En metabolomikundersökning som avgränsar geografisk platsrelaterad primär metabolisk förändring i bladen hos växande tobaksplantor med gc-ms och ce-ms | vetenskapliga rapporter

En metabolomikundersökning som avgränsar geografisk platsrelaterad primär metabolisk förändring i bladen hos växande tobaksplantor med gc-ms och ce-ms | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Naturlig variation i växter
  • Växtutveckling

Abstrakt

Ekologiska förhållanden och utvecklingsförmåga påverkar väsentligt växternas fysiologiska metabolism, men relativt lite är känt om påverkan av geografiskt läge på dynamiska förändringar i växtlöv under tillväxt. Pseudotargeted gaskromatografi-vald jonövervakningsmassespektrometri och kapillärelektrofores-masspektrometri användes för att undersöka en tidsförlopp för tobaksbladens metaboliska svar till geografiskt läge. Huvudkomponentanalys avslöjade uppenbar metabolsk diskriminering mellan växande områden relativt kultivarer. Ett komplext kol- och kvävemetaboliskt nätverk modulerades av miljöfaktorer under tillväxt. När Xuchang- och Dali-distrikten i Kina jämfördes, indikerade resultaten att högre frekvenser av fotosyntes, fotorespiration och andning användes i Xuchang District för att generera de energi- och kolskelett som behövs för biosyntes av kväveinnehållande metaboliter. Den ökade mängden försvarsassocierade metaboliter som genererades från shikimat-fenylpropanoidvägen i Xuchang i förhållande till Dali implicerade i skydd mot stress.

Introduktion

Tobak ( Nicotiana tabacum L.) är en viktig modell för studier om genetik, avel, fysiologi och biokemi inom växtvetenskap 1, 2 . Agronomiskt utbyte och smak är avgörande indikatorer på kvaliteten på tobaksplantor, som ofta begränsas av planteringsmiljön (t.ex. klimat och jordförhållanden) 2, 3 och genom genotyper 4 . Dessutom inducerar tobaksplantor en serie justeringar i deras metaboliska och fysiologiska funktioner för att anpassa sig till förändringar i miljön 5, 6, 7 . De metaboliska responserna från tobaksblad på saltlösning har varit nära förknippade med behandlingens dosering och tid. Glukoneogenes aktiverades, med uppreglering av sackaros, glukos och fruktos, under kortvarigt tillstånd med låg dos salt. Emellertid främjade högdossalt nedbrytningen av DNA, RNA och protein för att hämma tobakstillväxt under långvarig stress 5 . Förbättringar av alfa-aktiviteten hos tobaksblad som odlas med fosfatgödselmedel visade att den rimliga användningen av fosfatgödselmedel minskar skador från radioaktivitet och främjar tillväxten av tobak 6 . Dessutom visade transgena tobaksplantor som överuttryckte alenoxidsyntasgenen (AOS) -gen ökad tolerans mot zinkstress jämfört med vildtypsprover 7 .

Metabolomics är en lovande analytisk teknik som har använts för att upptäcka de metaboliska fluktuationerna för viktiga växtmolekyler och det metaboliska flödet förknippat med olika genotyper 8, 9 och tillväxtmiljöer 10, 11 . Vanliga analytiska tekniker som används för metabolomik inkluderar främst kromatografi i kombination med masspektrometri 12, 13, 14 och kärnmagnetisk resonansspektroskopi 15, 16 . Gasskromatografimasspektrometri (GC-MS) har också använts i stor utsträckning i metabolomikstudier på grund av dess höga kvalitet och reproducerbarhet, stora dynamiska intervall, universellt massspektralt bibliotek och förmågan att upptäcka hydrofila metaboliter efter derivatisering 17 . Nyligen utvecklade vi ett pseudotargeted metabolomics-tillvägagångssätt baserat på GC-MS med selektiv jonövervakning (SIM), där de karakteristiska jonerna av metaboliterna identifierades i obegränsade metaboliska profileringsdata från kvalitetskontrollprover 18 . Detta tillvägagångssätt integrerar fördelarna med riktade och inriktade metoder 2 och har använts för att studera metabolismprofilerna för olika vävnadsprover 12, 19 . Dessutom har kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS), som en ny och lovande metod med liten injektionsvolym och hög upplösning, enats för att separera och detektera joniska föreningar baserat på de olika migrationsgraden för laddade metaboliter 14 . Följaktligen kan en kombination av GC-MS och CE-MS tydligt förbättra täckningen av metaboliter (t.ex. kolhydrater, organiska syror och nukleosider) 20 .

Flera studier rörande metaboliska responser från tobaksplantor på miljön har genomförts, men relativt få studier har fokuserat på de dynamiska förändringarna av metaboliska svar på geografiska fluktuationer under tobaksväxtstadier. Två stora tobaksplantningsregioner består av Dali-distriktet från Yunnan-provinsen i sydvästra Kina och Xuchang-distriktet från Henan-provinsen i centrala Kina. Tobak som odlas i dessa regioner har markant olika kvalitetsegenskaper som återspeglar den geografiska variationen. I den aktuella studien undersökte vi påverkan av planteringsmiljön (Dali och Xuchang) på tobaksbladmetabolismen under tillväxt- och senestiden (Fig. 1a, b) med hjälp av pseudotargetade GC-SIM-MS och CE-MS-metoder. Det var uppenbart att både miljö (planteringsregioner) och tillväxt (fyra odlingsperioder) har stora effekter på den metaboliska fenotypen av tobaksblad jämfört med tobaksodling. Dessutom definierades de metaboliska signaturerna associerade med geografiskt ursprung och utvecklingsstadium och effekterna av miljöfaktorer på komplexa metaboliska regleringssystem identifierades.

( a ) Experimentell design, inklusive fyra utvecklingsstadier (kraftig tillväxt, kvadrat, fullblomning och mogna stadier) av tobaksbladutvecklingen. ( b ) De geografiska platserna för de två tobaksväxtodlingarna (Dali, Yunnan och Xuchang, Henan). ( c ) PCA-analys av tre rökhärdade kultivarer ( cv. HD, K326 och ZY100) från de två olika odlingsplatserna under de fyra utvecklingsstadierna. Rött, lila och gult indikerar K326, ZY100 respektive HD, odlade i Xuchang. Grönt, blått och svart representerar K326, ZY100 respektive HD, odlat i Dali. Kraftigt tillväxtstadium (○), kvadratisk scen (∆), fullblomningsstadium (*), moget stadium (□). Kartan genererades i Matlab R2014a-programvaran och modifierades med Adobe Illustrator CS5-programvara. Foton togs av Wenzheng Li.

Bild i full storlek

Resultat

Analytiska kännetecken för tobaks metaboliska profileringsmetoder

Både pseudotargeted GC-SIM-MS och CE-MS användes för tobaks metabolisk profilanalys. Ett QC-prov med dubbelkoncentration framställdes för toppidentifiering med användning av en pseudotargeted GC-SIM-MS-metod. Totalt förvärvades 329 toppar. Bland dessa verifierades 107 metaboliter med användning av autentiseringsstandarder, och 38 föreningar identifierades efter matchning med masspektralbibliotek (t.ex. Wiley, Mainlib och Fiehn). Med användning av CE-MS-metoden identifierades 148 metaboliter från biblioteksökningen 21 ; 115 och 33 metaboliter detekterades under katjoniska respektive anjoniska lägen. De pseudotargetade metaboliska metoderna GC-SIM-MS och CE-MS visade bra komplementaritet, med endast 37 metaboliter gemensamma. Efter avlägsnande av duplikat och okända metaboliter med användning av båda metoderna, totalt 237 metaboliter, som är involverade i kolmetabolismen (t.ex. sockermetabolism, glykolys, tricarboxylic syra (TCA) cykel och fenol metabolism) och kväve metabolism (t.ex. aminosyra ämnesomsättning, nukleotidmetabolism och polyaminmetabolism) identifierades och reserverades för vidare statistisk analys.

Typiska kromatogram från pseudotargetade GC-SIM-MS och från CE-MS i katjoniska och anjoniska lägen visas i tilläggsfiguren S1a1, S1b1 respektive S1c1. För att utvärdera reproducerbarheten för förbehandling och analysanordningens stabilitet infördes QC-proverna identiskt i analyssekvensen för alla prover. QC-proverna samlades tätt i huvudkomponentanalys (PCA) poängdiagram av GC-SM-MS (kompletterande figur S1a2) och CE-MS i katjoniska (kompletterande figur S1b2) och anjoniska lägen (kompletterande figur S1c2) . RSD (relativ standardavvikelse) fördelningsdiagram för alla variabler i de 34 QC-proverna visade att RSD-värdena 92, 45%, 98, 7% och 99, 65% av den totala topparean för GC-SIM-MS (kompletterande figur S1a3) och för de katjoniska (kompletterande fig. S1b3) och anjoniska (kompletterande fig. S1c3) -lägena för CE-MS var mindre än 20%. Dessa resultat antyder att de metabola profileringsmetoderna baserade på GC-SIM-MS och CE-MS var robusta och pålitliga.

Globala metaboliska svar på geografiska platser, kultivarer och tillväxtstadier

Dali och Xuchang är stora tobaksplanteringsregioner i Kina med väsentligt olika geografiska och klimatförhållanden (fig. 1b och kompletterande fig. S2). Dali ligger i den sydvästra regionen i Kina, i en platån monsun klimatzon som har en måttlig temperatur och riklig nederbörd 22 . Däremot är Xuchang en stad i Kina i Huanghuai, i en monsunklimzon med varm temperatur med hög temperatur och mindre nederbörd 23 .

För att undersöka de globala metaboliska förändringarna av tobak som svar på planteringsregioner, kultivarer och tillväxtperioder, samlades 143 gröna blad från tre allmänt använda rökskyddade kultivarer ( cv. K326, Zhongyan 100 (ZY100) och Hongda (HD)) i Xuchang, Henan och Dali, Yunnan (kompletterande tabell S1). Fyra tillväxtperioder (kraftig tillväxt, kvadrat, fullblomning och moget stadium) studerades. En oövervakad PCA-analys med enhetsvarians (UV) skalning (variabler subtraherat medelvärde dividerat med standardavvikelsen) genomfördes för att visualisera effekterna av geografiska platser, kultivar och tillväxtstadier på tobaksmetabolismen. Modellparametrarna (R2 X = 0, 776, Q 2 (cum) = 0, 618) indikerade att 77, 6% respektive 61, 8% av de totala variationerna förklaras och förutses. En uppenbar separering av tobaksbladen från de två regionerna observerades längs den andra huvudkomponenten (PC2) i PCA-poängsplottet, och tillväxtriktningarna för alla tobaksblad var identiska över den första huvudkomponenten (PC1) (Fig. 1c ). Emellertid observerades inga uppenbara skillnader mellan de tre huvudkultivarerna av rökhärdad tobak ( cv. HD, K326 och ZY100) odlade i Xuchang eller Dali (fig. 1c). Dessa resultat visar att planteringsområdet har ett större inflytande än kultivaren på den metabola fenotypen av rökhärdad tobak under växttillväxt.

Tidsberoende av metaboliska förändringar på geografiskt läge

För att klargöra metabolismegenskaperna förknippade med miljö och tillväxt undersöktes tidsberoende metaboliska svar till geografiska regioner. K326 är en rökhärdad kultivar med bred anpassningsbarhet till olika regioner 24 . De gröna bladen av K326-växter som odlades i Xuchang och Dali samlades. Totalt samlades 48 tobaksprover under fyra tillväxtperioder, såsom visas i tilläggstabell S1. Fyra utvecklingsstadier, nämligen kraftig tillväxt, kvadrat, fullblomning och mogen blad med mogen blad, täckte tillväxten och senescensen av tobaksblad. Alla proverna separerades i två kluster i PCA-poängplottet enligt planteringsregionen (fig. 2a). Motsvarande PCA-trajectory-plot avslöjade distinkta metaboliska fluktuationer som var förknippade med tillväxt- och miljöfaktorer längs PC1 respektive PC2 (Fig. 2b). De geometriska avstånden mellan de två planteringsdistrikten användes för att utvärdera de metabolomiska förändringarna som svar på miljöpåverkan över tillväxtstadier. Ökade metaboliska variationer mellan de två planteringsregionerna observerades under de kraftiga tillväxt- och mogningsstadierna (Fig. 2c), vilket antyder att både miljö (planteringsplats) och tillväxt (fyra odlingsperioder) markant påverkar den metaboliska fenotypen. Tvåvägs ANOVA-analys utfördes för att definiera variablerna förknippade med plats och tillväxt. Totalt av 17 och 26 metaboliter (2-vägs ANOVA, p <0, 05) förändrades markant efter miljö- och tillväxtperiodförändringar, respektive (Fig. 2d). Metaboliterna som påverkades signifikant av planteringsregionen inkluderade främst 7 organiska syror, 3 nukleosider, 2 aminosyror, 1 sockerderivat och 4 andra metaboliter. En hierarkisk klusteranalys (HCA) av dessa metaboliter genomfördes för att undersöka förändringar i mönstren mellan de två planteringsregionerna baserade på Pearson-korrelationskoefficienterna för metaboliter. Två mönster, oavsett tillväxtstadium, observerades (kompletterande fig. S3). En majoritet av metaboliterna, utom etanolaminfosfat, uppvisade högre nivåer i Xuchang under alla fyra tillväxtperioderna. Tjugoseks metaboliter, inklusive fettsyror, organiska syror och aminer, påverkades starkt av tillväxtstadiet. Två tillväxtstendenser (monoton stigande och fallande) observerades i HCA-tomten (kompletterande figur S4). Grupp 1, som inkluderar inosin, cystein och oxalsyra, visade en kontinuerlig ökning från kraftig tillväxt till mognad. Däremot minskade gradvis metaboliterna i grupp 2, som inkluderar fettsyror och aminer. Intressant nog visade halterna av dessa metaboliter inga signifikanta skillnader mellan de två planteringsregionerna under de fyra tillväxtperioderna.

( a ) PCA-poängdiagram av cv. K326 från Xuchang (röd) och Dali (grön) längs de första och andra huvudkomponenterna. ( b ) Tidsberoende metabolisk bana för 2D PCA-poängdiagram under fyra utvecklingsstadier. Felfält representerar standardmätningsfelet (SEM) vid varje tidpunkt. ( c ) Euklidisk avståndsplott mellan de två växande platserna i varje utvecklingsstadium. ( d ) Venn-diagram över tvåvägs ANOVA som definierar de betydligt olika variablerna förknippade med planteringsområden (miljö) och tillväxtstadium (tid) och visar deras interaktioner.

Bild i full storlek

Efter avlägsnande av variabler påverkade av tillväxtperioden eller av miljöfaktorer identifierades 170 metaboliter som signifikant skilde sig ( p <0, 05) i växter som odlades i Xuchang och Dali med användning av ett icke-parametriskt Mann-Whitney U- test. Dessa metaboliter var associerade med miljö-tillväxtinteraktioner. För att visualisera tidsberoendet av metaboliska responser på miljön konstruerades värmekartor baserade på metabolitkategorier (fig. 3). Före värmekartanalys beräknades metabolitförhållandet (Xuchang / Dali). En majoritet av metaboliterna, inklusive mellanprodukter av sockermetabolismen, aminosyrametabolismen, polyaminmetabolismen, fenolmetabolismen, fettsyrametabolismen, alkaloidmetabolismen och vitaminmetabolismen, var vanligare i tobaksväxter från Xuchang än i de från Dali. Däremot var mellanprodukter i TCA-cykeln, sackarinsyrametabolismen, asparaginsyra och prolinmetabolismen mer omfattande i tobaksväxter från Dali än i de från Xuchang. Betydelsen av korrelationskoefficienterna 25 mellan innehåll av metaboliter och klimatfaktorer (temperatur, nederbörd och solbelysningstimmar) beräknades för att utvärdera effekterna av klimafaktorer på differentiella metaboliter (Fig. S5). De flesta av metaboliterna är korrelerade med temperatur och nederbörd jämfört med soltimmar. Mellanprodukterna i sockermetabolism och shikimat-fenylpropanoidmetabolism är positivt korrelerade med temperatur och negativt korrelerade med nederbörd. Däremot uppvisade mellanprodukterna av TCA-cykeln och glykolys tydliga negativa korrelationer med temperaturen. Både regn och temperatur hade negativa effekter på innehållet i de flesta organiska syror. Innehållet i mellanprodukter i metioninmetabolismen, aminosyror från TCA-cykeln visade positiva korrelationer med nederbörd och negativa korrelationer med temperaturen. Däremot observerades tydliga positiva korrelationer mellan temperatur och innehållet av aminosyror från serinmetabolism och mellanprodukter i nukleotid- och polyamines metabolism.

Förhållandet Xuchang till Dali (Xuchang / Dali) för varje metabolit utsattes för värmekarteanalys. Rött och grönt indikerar förhållanden på mer än 1 respektive mindre än 1. * p <0, 05 mellan Xuchang och Dali.

Bild i full storlek

Diskussion

Kol (C) (fig. 4) och kväve (N) ämnesomsättning (fig. 5) representerar intuitiva parametrar för att jämföra tidsberoende metaboliska fluktuationer i tobaksblad som är förknippade med miljöfaktorer.

Röda och gröna linjer indikerar de relativa mängderna av metaboliter i Xuchang respektive Dali. Följande metaboliter är förkortade: glukos-6-fosfat (G6P), 3-fosfoglycerat (3PGA), inositol-3-fosfat (Inositol 3P), glycerol-1-fosfat (Glycerol 1P), ribulos-5-fosfat (Ru5P), erytritol-4-fosfat (E4P), treitol-4-fosfat (T4P), fosfoenolpyruvinsyra (PEP), tryptofan (Trp), fenylalanin (Phe), tyrosin (Tyr), klorogensyra (CGA) och 2-oxoglutarsyra syra (2-OG). Varje värde representerar medelvärdet ± SEM.

Bild i full storlek

Röda och gröna linjer indikerar de relativa mängderna av metaboliter i Xuchang respektive Dali. Följande metaboliter är förkortade: tryptofan (Trp), fenylalanin (Phe), tyrosin (Tyr), 3-fosfoglycerat (3PGA), fosfoenolpyruvinsyra (PEP), serin (Ser), O-acetylserin (OAS), glycin (Gly), valin (Val), alanin (Ala), leucin (Leu), 2-oxoglutarsyra (2-OG), glutaminsyra (Glu), prolin (Pro), hydroxiprolin (Hyp), ornitin (Orn), arginin (Arg) ), putrescine (Put), spermidin (Spd), spermin (Spm), citrulline (Cit), 4-aminobutyric acid (GABA), metionin (Met), S-adenosylhomocystein (SAH), S-adenosylmetionine (SAM), 1 -aminocyklopropan-1-karboxylsyra (ACC), S-metylmetionin (SMM), asparaginsyra (Asp), asparagin (Asn), treonin (Thr), ß-alanin (ß-Ala) och adenosinmonofosfat (AMP). All data visas som medelvärde ± SEM.

Bild i full storlek

C-metabolism (t.ex. sockermetabolism, glykolys, TCA-cykel och shikimat-fenylpropanoidmetabolism) är ansvarig för produktionen av tillgänglig energi, resistensmetaboliter och kolskelett för växtlivsaktiviteter under tillväxt och utveckling 26 . C-metabolism är nära besläktad med växttillväxt och senescens, och den kan delas upp i C-assimilering, C-transformation och C-ackumulering bland olika växtfysiologiska processer (t.ex. fotosyntes och andning). Glukos och fruktos, två viktiga reducerande monosackarider, är nedbrytningsprodukterna av sackaros och stärkelse. En kraftig minskning av glukos- och fruktosinnehållet observerades efter kvadratsteget i växter som odlades i Dali och på fullblomningsstadiet hos växter som odlades i Xuchang, vilket indikerar att övergången från C-assimilering till C-ackumulering inträffade senare i växter som odlades i Xuchang. Intressant nog kan sackaros, en cytoplasmatisk produkt som produceras under fotosyntes i växtceller med sackarosesyntas, användas som transportsocker för inträde i glykolys och TCA-cykeln för produktion av ATP och NADH 27 . De höga nivåerna av sackaros som observerats i växter som odlats i Xuchang återspeglade högre fotosynteshastigheter och högre energibehov i växtvävnader. Dessutom observerades ökade nivåer av sockeralkoholer (t.ex. erytritol, treitol, xylitol och ribitol) härrörande från pentosefosfat (PPP) -vägen i växter som odlats i Xuchang, vilket antagligen återspeglar den högre andningsfrekvensen för PPP-vägen i dessa växter. Den markerade ansamlingen av vissa sockerföreningar (t.ex. trehalos, mannitol och rhamnos) i växtprover erhållna från Xuchang kan också antyda att polysackariderna i växtcellväggen snabbt sönderdelades för att producera små sockermolekyler, såsom osmolyter, för att skydda cellen membran- och växtproteiner från hög temperatur eller torkstressskador i det mogna stadiet (tilläggsfiguren S2 och Fig. S5) 28, 29, 30 . Energimetabolism, huvudsakligen innefattande glykolys och TCA-cykeln, genererar enorma mängder energiföreningar (t.ex. ATP och NADH) och föregångare för olika växtfysiologiska processer genom oxidativ nedbrytning av kolhydrater med användning av en serie enzymer i växtcellen 31 . Det var tydligt att lägre mängder mellanprodukter i den centrala kolmetabolismen (glykolys och TCA-cykel) var närvarande i växter från Xuchang jämfört med de från Dali, ett fynd som troligen är förknippat med ökad energiförbrukning 32 och med transformationshastigheter från C-metabolism till N-metabolism 33 . Den shikimate-fenylpropanoidvägen genererar många antioxidanter (t.ex. flavonoider, fenoler och ligniner) och deras föregångare (t.ex. aromatiska aminosyror och shikiminsyra) för att rensa eller hämma syntesen av reaktiva syrearter (ROS) i växtceller under biotiska eller abiotiska spänningar, och därigenom skyddar cellproteiner, membranlipider, DNA och andra cellkomponenter från allvarlig skada 34 . Det ökade innehållet av försvarsrelaterade metaboliter (t.ex. dopamin, klorogensyra, scopolin och tokoferol) och deras föregångare (t.ex. fenylalanin, shikiminsyra och tryptamin) från shikimat-fenylpropanoidmetabolism i Xuchang-växterna kan vara nära förknippat med den höga temperatur och mindre mängd nederbörd under det mogna stadiet (kompletterande bild S2).

Dessa resultat visar att den högre frekvensen av fotosyntes, PPP-metabolism och energimetabolism i Xuchang-växter ger tillräckligt med C-skelett och energi för växtens fysiologiska metabolism. Dessutom skilde den metaboliska övergången från C-assimilering till C-ansamling sig mellan växter som odlades i Dali (efter kvadratstadiet) och Xuchang (efter fullblomningsstadiet) och återspeglade sannolikt de ekologiska förhållandena i de växande regionerna. De högre nivåerna av antioxidanter som upptäcks i Xuchang-växter i förhållande till Dali-växter tyder på att shikimat-fenylpropanoidvägen är mer aktiv för att generera mer försvarsrelaterade metaboliter för att klara den oxidativa spänningen i Xuchang. De högre halterna av mellanprodukter av PPP-metabolism (erytritol, arabitol och xylitol) och nedströms shikimat-fenylpropanoidvägsföreningar (tryptamin, dopamin och tokoferol) i Xuchang-växter jämfört med Dali-växter på det mogna stadiet tyder på att den respirationsrelaterade PPP-vägen förbättras i Xuchang-växter, som också kan vara en viktig faktor som ligger till grund för de metaboliska skillnaderna som observerats mellan de två odlingsplatserna i det mogna stadiet.

N-metabolism, inklusive aminosyrametabolism, polyaminmetabolism, ureacykel och nukleotidmetabolism, är en grundläggande fysiologisk mekanism för syntes och sönderdelning av kväveföreningar i växter 35 . Aminosyror, som viktiga energimetaboliter och syntetiska prekursorer för olika bioaktiva molekyler, är indelade i aromatiska, alifatiska och heterocykliska aminosyraföreningar baserade på kemiska strukturer. Glycin och serin, två viktiga fotorespirationsprodukter, ger en-kol (1-C) enheter som deltar i olika metaboliska vägar, inklusive nukleinsyrametabolism, polyaminmetabolism och betasyntes, genom glycindekarboxylas (GDC) 36 och serinhydroximetyltransferas (SHMT) 37 . I synnerhet kunde de högre glycin- och serinnivåerna i Xuchang-växter tillskrivas deras högre hastighet av fotorespiration. Dessutom observerades ett större överflöd av fotorespirationsassocierade mellanprodukter av nukleosidmetabolism, polyaminmetabolism, ureacykel och betainmetabolism i Xuchang-växter, vilket antyder att högre fotorespirationshastigheter förbättrar flöde av 1-C-enhet till N-metabolism i Xuchang-växter. Aromatiska aminosyror, som biosyntetiska föregångare för vissa antioxidanter, är uppreglerade för att tillhandahålla vissa osmoskyddande funktioner i växtceller under värme och torka stress 32 . Nivåerna för de flesta aromatiska aminosyror (t.ex. tyrosin, fenylalanin, kynurenin och 3-hydroxykynurenin) var högre i Xuchang-växter, en effekt som troligen är förknippad med den högre temperaturen och dehydratiseringsspänningen i Xuchang-växter i det mogna stadiet (tilläggsfigur S2) . Däremot observerades en ökad mängd aminosyror från TCA-cykeln (t.ex. prolin, 5-oxoprolin, hydroxiprolin och asparaginsyra) i Dali-växter jämfört med Xuchang-växter. Cellvägghydroxiprolin kan vara associerad med cellförlängning under växttillväxt. Extensin, ett hydroxiprolinrikt glykoprotein (HRGP), underlättar förlängningen av växtcellväggen och hämmar cellförlängning 38 . Tobaksblad som odlats i Xuchang uppvisade längre bladbredd och längder, lägre höjder och tjockare stamband, vilket tyder på att detta förlängningsprotein kan uttryckas starkt för att begränsa tillväxten i Xuchang-växter jämfört med Dali-växter (kompletterande tabell S2). Alla metaboliter i metionin (Met) -cykeln uppvisade högre nivåer i Xuchang-växter före kvadreringsstadiet men lägre nivåer efter kvadrat. Etylen, som en viktig nedströmsprodukt från Met-cykeln 39, reglerar det mogna stadiet hos växter 40 . Metaboliter associerade med eten i Met-cykeln (t.ex. S-adenosylmetionin, metionin och 1-aminocyklopropan-1-karboxylat) inducerar troligen högre nivåer av eten före kvadratsteget och sedan lägre nivåer av eten från kvadreringen till det mogna steget i Xuchang-växter. I överensstämmelse med de metaboliska förändringarna i etenprekursorinnehållet under tillväxtstadierna observeras snabb tobakstillväxt före kvadratsteget i Xuchang-växter och följs av långsam tillväxt under senare utvecklingsperioder. Dessutom visar kvävehaltiga föreningar, inklusive mellanprodukterna av aminosyrametabolismen, ureacykeln, nukleotidmetabolismen och Met-cykeln, en total minskning i de två planteringsregionerna, och skillnader i metabolitinnehållet mellan Xuchang- och Dali-växter reduceras gradvis som växterna mognar, i överensstämmelse med metabolismens svar från markörer för primär kväveassimilationshastigheter, inklusive glutamin / 2-oxoglutarsyra, malat / 2-oxoglutarsyra och glutamin / glutamat 41 (kompletterande fig. S6). Betydande skillnader i kväveassimilationsgraden för tobaksplantor som odlades på olika platser observerades under det kraftiga tillväxtstadiet.

Sammanfattningsvis kombinerades pseudotargetade GC-SIM-MS- och CE-MS-tekniker för att undersöka en tidsförlopp för tobaksbladens metaboliska svar på växande områden under tillväxt. Det komplicerade metaboliska mönstret handlade om två planteringsdistrikt över olika fysiologiska stadier av bladutveckling från kraftig odling till kvadratisk, fullblom och mogen stadie under lövets livscykel. Effekterna av både miljö och tillväxtförhållanden på metabolisk fenotyp av tobaksblad diskuterades. Resultaten gav informativ metabolisk profileringsdata för vidare statistisk analys. Multivariatanalys illustrerade att planteringsplatsen har en mycket starkare effekt än kultivar på den tobaksmetaboliska fenotypen under växttillväxt och senest. Betydande korrelationer mellan klimatfaktorerna och differentiella metaboliter observerades, särskilt temperaturen och nederbörden under växtväxt i fältet. Vidare undersöktes kopplingarna i metaboliska förändringar av C- och N-pooler i tobak som är nära förknippade med miljö- och tillväxtfaktorer till fysiologiska processer. En jämförelse av tobaksplantor som odlats i Dali och Xuchang visade att Xuchang-växter uppvisar högre hastigheter av fotosyntes, fotorespiration och andning för att tillhandahålla tillräcklig energi och C-skelett för biosyntes av N-innehållande metaboliter. Den shikimate-fenylpropanoidvägen aktiverades för att generera ett ökat överflöd av antioxidanter för att skydda tobaksplantor mot oxidativ stress i Xuchang.

metoder

Växtmaterial

Totalt 143 färska tobaksblad, inklusive 71 prover från Xuchang, Henan och 72 prover från Dali, Yunnan, samlades in och användes i denna studie (kompletterande tabell S1). Xuchang-distriktet i Henan-provinsen producerar tobaksväxter med starka smaker, och Dali-distrikten i Yunnan-provinsen genererar växter med känsliga smaker (fig. 1b) 42 . Tre primära rök-härdade tobaksodlar, K326, ZY100 och HD, undersöktes under fyra kritiska utvecklingsstadier (kraftig odling, kvadrat, fullblomning och moget stadium). Alla prover samlades in ungefär klockan tio på morgonen för att undvika effekterna av dagliga variationer på metabolismprofilerna. Fem till sex biologiska duplikat av varje prov uppsamlades och frystes snabbt i flytande kväve för att hämma minskningen av enzymaktivitet i växtvävnaden. Därefter frystorkades tobaksbladen och maldes till pulver vid en låg temperatur. Efter screening genom en sikt med 80 mesh förvarades tobakspulvret vid –80 ° C tills vidare analys. Ett kvalitetskontrollprov (QC) -prov erhölls efter blandning av lika stora mängder av varje prov, och detta prov användes för att fastställa den pseudotargeted metabolomics-metoden och för att övervaka robustheten hos den analytiska metoden. Klimatinformation, inklusive temperatur (° C), nederbörd (mm) och solskenstimmar (h), erhölls från det lokala väderkontoret (tilläggsfigur S2).

Provberedning

Tobaksblad framställdes för GC-MS-analys såsom tidigare beskrivits 2 . I korthet bereddes en blandad lösning av 4, 15 μg / ml tridekansyra (intern standard) i isopropanol / acetonitril / vatten (3: 3: 2, volym / volym) för metabolitextraktion från det lyofiliserade tobaksbladet. Cirka 10 mg tobakspulver överfördes till ett 2-ml Eppendorf-rör och nedsänktes i 1, 5 ml extraktionslösningsmedel. Därefter virvlades lösningen kontinuerligt i 4 minuter för att förstöra växtceller och extrahera metaboliter. Efter centrifugering vid 14 000 rpm i 10 minuter för att avlägsna olösligt material vakuumtorkades 500 ul av supernatanten i en Labconco-centrifugalkoncentrator och lagrades vid -80 ° C tills vidare analys. En derivatiseringsmetod som inkluderar oximering och silyleringsreaktioner utfördes för att öka volatiliteten hos metaboliter. Den torkade återstoden återupplöstes i 100 ul metoxiaminpyridinlösning (20 mg / ml) och inkuberades under 90 minuter vid 37 ° C. Därefter tillsattes en 80-mikrolikvot av MSTFA till blandningen, som sedan derivatiserades under 60 minuter i ett vattenbad på 37 ° C. Före injektion centrifugerades lösningen vid 14 000 varv per minut under 5 minuter för att avlägsna fällningar, och cirka 160 ul av supernatanten överfördes till ett glasflaska för injektion.

För CE-MS-analys bereddes tobaksbladen enligt följande. Först vägdes tobaksbladpulver (13 mg) i ett 2 ml Eppendorf-rör och blötlägges i 300 mikroliter metanol innehållande 50 mikrometer L-metioninsulfon och D-kamfer-10-sulfonsyra som interna standarder 1 (IS1) till standardisera metabolitintensiteten. To separate polar and nonpolar metabolites, 300 μL of chloroform and 1.2 mL of water were added to the tube, which was vortexed for 30 seconds before and after the addition of chloroform and water. A two-phase system was obtained after centrifugation at 9, 000 × g for 5 min at 4 °C. To prevent large molecular impurities (eg, proteins and chlorophyll) from adsorbing onto the surface of the capillary tube, 400 μL of the upper methanol-water phase was filtered through a 5-kDa ultrafiltration membrane (Millipore, USA) and centrifuged at 12, 000 × g for 2 hours at 4 °C. Subsequently, the filtrate was freeze-dried in a Vacuum Concentrator (Labconco, USA). The dried tobacco sample was dissolved in 35 μL of Milli-Q water containing 50 μM 3-aminopyrrolidine dihydrochloride, N, N-diethyl-2-phenylacetamide, trimesic acidand 2-naphtol-3, 6-disulfonic acid disodium salt as internal standards 2 (IS2) to adjust the migration time. Eventually, 10 μL of supernatant was placed into an injection vial with a conical insert for CE-TOF MS analysis.

All samples were randomly pretreated and analyzed to decrease errors derived from preparation and instrument analysis. Additionally, the QC samples were identically inserted into the analytical sequence to monitor the reproducibility of the analytical method.

Instrumental analysis

The GC-MS experiment was conducted using a Shimadzu GC/MS QP 2010 Plus (Kyoto, Japan). One microliter of derivatization solution was separated on a DB-5 ms fused-silica capillary column (length = 30 m, ID = 0.25 mm, df = 0.25 μm) (Agilent Technologies). The split ratio was set to 10:1. High-purity helium (99.9995%, China) was employed as a carrier gas with a constant flow rate of 1.2 mL/min. The initial column temperature was 70 °C for 3 min and was then ramped at 5 °C/min to 310 °C for 5 min. The total running time for the GC-MS analysis was 56 min. The temperatures of the injector, interface and the ion source were maintained at 280 °C, 280 °C and 240 °C, respectively. Electron impact at 70 eV was used as the ionization mode. A 33–600- m / z mass scanning scope was used on full scan mode at an acquisition rate of 5 scan/sec. The detector voltage and solvent delay time were controlled at 0.92 kV and 5.24 min, respectively. A light diesel oil sample was analyzed in full scan mode to obtain the retention times of n-alkanes (C 10 –C 30 ), which were used to calculate the Kovat's retention index (RI) of the plant metabolites.

The pseudotargeted method based on GC-SIM-MS was established as previously described, with few modifications 2, 12, 18, 19 . Briefly, the full-scan data of a doubled-concentration QC sample was converted to a netCDF file using the Shimadzu postrun workstation. The AMDIS (automated mass spectral deconvolution and identification system, NIST) and Leco ChromaTOF (USA) software programs were combined to analyze the netCDF data and achieve peak deconvolution and identification. The selection of characteristic ions was accomplished using various software programs (eg, AMDIS, Chroma TOF and homemade software). Furthermore, the group information of metabolites was obtained according to the differences in the retention times of adjacent peaks. Ultimately, 329 features, which were further separated into 63 groups, were defined in the pseudotargeted quantitative and acquired methods.

The CE-MS analysis was performed on an Agilent G7100A CE system coupled to a G6224A TOF/MS with electrospray ionization (ESI). The CE separation of each reconstituted sample was conducted on a fused-silica capillary (length = 80 cm; ID = 50 μm) (Human Metabolome Technologies, Inc., Japan). The capillary temperature was set to 20 °C. A minichiller (Huber, Germany) was used to maintain the temperature of the sample tray below 5 °C. To achieve coupling of CE with MS, a coaxial sheath liquid interface was developed. A 50% methanol/water solution with 0.1 μM hexakis(2, 2-difluoroethoxy)phosphazene were used as the sheath liquid at a constant flow rate of 1 mL/min via the column at a split ratio of 1:100. The specific parameters for cation mode and anion mode of the mass spectrometer were displayed in the Supporting Information.

Data processing and statistical analysis

For the GC-SIM-MS method, a quantitative analysis table containing characteristic ions and retention time (RT) of detected metabolites was established for peak alignment based on the SIM scan table 2 . Prior to statistical analysis, the peak area of each metabolite in each sample was normalized to the internal standard (tridecanoic acid).

For CE-MS, as described in previous studies 21, 43, 44, the raw MS data were imported into the Agilent MassHunter workstation software (B.04.00) for noise filtering, peak extraction, identification, smoothing and peak area integration. Additionally, MethodMarker software (HMT, Japan) was used to correct the migration time of metabolites. Metabolite identification was performed according to the accurate masses and adjusted migration times of standard chemicals in the HMT database. The matching windows for the m / z and migration time of a metabolite were adjusted to ±20 ppm and ±1.0 min, respectively. Subsequently, the integration of peak area was conducted using Agilent quantitative analysis software, and a peak table containing accurate mass, migration time and peak area was obtained. The peak area of every metabolite was divided by the internal standard for the following statistical processing.

Principal component analysis (PCA) accompanied by UV scaling 45 was performed using the SIMCA-P 11.0 program (Umetrics, Sweden) to visualize the sample distributions. Two-way analysis of variance (ANOVA) was used to achieve the discrimination of two independent factors using MetaboAnalyst 46 (//www.metaboanalyst.ca/). Each metabolite with a significant difference ( p < 0.05) was screened with a non-parametric Mann-Whitney U -test using SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 18.0 software. A heat map analysis was conducted with MeV.v.4.8.1 software 47 to visualize the relationships and relative levels of metabolites. The alteration trends of metabolites were depicted using VANTED V2.1.0 software 48 . The correlation significance test was calculated using SPSS 18.0 software, and metabolic correlation network with climate factors was constructed using the Cytoscape V2.8.3 software.

Metabolite identification in GC-MS and CE-MS was conducted as previously described 2, 43 . Briefly, a commercial library search (eg, Mainlib, Wiley, and Fiehn) and standard validations using to mass spectra, RT and RI were used as qualitative methods to analyze the metabolites acquired using GC-MS. Moreover, the metabolites in CE-MS were identified based on accurate mass and migration time matching between the detected metabolites and standard chemicals in mass spectral libraries containing 500 reference standards (HMT, Japan).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.