Metabolisk bana för celldifferentiering i tunntarmen genom fas fluorescens livslängdsmikroskopi av nadh | vetenskapliga rapporter

Metabolisk bana för celldifferentiering i tunntarmen genom fas fluorescens livslängdsmikroskopi av nadh | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biofysik
  • Utvecklingsbiologi
  • Differentiering
  • Stamceller

Abstrakt

Det saknas snabba och högupplösta metoder för att mäta metabolisk aktivitet hos enstaka celler i deras ursprungliga miljö. Här utvecklar vi en enkel, icke-invasiv och känslig metod för att mäta metabolisk fenotyp av enstaka celler i en levande vävnad. Genom att använda NADH som optisk biomarkör och fasmetoden för Fluorescence Lifetime mikroskopi (FLIM) identifierar vi cellulära metaboliska fingeravtryck relaterade till olika hastigheter av oxidativ fosforylering och glykolys. För första gången mäter vi en tredimensionell metabolisk gradient i tunntarmsepiteln (SI) som förekommer tätt associerad med epitelcellsproliferation, differentiering och Wnt-gradienten. De högsta fria / bundna NADH-förhållandena mäts vid basens krypta inom de starkt proliferativa stamcellerna, vilket indikerar höga nivåer av glykolys. För första gången identifieras små tunntarmsceller från mus i intakta levande krypter i vävnaden genom deras metaboliska fingeravtryck.

Introduktion

Även om flera metoder för att mäta fysiologiska processer i vävnader och genuttryck i enstaka celler har utvecklats under de senaste decennierna, förblir den största begränsningen frånvaron av robusta och icke-icke-invasiva metoder som tillhandahåller en snabb kvantitativ avläsning av encells metabolism inom det nativa mikro-miljön av den levande vävnaden.

Metabolisk aktivitet i prolifererande celler, såsom cancerceller och stamceller, skiljer sig grundläggande från icke-spridande celler. Warburg observerade först att de flesta cancerceller fermenterar glukos till laktat oavsett närvaron av syre 1 . Denna effekt, känd som aerob glykolys, stöder effektiv syntes av makromolekylära komponenter som är nödvändiga för att snabbt dela celler. De flesta proliferativa celler förlitar sig på aerob glykolys i motsats till normala differentierade celler som främst är beroende av oxidativ fosforylering 2 . Under proliferation genererar den stora ökningen av glykolytiskt flöde snabbt cytosolisk ATP vilket resulterar i höga ATP / ADP och NADH / NAD + förhållanden 2, 3, 4 .

Den metaboliska koenzym nikotinamidadeninuklotid (NADH) är den huvudsakliga elektronacceptorn i glykolys och elektrondonator vid oxidativ fosforylering. NADHs ubikvitet gör detta koenzym till en av de mest användbara och informativa inre biomarkörerna för metabolism, mitokondriell funktion, oxidativ stress, åldrande och apoptos i levande celler och vävnader 5 . Sedan det banbrytande arbetet med Britton Chance 6 används metabolisk avbildning av NADH-nivåer och av de relativa mängderna av reducerad och oxiderad NADH för att övervaka förändringar i metabolismen. Kemiska metoder som leder till NADH: NAD + -förhållanden indirekt från koncentrationerna av redoxpar såsom laktat och pyruvat 7 kräver användning av cellextrakt och är oförenliga med att studera dynamik i intakta levande celler och vävnader. Istället tillåter optiska avläsningar av NADH autofluorescens realtid och icke-invasiv övervakning av en cells metaboliska tillstånd under (patho) fysiologiska förändringar och rapporter om nivåer av oxidativ fosforylering och glykolys. Övervakning av NADH-fluorescensintensiteten ger användbar information om NADH / NAD + -förhållanden 8, eftersom NADH förlorar fluorescens vid oxidation till NAD +. Emellertid innehåller intensitetsbaserade mätningar av NADH / NAD + artefakter på grund av heterogeniteten i fluoroforkoncentrationen och på olika kvantutbyten av NADH i den fria och bundna formen. Detta problem kan hanteras med användning av fluorescens livstidsavbildning (FLIM), eftersom livslängden är ett koncentrationsoberoende optiskt svar och påverkas minimalt av vävnadsabsorption och spridning och fluktuering i excitationsintensitet. FLIM rapporterar om en fluorofores mikro-miljö och kan diskriminera fri eller proteinbunden NADH. Kombinationen av FLIM och flerfotonexcitering ger 3D-bilder av NADH-livstider med cellulär och subcellulär upplösning i levande vävnader med minimal fotoskada och fototoxicitet 9, 10, och blir en värdefull teknik för att utvärdera metaboliska tillstånd av celler associerade med karcinogenes och celldifferentiering in vitro 11, 12, 13, 14 och in vivo 15, 16 . NADH har antingen en kort eller lång livslängdskomponent beroende på om den är i ett fritt eller proteinbundet tillstånd. Proteinbunden NADH kännetecknas av en komplex flerfeksponentiell livstidsförfall som har varit relaterad till dess bindning till olika enzymer, såsom malatdehydrogenas (MDH) och laktatdehydrogenas (LDH) 17 . Metaboliska vägar relaterade till karcinogenes och differentiering är kända för att förändra NADH-bindningsställen och enzymatisk bindning är direkt relaterad till NADH-cykling genom energiproduktionsvägen 18 . Till exempel Bird et al. 2005 visade att förändringar i förhållandet fritt till proteinbundet NADH är förknippade med NADH / NAD + redox-förhållandet i bröstcancerceller 11 . Även om tekniska framsteg i tidsupplöst mikroskopi 19, 20 möjliggör mer känsliga mätningar, förblir en av de största begränsningarna för NADH-metabolisk avbildning tolkningen av komplexa flerdeksponentiella livstidsförfall för NADH. Det traditionella sättet att anpassa intensiteten sänks i varje pixel med två exponentiella antar att förhållandet mellan "korta" och "långa" komponenter motsvarar förhållandet mellan fri / bunden NADH. Denna approximation är vilseledande eftersom fritt och proteinbundet NADH har vanliga exponentiella komponenter och NADH-bindningsställena med olika enzymer inte kan beaktas. Vi introducerade nyligen fasmetoden för fluorescenslivsavbildningsanalys som ger en passformfri, opartisk representation av den råa autofluorescensen FLIM-data 16, 21 . Vi demonstrerade att fasor FLIM är ett mycket känsligt verktyg för att kvantifiera de relativa koncentrationerna av inneboende fluoroforer, oavsett komplexiteten i livstidsförfallet och möjliggör diskriminering av små cellulära redoxförhållanden skillnader 16 .

I detta arbete utvecklar vi en etikettfri metod för att mäta icke-invasivt metaboliska fenotyper av enstaka celler i en levande vävnad. Vi kvantifierar graden av oxidativ fosforylering och glykolys i enstaka celler och vi associerar cellulärt metaboliskt fingeravtryck till deras spridning och differentieringstillstånd. Vi karaktäriserar den metabola fenotypen av nativt, levande tunntarms kryptepitel med hjälp av fasmetoden till FLIM och förhållandet mellan fri och proteinbunden NADH-biomarkör. Tunntarmen är en viktig modell för stamcellbiologi och cancerforskning på grund av den höga proliferativa frekvensen av epitelceller. Positionen och antalet stamceller regleras strikt för att bibehålla vävnadshomeostas och för att förhindra vävnadsnedbrytning eller tumörtillväxt. En huvudregulator för cellförökning, differentiering och stamcells självförnyelse i tarmkrypten är Wnt-signalvägen 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Wnt-signaler är starkast vid basen av varje krypta där Wnt- målgenen Lgr5 markerar multipotenta stamceller 29 . Den snäva regleringen av självförnyelse av dessa stamceller och spridning av de engagerade stamcellerna som de producerar är undertryckt i cancerceller av avvikande höga nivåer av Wnt-signalering som leder till malig transformation. Konstitutiv aktivering av Wnt-signalvägen sker oftast via förlust-av-funktionsmutationer i den adenomatösa polypos coli- genen (APC) och när denna kritiska händelse inträffar i Lgr5 + stamceller leder de resulterande mönstren av avvikande spridning och differentiering till malig transformation och kolorektal cancer 30, 24 .

Även om det senaste arbetet har karakteriserat spektralt den inneboende kontrasten i frisk och sjuk sjukdom i magvävnaden 31, har vi, enligt vår kunskap, inte undersökt metabolism av tarmvävnad via den inneboende biomarkören NADH. Phasor-strategi för FLIM identifierar olika vävnadskomponenter i tunntarmslevande vävnad och differentierar den metaboliska aktiviteten hos kryptbasepitelceller (inklusive Lgr5 + -celler och Paneth-celler) från terminalt differentierade villusepitelceller. Vi visar att Lgr5 + stamceller har ett unikt metaboliskt fingeravtryck; deras karakteristiska fria / bundna NADH-förhållande tillåter deras etikettfri identifiering och separering både från de angränsande Paneth-cellerna och från deras differentierade avkommor. Genom att kartlägga den fria / bundna NADH-koncentrationen i tarmepitelet mäter vi de 3D-metaboliska gradienterna från basen av krypten till spetsen av villi. För första gången identifierar vi ett unikt metaboliskt fingeravtryck av proliferativa tunntarmsceller och en metabolisk bana (M-Trajectory) längs krypt-villusaxeln, som är starkt korrelerad med Wnt-gradient och nivån på cellproliferation och differentiering.

Resultat

Ursprunget till den inneboende kontrasten i tunntarmsvävnaden

Två-fotonmikroskopi och Phasor FLIM-klusteranalys (se metoder och ref. 16 ) används för att visualisera och identifiera tunntarmsens inre kontrast. Figur 1g visar ett schematiskt diagram över tunntarmsstrukturen. Tunntarmen täcks av ett enda lager epitelceller organiserade i krypter. Varje kryptering är befolkad med 8–14 stamceller vid kryptbasen, vars avkommor ständigt rör sig uppåt och går förlorade från villuspetsar. Alla avkommor regenereras var 4–6 dagar. Cryptepithelia sitter på ett komplext ställning av myofibroblaster, vaskulär endotelia och immunceller som innefattar lamina propria i villuskärnan. Figur 1 visar att olika fack i tunntarmsvävnaden kännetecknas av unika Phasor FLIM-signaturer som motsvarar specifika inneboende källor. Bilderna med två fotonintensitet och FLIM-kartor som är upphetsade vid 740 nm och 880 nm (fig 1a – d) erhållna vid kryptans bas (svart pil i figur 1g) visar runda krypter som innehåller epitelceller. Här använder vi transgena möss som uttrycker eGFP i Lgr5 + stamceller i tarmkrypteringsbaser 29 . Individuella GFP-Lgr5 + stamceller interkalerar mellan angränsande Paneth-celler (Fig. 1b) vid kryptbaser, i överensstämmelse med deras tidigare beskrivna mönster 29 . Två-foton fluorescensintensitet upphetsad vid 740 nm belyser NADH-kontrast för enstaka epitelceller inom den runda kryptbasen, och visar subcellulära detaljer, såsom dimma kärnor och ljusa mitokondrier. (Fig. 1d) Phasor FLIM-signaturen för epitelcellerna som är exciterade vid 740 nm (Fig. Lf) motsvarar den typiska komplexa flerdeksponentiella livslängdsfördelningen av NADH belägen i centrum av fasorplottet 16 . Det blå toppade emissionsspektrumet för tunntarms-kolon krypter (Fig SM1b) och den fria NADH-ackumuleringen vid blockering av cellulär andning (Fig SM1a) bekräftar att den främsta bidragaren till epitelial fluorescenssignatur är NADH, i överensstämmelse med tidigare arbete 31 . Det regelbundna avståndet mellan runda krypter består av lamina propria. När den är upphetsad vid 880 nm kännetecknas lamina propria av en kort livslängd (fig 1a – c) och Second Harmonic Generation (SHG) signal (SM2), vilket motsvarar kollagenfibrer 16 . Phasor FLIM-signaturen för lamina propria som är upphetsad vid 740 nm kännetecknas istället av en längre livslängd (lila i fig 1d – f) som indikerar en blandning av erytrocytporfyriner 16 inom kapillärer och NADH inom fibroblaster och makrofager.

Image

(ab) Fluorescensintensitetsbilder vid basen av tunntarms krypter upphetsade vid 880 nm (a) och 740 nm (b). Bilder förvärvas på nivå med den svarta pilen i fig g. (c – d) Phasor FLIM-kartor över vävnaden upphetsad vid 880 nm (c) och 740 nm (d) markerar Lgr5 + GFP-stamceller (grön), kollagen (blå), porfyriner i lamina propria (lila) och NADH inom epitelcellerna (cyan). Fasorplotthistogram för FLIM-bilden vid 880 nm (e) och 740 nm (f). Färgskalan (från blå till lila)

Image
) motsvarar de 64 nivåerna av konturerna som indikerar den procentuella förekomsten i fashistogrammet för bildens pixlar. Fyra kluster motsvarande olika vävnadskomponenter identifieras i fasfördelningen med olika färger. (g) Epitel är organiserat med differentierade villi och krypter som innehåller stamcellen (i grönt) medan lamina propria (prickade området) utgör kärnan i varje villus och består av lös bindväv som innehåller lymfocyter, myofibroblaster och ett nätverk av kapillärer och lymfatika.

Bild i full storlek

Proliferativa stamceller i tunntarmen har ett unikt NADH-metaboliskt fingeravtryck

Här visar vi att de epiteliala stamcellerna som ligger vid basen av krypten har en unik NADH Phasor FLIM-signatur som gör det möjligt att identifiera dem i levande vävnad utan någon yttre märkning. Stamceller vid basens krypta växlar med Paneth-celler, differentierade epitelceller som fungerar i medfödd immunitet 32 och som "sjuksköterska" celler till stamcellerna 33 . För att skilja mellan Paneth-celler och stamceller använder vi Lgr5-GFP-möss för att markera Lgr5 + stamcellspopulationen vid basen av tunntarmen (SI). (Se material och metoder). Excitationsvåglängden för Ti: Sapphire-lasern är inställd mellan 880 nm och 740 nm för att excitera alternativt GFP och NADH 9 . Fig. 2 visar de 2-foton-upphetsade fluorescensbilderna och FLIM-kartor som erhållits i tunntarmen ex-vivo från en Lgr5-GFP-mus upphetsad vid 740 nm (fig. 2a – b) och vid 880 nm (fig. 2c – d). Den breda livslängdsfördelningen uppmätt i kryptopitelceller exciterade vid 740 nm (fig. 1f och fig. 2b) har ett karakteristiskt linjärt långsträckt mönster som återspeglar en blandning av fritt och bundet NADH, vilket ger information om olika fördelningar av metaboliska tillstånd och redoxförhållanden mellan cellerna inom samma krypta. I fig 2 kartlägger vi den relativa koncentrationen av fri och bunden NADH i epitelcellerna vid basen av SI-krypter, i enlighet med FLIM-fasorplatsen för den fria NADH uppmätt i lösning 16 och den bundna NADH uppmätt i epitelceller (Fig.SM1 .en). Olika förhållanden mellan fri och proteinbunden NADH återspeglar olika hastigheter av glykolys och oxidativ fosforylering (SM4 och SM5) i överensstämmelse med ref. 11 .

Image

Två-foton fluorescensintensitetsbilder upphetsade vid 740 nm (a) och 880 nm (d) av tunntarmen från Lgr5-GFP-möss som uttrycker eGFP i krypterade stamceller. Prickade linjer indikerar gränsen för de runda krypterna i SI-vävnaden. (b) Phasor-färgkartor vid 740 nm porfyrin (blått) och av de relativa koncentrationerna av fritt NADH och bundet NADH i lamina propria. Röd-lila färg indikerar ett högt fritt / bundet NADH-förhållande, medan violett, cyan och vitt indikerar linjärt och progressivt minskande förhållanden fritt / bundet NADH-förhållande, såsom visas i f. (c) Phasor färgkarta vid 880 nm belyser GFP (gröna) stamceller. (e) Fasorhistogram för FLIM-bilden upphetsad vid 740 nm. Linjärt kluster representerar alla möjliga relativa koncentrationer av fri NADH (lila) och bunden NADH (vit). (f) Fasorhistogram för FLIM-bilden upphetsad vid 880 nm, med ett cirkulärt kluster som belyser GFP (grönt). (g) Spridningsdiagram för cellfasorn för alla stamceller (cyan-trianglar) och Paneth-celler (lila kvadrater) upphetsade vid 740 nm.

Bild i full storlek

Den metaboliska fasors-FLIM-signaturen vid basen av krypterna som är upphetsade vid 740 nm (fig 2.b) följer påfallande kartan över stamceller interkalerade mellan angränsande Paneth-celler. Stamceller (cyan) kännetecknas av ett lägre fritt / bundet NADH-förhållande med avseende på Paneth-cellerna (lila) (Fig. 2.b, Fig. 2e, g). Den unika NADH FLIM-signaturen för stamceller och det växlande mönstret av höga och låga fria / bundna NADH-celler i krypterna finns i alla krypter i tunntarmsvävnaden, oavsett GFP-uttryck (fig 2.b och fig 2.c) . Vi beräknar de genomsnittliga fasvärdena för stamceller och Paneth-celler genom att utföra manuell bildsegmentering i Lgr5-GFP-positiva krypter i fig 2.b och fig 2.c (se material och metoder). Vi väljer regionen för intressets stamceller med hjälp av en markör med godtycklig form som markerar konturerna av de enda Lgr5 + GFP-stamcellerna i fig 2.c. Panetceller identifieras vid basen av de runda krypterna genom frånvaro av Lgr5 + GFP-uttryck. Det genomsnittliga fasvärdet för celler beräknas inom markören och plottas i spridningsdiagrammet i fig 2g. De genomsnittliga FLIM-fasvärdena för stamceller skiljer sig väsentligt från värdena på Paneth-celler, vilket indikerar en annan metabolism (t-test, p <0, 05, Fig 2g).

NADH metabolisk bana från glykolys till oxidativ fosforylering är förknippad med cellulär spridning och differentiering längs tunntarmen krypt-villus-axeln

Här visar vi att epitelcellerna i tunntarmen följer en exakt metabolisk bana förknippad med fri och proteinbunden NADH. Proliferativa celler i basen av krypten kännetecknas av en glykolytisk metabolisk fenotyp, medan differentierade celler har en oxidativ fosforyleringsfenotyp (fig 3, fig 4, SM4 och SM5).

Image

Två-foton fluorescensintensitetsbilder (a) och fria / bundna NADH FLIM-kartor (b) av ex-vivo tunntarms krypter upphetsade vid 740 nm vid olika djup (z) av vävnaden med utgångspunkt från kryptobasen. (c) Phasor FLIM-distribution på olika djup (z). Det cirkulära blå klustret används för att markera porfyrinet i lamina propria. Ett linjärt kluster representerar relativa koncentrationer av fri NADH (lila) och bunden NADH (vit). Röd-lila färg indikerar ett högt fritt / bundet NADH-förhållande, medan violetta, cyan och vita indikerar linjärt och progressivt minskande förhållanden av fritt / bundet NADH. (d) Spridningsdiagram för cellfasorn hos stamceller och differentierade epitelceller på olika djup från kollagenfibrerna i basmembranet (figur SM3) upphetsade vid 740 nm. Cyan-diamant för Z = 55 um, svarta stjärnor för Z = 44 um, röda trianglar för Z = 34 um, gröna rutor för Z = 24 um och blå cirklar för Z = 14 um). Längs Z-axeln förskjuts cellfasorn mot en längre livslängd vilket indikerar en ökning av bundet NADH med avseende på fri NADH. dvs en minskning av NADH / NAD + -förhållandet. (e) Schematiskt diagram över tunntarmsepiteln visar en fri / bunden NADH-gradient längs epitelcellerna i SI-krypten.

Bild i full storlek

Image

Två-foton fluorescensintensitetsbilder (a) och fria / bundna NADH FLIM-kartor (b) av ex-vivo tunntarmsslemhinna som är upphetsade vid 740 nm vid olika djup (z) av vävnaden med början från spetsen av villi. (c) Phasor FLIM-distribution på olika djup z. Cirkulärt blått kluster används för att markera porfyrinet i lamina propria-kärlen. Ett linjärt kluster representerar de relativa koncentrationerna av fri NADH (lila) och bunden NADH (vit). Lila färg indikerar ett högt fritt / bundet NADH-förhållande, medan violett, cyan och vitt indikerar linjärt och progressivt minskande förhållanden fritt / bundet NADH-förhållande. (d) Spridningsdiagram för cellfasorn i stamceller och differentierade epitelceller på olika djup från spetsen av villi. Längs Z förskjuts cellfasorn mot den kortare livslängden, vilket indikerar en ökning av det fria / bundna NADH-förhållandet. (e) Schematiskt diagram över tunntarmsepiteln visar en fri / bunden NADH-gradient längs epitelcellerna i SI villi. (f) Metabolisk bana (M-bana) från fri till proteinbunden NADH indikerade en övergång från en glykolytisk fenotyp till en oxidativ fosforyleringsfenotyp.

Bild i full storlek

I figur 3 och 4 mäter vi den tredimensionella NADH FLIM-signaturen för tunntarmen och vi kartlägger de metaboliska gradienterna av epitelceller i tunntarmen från basen av krypten till villuspetsarna. Stamcellpoolen ligger vid basen av tarmkrypten där de själv förnyar och genererar differentierade celltyper (fig 1g). När stamceller delar sig genomgår de ofta asymmetrisk celldelning och bildar en ny stamcell och en engagerad dottercell. Stamcellscykling producerar snabbt spridande "engagerade progenitor" (CP) celler som kan differentieras mot alla celllinjer. CP-celler genomgår sedan ett begränsat antal celldelningar innan de slutligen differentierar på villusytan.

I figur 3 avbildade vi ex-vivo tunntarmsvävnad från "utsidan in" med en intakt sektion av tunntarmen. (Fig. 3e och material och metoder). Med utgångspunkt från den yttre serosala ytan på intakt tunntarmen, avbildade vi först submukosala kollagenfibrer, sedan krypteringsbaserna och varandra i lamina propria. (Fig SM1). I figur 4 öppnar vi SI-röret för att avbilda slemhinnan från villusspetsarna mot SI-krypteringsbaserna (Fig. 4e och Material och metoder).

NADHs livslängdsfördelning uppmätt i epitelcellerna som exciteras vid 740 nm är olika på olika djup (z) längs krypt / villusaxeln (Fig 3c – d och Fig 4c – d). Deras tredimensionella FLIM-fas är fördelad längs en linjär bana i fasorplottet som motsvarar blandningen av fri och bunden NADH (Fig. SM1.a och ref 16 ). Vi definierar "M-Trajectory" (metabolisk bana) banan från en glykolytisk fenotyp med höga fria / bundna NADH-förhållanden till en oxidativ fosforyleringsfenotyp med höga fria / bundna NADH-förhållanden (Fig. 4g och SM4 och SM5). Kartläggning av den relativa koncentrationen av fritt och bundet NADH i epitelcellerna i SI-krypter och villi visar en förskjutning mot lägre förhållanden av fri / bunden NADH med differentiering från kryptobasen till villusspetsen (i fig. 3b och 4b). Vi beräknar de genomsnittliga fasvärdena för stamceller och de differentierande avkommorna genom att utföra manuell bildsegmentering. (Se material och metoder). Det genomsnittliga fasvärdet för epitelceller på olika djup beräknas inom markören och plottas i spridningsdiagrammet i fig 3g och 4g. FLIM-fasvärdena för stamceller skiljer sig statistiskt från differentierade epitelceller på olika djup, (t-test, p <0, 05 Fig 3d) som visar en gradvis minskning av det fria / bundna NADH-förhållandet längs krypten. Stamceller (z = 14 um och z = 24 um) (Fig 3d) och Paneth-celler (Fig 2b), belägna inom den Wnt-rika miljön vid kryptbasen, kännetecknas av en glykolytisk metabolisk fenotyp inom M-Trajectory ( Fig 4g, SM4 och SM5) med den kortaste livslängden och det högsta fria / bundna NADH (dvs. NADH / NAD +) -förhållandet. Förflyttning upp krypten till det begåvade stamfacket (Fig 3b – d) och vidare till områden med helt differentierade celler på slemhinnans yta (Fig 4b – d) motsvarar en rörelse längs M-banan, med minskande fri / bunden NADH ( dvs NADH / NAD +) -förhållanden (vit fig 3b – d), vilket indikerar en metabolisk förskjutning från glykolys till oxidativ fosforylering (SM4 och SM5). Samma trend observeras hos fem olika djur (SM6 och SM7).

Diskussion

Här utvecklade vi en icke-invasiv, etikettfri optisk metod för att mäta och identifiera NADH metabolism signatur förknippad med glykolys och oxidativ fosforylering i en levande vävnad. Vår metod tillhandahåller identifiering av metaboliskt tillstånd som är förknippat med cellproliferation och differentiering i den levande murina tunntarmen och identifierar de proliferativa tarmstamcellerna baserat på deras unika metaboliska fingeravtryck.

Genom att utföra ex-vivo två-foton upphetsad fluorescerande livslängdsmikroskopi och Phasor-analys visar vi att vi kan identifiera olika SI-cellpopulationer och strukturer baserat på deras unika FLIM-signaturer (fig 1). Kollagenfibrer (fig 1, SM2 och SM3) avbildas vid basen av krypterna som stöder stamcellsnisch, och lamina propria identifieras genom dess speciella långa livslängd som indikerar närvaron av porfin i kärlsnätet i kapillärerna (Fig 1d, f). Vi visar att den huvudsakliga källan till epinalkontrastkontrast är det metaboliska koenzym NADH (Fig. 1d – f och Fig. SM1). Dessa fynd överensstämmer med mätningarna som utfördes på egenkontrast genom hyper-spektral mikroskopi i magvävnad 31 . Vår metod tillhandahåller ett enkelt sätt att identifiera och rikta den inneboende kontrasten i tarmvävnaden genom att tilldela FLIM-kontrast till intracellulära och extracellulära fysiologiska fluoroforer (fig 1). Ännu viktigare ger vår metod fysiologisk information relaterad till metabolismen av enstaka celler i vävnaden. Vi visar att Phasor FLIM-signatur av epitelceller ger information om innehållet av fria och proteinbundna former av NADH associerade med glykolys och oxidativ fosforylering (SM4 och SM5) och med cellproliferation och differentiering (fig 3 och fig 4).

Våra resultat visar att Phasor FLIM identifierar de starkt proliferativa tarmstamcellerna baserat på deras metaboliska signatur utan behov av någon extrinsic etikett eller genetisk markör. Vi visade att de Lgr5-positiva stamcellerna har en unik NADH FLIM-signatur som skiljer dem både från de angränsande Paneth-cellerna (fig 2) och från differentierade epitelceller längs krypten (fig 3) och villi (fig 4). FLIM-kartor över fria och bundna NADH (Fig 2b och Fig 3b) och Phasor FLIM metaboliska fingeravtryck (Fig 2g och Fig 3d) sorterar tarmstamceller och differentierade avkommor efter deras metaboliska tillstånd. Det metaboliska tillståndet för tarmstamceller (fig 3) kännetecknas av ett högt förhållande av fritt / bundet NADH, vilket indikerar att de huvudsakligen förlitar sig på glykolys, som förväntat i mycket proliferativa celler 2, 3 . Vi demonstrerar att den tredimensionella Phasor FLIM-signaturen för tunntarmen möjliggör en enkel kartläggning av den relativa koncentrationen av fri och bunden NADH och ger information om de metaboliska gradienter som är förknippade med spridning och differentiering (Fig 3c och Fig 4c). Utvecklingen av cellfasorfingeravtrycket från basen av krypten till toppen av villi (fig. 3d och fig. 4d) återspeglar en minskning av fritt NADH med avseende på proteinbundet NADH längs M-banan (fig. 4g). Våra fynd indikerar därför en minskning av det relativa bidraget av den glykolytiska metaboliska vägen med avseende på oxidativ fosforylering under epitel stamcelldifferentiering i den levande tunntarmen (Fig 3, Fig 4, SM4 och SM5). Den observerade övergången från glykolys till oxidativ fosforylering överensstämmer med den ökade NADH-livslängden mätt under vuxna stamcellsdifferentiering in vitro 12, 13 och i levande vävnad 16 . Förändringen i NADH FLIM-fingeravtrycket under differentiering (fig 3 och fig 4) kan också föreslå en förändring av bindningsställena för NADH med olika enzymer såsom malatdehydrogenas (MDH) och laktatdehydrogenas (LDH) 17 . Den metaboliska gradienten vid spetsen av villi (fig 4d) kan indikera ett bidrag av FAD, medan cell-till-cell metabolisk heterogenitet vid spetsen av villi (fig 4b) kan indikera celltyper med olika funktioner, såsom bägare celler, enterocyter eller enteroendokrina celler. Alternativt kan det indikera epitelceller under oxidativ stress och genomgå apoptos.

Intressant är den fria / bundna NADH FLIM-gradienten som vi mäter (Fig. 3 och Fig. 4) tätt associerad med Wnt-gradienten längs krypt-villusaxeln, som visar den högsta signalaktiviteten vid kryptbotten där den kontrollerar cellproliferation, stamcell självförnyelse och cellbeslut 24, 34 . Epitelceller vid kryptbasen (Lgr5 + stamceller och Paneth-celler) kännetecknas båda av hög Wnt-signalering 26, 35, och vi observerar att de har det högsta fria / bundna NADH-förhållandet, (fig 2 och fig 3), dvs den högsta glykolysen / oxidativ fosforyleringsförhållande (SM4 och SM5). Intressant nog kännetecknas Paneth-celler av ett högre fritt / bundet NADH-förhållande än Lgr5 + stamceller, vilket indikerar att de använder en stark, aktiv glykolytisk ämnesomsättning för sina funktioner. Även om Paneth-celler är differentierade celler, uttrycker de flera Wnt-målgener såsom defensiner och kryptdiner 26, 36 och de tillhandahåller väsentliga nischsignaler för stamcellstöd och självförnyelse såsom EGF, Wnt3, R-Spondin och Notch 33, 37 .

Så vitt vi vet är detta första gången att tarmstamceller identifieras märkningsfritt i en levande vävnad baserat på deras metaboliska fingeravtryck. Metaboliska tillstånd för enstaka celler mäts och graden av glykolys och oxidativ fosforylering kartläggs i den levande vävnaden. Vi rapporterar för första gången att en metabolisk gradient associerad med fri och proteinbunden NADH korrelerar med cellproliferation, differentiering och Wnt-signalering i tunntarmen. Förmågan att identifiera tarmstamceller och att urskilja metabolismtillståndet för starkt proliferativa celler associerade med hög Wnt-signalering utan någon extrinsisk markör kan starkt påverka området stamcellbiologi, cancerforskning och klinisk diagnos. Våra metoder skulle möjliggöra icke-invasiv avbildning av metaboliska förändringar i varje givet cellfack, associerat med epitelial tillväxtdysregulering i någon modell av kolorektal cancer. Muterade celler med konstitutivt aktiva onkogena vägar som tillåter en metabolisk fenotyp av biosyntes oberoende av normala fysiologiska tillstånd kan isoleras och detekteras vid tidiga tillstånd av sjukdomen. I det framtida arbetet planerar vi att karakterisera de metaboliska signaturerna i tjocktarmsvävnad i tunntarmen i transgena djurmodeller av inflammatorisk tarmsjukdom och kolorektal cancer. Eftersom vårt tillvägagångssätt är märkningsfritt och icke-invasivt, kan vår metod ha en enorm användbarhet vid diagnos och hantering av cancer som möjliggör utvecklingen av "metabolisk histologi" signaturer och så småningom in-vivo och in-situ endoskopisk mikroskopi 38 . Miniaturiserade fiberoptiska tillvägagångssätt har anpassats för intravital mikroskopi och endoskopisk klinisk avbildning 39 med nyligen framsteg i endoskopi 40 av fluorescens livslängdsavbildning. FLIM-endoskop skulle möjliggöra diagnostisk avbildning i vivo med molekylär kontrast- och etikettfri identifiering av cancerceller och eventuellt stamceller baserat på deras metaboliska tillstånd.

Vår metod ger en enkel och kvantitativ mätning av oxidativ fosforylering och glykolysmetabolism (SM4 och SM5) och förknippar metabola fenotyper med spridning och differentiering inom M-banan (fig 3 och fig 4). Genom att tillhandahålla hög känslighet för den fria / bundna NADH-molekylgradienten representerar vår metod ett lovande verktyg för att övervaka (patho) fysiologiska processer korrelerade till metaboliska förändringar. Våra metoder kan användas för att identifiera enstaka starkt proliferativa stamceller och cancerceller och för att mäta metaboliska gradienter och dynamisk metabolisk anpassning till nivån på syre- och näringsämnen upptag under utveckling och cancerframsteg i en mängd levande vävnader.

metoder

Djurmodell och förfaranden

We used Lgr5+GFP mice that express GFP within the stem cells of the small intestine and colon epithelium (Jackson Labs strain 008875). E x-vivo tissue imaging is performed immediately after mice euthanasia. Selected freshly excised small intestine is cleaned by flushing with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Thermo Scientific Part NumberSH30031.02). To image the SI crypt, images were acquired from the outside (serosal) surface. To acquire images of the SI villi, a length of SI tissue was opened flat, gently rinsed and imaged, villi up, in a Mat-Tek dish with a #1 coverslip. Tissue was bathed in HBSS while imaging and all imaging occurred immediately after isolation. All procedures followed were reviewed and approved by the Irvine University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC animal protocol number 2002-2357-3).

We block the respiratory chain of the DLD-1 colon cancer cells by means of potassium cyanide (KCN) to inhibit the Oxidative phosphorylation and increase the mitochondrial concentration of NADH. KCN in PBS was added to the culture medium with a final concentration of 4 mM. Cells were imaged immediately after the addition of KCN.

DLD-1 colon cancer cells are treated for 24 hours with 50 mM Sodium dichloroacetate (Sigma #34779) to inhibit glycolysis.

NIH3T3 fibroblasts are treated for one hour with Low Glucose (4.4 mM glucose) and High Glucose (22 mM glucose) media. Low Glucose medium ( Invitrogen Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), # 11885-092, no Fetal Bovine Serum). High Glucose medium ( Invitrogen Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) # 11965-092, no Fetal Bovine Serum).

Imaging

Fluorescence lifetime images are acquired with a Zeiss 710 microscope coupled to a Ti:Sapphire laser system (Spectra-Physics Mai Tai) and a ISS A320 FastFLIM system 20 . A 40×0.8 NA water immersion objective (LUMPlanFl Olympus.) is used. For image acquisition the following settings are used: image size of 256×256 pixels or 1024v1024 pixels and scan speed of 25 μm/pixel. A dichroic filter (690 nm) is used to separate the fluorescence signal from the laser light and the fluorescence. For the acquisition of FLIM images, fluorescence is detected by a photomultiplier (H7422P-40 of Hamamatsu) and a 610 nm short pass filter is placed in front of the detector. FLIM data are acquired and processed by the SimFCS software developed at the Laboratory of Fluorescence Dynamics. The excitation wavelengths used were 880 nm and 740 nm. An average power of about 5 mW was used to excite the live tissue. FLIM calibration of the system is performed by measuring the known lifetime of the fluorescein with a single exponential of 4.04 ns. FLIM data are collected until 100 counts in the brightest pixel of the image are acquired. Typically the acquisition time was of the order of few seconds.

FLIM Phasor data analysis

Every pixel of the FLIM image is transformed in one pixel in the phasor plot as previously described in ref 16, 21 . The coordinates g and s in the phasor plot are calculated from the fluorescence intensity decay of each pixel of the image by using the transformations defined in ref 16, 21 . The analysis of the phasor distribution is performed by cluster identification. Clusters of pixel values are detected in specific regions of the phasor plot. The cluster assignment is performed by taking in account not only the similar fluorescence properties in the phasor plot but also exploiting the spatial distribution and localization in cellular substructures or tissues, as described in ref 16 . Fractional intensities of chemical species in every pixel of the image are evaluated with a graphical analysis in the phasor plot as described in ref 21 . We perform image segmentation on the FLIM data by selecting the region of interest of cells within the tissue. The region of interest of cells is selected by using a cursor with arbitrary shape. We calculate the phasor average value within these regions of interest. When measuring the cell phasor, all pixels of the cell (about 1000) are taken in account and the signal to noise ratio of the FLIM signature of cells is higher than in single pixels. All phasor transformation and the data analysis of FLIM data are performed using SimFCS software developed at the LFD.

All procedures followed were reviewed and approved by the Irvine University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC animal protocol number 2002-2357-3).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.