Metatranscriptomic analys av autonomt samlat och bevarat marint bakterioplankton | isme journal

Metatranscriptomic analys av autonomt samlat och bevarat marint bakterioplankton | isme journal

Anonim

ämnen

  • Genexpression
  • Mikrobiell biooceanografi
  • transkriptomik

Abstrakt

Planktonisk mikrobiell aktivitet och samhällsstruktur är dynamisk och kan förändras dramatiskt på tidsskalor från timmar till dagar. Ändå av logistiska skäl är denna temporära skala vanligtvis underprovade i den marina miljön. För att underlätta högre upplösning, långsiktig observation av mikrobiell mångfald och aktivitet, utvecklade vi ett protokoll för automatiserad insamling och fixering av marina mikrober med hjälp av plattformen för miljöprover (ESP). Protokollet tillämpar ett konserveringsmedel (RNALater) på celler som samlats in på filter, för långvarig lagring och konservering av total cellulärt RNA. Mikrobiella prover som bevarades med användning av detta protokoll gav högkvalitativt RNA efter 30 dagars lagring vid rumstemperatur, eller ombord på ESP vid temperaturer på plats. Pyrosquencing av komplementära DNA-bibliotek genererade från ESP-insamlade och konserverade prover gav transkript-överflödsprofiler som nästan inte kan skiljas från de härledda från konventionellt behandlade replikatprover. För att demonstrera metodens användbarhet använde vi en förtöjd ESP för att fjärr och autonomt samla Monterey Bay havsvatten för metatranscriptomic analys. Gemenskapens RNA extraherades och pyrosekvenserades från prover uppsamlade vid fyra tidpunkter under loppet av en enda dag. I alla fyra proverna var de syrehaltiga fotoautotroferna övervägande eukaryota, medan bakteriesamhället dominerades av Polaribacter- liknande Flavobacteria och en Rhodobacterales- bakterie som delade hög likhet med Rhodobacterales sp. HTCC2255. Emellertid var varje tidpunkt förknippad med distinkt artens överflöd och gentranskriptprofiler. Dessa laboratorie- och fälttest bekräftade att autonom insamling och konservering är en genomförbar och användbar metod för att karakterisera de uttryckta generna och miljöresponserna i marina mikrobiella samhällen.

Introduktion

Gemenskapssekvenseringstekniker har blivit ett framträdande verktyg inom mikrobiell ekologi. Marina miljöer har varit i fokus för stora metagenomiska undersökningar som har gett insikt i mikrobiellt geninnehåll och samhällsstruktur (Venter et al., 2004; DeLong et al., 2006; Martin-Cuadrado et al., 2007; Rusch et al., 2007; Feingersch et al., 2010). Metatranscriptomic analyser, med deras fokus på gemenskapens transkriptionella aktivitet, ger också insikt i samhällsfunktion och genreglering (Frias-Lopez et al., 2008; Poretsky et al., 2009; Shi et al., 2009; Hewson et al., 2008; al., 2010). Nuvarande protokoll för sådana studier kräver emellertid manuell provbearbetning och insamling av ombord, och som ett resultat är samplingsscheman ofta begränsade av fartygets tillgänglighet, logistik för provtagning av ombord och kostnader. Med tanke på vikten av episodiska leveranser av näringsämnen vid modulering av biogeokemiska cykler (Fasham et al., 2001; Karl et al., 2001; Karl, 2002), behövs nya verktyg för observation och provtagning av mikrober för att underlätta observation av mikrobiella processer på ekologiskt sätt meningsfulla temporära och rumsliga skalor.

Syftet med denna studie var att utveckla protokoll för automatiserad insamling och bevarande av prover för transkriptomisk analys med hjälp av miljöprovprocessorn (ESP), en automatiserad plattform för vattenprovtagning och molekylanalys. ESP är ett automatiserat fluidhanteringssystem som samlar och bearbetar biologiska prover från havsvatten (Scholin et al., 2009). Nuvarande realtidsfunktioner inkluderar matrisbaserad detektion av målorganismer inklusive skadliga algarter (Greenfield et al., 2006, 2008; Haywood et al., 2007), ryggradslövlarver (Goffredi et al., 2006; Jones et al., 2007) 2008) och stora bakterie- och archaeallader (Preston et al., 2009). Kvantitativa PCR-kapaciteter är också för närvarande under utveckling (Scholin et al., 2009). ESP kan returnera prover som bevarats i en saltlösning-etanollösning, men provanalysen har primärt varit begränsad till hybridiseringstekniker in situ (Goffredi et al., 2006; Greenfield et al., 2006, 2008; Jones et al., 2008). För att utvidga omfattningen av laboratorieanalys av arkiverade prover utvecklades nya protokoll för provbevaring för genuttrycksanalys och transkriptomik.

I denna studie validerade och fälttestade protokoll för automatiserad insamling och bevarande av mRNA från samhället från prover av marin bakterioplankton. Tillsammans med ESP-plattformen (Scholin et al., 2009) möjliggör dessa protokoll den autonoma samlingen av prover och deras återkomst till laboratoriet för transkriptionell analys. Eftersom ESP också innehåller standard oceanografisk instrumentering och förmågan att överföra insamlade data och ta emot fjärrkommandon, är miljökontextövervakning och händelsessvar också möjliga. Efter framgångsrika laboratorietester användes våra protokoll i fältutplaceringar. Vi använde ESP och tidigare utvecklade metatranscriptomic-protokoll för att analysera mikrobiellt samhällsgenuttryck i Monterey Bay, ett kustsystem som har varit i fokus för tidigare molekylära mikrobiella samhällsanalyser (Suzuki et al., 2001, 2004; O'Mullan och Ward, 2005 ; Mincer et al., 2007; Rich et al., 2010). Transkriptomisk analys av ESP-samlade ytvattenprover gav högupplösta sekvensdata användbara för att bestämma identiteten, relativa överflödet och uttryckte genprofiler för dominerande marin bakterioplankton.

Resultat och diskussion

Validering av ESP-konserveringsprotokoll

Efter insamling och konservering på ESP befanns marina bakterioplanktonprover vara stabila under minst 4 veckor (figur 1). I ett experiment filtrerades och replikerades replikatprover av ett ytvattenprov nära kusten och bevarades med användning av en ESP i laboratoriet och lagrades under ESP-liknande förhållanden vid rumstemperatur (hög luftfuktighet, N2-atmosfär). Var och en av de fem proverna som behandlades med veckointervall hade liknande utbyten (tabell 1) och gelelektrofores indikerade jämförbar RNA-kvalitet (diskreta 16S- och 23S-rRNA-toppar utan uppenbar nedbrytning) (figur la). I ett separat fältprov extraherades RNA från celler som hade filtrerats och fixerats av ESP under en 29-dagars installation i Monterey Bay. Dessa in situ- filtrerade och fixerade celler gav också höga utbyten av RNA (tabell 1) med jämförbar hög kvalitet över alla provtagna tidpunkter (figur Ib). Vi drar slutsatsen att ESP-provtagnings- och konserveringsprotokollet tillhandahåller material som är tillräckligt för nedströms extraktion av högkvalitativt, högt utbyte av totalt cellulärt RNA.

Storleksfraktionering av totalt RNA extraherat från ESP-insamlade och konserverade prover. Alla prover späddes till ungefär lika stora koncentrationer före analys för att underlätta jämförelse av RNA-kvalitet. ( a ) Totalt RNA extraherat från replikatytvattenprover som samlats upp och konserverades med hjälp av ESP och lagrades vid rumstemperatur under förhållanden som simulerar ett utplacerat instrument (hög luftfuktighet, N2-atmosfär). ( b ) Totalt RNA extraherat från prover som samlats in under en enda distribution av ESP vid Monterey Bay station M0.

Bild i full storlek

För att utvärdera bevarandet av mRNA behandlades ett ytvattenprov nära kusten taget från den kommunala hamnen i Santa Cruz via ESP för filtrering och fixering och utsattes sedan för 29 dagars lagring ombord på instrumentet under en utplacering i Monterey Bay. Detta prov, och ett kontrollprov som filtrerades parallellt genom vakuumfiltrering och omedelbart bli fryst, användes för att framställa ett transkriptom-pyrosekvensbibliotek för gemenskapen. Transkriptionsöverskottsprofiler för det konventionellt bearbetade flashfrysta provet och det 29-dagars ESP-konserverade provet var mycket lika, med endast 6 av 17 284 transkript som visade signifikant olika mängder i de två proverna (figur 2, tabell 3). Ett ESP-bearbetat och konserverat prov samlat nära MBARI-stationen M1 i Monterey Bay jämfördes också med ett replikatprov behandlat genom snabb peristaltisk pumpfiltrering. Detta par prov gav återigen liknande transkriptionsfrekvensprofiler, med signifikanta skillnader för 28 av 35 036 referensgener (kompletterande figur S1, kompletterande tabell S1).

Metatranscriptomic analys av ESP-samlade och bevarade prover. Överflödet av referensgener av NCBI-nr visas för ett prov som samlats in av ESP och kvarhålls på instrumentet för en 29-dagars installation i Monterey Bay och ett replikatprov som samlats in genom vakuumfiltrering och snabbfryst. För visualiseringsändamål visas referensgener med 0 tilldelade sekvenser i en av de två datamängderna som 0, 5 sekvensläsningar. Referensgener med signifikant olika mängder i de två datamängderna (falsk upptäcktsfrekvens-korrigerad P- värde <0, 05) är markerade med rött. Anslutningsnummer och P- värden för signifikant olika referensgener listas i tabell 3.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Båda våra jämförelser av ESP- och manuellt bearbetade prover gav antal signifikant olika referenser, och procentsatser av sekvensläsningskartläggning till signifikant olika transkript, som fanns inom det intervall som vanligtvis observerades för tekniskt replikerade metatranscriptomiska profiler (Stewart et al., 2010; se; Kompletterande tabell S2 för jämförelser omberäknade med hjälp av vår uppdaterade databas och avgränsningar). Faktum är att provet som utsattes för långvarig lagring ombord på instrumentet (Santa Cruz wharf ESP) liknade dess manuellt bearbetade kontroll (när det gäller taxonomisk sammansättning och signifikant olika transkript), än var de ihopkopplade fartygsproverna ( Station M1 PP och ESP), i vilken det ESP-samlade provet omedelbart avlägsnades från instrumentet och lagrades vid -80 ° C (tabell 4). Detta antyder att den använda vattenfiltreringsmetoden kan ha större påverkan på den observerade metatranscriptomic-profilen än tiden mellan konservering och borttagning till permanent temperatur vid låg temperatur.

Full storlek bord

Metatranscriptomic analys av Monterey Bay ytvattenprover

Fyra tidpunkter under en utplacering av ESP i Monterey Bay ytvatten valdes för transkriptom sekvensering. Dessa tidpunkter representerade transkriptomiska profiler av mikrobiella samhällen vid gryningen (0500–0600 timmar), sent på morgonen (1000–1100 timmar), skymning (1800–1900 timmar) och natt (2200–2300 timmar) den 2 juni 2009. Som ESP utplacerades i en förtöjd konfiguration, dessa prover representerade distinkta mikrobiella populationer från vattenmassor med olika fysikaliska och kemiska förhållanden (kompletterande figurer S2 och S3, kompletterande tabell S3). För att ge genomiskt sammanhang och ytterligare information om befolkningsstrukturen extraherades DNA-samhället och sekvenserades från ett 10 l vattenprov som samlades in nära ESP den 2 juni 2009.

Taxonomisk sammansättning av metanolomiska och metatranscriptomiska stationer från station M0

Metagenomiska och metatranscriptomiska sekvenser tilldelades taxonomiska grupper med användning av MEGAN (Huson et al., 2007) för att analysera både proteinkodande regioner och rRNA SSU och LSU-sekvenser (figur 3). Den metagenomiska datauppsättningen visade en liknande taxonomisk sammansättning bland alla transkripttyper, med ett primärt bakteriesamhälle som dominerades av flavobacteria och alfa- och gamma-proteobacteria. Cyanobakteriella sekvenser representerade endast en liten andel metagenomiska och metatranskriptomiska bibliotek, vilket tyder på att primärproduktionen i dessa prover dominerades av eukaryotisk fytoplankton. En mångfald av sekvenser från eukaryotisk nano- och pico-plankton med förmåga att passera genom 5 mikrometerfiltret upptäcktes i metatranscriptomic-prover. SSU-rRNA-baserad analys visade en högre representation av eukaryota organismer i metatranscriptomiska prover än i metagenomet, i överensstämmelse med tidigare observationer att eukaryotisk picoplankton uppvisar högre transkriptionell aktivitet relativt till genomiskt överflöd än bakterier (Man-Aharonovich et al., 2010). I taxonomiska analyser av LSU-rRNA och kodande sekvenser representerade eukaryoter en mycket mindre andel av tilldelade sekvenser än förväntat baserat på SSU-rRNA-resultaten, men detta kan bero på begränsad databasstäckning av marina picoeukaryoter.

Relativ överflöd av stora taxonomiska grupper i metatranscriptomic och metagenomic prover. Sekvenser tilldelades NCBI-taxonomin med MEGAN-programmet (Huson et al., 2007), (bitscore> 50, topp 10% av träffar). Taxonomiska analyser av SSU- och LSU-rRNA-sekvenser baseras endast på osubtraherade RNA-prover. Kodningssekvenstaxonomi genererad från den kombinerade icke-replikerade, icke-rRNA-fraktionen av både icke-subtraherad och subtraherad RNA. Grupper som representerar> 1% av tilldelningsbara sekvenser i ett eller flera prover visas, de som representerar <1% av sekvenserna i alla prover ingår i kategorin 'andra' och de tilldelade vid lägre taxonomiska nivåer visas inte.

Bild i full storlek

Den annoterade proteinkodande transkriptpoolen innehöll två särskilt rikliga organismer / grupper. Den första var en alfa-proteobacterium nära relaterad till Rhodobacterales sp. HTCC2255. HTCC2255 är en proteorhodopsin-innehållande Roseobacter av NAC11-7 clade (Newton et al., 2010; Yooseph et al., 2010) som isolerades genom utspädning till utrotning nära kusten i Oregon som en del av kulturen med hög genomströmning ( Connon och Giovannoni, 2002). HTCC2255 var också den oftast identifierade taxonen i båda vattenproven som användes för valideringsstudier, och utgör> 25% av tilldelade icke-rRNA-sekvenser i de två Santa Cruz-wharf-transkriptomerna och ∼ 10% av tilldelningsbara sekvenser från Station M1-transkriptomer (kompletterande Figur S4). Den andra mycket rikliga gruppen av sekvenser verkar representera en eller flera Flavobacteria , som är närmast besläktade med de två sekvenserade Polaribacter- arterna, Polaribacter sp. MED152 (González et al., 2008) och P. irgensii 23-P (Gosink et al., 1998). Totalt tilldelades 8–9% av sekvenserna från Santa Cruz-hamnen, men <2% av sekvenserna från Station M1-proverna, en av dessa två Polaribacter- genomer.

Andra bakterier som representerar betydande andelar av samhället inkluderade gammaproteobacterium HTCC2207 (Stingl et al., 2007), en mångfald av Flavobacteria inklusive Flavobacteria sp. MS024-2A (Woyke et al., 2009) och eubacterium SCB49 (Yooseph et al., 2010). Ostreococcus (Derelle et al., 2006; Palenik et al., 2007) och Micromonas (Worden et al., 2009) var bland de vanligaste picoeukaryoterna identifierade i antecknade proteinkodande transkript, men rRNA-baserad analys antyder en stor mångfald av eukaryoter utan sekvenserade genom var närvarande i proverna.

I de fyra tidpunkterna förblev samhällssammansättningen i stort sett likadan, med Whittakers föreningsindex (Whittaker, 1952) värden mellan 0, 68–0, 85 för NCBI-taxonräkningar (kompletterande tabell S2). De fem vanligaste bakterietaxorna dominerade i alla fyra proverna (kompletterande figur S5), även om picoeukaryoten Ostreococcus lucimarinus visade mer dramatiska förändringar i överflöd mellan de olika proverna. Alla taxa närvarande vid> 0, 02% av unikt tilldelbara transkript i minst ett prov detekterades i alla fyra prover. Men de relativa RNA-mängderna av dessa organismer varierade dramatiskt. En av de största förändringarna var i O. lucimarinus- liknande sekvenser, som sträckte sig från 0, 2% till 6, 2% av transkript, medan MED152-liknande sekvenser varierade från 5, 5% till 16, 8% och HTCC2255-liknande sekvenser från 9, 12% till 16, 7%. Denna variation är större än skillnaderna som ses i jämförelser av rikliga taxa i transkriptomiska profiler på olika djup i den euphotiska zonen vid stationen ALOHA (Shi et al., 2010) eller av dag- och nattprov samlade med två dagars mellanrum på en enda station i North Pacific Subtropical gyre (Poretsky et al., 2009). Dessa jämförelser kan emellertid inte oberoende skilja mellan förändringar i överflöd av organismer och förändringar i aktivitetsnivå (cellulärt RNA-innehåll). Till exempel, i inkubationsförsök där dimetylsulfoniopropionat sattes till oligotrofiskt vatten, observerades märkbara förändringar i transkripttaxonomisk sammansättning inom 30 minuter, förmodligen för kort intervall för omfattande tillväxt (Vila-Costa et al., 2010).

Rhodobacterales sp. HTCC2255

HTCC2255-liknande transkript var rikligt vid alla fyra tidpunkter. HTCC2255 var bland de högst rankade justeringarna i databasen NCBI-nr, och stod för totalt 12%, 14%, 15% och 8% av tilldelningsbara sekvenser i metatranscriptomiska datauppsättningarna 0500, 1000, 1800 och 2200 timmar och en motsvarande 9%, 10%, 11% och 6% av sekvenserna kunde otvetydigt tilldelas HTCC2255 av Megan LCA-algoritmen. HTCC2255-liknande proteinkodande gener var i genomsnitt 95% identitet till den sekvenserade stammen på aminosyranivån (figur 4). Sammantaget identifierades 2092 av 2240 av HTCC2255-kodande sekvenser i minst en av de fyra Station M0-transkriptomerna, inklusive proteorhodopsin, full citratcykel och gener involverade i dimetylsulfoniopropionatnedbrytning och svaveloxidation. Utkast till genomsekvens för HTCC2255 har två ställningar, NZ_DS022282 och NZ_DS022288, varav den mindre, NZ_DS022288 har mycket lägre täckning i både metagenomet och transkriptomerna (kompletterande figur S6). Detta kan representera en mindre konserverad genomisk ö, eller en plasmid som saknas från Monterey Bay-genotypen. Alternativt noterar metadata förknippade med utkastet genomet att kontaminerande gammaproteobacteria- sekvenser var närvarande i råsekvensdata och avlägsnades från byggnadsställningarna under utkastmontering; NZ_DS022288 kan representera ett byggnadsställning som inte tilldelades HTCC2255.

Procent identitetshistogram för sekvenser tilldelade Rhodobacterales sp. HTCC2255 eller Polaribacter . En global procentuell identitet (procentuell aminosyra likartad brytning av läst täckt) beräknades för alla signifikanta (bitscore> 50) BLASTX-träffar i NCBI-nr-databasen för metatranscriptomic-bibliotek från Station M0, och antalet sekvenser som anpassades till varje procentidentitet bestämdes. ( a ) Sekvenser för vilka Rhodobacterales sp. HTCC2255 är bland de högst rankade träffarna i NCBI-nr-databasen. För att visa specificiteten med vilken dessa sekvenser kartlades undersöktes ytterligare databasträffar som passerade bitscore-tröskeln och procentidentitetshistogram genererades för de två mest ofta identifierade taxorna, Rhodobacterales spp. HTCC2150 och HTCC2083. ( b ) Sekvenser med minst ett toppslag till någon av de två Polaribacter- referensgenomen. Betydande justeringar av Polaribacter- anpassade läser till Flavobacteriales sp. ALC-1 och Kordia algicida OT-1 visas också.

Bild i full storlek

HTCC2255 verkar vara en mycket vanlig komponent i Monterey Bay mikrobiella gemenskap. Flera bakteriella artificiella kromosomsekvenser som tidigare isolerats från Monterey Bay (Rich et al., 2008, 2010) har en hög procentuell identitet och synteni med HTCC2255, och sonder som riktar sig till dessa bakteriella konstgjorda kromosomkloner och HTCC2255 referensgenomet identifierade dessa organismer 97–100 % av ytvattenprover som sträcker sig över en 4-årig tidsserie vid Monterey Bay station M1 (Rich et al., 2010). Dessutom detekterades den HTCC2255-liknande bakteriella artificiella kromosomen EB000-55B11 i prover nära kusten från Woods Hole, MA, USA under experiment med prototypen genom-proxy-array (Rich et al., 2008). Generellt sett verkar HTCC2255-liknande organismer vara allmänt närvarande i marina samhällen (Yooseph et al., 2010), men kan vara särskilt rikligt i vatten nära kusten. Referensstammen isolerades utanför Oregon-kusten, släktingar har upptäckts från både Kaliforniens och Massachusetts-kusten, och HTCC2255-liknande sekvenser rapporterades som den vanligaste sekvenstypen i ett proteorhodopsin-bibliotek från Nordsjön (Riedel et al., 2010 ).

Polaribacter-liknande sekvenser

Polaribacter- liknande transkript identifierades vid alla fyra tidpunkter, men var vanligast i 0500-timmarsprovet. En Polaribacter- härledd sekvens var bland de toppskårande justeringarna i NCBI-nr-databasen för 27%, 12%, 12% och 9% av tilldelningsbara sekvenser i metatranscriptomiska datauppsättningarna 0500, 1000, 1800 och 2200 timmar och motsvarande 15%, 6%, 5% och 5% tilldelades entydigt till detta släkte av Megan LCA-algoritmen. Dessa sekvenser verkar representera en eller flera oförstörda organismer relaterade till Polaribacter , eftersom sekvensen läses med toppdatabasträffar till en Polaribacter sp. i genomsnitt 82% aminosyraidentitet till P. irgensii 23P och 83% identitet till Polaribacter sp. MED152 (figur 4). De två sekvenserade organismerna har i genomsnitt 72% aminosyraidentitet bland deras delade gener (definierade som ömsesidiga bästa träffar med e-värde <1 × 10 −5 och 80% av genen i linje). Sammantaget identifierades 1519 av 1636 Polaribacter- gener i ett eller flera av de fyra transkriptomiska proverna, medan 361 av 974 MED152-specifika och 259 av 920 23P-specifika gener identifierades (kompletterande figurer S7 och S8).

Det finns mindre tidigare bevis för Polaribacter som en vanlig komponent i Monterey Bay-bakterioplanktonsamhället än vad som finns för HTCC2255. Polaribacter- liknande sekvenser detekterades inte i experiment med användning av genomproxy-arrayer för att undersöka samhällsstrukturen vid Monterey Bay station M1, trots att båda sekvenserade Polaribacter- genotyper inkluderades i matrisen (Rich et al., 2010). Emellertid var de sekvenser som utvunnits i denna studie i genomsnitt ∼ 82% aminosyraidentitet till referensstammarna, vilket är för genetiskt olikt för att visa stark hybridiseringssignal på matrisen (Rich et al., 2008, 2010). Dessutom använde vår studie ett 5 mikrometer förfilter under provinsamling, medan arrayexperimenten använde ett 1, 6 mikrometer förfilter, vilket kan förändra representationen av större och / eller partikelbundna bakterieceller. Polaribacter- liknande sekvenser identifierades i 16S rRNA-bibliotek framställda från prover samlade på stationen M0 i september – oktober 2004, under utvecklingen av deras sandwich-hybridiseringsanalys (Preston et al., 2009). Andra studier av Monterey Bay har inte specifikt undersökt överflöd av Flavobacteria eller Polaribacter , även om Suzuki et al. (2004) identifierade gruppen Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides som representerade 8, 5% av bakterierna i ett ytvattenprov. Flavobacteria och Bacteroidetes som helhet tros emellertid ha en viktig roll i nedbrytning av partikelformigt och högmolekylärt löst organiskt material i havet (Kirchman, 2002), och Polaribacter befanns vara den vanligaste Flavobacterial- gruppen i ett transekt i Nordatlanten (Gómez-Pereira et al., 2010).

Näringsvärdesstrategier för Monterey Bay Rhodobacterales och Polaribacter

Även om både HTCC2255 och de två Polaribacter- referensstammarna är proteorhodopsin-bärande heterotrofer, är deras genomkarakteristika och transkriptionella aktivitet förenliga med tydligt olika näringsämnesstrategier. Bland de mest uttryckta HTCC2255-liknande generna var substratbindande proteiner associerade med tripartit ATP-oberoende periplasmiska (TRAP) och ATP-bindande kassett (ABC) transportörer av aminosyror, sockerarter och sockeralkoholer (kompletterande tabeller S4 och S5). Däremot González et al. (2008) fann att Polaribacter sp. MED152 bär relativt få transportörer för fria aminosyror eller sockerarter, och inga sockerspecifika ABC-transportörer. Båda Polaribacter-generna tycks sakna TRAP- och TRAP-T-transportörer, och få transkript mappade till de ABC-transportörer som de har (<1% av Polaribacter- liknande sekvenser i motsats till 10–14% HTCC2255-liknande sekvenser; detaljer i tilläggstabell S6 ). På liknande sätt, i en undersökning av transportörer i ett kusttranskriptom, Poretsky et al. (2010) fann ett överflöd av Rhodobacterales och SAR11-associerade ABC- och TRAP-relaterade transkript i kustmiljöstranskriptomer, och relativt få Flavobacterales associerade sekvenser. En metaproteomisk undersökning av SAR11 i Sargasso-havet (Sowell et al., 2009) fann att transportfunktioner på liknande sätt dominerade proteomen i det alfa-proteobacterium, varvid de vanligaste proteinerna var ABC- och TRAP-transportörer. Detta överensstämmer med tidigare studier som visar att Alphaproteobacteria dominerar upptag av aminosyror och monomerer, medan Bacteroidetes är specialiserade på användning av polymerer (Cottrell och Kirchman, 2000; Kirchman, 2002).

Den vanligaste gruppen av transportrelaterade transkript inom de Polaribacter- associerade sekvenserna är TonB-beroende / ligandgrindade kanaler (kompletterande tabell S7). TonB-beroende kanaler var också bland de mest uttryckta proteinerna från gammaproteobacterium HTCC2207 och flavobacterium MS024-2A. Rhodobacterales sp. HTCC2255 verkar sakna ett TonB-system; utkastgenomet innehöll inga signifikanta träffar på pfam-profilerna för varken TonB eller de två TonB-beroende receptordomänerna. TonB-beroende transportörer från olika taxonomiska grupper var den vanligaste familjen av membranproteiner identifierade i en metaproteomisk analys av prover från South Atlantic (Morris et al., 2010). TonB-relaterade proteiner identifierades också som bland de vanligaste transkripten tilldelade Idiomarinaceae och Alteromonadacea i en marin mikrokosmos berikad med hög molekylvikt löst organiskt material (McCarren et al., 2010). Som nämnts ovan konstaterades att ABC-transportörer från Flavobacterales inte fanns i överflöd i en kustmetatranscriptom (Poretsky et al., 2010). Emellertid nämnde dessa utredare ett överflöd av Flavobacterales transportörer för oorganiska föreningar, och COG1629, som inkluderar vissa TonB-transportörer, ingår i denna grupp under COG-klassificeringsschemat. TonB-beroende kanaler identifierades ursprungligen i samband med järntransport, men har sedan dess associerats med transporten av en stor mängd föreningar (Schauer et al., 2008). Av särskilt intresse är deras nyligen erkända associering med nedbrytning av polymerer och komplexa kolhydrater (Blanvillain et al., 2007; Martens et al., 2009). Flera av de TonB-beroende kanalerna i Polaribacter sp, MED152 var associerade med förutsagda peptidaser och glykosylhydrolaser (González et al., 2008), vilket tyder på att de kan vara involverade i användning av substrat med hög molekylvikt i denna organisme.

Skillnader i funktionella och metaboliska profiler av metatranscriptomic prover

För att undersöka transkriptionsfrekvensdynamiken använde vi KEGG-vägar för att funktionellt profilera de fyra transkriptomiska proverna. KEGG-profiler genererades för samhällsdata för bulk, och individuellt för Rhodobacterales sp. HTCC2255-liknande och Polaribacter- liknande transkript. Metaboliska gener representerade den vanligaste klassen av antecknade transkript, även om de var numrerade av icke tilldelade transkript för både bulkgemenskapen och Polaribacter- liknande sekvenser (tabell 5). Transkript involverade i bearbetning av miljöinformation var mer omfattande i HTCC2255-fraktionen jämfört med bulkgemenskapen (14–19% mot 4, 4–4, 9% av transkript); denna signal dominerades av ABC-transportörer.

Full storlek bord

KEGG-annoterade gener kan tilldelas 188 (bulk community), 127 (HTCC2255) och 129 ( Polaribacter ) vägar, exklusive BRITE hierarkier och vägar associerade med mänskliga sjukdomar och organismer. Av dessa hade 133, 76 och 69 signifikant olika nivåer av uttryck mellan prover (kompletterande tabeller S8 och S9). Många centrala metaboliska vägar, inklusive oxidativ fosforylering, fotosyntes, citratcykeln, pyruvatmetabolismen och glykolys överrepresenterades i 1000 timmars provet (figur 5), både på bulkgemenskapen och taxonspecifika nivåer. Däremot toppade ribosomala proteiner i morgon- och kvällsprover och hade olika maxima och minima för bulkgemenskapen, HTCC2255 och Polaribacter- grupper. RNA-polymeras visade också olika trender bland de tre grupperna. Med tanke på de förändringar i taxonomisk sammansättning som diskuterats ovan kan vi inte utesluta effekter på befolkningsnivå i jämförelser av relativ transkriptionsflod. Men de synkrona förändringarna i den centrala kolhydratmetabolismen och energimetabolismen antyder att dessa vägar kan vara anpassade till bredare miljöfaktorer, medan dynamiken i översättning och transkription antyder mer populationsspecifika kontroller.

Relativa överflöd av KEGG-vägar i metatranscriptomiska datamängder. De 10 vanligaste KEGG-vägarna i bulkgemenskapen, plus vägar inom de 10 vanligaste vägarna för antingen Rhodobacterales sp. HTCC2255 eller Polaribacter visas i ordning efter fallande överflöd i det totala samhället. Procentandel av sekvenser med signifikanta träffar i KEGG-databasen (community) eller procent av totala sekvenser tilldelade specifika taxor som visas. Felfält representerar 95% konfidensgränser Fotosyntesignal i (icke-fotosyntetiska) HTCC2255- och Polaribacter- facken beror på tilldelningen av F0F1 ATP-syntasgener till denna kategori.

Bild i full storlek

Även om komplicerade befolkningsspecifika faktorer inte kan uteslutas, tyder dessa transkriptionella profiler på att ljus kan ha en roll i metabolismen av Rhodobacterales sp. HTCC2255 och Polaribacter. På senare år har ett antal potentiella mekanismer genom vilka ljus kan påverka metabolismen av heterotrofer i havet upptäckts (Béjà et al., 2000, 2002; Kolber et al., 2001; Venter et al., 2004). Proteorhodopsin utgör 0, 18–0, 82% av HTCC2255-liknande och 0, 42–1, 18% av Polaribacter- liknande transkript. Överraskande, i båda grupperna var representationen av proteorhodopsin-transkript högst under natten (2200 timmar) provet. Dokdonia sp. MED134, ett annat proteorhodopin-bärande flavobacterium, har visat sig ha högre nivåer av proteorhodopsin i ljusinkuberade vs mörkinkuberade kulturer, men dessa förändringar undersöktes vid tidsskalor på 3–13 dagar, inte timmar som i denna studie (Gómez- Consarnau et al., 2007). Proteorhodopsin var ett av de vanligaste transkripten associerade med gammaproteobacterium HTCC2207 (0, 55–0, 91% av HTCC2207 transkript) och flavobacterium MS024-2A (0, 86–3, 9% av MS024-2A-transkript). HTCC2207-liknande proteorhodopsin-transkript verkade mest rikligt på natten, men MS024-2A-liknande proteorhodopsin-transkript hade det högsta relativa överflödet på 1000 timmar. Men medan dagökningen i proteorhodopsin-uttryck för MS024-2A var signifikant i samband med det totala antalet transkript som tilldelats denna organism, förhindrar den relativt låga täckningen (1610–5210 tilldelade sekvenser) rigorös transkriptionsanalys.

Även i frånvaro av fotoreglering av proteorhodopsin-uttryck uppvisade de HTCC2255-liknande transkripten potentiella ljusberoende förändringar i energimetabolismen. I synnerhet tycktes HTCC2255-liknande Fen-typ adenosintrifosfat (ATP) syntasutskrifter vara nedreglerade på natten; 5 av 9 ATP-syntasassocierade proteiner hade signifikanta skillnader i överflöd, och alla var minst rikliga i 2200 timmarsprovet. Detta kan indikera ljusberoende förändringar i protongradienten över membranet. I motsats härtill, även om ATP-syntas som helhet (fotosyntesväg i figur 5) visade en liten men signifikant minskning av transkriptionsflöde på natten för Polaribacter- liknande sekvenser, uppvisade endast en underenhet en signifikant förändring i uttrycket på transkriptnivå. En förklaring till denna skillnad i ljusberoende av ATP-syntasuttryck är att HTCC2255-liknande organismer kan vara mer beroende av ATP för krafttransport än Polaribacter , som ett resultat av den utökade användningen av ABC-transportörer i denna organisme (TonB-beroende transportörer använder protongradienten direkt). Mer allmänt visade den transkriptomiska profilen för HTCC2255-liknande mikrober vid 2200 timmar en större minskning av många metaboliska aktiviteter än man såg på samtidigt förekommande Polaribacter- liknande bakterier, vilket antyder potentiellt större ljusreglering i denna organisme. Alternativt kan den speciella populationen av HTCC2255-liknande organismer som samlades in under tidpunkten för 2200 timmar ha varit i ett lägre energimetabolsk tillstånd, av skäl oberoende av tiden på dagen.

Implikationer

Även om ett antal metatranscriptomiska studier av marina mikrobiella samhällen har genomförts, har de flesta representerat enstaka eller relativt få tidpunkter som var rumsligt segregerade. Även om dessa studier har visat sig vara användbara för allmänna undersökningar av uttryckta gener och icke-kodande RNA, är användbarheten av sådana jämförelser begränsad i frånvaro av data om de rumsliga och temporala skalorna med naturlig miljövariabilitet. I denna studie demonstrerar vi genomförbarheten av in situ autonom insamling av metatranscriptomic-prover med hjälp av ESP-plattformen, tillsammans med synoptiska data om miljöförhållanden. En tydlig fördel med detta tillvägagångssätt är att det möjliggjorde längre siktutplaceringar och kontinuerlig övervakning av miljöförändringar under hela tiden för flera provsamlingar. I överensstämmelse med den kända dynamiska variationen i kustsystemen återspeglade våra observationer kontinuerligt förändrade förhållanden, i överensstämmelse med hög strömhastighet på provplatsen. Var och en av de fyra metatranscriptomiska datauppsättningarna representerar således en annan vattenmassa och en distinkt mikrobiell gemenskap. Även om liknande taxa fanns närvarande i varje tidpunkt visade dessa taxa olika bulkaktivitetsnivåer (vilket återspeglas i mängder av rRNA och mRNA) och uttrycksprofiler i vart och ett av de fyra proverna. Som ett resultat, även om skillnader i genuttrycksnivåer kunde observeras, var det svårt att differentiera förändringar som återspeglar de specifika vattenmassorna och mikrobiella populationer som togs ur provet mot diskreta organismer svar på bredare miljöparametrar (såsom tid på dagen). Vår studie visar att sådana effekter är tillräckligt stora för att kräva allvarlig övervägning, även när en fast plats samplas över relativt korta (24 timmar) tidsskalor.

Automatiserad provtagning har potential att kraftigt minska kostnaderna för långsiktig miljöövervakning, vilket möjliggör längre varaktighet och / eller högre frekvensprovtagningssystem. Olika distributionsscheman för provtagaren, till exempel på "drivare" eller autonoma fordon, kan också underlätta kortvarig temporär provtagning i sammanhängande vattenmassor. Detta kan visa sig vara viktigt för att utveckla en bild av de temporära och rumsliga skalorna av naturlig variation i mikrobiella populationer. I denna studie fann vi att identiteten hos de vanligaste mikrobiella populationerna inte förändrades dramatiskt i prover som samlats in under en dag, men deras relativa mängder gjorde det. Med ESP-teknik kommer det att vara möjligt att undersöka sådana skillnader över längre tidsskalor och använda olika samplingslägen (till exempel Lagrangian vs Eularian) för att bättre korrelera förändringar i miljöförhållanden med förändringar i mikrobiell gemenskapssammansättning och aktivitet.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • SRS167142

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande metoder

    Kompletterande information åtföljs av uppsatsen på webbplatsen ISME Journal (//www.nature.com/ismej)