100) under 10 minuter med en rotation vid 4 ° C. Vävnadslysater triterades 10 gånger med användning av en 23 gauge nål och tömdes genom centrifugering vid 14 800 g under 10 minuter. Anti-VMAT2-antikropp (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) kopplades till magnetiska dynapärlor (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) och immunutfällt VMAT2 från vävnadslysat enligt tillverkarens instruktioner. Immunutfällt VMAT2 kördes på en 10% SDS-PAGE och immunblottades för anti-GSH (Virogen, Watertown, MA, USA) och anti-VMAT2 antikroppar. Efter immunblotting analyserades / kvantifierades prover med användning av fluorescerande sekundära antikroppar och Li-Cor Odyssey-bildsystemet.

Cirkelbeteende-analys

Vuxna Wistar-råttor av hankön ( n = 10, > 400 g i början av experimentet) implanterades med en ledningskanyl (MD-2250, Basi Instruments, West Lafayette, IN, USA) i NAc (+1, 2 till +1, 7 AP), −0, 8 till − 1.6ML, +6.0 till +7.0 DV), som fixerades på plats med tandcement. Personerna hölls under isoflurananestesi (1, 5 -2, 0%) under hela det kirurgiska ingreppet och tillät minst en veckas återhämtningstid. Cirklande experiment utfördes i ett 16 x 16 x 16 tum plexiglasfack. Råttor bedövades kort med användning av isofluran (4, 0%) under injektioner för att mildra injektionsstress. På testdagarna injicerades råttor intraperitonealt med antingen 5 mg / kg METH löst vid 5 mg / ml i 0, 9% NaCl-saltlösning eller 1 ml / kg 0, 9% NaCl-saltlösning. Denna injektion följdes 5 minuter senare av antingen en ensidig 0, 5 μl injektion av 5 μg BD-1063 upplöst i ACSF eller en 0, 5 μl unilateral injektion av ACSF i NAc. Mikroinjektioner genomfördes med hjälp av en mikroinjektionspump (A-99, Razel Scientific Instruments, Fairfax, VT, USA) och en 25 μl glasspruta (Hamilton Robotics, Reno, NV, USA) anslutna med silastiskt rör till en injektionsnål som sträckte sig 0, 5 1, 0 mm förbi slutet av styrkanylen. Injektionen inträffade under 30 s, med nålen kvar på plats under ytterligare 30 s före avlägsnande. Efter injektioner registrerades en timmes beteende i cirklingskammaren med hjälp av en kamera monterad på taket ovanför apparaten ansluten till en Windows 7 PC som kör Pinnacle Studio 16 (Corel, Menlo Park, CA, USA). Injektionsordning var balanserad mellan råttor för att undvika ordningseffekter. I slutet av experimentet injicerades råttor med 0, 5 ul 100 mM pontamin himmelblått (Avocado Research Chemicals Limited, Lancashire, UK) löst i destillerat vatten. Råttor dödades sedan och deras hjärnor avlägsnades för snittning med användning av en vibratom. Snittade hjärnskivor undersöktes för att bestämma plats för mikroinjektion. Två råttor avlägsnades från experimentet, en på grund av kronisk nöd och en andra på grund av felaktig injektionsplats. I den nödställda råtta avslöjade en obduktion att den nedre delen av ledningskanylen hade kopplats från implantatet vilket resulterade i en omfattande striatal skada. Två ytterligare råttor fullbordade inte saltförsöket + BD-1063 experimentella tillstånd trots att alla andra betingelser fullbordades.

Statistiska analyser

Omedelbart efter METH-administrering ökade amplituden av elektriskt framkallade DA-frisättning, men sjönk efter flera insamlingssvep. För att direkt jämföra med DA-utflöde, var vi i genomsnitt de maximala tre topp-DA-amplitudmätningarna. För statistiskt mått på DA-utflöde bestämdes resultaten utifrån maximala oxidations-toppvärden för framkallade DA-experiment. Eftersom DA-utflödet som framkallades av METH i allmänhet minskade efter 30–60 min beräknades området under kurvan (AUC) mellan den första DA-ökningen och återkomsten till baslinjen med Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR, USA). AUC delades sedan med thet av DA-utflödet för de genomsnittliga dataplottema. Detta standardiserade experiment för genomsnittlig DA-frisättning per sekund. Dessa värden gjordes sedan i genomsnitt över djur. Värden uttrycktes som medel ± SEM för kumulerade data.

Statistik utfördes med användning av IBM SPSS Statistics 21 (Armonk, NY, USA) eller STATA 14.2 (College Station, TX, USA). Ett två-svansat Student's t- test användes för jämförelser med endast två variabler. För att bestämma betydelse mellan mer än två variabler användes en enkelriktad variansanalys (ANOVA) med Tukey's post hoc- analys. Cirkling och lokomotorisk aktivitet analyserades med användning av upprepade mått ANOVAs med en växthus-Geisser-korrigering för sfäricitet. Efter analys med användning av upprepade mått ANOVAs kännetecknades signifikanta effekter vidare genom att jämföra specifika behandlingsbetingelser med användning av Tukeys HSD-test. Före analysen utvärderades data med avseende på normalitet och outliers. Det visade sig att cirkulationsdata normalt distribuerades med Shapiro – Wilk-testet för normalitet. När man kontrollerade efter outliers ansågs en datapunkt vara en outlier om den föll mer än tre interquartile intervall (IQR) över eller under medianen. Med hjälp av detta kriterium identifierades 2 poäng över två råttor som utslagare i cirkeldata. Dessa punkter var inhägnad till yttergränsen (median ± 3 IQR), eftersom det inte fanns någon anledning att tro att uppgifterna för dessa personer var felaktiga. För alla experiment sattes kriteriet för betydelse till p <0, 05 (*), p <0, 01 (**) och p <0, 001 (***).

Kompletterande material och metoder

För information om CFE-konstruktion, masspektrometri och VMAT2-aktivitetsanalysmetoder, se kompletterande material och metoder.

Resultat

METH inducerar DA-efflux i NAc-kärnan oberoende av handlingspotentialer eller konstgjord stimulering

Voltammetri användes för att utvärdera effekterna av METH (0, 1–100 μM) på elektriskt framkallade DA-frisläppande i NAc-kärnan. METH ökade toppamplituden för den framkallade (20 Hz, 10 puls) DA-signalen med en EC50 på ~ 5 μM (figur 1a – c; F 4, 30 = 4, 27, p <0, 01) och inducerade spontan (dvs. ingen artificiell stimulering) DA-utflöde med en liknande EC50 (figur 1f; F 4, 16 = 3, 54, p <0, 05). De representativa spår- och voltammogrammen för icke-stimulerad DA-frisättning erhölls med användning av 100 mikrometer METH (figur 1d och e). Lidocaine (100 μM), en spänningsgrindad natriumkanalblockerare, reducerade elektriskt stimulerad DA-frisättning (figur 2a och c, vänster; 100 μM lidocaine: F 1, 16 = 15.04, p <0, 001), medan det inte har någon påverkan på icke- stimulerad DA-frisättning med METH (figur 2b och c, höger; 100 μM lidokain: F 1, 10 = 0, ns). Elektriskt framkallade DA-koncentrationer uttrycks som en procentuell förändring, men genomsnittliga råvärden var: kontroll = 1, 28 ± 0, 52 μM, Lidocaine = 0, 20 ± 0, 05 μM. DAT-hämmaren GBR-12909 misslyckades med att förhindra METH-inducerade ökningar i stimulerad DA-frisättning (figur 2d och f, vänster; 1 μM GBR-12909: F 1, 16 = 1, 94, ns), men markant minskad METH-inducerad icke-stimulerad DA-frisättning (figur 2e och f, höger; 300 nM GBR-12909: F 1, 9 = 13, 16, p <0, 01), vilket antyder att icke-stimulerad frisättning representerar DAT-medierat utflöde. Genomsnittliga råa elektriskt framkallade DA-koncentrationer var: kontrollbaslinje = 0, 57 ± 0, 15 μM; kontroll METH = 1, 52 ± 0, 32 μM; experimentell baslinje = 0, 84 ± 0, 27 mikrometer; GBR-12909 + METH = 1, 48 ± 0, 32 um. Därför förbättrar METH två olika former av DA-frisättning: handlingspotentialberoende och DAT-medierat utflöde.

Metamfetamin förbättrade markant elektriskt framkallade dopaminfrisättning och dopaminutflöde i nucleus accumbens kärnan ex vivo . (a) Representativa överlagrade cykliska voltammogram (Ai) och ström mot tid (Aii) framkallade DA-frisättningsplott registrerade i kärnan i NAc-skivpreparatet och framkallade genom lokal stimulering (STIM) i skivpreparatet före och efter superfusion av METH. (b) I detta representativa exempel förbättrade METH markant framkallade DA-frisättning vid 5 μM (de tre toppvärdena togs för analys) med återhämtning på ungefär 1 timme ( n = 11). (c) Dos-svarskurva som visar att METH signifikant förbättrade framkallade DA-frisättning med uppskattat EC 50 på 5 μM. (d) Representativa cykliska voltammogram av spontant DA-utflöde före (BASELINE; vänster) och efter 100 μM METH (höger). (e) I detta representativa exempel förbättrade METH markant DA-utflöde med återhämtning på cirka 1 timme. Även om EC 50 beräknades vara 5 mikrometer valdes detta representativa spår vid 100 mikrometer METH för att visa ett renare voltammogram för att bekräfta att detta verkligen orsakar DA-frisläppande. (f) Dos-svarskurva som visar att METH signifikant förbättrade DA-utflöde (AUC) med en uppskattad EC 50 på 5 μM. Värden inom parentes indikerar n- värden. Stjärnor (***) representerar signifikansnivå p <0, 001. DA, dopamin; METH, metamfetamin; NAc, nucleus accumbens.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Mekanisk farmakologi för METH-förbättring av frisättning av dopamin. (a, c) Lidokain (100 μM) avskaffade framkallade DA-frisättning i kärnan i NAc-skivpreparatet ( n = 5). (b, c) METH-inducerat DA-utflöde påverkades inte av lidokain. (d, f) Metamfetaminförbättring av framkallad DA-frisättning påverkades inte av den selektiva DAT-hämmaren GBR-12909 (1 um) i skivan ( n = 6). (e, f) GBR-12909 reducerade METH-inducerat DA-utflöde. Värden inom parentes indikerar n- värden. Asterisker (**, ***) representerar signifikansnivåerna p <0, 01 respektive p <0, 001. DA, dopamin; DAT, DA-transportör; METH, Methamphetamine.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Sigma-receptorer är involverade i METH-inducerad förbättring av DA-frisläppande

Med en Ki på 2 μM är METH en potent agonist av σ 1Rs (Itzhak, 1993; Nguyen et al, 2005). Därför undersöktes σ 1R-interaktioner med METH-effekter på DA-frisättning. Den σ 1R-selektiva antagonisten BD-1063 (100 nM) hade inga uppenbara direkta effekter på stimulerad DA-frisättning eller upptag (data visas inte). BD-1063 förhindrade METH (5 um) förbättring av stimulerad DA-frisättning med ~ 50% (figur 3a och c, vänster; 100 nM BD-1063: F 1, 16 = 4, 96, p <0, 05) och METH-driven DA efflux med 80% (figur 3b och c, höger; 100 nM BD-1063: F 1, 9 = 12, 97, p <0, 01). Dessa effekter tycktes bero på inaktivering av ß 1R och inte σ 2R på grund av den höga affiniteten för BD-1063 för σ 1R ( Ki = 9 nM för σ 1R vs 449 nM för σ 2R). Därför verkar σ 1R-aktivering vara involverad i METH: s effekter på både stimulerad och icke-stimulerad DA-frisättning.

Sigma-receptorantagonisten BD-1063 reducerar metamfetamininducerad dopaminfrisättning i nucleus accumbens kärnan ex vivo . (a) Representativa överlagrade ström vs tidsplaner som jämför METH-effekter på framkallade DA-frisättning i NAc-kärnan under kontrollförhållanden vs i närvaro av σR-antagonisten BD-1063 (1 μM), vilket måttligt reducerade METH-inducerad framkallade DA-frisättning. (b) Metamfetamininducerat DA-utflöde avskaffades av BD-1063 (100 nM). (c) BD-1063 reducerade signifikant både METH-inducerad framkallad DA-frisättning (vänster) och DA-utflöde (höger). Värden inom parentes indikerar n- värden. (d, e, f) TEMPOL, en superoxid-dismutas-mimetisk förening, reducerade signifikant både METH-inducerad framkallad DA-frisättning (f, vänster) och DA-utflöde (f, höger). Asterisker (*, **) representerar signifikansnivåerna p <0, 05 respektive p <0, 01. DA, dopamin; METH, Methamphetamine.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Antioxidanter förhindrar METH-inducerad DA-frisättning

METH kan påverka DA-frisättning genom dess oxidativa stresseffekter via ROS-bildning (Imam et al, 2001a; Solhi et al, 2014; Walker et al, 2014). Faktum är att σ 1R-aktivering inducerar ROS-bildning, vilket kan bidra till METH: s effekter på DA-frisättning. Därför undersöktes effekterna av TEMPOL, en superoxidavfallare, på METH (5 μM) förändringar i DA-frisläppande. I likhet med tidigare resultat (Jang et al, 2017) hade TEMPOL (1 mM) inga uppenbara direkta effekter på stimulerad DA-frisättning eller upptag (data visas inte). TEMPOL försvagad METH-inducerad förbättring av stimulerad DA-frisättning med 45% (figur 3d och f, vänster; 1 mM TEMPOL: F 1, 17 = 5, 51, p <0, 05), och minskade METH-framkallade DA-utflöde med 67% (figur 3e och f, höger; 1 mM TEMPOL: F 1, 10 = 5, 34, p <0, 05). Genomsnittliga råa DA-koncentrationer för TEMPOL är: kontrollbaslinje = 0, 57 ± 0, 15 μM; kontroll METH = 1, 52 ± 0, 32 μM; experimentell baslinje = 0, 53 ± 0, 08 μM; TEMPOL + METH = 0, 99 ± 0, 10 μM. Därför är ROS-produktion involverad i METH: s effekter på stimulerad DA-frisättning och DA-utflöde.

ROS Impair VMAT2-funktion

ROS-bildning kan leda till protein S- glutationjonylering. Denna post-translationella modifiering involverar kovalent konjugering av tiolgruppen med reducerad glutation (GSH) till cysteinrester på proteiner, som sedan kan förändra proteinfunktionen (för granskning se (Womersley och Uys, 2016)). När METH ökar ROS-bildningen, kan METH påverka VMAT2-funktionen och DA-vesikulär förpackning genom denna proteinmodifiering (Uys et al, 2014). Därför undersöktes effekterna av ROS på VMAT2-funktionen och S- glutionionylering. Eftersom METH har direkta effekter på VMAT2-funktionen (Fleckenstein et al, 2009) testades effekterna av disulfiram (en molekyl som inducerar ROS-bildning; 10 μM) och GSH (10 mM) på VMAT2-funktionen. Disulfiram minskade markant VMAT2-funktionen i en VMAT2-aktivitetsanalys med användning av proteinrenad från färsk mus NAc-vävnad (kompletterande figur 1A; F 1, 6 = 576, 96, p <0, 001). Rekombinant humant VMAT2-protein exponerades för disulfiram och GSH och analyserades därefter med användning av masspektrometri. Cys-rest 488 identifierades som ett ställe som är mottagligt för S- glutationjonylering (kompletterande figur IB). Därför kan ROS-bildning inducera S- glutationjonylering av VMAT2 som minskar VMAT2-aktiviteten, vilket resulterar i försämrad vesikulär förpackning av DA.

Akut METH orsakar S- glutationylering av VMAT2

Eftersom VMAT2-funktionen inhiberades in vitro och tycktes involvera S- glutationylering av Cys 488, testades effekterna av METH på VMAT2 Cys 488 S- glutionionylering in vivo . En samimmunutfällningsanalys användes för att bestämma omfattningen av VMAT2S-glutationylering. METH (intraperitoneal, 10 mg / kg) ökade modifierade VMAT2-nivåer. Vidare dämpade förinjicering av BD-1063 (intraperitoneal, 30 mg / kg) METH: s effekter på VMAT2S-glutationionylering (figur 4; F 2, 9 = 4, 26, p = 0, 006). Därför involverar METH-inducerad S- glutationionylering av VMAT2 och efterföljande nedsatt VMAT2-aktivitet METH: s effekter på σ 1R-aktivitet.

S- glutationjonylering av VMAT2 efter akut metamfetamin. Fluorescerande intensiteter för S- glutationylerad VMAT2 normaliserade mot total VMAT2-intensitet ( n = 4). Djur injicerade med METH (10 mg / kg, IP) visar ökade nivåer av S- glutationjonylering jämfört med kontrollerna. BD-1063 (30 mg / kg, IP) reducerar METH-förbättring av S- glutationjonylering. Asterisker (*, ***) representerar signifikansnivåerna p <0, 05 respektive p <0, 001. Värden inom parentes indikerar n- värden. METH, Methamphetamine.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

METH-inducerad cirkelbeteende är beroende av σ 1R

Amfetaminer ökar lokomotorisk aktivitet genom att öka DA-transmission och samadministrering av DA-receptorantagonister i NAc inducerar cirklingbeteende (Ikeda et al, 2007). Därför kan förändringar i cirkelbeteende indikera relativ styrka av METH: s effekter på DA-frisläppande. Deltagandet av σ 1R-aktivering i METH: s (intraperitoneala, 5 mg / kg) effekter på cirklande beteende testades (figur 5). Envägs ANOVA avslöjade en huvudeffekt av behandlingen på cirklande beteende (figur 5a; F 2, 12 = 12, 92, p = 0, 004). Intra-NAc-injektioner av BD-1063 (5 μg) ökade tiden som användes för att cirkulera ipsilateralt till mikroinsprutningen (METH + BD) jämfört med ACSF (METH + BD vs METH + ACSF; t = -4, 82, p = 0, 001, n = 8) eller saltlösning (intraperitoneal) och BD-1063 kontroller (METH + BD vs saltlösning + BD; t = 3, 60, p = 0, 01, n = 8 respektive n = 6). Ipsilateral cirkulation skilde sig inte signifikant mellan METH + ACSF och saltlösning + BD-behandlingar ( t = -1, 61, p = 0, 281). Behandling tycktes inte påverka tiden som använts i cirkeln i kontralateralt läge vid mikroinjektionen (saltlösning + BD: 7, 89 ± 5, 20 vs METH + BD: 377, 45 ± 199, 18 vs METH + ACSF: 121, 44 ± 68, 98; F 2, 12 = 3, 01, p = 0, 1293). Det fanns en trend mot allmän ökad lokomotorisk aktivitet i behandlingsbetingelserna som involverade METH-injektioner; emellertid avslöjade ANOVA inte någon signifikant effekt av behandlingen på lokomotorisk aktivitet (figur 5b; saltlösning + BD: 100 ± 0%, METH + BD: 196, 51 ± 12, 85%, METH + ACSF: 221, 76 ± 42, 56%; F 2, 8 = 6, 42, p = 0, 0553; n = 5 vardera). Posthum identifiering av plats för mikroinjektion verifierade att BD-1063 och ACSF-mikroinjektioner var lokaliserade i NAc-kärnan och skalregionerna (figur 5c). Därför resulterar inaktivering av σ 1Rs med BD-1063 i METH-inducerat cirklingbeteende, troligtvis genom reducerade METH-effekter på DA-frisättning i BD-1063 ipsilaterala infunderade regioner.

Cirkelbeteende efter akut metamfetamin. (a) Intraperitoneal METH inducerar en viss, om än obetydlig, cirkulering ipsilateral till en ACSF-infusionskontroll genom en ensidig ledningskanyl. När BD-1063 upplöses i ACSF-kanylinfusion, producerar en systemisk METH-injektion djup ipsilaterala cirkulationer. Ensidig BD-1063-infusion utan METH-injektion misslyckas med att inducera ipsilateral cirkling på egen hand. (b) Systemisk METH verkar inducera ökad lokomotorisk aktivitet. Denna ökning verkar inte dämpas genom kanylinfusion av BD-1063 upplöst i ACSF. (c) Anatomiska diagram som visar plats för guidekanuler. Asterisk (*) representerar signifikansnivå p <0, 05. ACSF, konstgjord cerebrospinalvätska; METH, Methamphetamine.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Diskussion

Blockering av spänningsgrindade natriumkanaler förhindrar åtgärdspotentialberoende DA-frisättning, medan METH-inducerad DA-utflöde förhindrades med DAT-blockad via GBR-12909, vilket indikerar att de mekanismer som ligger till grund för METH: s effekter på dessa två frisättningsformer är grundläggande olika (Jones et al., 1998b; Schmitz et al, 2001; Sulzer, 2011). METH har många effekter som kan öka DA-frisättningen. Exempelvis ökar amfetamin neuronal excitabilitet genom ökningar i DAT-medierade strömmar, vilket resulterar i membran depolarisering och ökad avfyrning (Ingram et al, 2002). Amfetaminer ökar också DA-signaler vid terminaler genom att minska DAT-aktivitet så att DA-signaler från stimuleringar med flera puls är mer känsliga för hämning av upptag (Siciliano et al, 2014). Föreliggande studie indikerar att METH: s effekter på DA-frisläppande är mer komplexa än direkta interaktioner med DAT och VMAT2, som involverar aktivering av σ 1Rs och efterföljande modifikationer i VMAT2-funktionen. Blockering av 1 1Rs med BD-1063 dämpade både METH-inducerade ökningar i verkan potentialberoende frisättning och DAT-medierat utflöde. METH är en potent σ 1R-agonist (Maurice och Su, 2009) och aktivering av σ 1R inducerar ROS-produktion, som sedan modifierar VMAT2-aktivitet genom S- glutionionylering av Cys 488.

Tidigare studier som använde kumulativa koncentrationer över flera timmars METH har visat endast minskningar i framkallade DA-frisläppande vid högre koncentrationer (John och Jones, 2007; Siciliano et al, 2014), troligtvis på grund av effekterna av blödesutarmning för dessa längre experiment. För att studera de DA-förbättrande effekterna av METH på framkallad frisättning över flera koncentrationer applicerades därför enskilda koncentrationer på enskilda skivor.

Sigma-mottagarens roll i METH-inducerad DA ökar

Σ 1R skiljer sig grundläggande från klassiska ligandaktiverade receptorer såsom G-proteinkopplade receptorer och jonkanaler, i och med att den inte är en plasmamembranreceptor utan fungerar främst som en chaperonreceptor (Matsumoto et al, 2014). METH: s DA-förbättrande effekter verkar involvera den σ 1R-signaleringskaskaden som den selektiva σ 1R-antagonisten BD-1063 försvagade METH-inducerade ökningar i stimulerad och icke-stimulerad frisättning. Kokain är en annan σ R-agonist (Maurice och Su, 2009), vilket antyder att kokain, liknande METH, kan förbättra DA-frisläppningen delvis genom σ R-aktivering. Faktum är att både METH och kokain ökar elektriskt stimulerat DA-frisläppande (Jang et al, 2015; 2017). Men liknande GBR-12909 är kokain också en DAT-blockerare och kan sannolikt förhindra σ 1R-beroende DAT-medierat DA-utflöde. Viktigare är det som ett substrat för DAT att METH är mer farmakologiskt aktivt vid intracellulära sigma-receptorer än kokain, och huruvida kokain interagerar med sigma-receptorer för att påverka DA-frisättning behöver ytterligare undersökning.

METH-inducerad produktion av ROS

METH inducerar oxidativ stress i nervvävnad (Jang et al., 2015) och återhämtande av METH-missbrukare uppvisar högre nivåer av oxidativ stress (Huang et al, 2013). Det antas i stor utsträckning att det mesta av den oxidativa stressen förknippad med METH-missbruk är resultatet av höga nivåer av extra-vesikulärt DA som sedan oxideras och metaboliseras (t.ex. en biprodukt av monoaminoxidas är väteperoxid) Detta tycks emellertid inte vara den enda källan till oxidativ stress i DA-terminaler efter METH. Till exempel hämmar METH också komplexen I, II, III och IV i elektrontransportkedjan i mitokondrierna (för fullständig granskning se (Barbosa et al, 2015)), vilket indikerar att det finns andra potentiella källor till oxidativ stress. För närvarande användes TEMPOL för att reducera exponering av superoxid orsakad av METH. När TEMPOL dämpas METH-inducerad ökning av DA-frisläppande är det troligt att METH-inducerad oxidativ spänning är uppströms för DA-vesikulärt läckage och efterföljande DA-auto-oxidation. Dessutom dämpar TEMPOL mitokondriell inducerad oxidativ skada genom METH och METH-inducerad sensibilisering (Shiba et al, 2011) såväl som med kokain in vivo (Jang et al, 2015), vilket indikerar att METH: s och kokainens oxidativa stresseffekter är involverade i aspekter av förstärkning av psykostimulant.

METH-inducerad oxidativ stress och VMAT2

Mekanismerna som är involverade i METH-triggad oxidativ stress belyses fortfarande. Kronisk oxidativ stress från METH-exponering tros bidra till dess neurotoxiska effekter (Yu et al, 2015), men de omedelbara konsekvenserna av ROS är inte väl förståda. Reaktiva radikaler kan leda till S- glutationjonylering, en post-translationell modifiering av cysteinrester som kan leda till funktionella förändringar i målproteiner (Uys et al, 2014). För närvarande avslöjade mass-spektrometri-experiment med hög upplösning att disulfiram inducerade S- glutationylering (Rossi et al, 2006) på Cys 488 av VMAT2. Disulfiram minskade VMAT2-funktionen, förmodligen genom denna Cys-modifiering. Dessutom ökade en enda METH-exponering in vivo VMAT2 Cys 488 S- glutationionylering. Minskad VMAT-funktion tros förhindra att vesiklar upprätthåller 'normala' DA-koncentrationer, vilket resulterar i DA-läckage (Sulzer, 2011), antingen genom inneboende läckande vesiklar (Floor et al, 1990) eller genom en störd protongradient (Freyberg et al, 2016 ). Därför kan METH-inducerade minskningar av VMAT-funktion resultera i ökad cytosolisk DA. Ökad cytosolisk DA skulle då kunna överväldiga den aktiva transporten av DAT, vilket kan leda till DA-utflöde genom DAT. Samtidigt med dessa effekter ökar uppbyggnad och nedbrytning av DA oxidativ stress (både inuti och utanför cellen), eftersom DA-metaboliter inkluderar superoxid, väteperoxid och 3, 4-dihydroxyfenylacetaldehyd (DOPAL) (Casida et al, 2014; Kita et al, 1999; LaVoie och Hastings, 1999). Detta bidrar till METH-inducerad neurotoxicitet. Som stöd för dessa fynd har det visats att ökande uttryck av VMAT2 skyddar mot METH-neurotoxicitet (Lohr et al, 2015) och att kroniska METH-användare visar utarmat VMAT2-uttryck (Johanson et al, 2006).

I den aktuella studien framkallade METH framkallade DA-frisläppande, vilket TEMPOL-applikationen dämpade. Detta antyder att i likhet med METH-inducerat DA-utflöde, ökningar i framkallade DA-frisättning också involverar bildandet av ROS. Mekanismerna bakom ROS-inducerade ökningar av DA-frisläppande är emellertid oklara och kan ha flera effekter på DA-terminaler. Dessutom är det tveksamt att denna effekt involverar VMAT2-försämring och resulterande vesikulär utarmning, eftersom VMAT2-hämmaren reserpin endast verkar minska framkallade DA-frisläppande (Yorgason et al, 2017; Gantz et al, 2013). METH-inducerad ROS-bildning inkluderar icke-enzymatisk bildning av kväveoxid (Friend et al, 2014). Kväveoxid har visat sig öka framkallat DA-frisläpp genom direkta och indirekta effekter på DA-terminaler, en effekt som förhindras av kväveoxidavfallare (Hartung et al, 2011). Därför ökar METH troligtvis DA-frisättning delvis genom bildning av kväveoxid och nedströmseffekter på lokal internuronaktivitet på DA-terminaler. TEMPOL är en kväveoxidavskiljare och bör därför dämpa eventuella kväveoxidinducerade ökningar av DA-frisläppande. Det är viktigt att de flera pulsstimuleringar som används i den här studien kan vara särskilt känsliga för METH-inducerade ökningar på grund av ökad konkurrens vid DAT på grund av ytterligare DA (Siciliano et al, 2014). Faktum är att METH-ökningar väckte DA-frisläppning lättare genom multipla vs enstaka pulsstimuleringar (Siciliano et al, 2014; John och Jones, 2007). Emellertid är kväveoxidförbättrad DA-frisättning också större under stimuleringar med flera puls (Hartung et al, 2011). Därför verkar METH-inducerade ökningar i framkallade DA-frisättning involvera flera faktorer.

METH-inducerad cirkelbeteende

METH-behandling efter 6-OHDA-lesioner av den mesolimbiska vägen har visat sig ge ipsilateralt cirklande beteende hos råttor (Ali et al, 1995; Jalewa et al, 2017). Dessutom kan ensidig behandling med D1 / D2-receptoragonister inducera kontralateral cirkling, en effekt som kan avskaffas genom ipsilateral injektion av en D1 / D2-receptorantagonist (Ikeda et al, 2007; Saigusa et al, 1993). Detta indikerar att cirkling resulterar från en obalans i DA-överföring mellan de två halvkuglen. I denna studie gav unilaterala injektioner av BD-1063 i det ventrala striatum en ökning i ipsilateralt cirklingbeteende efter behandling med systemisk METH. När BD-1063 minskar METH-inducerad DA ökar ex vivo producerar det troligtvis en obalans in vivo i NAc DA-transmission för att producera ipsilateralt cirkulationsbeteende. Således verkar σ 1R-aktivering ha en nyckelroll i METH: s förmåga att öka DA-signalering och relaterat beteende. Eftersom amfetaminer förbättrar konditionerat lärande och målinriktat beteende genom ökad frisättning av DA under fasisk DA-avfyrning (Knutson et al, 2004; Wyvell och Berridge, 2000), är det troligt att läkemedel som är inriktade på σ 1R kan bidra till att minska förstärkningsvalensen hos METH, men detta måste testas uttryckligen.

Slutsatser

På grundval av de aktuella studierna föreslås en modell av METH: s åtgärd på σ 1R och nedströmseffekter i DA-terminaler (kompletterande figur 2). METH kommer in i DA-terminalen genom DAT, dämpar DA-godkännande för att öka DA-frisläppandet. Väl inne i cellen aktiverar METH σ 1R, vilket ökar Ca 2+ -signaleringen mellan den smidiga ER och mitokondrierna (Ruscher och Wieloch, 2015). Denna frisättning av intracellulär Ca 2+ ökar framkallade DA-frisläppande (Fernandes et al, 2004; Kataoka et al, 1994) genom icke beskrivna mekanismer. Ökad intracellulär Ca 2+ avbryter sedan mitokondriell funktion och resulterar i superoxidproduktion. Superoxid (mekanistiskt relaterat till många andra ROS (Bellinger et al, 2009)) utlöser S- glutationionylering av VMAT2, vilket försämrar VMAT2-funktionen och gör det möjligt att tappa DA-innehållande vesiklar. DA som släpps från vesikelpooler rinner ut genom det komprometterade DAT. Sammantaget indikerar de nuvarande uppgifterna att σ 1R och relaterat oxidativt stressmaskineri kan vara lämpliga mål för behandling och förebyggande av missbruk och beroende av METH.

Finansiering och avslöjande

Detta arbete stöds av NIH Grants AA020919 och DA035958 till SCS, DA040409 till JTY och AA024426 och GM103542-02 till JDU. Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande material och metoder

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Neuropsychopharmacology (//www.nature.com/npp)