Mesenkymala stamceller använder extracellulära vesiklar för att lägga ut mitofagi och skyttel mikrornor | naturkommunikation

Mesenkymala stamceller använder extracellulära vesiklar för att lägga ut mitofagi och skyttel mikrornor | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Mesenkymala stamceller
  • miRNA i immunceller
  • Mitophagy

Abstrakt

Mesenkymala stamceller (MSC) och makrofager är grundläggande komponenter i stamcellnisch och fungerar samordnat för att reglera hematopoetisk stamcells självförnyelse och mobilisering. Nya studier tyder på att mitofagi och hälsosam mitokondriell funktion är avgörande för stamcells överlevnad, men hur dessa processer regleras i MSC är okänt. Här visar vi att MSC: er hanterar intracellulär oxidativ stress genom att rikta depolariserade mitokondrier till plasmamembranet via arrestin-domäninnehållande protein 1-medierade mikrovesiklar. Vesiklarna är sedan uppsvulda och återanvändas via en process som involverar fusion av makrofager, vilket resulterar i förbättrad bioenergetik. Vidare visar vi att MSC: er samtidigt tömmer mikro-RNA-innehållande exosomer som hämmar makrofagaktivering genom att undertrycka Toll-liknande receptorsignalering, och därigenom avkännar makrofager till de intagna mitokondrierna. Sammantaget kopplar dessa studier mekanistiskt mitofagi och MSC-överlevnad med makrofagfunktion, vilket ger ett fysiologiskt relevant sammanhang för den medfödda immunmodulerande aktiviteten hos MSC: er.

Introduktion

Mesenkymala stamceller (MSC) -baserade terapier har gett fördelaktiga effekter i ett brett spektrum av djurmodeller av sjukdomar och flera humana kliniska prövningar. Ändå förblir deras handlingssätt in vivo tvetydigt. Tidigare studier indikerade att MSC: er främjade vävnadsreparation via direkt differentiering; data som visade celler som uppvisade kortvarig och låg engraftment in vivo återtog emellertid denna hypotes. Det antas nu att MSC: er uppnår en terapeutisk effekt in vivo via paracrinverkan 1, 2, 3 . Denna paradigmförskjutning baserades initialt på studier som indikerade att konditionerat medium från odlade MSC: er reproducerar några av de gynnsamma effekterna av intakta celler 4, 5 . Efterföljande studier har identifierat en lång lista med parakrinverkande faktorer som utsöndras av MSC: er som bidrar till deras terapeutiska styrka 1, 2, 3 . Nyare studier indikerar att cellerna också tappar extracellulära vesiklar inklusive exosomer (50–100 nm i diameter) och mikrovesiklar (MV: er; 0, 1–1 mikrometer i diameter) i det extracellulära utrymmet 6, 7, 8, 9, 10, 11 och att MSC-härledda exosomer skyddar möss från myokardiell eller renal ischemi och pulmonal arteriell hypertoni 12, 13, 14, 15 . Medan isolering av exosomer kräver differentiell ultracentrifugering, kan MV: er isoleras från cellkultursupernatanten genom centrifugering med låg hastighet 16, 17, 18, 19 . MV: s roll i MSC-biologi är till stor del okänd.

MSC är bosatta inom benmärgsstamcellnisch och reglerar underhåll av hematopoietisk stamcell (HSC) via korsning med makrofager 20, 21, 22, 23, 24, 25 . Benmärgsnisch representerar en miljö med låg syre och förändringar i syrekoncentrationen påverkar MSC och HSC öde 26, 27 . Vi rapporterade nyligen att kulturutvidgning av MSC i atmosfäriskt syre inducerar mitokondriell oxidativ stress (mtROS) som komprometterar celltillväxt och överlevnad 28 . Programmet som reglerar kvalitetskontrollen av mitokondrier i MSC är emellertid dåligt förstått. Mitophagy och allophagy reglerar mitokondrialtal i stamceller och förmedlar materns arv av mitokondriell DNA (mtDNA) genom att underlätta eliminering av paternal mitochondria 29 . Nyligen genomförda studier indikerar att mitokondrier kan överföras mellan celler och korssamtal mellan MSC och njur-, myokardie- och lungepitelceller involverar mitokondriell överföring 30, 31, 32 . Exempelvis bildar MSC: er införda i lungorna hos lipopolysackarid (LPS) -behandlade möss connexin 43 mellanrumskanaler och överför mitokondrier till det alveolära epitelet 33 . Cirkulation av mitokondrier inducerar emellertid inflammatoriska svar som liknar sepsis 34 . Dessa inflammatoriska svar har tillskrivits frisättningen av mitokondrier av skada-associerade molekylära mönster inklusive mtDNA, som stimulerar mönsterigenkänningsreceptorer 34, 35, 36 . Även om mitokondriell överföring påstås att bidra till paracrinverkan av MSC: er, är dess fysiologiska relevans oklar. Faktum är att förlust av mitokondrier sannolikt kommer att ha skadliga effekter på överlevnaden av celler.

Vi antagade att oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion inducerar cellöverlevnadsmekanism i MSC som inkluderar mitokondriell överföring, vilket därmed ger en fysiologisk relevant förklaring till detta beteende. För att testa den här hypotesen studerade vi mitofagi i MSC: er och makrofagernas roll i denna process eftersom dessa två celltyper ligger i närheten inom HSC-nisch 20, 24, 25 . Vi demonstrerar att under standardkulturförhållanden MSC: er genomgår mitofagi och använder arrestin-domäninnehållande protein 1-medierade MV: er (ARMM) för att lossa mitokondrier, som är uppslukade av makrofager och återanvändas för att öka bioenergetik. Dessutom visar vi att MSC: er tolererar makrofager till mitokondriell överföring genom att kasta exosomer som modulerar Toll-liknande receptor (TLR) -uttryck och inflammatorisk signalering via överföring av reglerande mikroRNA både in vitro och i en in vivo- modell för lungskada.

Resultat

MSC: er genomgår mitofagi som svar på oxidativ stress

Mänskliga MSC: er kastade från sin yta en varierande underpopulation av vesiklar. För att karakterisera dessa vesiklar utförde vi elektronmikroskopi på de som utvanns från MSC-konditionerat medium genom differentiell ultracentrifugering (100 000 g under 18 timmar). Denna analys visade närvaron av 50–100 nm vesiklar som är morfologiskt förenliga med exosomer (fig. 1a, till vänster). Flotation av 100 000 g pellets på sackarosgradienter följt av western blot och fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) visade vidare att dessa vesiklar uttryckte de exosomala markörernas mjölkfettkulafaktor 8 (Mfge8) respektive tetraspaninerna CD9 och CD63 (Kompletterande fig 1A). Centrifugering av konditionerat medium vid låga hastigheter (10 000 g ) avslöjade närvaron av större vesiklar (> 100 nm) som innehåller subcellulära mitokondriella strukturer inklusive yttre och inre membran och cristae, och uttryckte det mitokondriaspecifika proteinet ATP-syntas, vilket framgår av immunguld märkning (Fig. 1a, mitt och tilläggsfigur Fig. 1B). MSC frisätter också större multivesikulära kroppar innehållande lysosomliknande vesiklar och hela mitokondrier, vilket antyder att dessa organeller valdes för mitofagi genom inriktning mot autofagosomer (Fig. 1a, till höger).

Image

( a ) Vänsterpanel, elektronmikroskopi av vesiklar isolerade från sackarosdensiteter av 1, 11 och 1, 14 g ml −1 och renat med användning av differentiell ultracentrifugering (100 000 g per 18 timmar) avslöjar en typisk exosom morfologi. Mittpanel, MV: er över 100 nm i storlek utvunnna från humant MSC-konditionerat medium efter låg hastighet (10 000 g per 1 h) centrifugering innehåller strukturer som överensstämmer med morfologin i mitokondrier. Höger panel, MV: er innehåller tätt packade vesiklar och hela mitokondrier (multivesikulär kropp (MVB)) som representerar autofagosomer. ( b ) Vänsterpanel, flödescytometrisk analys av MitoSOX Rödfärgade humana MSC: er expanderade i 5 eller 21% syre under 7 dagar. Höger panel, kvantifiering av flödescytometriska data. Plottade värden (medelvärde ± sem) representerar fyra replikat för varje prov med användning av tre distinkta replikatkulturer från varje experimentell grupp. ( c ) Mitokondriell membranpotential för humana MSC från b bestämdes med användning av JC-1-färgning. Expansion i 21% syre resulterar i partiell depolarisering av mitokondrier, vilket framgår av ackumulering av JC-1-monomerer (* P <0, 005, Studenttest mot MSC: er i 5% syre). ( d ) Western blot-analys (kompletterande fig. 1) av cytoplasmatiska eller mitokondriala extrakt framställda från humana MSC: er expanderade i 21% syre för de angivna passagenumren (P1 eller P4) avslöjar Parkin-mitokondriell translokation och Pink1-kinasaktivering i humana MSC: er men inte människa dermala fibroblaster. Data är representativa för ett enda experiment som upprepades fem gånger.

Bild i full storlek

För att bestämma om kulturutvidgning av MSC försämrar mitokondriell funktion expanderade vi celler under fysiologiska syrgasnivåer (5% O 2 ) eller standardkulturförhållanden (21% O 2 ) och kvantifierade mtROS-nivåer och mitokondriell membranpotential genom färgning med MitoSOX Red och JC- 1 respektive 37 . FACS-analys av färgade celler bekräftade att exponering för 21% syre resulterade i en signifikant ökning av mtROS (fig. 1b) och en samtidig minskning av mitokondriell membranpotential, vilket visades genom ackumulering av JC-1-monomerer (fig. 1c). Dessutom avslöjade Western blot-analys att långvarig exponering för 21% syre aktiverade den Pink1 / Parkin-medierade vägen för mitofagi i MSC men inte i humana fibroblaster odlade under identiska förhållanden (fig. 1d). Härvid åtföljdes ökad mitokondriell expression av Parkin och Pink1-kinas av Pinkl-kinasaktivering, vilket framgår av närvaron av proteiner med lägre molekylvikt och reducerade Miro-nivåer i mitokondriala extrakt från P4 kontra P1 MSC: er (Fig. 1c och kompletterande Fig. 1C ). Det är viktigt att Pink1 riktar Miro för nedbrytning, varigenom anslutningen av mitokondrierna till cytoskelettet och underlättar dess införlivande i fagosomen 38 . I överensstämmelse med dessa resultat avslöjade Western blot-analys också att mitokondrierinnehållande MV: er uttryckte mikrotubulärassocierat protein 1 lätt kedja 3 (LC3) och autofagi-relaterat protein 12, som är mycket anrikade i MV: er jämfört med helcellsextrakt (kompletterande fig 1D). Därför är dessa MV: er karakteristiska för autofagosomer 39 .

MSC: s paket mitokondrier i MV: er för cellöverföring

För att undersöka mitofagi i MSCs mer detaljerat infekterades MSC med baculovirus som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) smält till E1alpha pyruvat-dehydrogenas-ledarpeptid, som driver transport till mitokondrierna, och LC3 smält till ett rött fluorescerande protein (RFP) för att tillåta spårning till fagoforen 39, 40 . Fluorescerande mikroskopi bekräftade att det GFP-märkta mitokondriella nätverket är i närheten av RFP-LC3-märkta fagosomer (Fig. 2a). Levande cellavbildning avslöjade vidare att mitokondrier laddas i cytoplasma i LC3-innehållande vesiklar, som migrerar mot cellperiferin och införlivas i utåt knoppande blad i plasmamembranet (fig. 2b – d och kompletterande film 1). Western blot-analys avslöjade vidare att RFP-LC3-MVs också uttryckte det endosomala sorteringskomplexet som krävs för transport (ESCRT) -associerade proteiner tumörsuppressorgen 101 (TSG101) och arresterande domäninnehållande protein 1 (ARRDC1) 11, 41 (kompletterande fig 1D). Sammantaget indikerar dessa resultat att MSC: er använder frisättningen av ARMM för att extrudera mitokondrier vid deras cellyta. Dessutom uppvisade MSC signifikanta ökningar i apoptos när de behandlades med Bafilomycin A1 eller låga koncentrationer (3-5 μM) klorokin, som blockerar mitofagiflödet, vilket indikerar att denna process är kritisk för MSC-överlevnad (kompletterande film 2).

Image

( a - d ) Fluorescensöverlagring av levande humana MSC: er som uttrycker fluorescerande proteiner som riktar sig mot mitokondrier (grönt) och fagosomer (rött) visar att mitokondrier laddas in i fagosomer (pilar), som sedan skickas till plasmamembranet för extrudering (se även Kompletterande film 1). ( e - h ) Inset visar en representativ makrofag som interagerar med en mänsklig MSC. Denna interaktion visas som en tidssekvens (5 min intervall) i de nedre bilderna och i tilläggsfilm 3. Insatsen avgränsar området i det mänskliga MSC-plasmamembranet där membranet blåser utåt och ackumulerar vesiklar. Makrofager knaprar ytan på mänskliga MSC: er och tar upp mitokondriella laddade fagosomer från bladknoppar (pilar) från plasmamembranet hos mänskliga MSC: er. Skalstänger, 10 μ.

Bild i full storlek

Därefter samodlade vi GFP-märkta humana MSC från ovan med primära humana eller musmakrofager. Levande cellavbildning avslöjade att makrofager knaprar plasmamembranet hos MSC: er, vilket upprättar cellkontakt vid områden där membranblåsan berikas i RFP-märkta vesiklar, som därefter strippas av makrofagen (fig. 2e – h och kompletterande film 3). Denna aktivitet observerades också mellan musmakrofager och primära humana MSC: er (fig. 3a och kompletterande filmer 4 och 5) men var inte uppenbar när makrofager odlades tillsammans med mus- eller humana fibroblaster (kompletterande fig. 2). I ett efterföljande experiment odlade vi makrofagcellinjen RAW 264.7 med humana MSC: er innehållande RFP-märkta mitokondrier (10: 1-förhållande) i 4 timmar och återhämtade makrofager med FACS efter färgning med antikroppar som känner igen makrofagepitoper (det vill säga F4 / 80) inte uttryckt av MSC: er. Sorterade makrofager odlades i upp till 2 veckor i RPMI-media, vilket inte stöder MSC-expansion och överlevnad. Fluorescerande mikroskopi av dessa makrofager avslöjade tydliga bevis på cellassocierad RFP härledd från humana MSC: er (fig. 3b). För att bekräfta dessa fynd visade vi med PCR-amplifiering att dessa makrofager uttryckte det mitokondriella specifika transkriptet humant cytokrom c- oxidas I (MT-COX I), vilket bekräftades på basis av det restriktionsfragmentmönster som erhölls efter digerering av PCR-produkten med Bfa1 (Fig. 3b). Denna PCR-produkt detekterades inte i musmakrofager på grund av begränsad sekvenshomologi mellan de två generna 30 men detekterades i humant MSC-härledda MV: er som förväntat (fig. 3c och kompletterande fig. 3A). Slutligen samodlade vi Cy5-märkta humana MSC: er med makrofager som förinkuberades med eller utan dextransulfat (100 μg ml −1 ), en ospecifik hämmare av fagocytos. Levande cellavbildning visade fagocytos av MV: er av makrofager under en period av 18 minuter, och konfokal mikroskopi bekräftade att de uppslukta Cy5-märkta vesiklarna bodde i cellkroppen på makrofagen (kompletterande film 6). Emellertid blockerades MV-upptag i makrofager förbehandlade med dextransulfat, vilket framgår av ackumuleringen av Cy5-märkta MV: er på makrofagytan (kompletterande film 7).

Image

( a ) Topppanelen är DIC-lysrörsbeläggning vid tidpunkt 0 av primära mänskliga MSC: er infekterade med organelljus för att märka mitokondrier (grön) och samodlade med musmakrofager (RAW 264.7). Nedre paneler, tidsföljd med intervaller på 45 minuter som visar överföring av grönmärkta mitokondrier från en MSC till en makrofag (röd pil, se kompletterande film 4 för överföring av mitokondrier i filamentös form, och kompletterande film 5 där GFP-signal kompenseras till tillåta spårning av de överförda mitokondrierna till makrofager). ( b ) Vänsterpanel, mikrofotografi av FACS-sorterade musmakrofager som samodlades med mitokondria-märkta (RFP) humana MSC: er visar tydligt retentionen av RFP-etiketten. Höger panel, elektroforetiskt mönster av human COX I PCR-produkt behandlad med eller utan Bfa1 efter amplifiering från de angivna cellkällorna. ( c ) MSC-härledda exosomer och MV: er uttrycker den Bfa1-känsliga 228-bp COX I mtDNA PCR-produkten detekterad i humana MSC: er ( b ). ( d ) Vänsterpanel, elektroforetiskt mönster av Bfa1-digererad human COX1 PCR-produkt amplifierad från mus-lung-DNA isolerat 14 dagar efter den intravenösa administreringen av humana MSC: er, humana MSC-härledda MV: er eller exosomer. Höger panel, humant GAPDH och humant COX1-relativa uttrycksnivåer kvantifierat med RT – PCR i mus-lunga (3–28 dagar) efter en enda (intratrakeal (IT) eller intravenös (IV)) injektion av humana MSC: er, humana MSC-härledda exosomer eller mänskliga fibroblaster. * P <0, 001, # P <0, 001 av ANOVA jämfört med obehandlad musslunga. Plottade värden (medelvärde ± sem) är från experiment upprepade fyra gånger. Skalstänger, 20 μ.

Bild i full storlek

För att spåra in vivo- överföringen av mitokondrier administrerade vi systematiskt RFP-märkta humana MSC: er i C57BL / 6-möss som uttryckte en GFP-reporter under kontroll av den endotelspecifika Tie2-promotorn. 24 timmar efter injektion var GFP-märkta endotelceller, epitelceller och makrofager som innehöll RFP-märkta mitokondrier synliga (kompletterande figur 3B). Bfa1-matsmältning av mus-lung-DNA efter intravenös administrering av humana MSC: er, exosomer eller MV: er gav ett mönster av restriktioner liknande de som observerades i RAW 264.7-makrofager (fig. 3d). För att följa ödet för livskraftiga humana MSC: er i musens lunga, mätte vi överflödet av mänskliga specifika GAPDH-transkript via omvänt transkriptas – PCR (RT – PCR) 42 . Humant GAPDH-mRNA detekterades inte i lungvävnaden hos obehandlade möss men detekterades 3 dagar efter injektion av humana MSC: er eller humana fibroblaster (fig. 3d). Emellertid minskade uttrycket snabbt och var inte längre tydligt 14 eller 28 dagar efter transplantation, i överensstämmelse med clearancehastigheten för celler från lungvävnad. Expression av humant COXI-mRNA i muselung speglade det från humant GAPDH efter injektion av humana fibroblaster och detekterades 3 dagar men inte 14 eller 28 dagar efter transplantation. Däremot detekterades humana COXI-transkript upp till 28 dagar efter injektion av humana MSC: er, vilket indikerar att musvävnad behöll mtDNA långt efter försvinnandet av livskraftiga humana MSC: er (fig. 3d). Således utgör MSC-härledda vesiklar en effektiv mekanism för att överföra mtDNA till musens lunga.

MSC extracellulära vesiklar förstärker makrofagenergi

För att studera effekten av MV: er på makrofagens bioenergi analyserade vi syreförbrukningshastigheter (OCR) med SeaHorse-tekniken. Mänskliga makrofager uppvisar högre basal OCR än humana MSC: er eller humana fibroblaster (fig. 4a). Samkultur av makrofager med humana MSC: er (Mac + hMSC) eller MSC-härledda exosomer (Mac + Exo) men inte humana fibroblaster (Mac + Fibro) signifikant (analys av varians (ANOVA) följt av Student – ​​Neuman Keuls) -hoc parvisa jämförelser) ökade deras OCR, vilket tyder på att MSC: er eller MSC-härledda exosomer förändrar makrofagens bioenergetik (fig. 4a). Därefter upprepade vi dessa mätningar efter behandling av celler med oligomycin A, en hämmare av ATP-syntas, vilket krävs för oxidativ fosforylering av ADP till ATP. Dessa tillstånd skiljer ATP-kopplad andning från protonläckan. Makrofager uppvisade en högre nivå av protonläcka jämfört med humana MSC: er och fibroblaster, och protonläckan var signifikant (ANOVA följt av SNK-parvisa parvisa jämförelser) minskade efter samkultur med human Mac + Exo men inte Mac + Fibro (fig. 4a ). Samkultur med mänskliga MSC: er (Mac + hMSC) minskade också signifikant (ANOVA följt av SNK efter parvis jämförelse av parvis) protonläckage i makrofager. Vi upprepade också OCR-mätningarna efter behandling av celler med frikopplingsmedlet karbonylcyanid 4- (trifluormetoxi) fenylhydraon (FCCP) för att bestämma hur celler svarar på en ökning av ATP-efterfrågan. Alla tre celltyper svarade på FCCP-behandling med ökad OCR, och storleken på svaret var större i makrofager jämfört med humana MSC: er och fibroblaster. Dessutom ökades OCR signifikant i FCCP-behandlade makrofager efter samodling med humana MSC: er (Mac + hMSC) eller human Mac + Exo men inte Mac + Fibro (fig. 4a).

Image

( a ) Mitokondriell andning av humana makrofager, mänskliga MSC: er eller humana fibroblaster mättes som OCR med användning av XF-tekniken. Makrofager odlades tillsammans med eller utan humana MSC: er eller fibroblaster (förhållandet 1:10) eller behandlades med humana MSC-härledda exosomer (40 μg per protein) i närvaro eller frånvaro av Oligomycin A och FCCP för att skilja ATP-länkad andning från protonläcka. Plottade data (medelvärde ± sem) utfördes med användning av sex replikat per prov och upprepades tre gånger. ( b ) Pseudokollorerade fotomikrografier (0–240 min) av MitoSOX rödfärgade makrofager som var icke-stimulerade (övre panel) eller behandlade med kiseldioxid (20 μg cm −2, nedre panel) eller kiseldioxid plus humana MSC-härledda exosomer ( tillsattes 10 minuter efter kiseldioxid, mittpanel). Skalstänger, 50 μ. ( c ) Tidsförlopp för MitoSOX Rödutsläpp av mänskliga makrofager behandlade som i b . Figuren är representativ för fem exponeringar (nio stegpositioner per test och 6 celler per steg). ( d ) OCR som i en av kiseldioxid exponerade makrofager behandlade med eller utan humana MSC, humana MSC-härledda exosomer eller humana fibroblaster. Plottade värden (medelvärde ± sem) är från experiment som upprepades tre gånger, * P <0, 05 jämfört med kontroll, # P <0, 05 jämfört med kiseldioxidbehandlade makrofager, bestämda med Student's t- test.

Bild i full storlek

För att undersöka effekten av MSC eller exosomer på makrofagens bioenergi under förhållanden med förändrad homeostas, utsatte vi makrofager för kiseldioxidpartiklar. Silikaxponering resulterar i en sprängning av mtROS-produktion, vilket framgår av förändringar i MitoSOX Röd fluorescensintensitet; emellertid mildras denna effekt till stor del i makrofager som inkuberas med humana MSC-härledda exosomer (fig. 4b, c). Silikaxponering minskade också makrofag OCR, men denna minskning vändes av samkultur med humana MSC eller humana MSC-härledda exosomer men inte med humana fibroblaster (fig. 4d). Det faktum att överföring av delvis depolariserade mitokondrier från MSC: er till makrofager ökar att makrofagens bioenergetik verkar paradoxalt. Emellertid är förlust av mitokondriell membranpotential som ett resultat av MSC-expansion inte absolut eftersom mitokondrier uppvisar restmembranpotential, vilket framgår av koncentrationen av JC-1-aggregat (fig. 1c). Detta indikerar att mitokondriell membran inte kollapsas och mitokondrierna fortfarande kan genomgå fusion. För att avgöra om dessa mitokondrier återvinns i makrofager genom fusion, samkulturerade vi mänskliga MSC med makrofager efter märkning av celler med två olika MitoTracker-färgämnen (rött och grönt) 43 . Levande cellavbildning visade tydligt överföringen och efterföljande fusion (gul färg i sammanslagna bilder) av RFP-märkta, humana MSC-härledda mitokondrier med GFP-märkta mitokondrier inom humana makrofager (fig. 5). Dessa data indikerar att MSC: er under oxidativ stress outsourcerar mitofagi till makrofager för att lossa delvis depolariserade mitokondrier, som återvinns via fusion med makrofager för att därigenom förbättra deras bioenergetik.

Image

Mänskliga MSC: er och humana makrofager (1 × 105) infekterades separat med Organelljus för att märka humana MSC-mitokondrier (röd) och makrofag-mitokondrier (grönt). 24 timmar efter infektion skördades makrofager och saminkuberades med humana MSC under 2 timmar. Bilder samlades med ett inverterat Nikon TiE-lysrörsmikroskop utrustat med en oljedoppningsoptik × 60 och NIS Elements Software. Organelljus var upphetsade med användning av en Lumencor diodpumpad ljusmotor och detekterades med användning av en ORCA-Flash4.0 sCMOS-kamera. ( a, b ) DIC-bilder av två separata fält i samma skål. ( c ) En zoomad bild av det skisserade avsnittet inom b (skalfält, 20 μ). De fluorescensbaserade bilderna för varje fält visas i panelerna under DIC-bilderna, med d - f som visar makrofag mitokondrier (grönt); g - i som visar mänsklig MSC-mitokondrier (röd); och j - l som visar överläggningen med gult som indikerar kolokalisering av humant MSC och makrofag mitokondrier. Inte varje makrofag visade sig ta upp humana MSC-mitokondrier ( a, d, g, j ).

Bild i full storlek

MSC-härledda exosomer berikas i mikroRNA

Exosomer överför RNA mellan celler 8 . Vi antog att denna process kan utnyttjas av MSC för att tolerera makrofager mot mitokondriell överföring. För att undersöka denna möjlighet analyserade vi RNA-innehållet i humana MSC-härledda exosomer. Med hjälp av mikroRNA-mikroarrayanalys identifierade vi 156 (45 ökade; 111 minskade) mikroRNA som skilde sig (log2> 1, 0, P <0, 05 (ANOVA följt av Holm – Sidak efter parvisa jämförelser) i överflöd mellan exosomer jämfört med deras överordnade MSC. mikroRNA som uppvisade den största ökningen inkluderade miR451a (316-faldig), miR1202 (45-faldig), miR630 (40-faldig) och miR638 (28-faldig), medan mikroRNA som uppvisade den största minskningen av exosomer och berikades i MSC inkluderade miR125b (148-faldig) och miR21 (91-faldig; fig. 6a, b). Detta mönster av mikroRNA-uttryck bevarades i MSC-härledda exosomer erhållna från fem humana donatorer (fig. 6c, d).

Image

( a ) Värmekarta som illustrerar de 10 mikroRNA som är mest anrikade i mänskliga MSC: er jämfört med deras motsvarande exosomer. Varje rad representerar ett mikroRNA och varje kolumn representerar en cell eller en exosom respektive gul och lila ökat eller minskat uttryck. ( b ) Plottade värden representerar medelloggen tvåfaldig anrikning av exosomalt kontra humant MSC-mikroRNA ( n = 5 mikroarrayer av olika MSC: s cellinjer; P <0, 05, ANOVA följt av Holm – Sidak efter parvisa jämförelser). ( c ) Data i b visar fördelning av differentiellt uttryckta mikroRNA mellan prover baserat på –log bas 10 signifikant P- värde (2 (i logbas 2). Gröna och röda rutor representerar alltmer och minskande uttryckta mikroRNA, respektive i exosomer kontra humana MSC. ( D ) Beräkningsanalys av mänskliga MSC: er och exosomer från fem givare visar att mikroRNA isolerade i exosomer kluster bland olika givare.

Bild i full storlek

MSC-härledda exosomer hämmar TLR-signalering i makrofager

Mitokondrialt upptag kan inducera inflammation via aktivering av mönsterigenkänningsreceptorer 34 . Därför, med tanke på närvaron av mtDNA och mikroRNA i MSC-härledda MV: er respektive exosomer, antog vi att exponering för dessa vesiklar skulle tolerera makrofager till mitokondriell överföring genom att inducera förändringar i TLR-uttryck. Därefter profilerade vi uttrycket av 84 TLR-associerade transkript i musmakrofager. Vi kontrasterade dessa resultat med de som observerades i makrofager som samodlades med mus- eller humana MSC: er, humana MSC-härledda exosomer eller kiseldioxidpartiklar, som när fagocytiserad inducerar makrofagaktivering 44 . Samodling av makrofager med MSC-härledda exosomer inducerade nukleär translokation av transkriptionsfaktorn NF-KB (fig. 7a) vilket resulterade i signifikanta förändringar (> 2, 5-faldig ökning eller minskning) i uttryck av 50 av de 84 TLR-associerade transkripten ( Fig. 7b). Till exempel, jämfört med kiseldioxid-exponerade makrofager, uppvisade de som behandlats med exosomer signifikanta (> 2, 5-faldiga) ökningar i transkript associerade med cytokinsignalering inkluderande interleukin (IL) -1P, prostaglandin endoperoxidsyntas 2 (PTGS2, alias COX2), granulocytkoloni- stimulerande faktor 3 (CSF3), IL-10, kemokin (C – C-motiv) ligand 2 (CCL2, alias MCP-1), NF-kB-kemokin (C – X-C-motiv) ligand 10 (CXCL10), tumornekros faktor (TNF) och retikuloendotelios onkogen (Rel; Fig. 7b). Däremot transkript som kodar proteiner involverade i MyD88-beroende signalering (MyD88, TLR 1, 4, 5, 7, 8 och 9, IRAK1 och TRAF6), TRIF-beroende signalering (TLR-adaptermolekyl 1 (TICAM1) och TICAM2) och TLR -relaterad signalering (CD80, CD86, IL-2, IL-12, Interferon gamma, PGLYRP1 och CSF2) nedreglerades.

Image

( a ) Övre paneler, konfokal mikroskopi som visar intracellulär lokalisering av Cy5-märkta exosomer inom makrofager 18 minuter efter administrering. Nedre panel, nukleär lokalisering av NF-KB i makrofager 2 timmar efter administrering av exosomer. Skalstänger, 15 μ. ( b ) Partiell värmekarta som illustrerar mRNA-nivåer av 84 TLR-associerade transkript i makrofager 8 timmar efter behandling med kiseldioxid (20 mg cm −2 ), MSC: er för människa eller mus (förhållande 1:10) eller humana MSC-härledda exosomer (40 μg protein). Transkriptionsordning är högst (överst) till lägst (botten), och varje rad representerar en gen och varje kolumn en specifik behandling. Rött och grönt illustrerar ökat respektive minskat genuttryck. Experiment upprepades fyra gånger. ( c ) Effekt av exosombehandling på utsöndring av PGE2, TNF och IL-10 i makrofager från de angivna musstammarna. Plottade data (medelvärde ± sem) var från experiment som upprepades fem gånger. * P <0, 05 jämfört med C57BL / 6J eller BALB / CJ-makrofager såsom bestämdes av ANOVA). ( d ) Övre panel, western blot som illustrerar den tidsberoende effekten av kiseldioxid eller humana MSC-härledda exosomer på expression av TLR7 i makrofager. Nedre panel, vik förändring i uttryck för de indikerade transkripten i makrofager RT – PCR som visar den negativa regleringen av exosomer på makrofaguttryck av TLR-gener. Plottade data (medelvärde ± sem) är från experiment som upprepats fyra gånger. * P <0, 05 jämfört med baslinjen. # P <0, 05 jämfört med nativa exosomer genom Studenttest. † P <0, 05 jämfört med effekten av nativa exosomer och indometacin (Indo) behandlade med Student's t- test.

Bild i full storlek

MSC utsöndrar PGE2 som verkar på prostaglandinreceptorer för LPS-stimulerade makrofager för att förbättra deras produktion av det antiinflammatoriska cytokinet IL-10 (ref. 45). Emellertid upphävdes denna effekt av MSC: er i makrofager från TLR4, MyD88, TNFR1 eller COX2-bristande möss 45 . I överensstämmelse med dessa resultat ökade exosom behandling av icke-stimulerade makrofager utsöndring av PGE2, TNF, IL-10 och IL-1-receptorantagonist (fig. 7c), som kan omprogrammera makrofager 3 . Dessa svar rekapitulerar de som observerades när makrofager exponerades för intakta mänskliga eller mus-MSC: er, förutom att IL-6, CSF2 och IL-1-receptor 1 ökades mer efter exponering för mus-MSC: er (fig. 7b).

Därefter behandlade vi TLR-signalmangel-makrofager (TLR4 - / -, TLR9 - / -, MyD88 - / - ) eller makrofager med scavengerreceptor-brist (MARCO - / - ) med MSC-härledda exosomer. Såsom visas i fig. 7c var PGE2-produktionen likadan efter exosombehandling i alla signalbristmakrofager jämfört med vildtypceller från stam-matchade C57BL / 6J- eller BALB / CJ-möss. Däremot var sekretion av TNF och IL-10 signifikant (ANOVA följt av SNK post-hoc parvisa jämförelser) reducerad i TLR4 - / - och MYD88 - / - makrofager jämfört med vildtypceller efter exosombehandling och IL-10 utsöndring minskades också signifikant i makrofager från TLR9 - / - möss (fig. 7c). Dessa data bekräftar vikten av TLR: er och i synnerhet MyD88-beroende vägar för att förmedla exosominducerade effekter på makrofagfunktion. Slutligen visade vi att preinkubation med dextransulfat signifikant (ANOVA följt av SNK- post-hoc parvisa jämförelser) minskade frisättningen av PGE2, TNF och IL-10 genom exosombehandlade makrofager, vilket bekräftade behovet av fagocytos av MSC-härledda vesiklar i denna process (kompletterande figur 4A).

För att undersöka mikroRNA: s roll i makrofagtolerering behandlade vi RAW 264.7-celler, som använder TLR: er för att rekrytera autofagiproteiner i fagosomer för att försämra sin last 46, med exosomer härrörande från humana MSC: er transfekterade med eller utan en kort hårnål-RNA (shRNA) utformad för att hämma DICER-expression i närvaro eller frånvaro av indometacin, en cyklooxygenasinhibitor (kompletterande fig. 4B). Behandling av naiva RAW 264, 7-makrofager med nativa exosomer förbättrade TNF och reducerade TLR: er och MyD88-mRNA-uttryck under 24 timmar (fig. 7c), medan behandling av kiseldioxid-exponerade makrofager med exosomer förbättrade induktion av TLR7 efter kiseldioxideksponering (fig. 7c). Förinkubation av RAW 264.7-makrofager med indometacin före behandling med nativa exosomer, eller behandling med exosomer från DICER-knockout MSCs signifikant (ANOVA följt av SNK- post-hoc parvisa jämförelser) reducerade de observerade effekterna på TLR-mRNA-uttryck (fig. 7c) och reducerade sekretion av proteiner såsom TNF, MIP, MCP1, KC och IP-10 associerade med makrofagaktivering (kompletterande figur 4B, C). De hämmande effekterna av indometacin begränsades till TLR4 och MyD88 mRNA, medan effekterna av DICER-bristiga exosomer var av större storlek och involverade också negativ reglering av TLR 7 och 9 (fig. 7c). Samtidig behandling med indometacin och exosomer från DICER-bristfälliga exosomer visade tillsatseffekter (Fig. 7c).

Det är viktigt att miR-451 är en av de mest rikligt uttryckta mikroRNA: erna i MSC-härledda exosomer, men dess mognad sker oberoende av DICER 47 . Därför förändras dess uttryck inte i exosomer från DICER knockdown MSC: er. MiR-451 reglerar negativt cytokinproduktion i dendritiska celler infekterade med influensavirus 48 . I överensstämmelse med dessa resultat minskade transfektion av RAW 264.7-makrofager med en miR-451 signifikant (Studentens t- test) TNF-mRNA-uttryck i icke-stimulerade makrofager och hämmade mRNA-expression och proteinfrisättning i kiseldioxid-exponerade makrofager (kompletterande fig. 4D ). Däremot gav behandling av celler med en miR-451-antagomir motsatt resultat. Dessa data bekräftar en roll av exosom-härledda mikroRNA i att reglera cytokinuttryck i makrofager.

MSC-exosomer dämpar monocytaktivering och silikos

Cirkulerande MV: er kommer in i benmärgen och omprogrammerar celler för att uttrycka proteiner från vävnaden med vesikell ursprung 49 . Ly6C hi monocyter rekryteras från benmärgen in i lungan som svar på skada och spelar en viktig roll i patogenesen av lungfibros 50, 51 . Därför undersökte vi om MSC eller deras exosomer kan förändra lungrekryteringen och cytokinproduktionen av Ly6C hi monocyter hos möss efter exponering av kiseldioxid. Såsom visas i fig. 8a identifierade FACS ett begränsat antal Ly6C- hi- monocyter i den normala mus-lungan, vilket var signifikant (ANOVA följt av SNK- post-hoc- parvisa jämförelser) ökade med 72 timmar exponering för kiseldioxid. Dessutom indikerar högt uttryck av CCR2 och frisättning av inflammatoriska (TNF, CCL2 och CXCL1) och fibrotiska (transformerande tillväxtfaktor p (TGFp) och IL-10) att dessa monocyter är aktiverade (fig. 8b). Däremot, intravenös administrering av humana MSC: er (500 000 celler) eller färskt isolerade humana MSC-härledda exosomer (∼ 3 × 10 11 exosomer innehållande 40 μg protein) vid 24 timmar efter exponering av kiseldioxid (0, 2 g · kg −1 ) minskade signifikant omfattning av Ly6C hi monocytinfiltrering i lungan och utsöndrade nivåer av inflammatoriska mediatorer (Fig. 8a, b).

Image

( a ) Övre panel, absolut antal F4 / 80 / CD11b- och Ly6C / CCR2-uttryckande celler i lungvävnad från möss 72 timmar efter administration av saltlösning (50 ul), kiseldioxid (0, 2 g kg −1 ) eller kiseldioxid plus människa MSC-härledda exosomer (∼ 3 × 10 11 exosomer innehållande 40 μg protein). * P <0, 05 jämfört med saltlösning med t- test). Nedre panel, representativa histogram av flödescytometriska data analyserade i en visar fenotypen och frekvensen för celler som utvunnits från lungvävnad efter enzymatisk matsmältning. ( b ) Mulitplex ELISA av inflammatoriska (TNF, MCP1 och KC) och fibrotiska (TGFp och IL-10) mediatorer utsöndrade av odlade F4 / 80 / CD11b / och Ly6C / CCR2-celler från a . Plottade värden (medelvärde ± sem) är från experiment med användning av N = 5 djur per grupp och upprepades tre gånger. * P <0, 05 jämfört med saltlösning, # P <0, 001 jämfört med kiseldioxidbehandlade monocyter av ANOVA.

Bild i full storlek

Kiseldioxid inducerar inflammation och kollagenavsättning i peri-bronchiolar, silikotisk nodul och peri-vaskulära regioner i lungan (Fig. 9a). Dessa skador är förknippade med ökat antal inflammatoriska celler (även om andelen makrofager minskar, det finns en ökning av neutrofiler och lymfocyter) i bronkoalveolär sköljvätska (BALF, fig. 9b), signifikant avsättning av lungkollagen mätt med hydroxyprolin (fig 9c) och förstärkt expression av pro-inflammatoriska cytokiner (TNF och IL-6) och fibrotiska mediatorer (IL-10 och a (I) kollagen) med 14 och 28 dagar efter exponering av kiseldioxid (fig. 9d). Intravenös administrering av humana MSC eller exosomer 3 dagar efter exponering av kiseldioxid minskade storleken på de silikotiska knutarna (fig. 9a), det totala antalet vita blodkroppar i BALF (fig. 9b) och uttryck av inflammatoriska och pro-fibrotiska gener i lunga (Fig. 9d). Administrering av exosomer signifikant (ANOVA följt av SNK-parvisa parvisa jämförelser) minskade ansamlingen av neutrofiler och lymfocyter i BALF, medan MSC endast minskade ackumuleringen av neutrofiler och inducerade en lätt (<1%) ökning i eosinofilantalet (Fig. 9b) . Däremot förvärrade den intravenösa administrationen av humana fibroblaster avsevärt de inflammatoriska och fibrotiska responserna på kiseldioxid (Fig. 9a – c). Exosomer, men inte MSC eller fibroblastadministration, reducerade ackumuleringen av hydroxiprolin i lungvävnad 28 dagar efter kiseldioxid (Fig. 9c).

Image

( a ) Mikrofotografier av lungavsnitt färgade med hematoxylin och eosin från möss 28 dagar efter intratrakeal administration av kiseldioxid (0, 2 g kg -1 ) ensam eller följde 3 dagar senare med en intravenös injektion av humana MSC: er, humana MSC-härledda exosomer (∼ 3 × 10 11 exosomer som innehåller 40 μg protein) eller humana fibroblaster (skalstänger, 500 μ). ( b ) Övre panel, mikrofotografier av Diff-Quick-färgade cytospiner av BAL från möss i en . Nedre panel, differentiella cellräkningar som visar antalet totala celler (vänster) och procentandel makrofager, lymfocyter, neutrofiler och eosinofiler (högra paneler). * P <0, 05 jämfört med kontroll, † P <0, 05 jämfört med fibroblaster behandlade möss med Student's t- test. ( c ) Hydroxyprolininnehåll i lungvävnad från djur behandlade som i en . * P <0, 001 jämfört med saltlösning genom Studentens t- test. † P <0, 05 jämfört med kiseldioxid, humant MSC eller fibroblast av ANOVA. ( d ) Kvantifiering av musens TNF-, IL-6-, IL-10- och Col1al-nivåer i lungvävnad från möss i en 14 och 28 d efterbehandling. Plottade värden (medelvärde ± sem) är representativa för experiment med 15 djur per grupp och upprepas tre gånger. * P <0, 001 jämfört med saltlösning med Student's t- test, † P <0, 05 jämfört med kiseldioxid av ANOVA.

Bild i full storlek

Diskussion

MSCs modulate macrophage function by a variety of mechanisms, and this crosstalk contributes to their anti-inflammatory activity but the physiological relevance of this crosstalk remains obscure particularly as it relates to the survival and function of MSCs. In this study, we report that during their ex vivo culture MSCs transfer partially depolarized mitochondria to macrophages as a pro-survival mechanism in response to oxidative stress and that these mitochondria are repurposed via a process involving fusion to increase macrophage bioenergetics. Moreover, we show that MSCs also desensitize macrophages to mitochondrial transfers by repressing TLR-signalling. Our data indicate that MSCs employ two different types of MVs to achieve these goals. MSCs load mitochondria in the cytoplasm into LC3 containing MVs that are recovered from cell culture media with low-speed centrifugation. These MVs express the ESCRT-I-associated proteins TSG101 and ARRDC1 and are extruded from cells in ARMMs 11, which bud outwards directly from the plasma membrane where they are identified by macrophages. MSCs also shed exosomes that modulate TLR signalling and cytokine secretion in macrophages, in part, by transfer of regulatory microRNAs.

Previous reports indicate that mitochondria transferred by MSCs improve the energetic activity of the alveolar epithelium of LPS-treated mice 30, 31, 32, 33 and animal models of rotenone-induced airway injury 52 . However, the beneficial effects of mitochondria were limited to acceptor cells almost completely deficient of mitochondrial function 30, 53 . Therefore, it is unclear whether rescue is because of the transfer of mitochondria, mtDNA or release of other mediators by MSCs 33 . Importantly, the bone marrow niche contains few, if any, epithelium, so the physiological relevance of this is unclear.

Our data suggest that mitochondrial transfer by MSCs is not altruistic but rather may serve to enhance MSCs' cell survival by unloading partially depolarized mitochondria. Elimination of depolarized mitochondria is a priority for MSCs that experience high mtROS generation when cultured under atmospheric oxygen tension 28 since inhibitors of the mitophagy flux induce MSC apoptosis. Unexpectedly, MV-mediated mitochondrial transfer augments macrophage function by improving mitochondrial bioenergetics. As reported for the alveolar epithelial cells, recovery of the energetic function of macrophages is characterized by an increased ability to generate ATP under conditions in which the cells exhibit mitochondrial uncoupling or an enhanced proton leak, and involves protection of the macrophage by reducing mtROS generation. This outcome is consistent with data indicating that transfer of mitochondria, even if partially depolarized, is followed by fusion inside the acceptor macrophage. Notably, several studies have reported that transfer of only a few mitochondria is sufficient to rescue cells depleted of mtDNA by culture in ethidium bromide 30, 54, 55 . Furthermore, the current study confirms evidence that exosomes, which do not carry mitochondria, contain nucleic acids 56, including mtDNA that can be transferred, long term, in vivo to the lung. Presence of mtDNA inside exosomes is not surprising as mtDNAs are dispersed throughout the mitochondrial network as histone-free nucleoids with an average size in mammals under 100 nm, and contain a single copy of mtDNA per nucleoid 57 . However, we cannot completely exclude the possibility that the exosome preparations could be contaminated by apoptotic bodies.

Accumulation of mtDNA that escapes mitophagy induces TLR 9-mediated inflammation that in the case of cardiac muscle is associated with heart failure 35 and mice transplanted with cells harbouring allogeneic mtDNA trigger MyD88 responses to reject these cells 36 . Therefore, silencing TLR responses in macrophages is likely necessary to induce tolerance to transferred mitochondria. Consistent with this hypothesis, we demonstrate that uptake of MSC-derived exosomes represses TLR signalling in macrophages and the production of inflammatory mediators by targeting pathways (TLRs and NF-κB) central to inflammation.

Interestingly, microRNAs present in MSC-derived exosomes are highly conserved between human MSC donors. One such microRNA, miR-451, is highly abundant in exosomes but is expressed at low levels in macrophages and dendritic cells where it regulates cytokine production 58, 59, 60 . Mir-451 is known to suppress TNF, and macrophage migration inhibitory factor, which inhibits the anti-inflammatory effects of glucocorticoids and negatively regulates p38 MAPK signalling to protect from diabetic nephropathy 48, 58, 59, 60 . Indeed, ectopic expression of a mir-451 mimic in macrophages inhibits TNF secretion in response to silica. Consistent with these findings, MSC-derived exosomes prevent the recruitment of Ly6C hi monocytes and reduces secretion of pro-fibrotic IL-10 and TGFβ by these cells in the lung of silica-exposed mice. Therefore, these data suggest that, as tested in vitro , immunomodulatory activities may have evolved, in part, as a mechanism by which MSCs survive oxidative stress and serendipitously confers on cells the ability to suppress inflammation, in lung injury models. Indeed, our data illustrate a physiological role for the innate immune regulatory activity of MSCs, and in doing so further highlights the important association between MSCs and macrophages in vivo .

metoder

Human MSC and cell lines

Human MSCs were harvested from small volume aspirates of the iliac crest bone marrow from five healthy adult volunteers by the Center for Preparation and Distribution of Adult Stem Cells formerly at the Tulane University School of Medicine (New Orleans, LA). The Institutional Review Board at the Tulane University approved the procedures involved in the procurement of these cells as previously described 61 . Human MSCs were also provided by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI)-sponsored Production Assistance for Cellular Therapies Program at the University of Minnesota. Adult normal human dermal or lung fibroblasts were commercially obtained from Lonza (Walkersville, MD). Mouse MSCs were isolated from FVB/NJ or C57BL/6J mice (The Jackson Laboratory) as previously described 28 . All studies employing human or mouse MSCs were performed using low-passage (1–4) populations. Primary mouse macrophages were isolated from the femurs of C57BL/6J, BALB/CJ (The Jackson Laboratory), TLR4−/− (The Jackson Laboratory), TLR9−/− and MyD88−/− (Department of Host Defense, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University and Core Research for Evolutional Science and Technology, Japan Science and Technology Corporation, Suita) and MARCO−/− (provided by Dr Andrij Holian at the University of Montana) strains as previously reported 62 . Human monocytes were isolated from the peripheral blood of normal human volunteers (blood donors at local blood bank) and were differentiated into mature macrophages as previously described 63 . Cells were cultured at specific densities as described in the text. The mouse macrophage cell lines IC21 and RAW 264.7 were purchased from the American Type Culture Collection (Rockville, MD) and were cultured in RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Rockville, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U ml −1 of penicillin G and 100 μg ml −1 streptomycin and grown at 37 °C in 5% CO 2 .

Experimental silicosis

Crystalline silica (α-quartz, average size, 1.7 μm) was obtained from US Silica Co. (Berkeley Springs, WV) and was selected by sedimentation according to Stokes' law, acid hydrolysed and baked overnight (200 °C, 16 h) to inactivate endotoxin contamination. Ten- to twelve-week-old Specific pathogen-free female C57BL/6 mice (Charles River Laboratories, Kingston, NY) weighing 20–25 g were housed in pathogen-free cabinets. Animals were anaesthetized via intraperitoneal administration of sodium pentobarbital (200 mg kg −1 ; Henry Schein, Indianapolis, IN), exposed to silica (0.2 g kg −1 ) or saline (control) and after 3 days received intravenous injections of human MSC or fibroblasts (500, 000 cells per mouse), or human MSC-derived exosomes ( ∼ 3 × 10 11 exosomes containing 40 μg protein). Animals were euthanized by exsanguinations at 3, 14 and 28 days post exposure. All lung samples were harvested at a terminal anaesthesia point, fixed and embedded in paraffin for histological analysis or snap-frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C for RNA or collagen analysis. All procedures involving animals were approval by the Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pittsburgh.

Collagen deposition was measured with hydroxyproline assay as previously described 64 . Briefly, dried left lungs were acid-hydrolysed in 6 N HCl at 110 °C under nitrogen gas. After evaporation of HCl, samples were suspended in PBS and incubated in a 60 °C water bath. Following three consecutive high-speed centrifugations, a 40 × dilution in PBS of the supernatant was oxidized with chloramine-T and the reaction was stopped with perchloric acid. Finally, p -dimethylaminobenzaldehyde was added and samples were analysed spectrophotometrically at 557 nm. Hydroxyproline content per lung was calculated from a hydroxyproline standard curve.

Inflammatory cells were measured in BALF of mice 28 days after the treatment with silica or intervention with MSCs, MSC-derived exosomes or fibroblasts. Mice were killed with an overdose of sodium pentobarbital and the lungs lavaged with a single instillation of 1 ml normal saline. Recovery of BALF was consistently above 80%. BALF cells were counted using a Z1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA), and 50, 000 cells were transferred to glass slides using a Shandon Cytospin 4 (Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, PA) at 750 rpm for 5 min. After 3 days of drying, cells were stained using the Diff-Quick stain (Dade Behring, DE), and macrophages, neutrophils and lymphocytes were counted (400 cells).

Isolation of MVs

Purification of exosomes was performed as previously described 17, 18 . Briefly, MSCs were expanded in multilayer tissue culture plates (Millipore) in medium depleted of serum derived-MVs/exosomes by overnight ultracentrifugation at 100, 000 g or in serum-reduced MSC medium (Invitrogen) supplemented with bovine serum albumin (Sigma-Aldrich). Conditioned medium from 10 × 10 6 MSCs was collected every 24 h and was subjected to successive centrifugations at 300 and 2, 000 g (10 min each) to remove cells. The cell-free supernatant was then centrifuged at 10, 000 g for 30 min to remove cell debris and 100, 000 g (Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifuge) at 4 °C for 90 min. The 10, 000 and 100, 000 g pellets were washed and suspended in 100 μl of PBS. Total protein was isolated from 2–5 × 10 6 MSCs and quantified using the Bradford protein assay (Thermo Fisher Scientific). The protein content of exosomes (100, 000 g ) or vesicles (10, 000 g ) recovered from conditioned medium was quantified ( ∼ 3–5 μg per preparation) and pooled to perform electron microscopy, western blotting or in vivo administration.

Vesicles isolated from conditioned medium from 10 × 10 6 human MSCs were pooled (five to seven preparations) and overlaid on sucrose as previously described 16, 17, 18 . Exosomes were suspended in 2 ml of 2.5 M sucrose and loaded in a SW41 tube, and 10 ml of a continuous sucrose gradient, from 2 to 0.25 M, was layered on top. Tubes were centrifuged for 18 h at 4 °C at 100, 000 g (ref. 18). Single 1-ml fractions were collected and sucrose density was determined on an aliquot of each gradient with the use of a refractometer (Reichert) and the fractions re-suspended in 3 ml PBS, centrifuged for 70 min at 100, 000 g 4 °C and the pellet suspended in sample buffer before being analysed with NanoSight tracker to determine particle number as previously described 19, or SDS–PAGE and western blot.

Measuring MSC-derived exosomes by nanoparticle tracking

Exosomes were diluted in particle-free PBS and measured using Nanoparticle Tracking Analysis as described 19 . Briefly, videos were collected using a NanoSight LM10 system equipped with a 405-nm laser and a highly sensitive digital camera (OrcaFlas2.8, with camera shutter speed fixed at 30.01 ms and gain set to 500), and analysed with the NTA software (NANOSight version 2.3). Ambient temperature was recorded manually and samples administered and recorded under control flow, using NanoSight syringe pump and script control system. For each sample, three videos of 60-s duration were obtained with 10-s delay between recordings, generating three replicate histograms. The typical number of tracks per sample was ∼ 1, 500. To obtain average particle counts, the area under the curve was calculated using the Prism-4 software. Black histograms indicate the average size concentration, and red error bars indicate the±1 se of the mean.

Western blotting and histochemistry

Western blot analysis was conducted as previously described 44 . The following primary (at a concentration of 1.5 μg ml −1 ) and secondary (0.5 ng ml −1 ) antibodies were used for western blotting: polyclonal anti-ARRDC1, anti-LC3, anti-MDA5, anti-TLR9 (Abcam), polyclonal anti-Atg-12 (Santa Cruz Biotechnology, SC-68884), polyclonal anti-Pink1 (Santa Cruz Biotechnology, SC-33796), anti-Parkin mouse monoclonal (clone PRK8, Santa Cruz Biotechnology), polyclonal anti-Miro (Santa Cruz Biotechnology, SC-292547), anti-CD9 (MM2/57, Millipore), anti-CD63 (MEM-259, ThermoFisher), anti-TSG101 (51/TSG101, BD Biosciences), anti-Human MFGE8 (Abnova), anti-Dicer (D11, Santa Cruz Biotechnology, used at a concentration of 2 μg ml −1 ), anti-Tubulin, anti-LC3 (rabbit polyclonal), anti-TLR-7 (Cell Signaling Technology), Beta actin (AC-15, Sigma-Aldrich) and anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, SC-25778). NF-κB nuclear translocation was characterized by staining cells with anti NF-κB-P50 Alexa Fluor 488 (E-10, Santa Cruz Biotechnology). Images were obtained using a Leica TCS NT upright confocal microscope.

Live cell imaging and electron microscopy

Human or mouse MSCs (1 × 10 6 ) were infected with baculoviruses (BacMam2 delivery system, Life Technologies) encoding fluorescent proteins (Organelle Lights, Life Technologies) to target mitochondria (GFP) or LC3-associated with phagosomes (RFP) for 48 h at 37 °C at an multiplicity of infection of 30 in accordance with the manufacturer's specifications. Subsequently, 1 × 10 5 cells were plated into Mattek dishes and co-incubated with an equal amount of bone marrow-derived macrophages (C57BL/6J, BALB/CJ and FVB/NJ) or macrophage cell lines (RAW 264.7 or IC-21). MSCs were maintained alive using a Tokai Hit temperature-controlled humidified chamber at 37 °C for periods of up to 72 h. During this time, multimode imaging events in five dimensions were obtained using high-speed confocal imaging on a Nikon Ti stand equipped with a Prairie Sweptfield scanner and Elements software. Images were collected using shuttered illumination in two colours with cubes specifically designed for GFP, ratiometric dyes or membrane/cytoplasmic labels, and differential interference contrast modes. Image series were viewed as movies for qualitative assessment, or were imported to Metamorph for quantitative assessment of cell motion, protein expression and organelle transfer between MSCs and macrophages. To inhibit the mitophagic flux, double GFP and RFP-labeled MSCs were treated with 3 μM chloroquine (Invitrogen) and images taken every 5 min as described. In some experiments, MSCs were stained with Cy5 dye (Amersham) following the manufacturer's instructions; MSC-conditioned medium was collected and extracellular MVs isolated as described above. Cy5-labelled exosomes/MVs were co-cultured on Mattek dishes with macrophages from different mouse strains (C57BL/6J, BALB/CJ, TLR4−/−, TLR9−/−, MyD88−/−, MARCO−/− and RAW 264.7) and phagocytosis followed as described above. To inhibit phagocytosis, macrophages were treated for 2 h with 100 μg ml −1 dextran sulfate (Sigma-Aldrich) before their exposure to Cy5-labelled vesicles.

Electron microscopy analysis was performed on MSC extracellular vesicles loaded on carbon-coated grids and fixed in 4% paraformaldehyde. Grids were labelled with mouse or rabbit anti-human ATP synthase (ab54880). Grids were observed at 80 kV with a JEOL 1210 transmission electron microscope (TEM) with high-resolution AMT digital camera. Size of MVs was measured on five to seven different pictures using the TEM software.

RNA analysis

RNA was extracted using the RNeasy micro kit (Qiagen), and first-strand cDNA synthesized using SuperScript III (Invitrogen). Quantitative PCR was performed using the Taqman single-gene expression assay (Invitrogen) on an ABI 7900 Real Time PCR System (Applied Biosystems). The following oligonucleotide primers were used: hCOX-I (Hs03929097_g1), hGAPDH (Hs02596864_g1), mCOLLAGEN (Mm00472589_m1), mTNF (Mn 00443258_m1), mIL-6 (Mm00446190_m1), mIL-10 (Mm00439614_m1), mMyD88 (Mm00440338_m1), mTLR9 (Mm00446193), mTLR7 (Mm00446590_m1) and mTLR4 (Mm00445273_m1). Mouse Toll Like Receptor Signaling Pathway genes were measured using a mouse RT 2 Profiler PCR Array System (SABioscience Version 4) as previously described. Alternatively, total RNA was isolated from five different human MSC donor populations or their exosomes using the Qiagen miRNeasy Mini Kit (PN 217004) according to the manufacturer's instructions. Samples were then analysed using human microRNA microarrays from Agilent (Version 3, PN: G4470C) and data analysed using the Agilent GeneSpring GX 11 software. In some cases, array data were validated via quantitative RT–PCR.

mtDNA from five human MSC donors was isolated, and human COXI, tRNA leucine and mitochondrial hypervariable regions I and II (HVRI) were sequenced to generate specific probes to allow for the documentation of fragment length polymorphism 30 . We identified polymorphisms in the sequences of HVR in each one of the five hMSC donors used in the current study and partial homology in human tRNA leu probes between species that yielded a positive hybridization signal in mouse macrophages. Subsequently, we sequenced the COX gene from our five human MSC donors and designed COX I-specific primers encompassing base pairs 64–293 that were conserved among the different human MSC populations. In Supplementary Fig. 4 we illustrate sequences spanning nucleotides 108–293 that exhibit little homology with the mouse gene and contain a BfaI restriction site (5′-CTAG-3′) allowing the generation of a specific restriction map. PCR products were digested with BfaI and products resolved with agarose electrophoresis (Novex, Invitrogen).

Fluorescent activated cell sorting

Mouse lung tissue was digested with collagenase-dispase (Sigma-Aldrich) to generate a single-cell suspension as previously described 50 . Cells were then stained with the following antibodies: Anti-F4/80-FITC (BM8, Abcam), CCR2-PE (475301, R&D System), Ly-6C-APC (HK1.4, eBiosciences) and CD11b-V450 (M1/70, BD Biosciences). CD11b + and Ly6C hi cells were gated within the F4/80 + subpopulation, and from these CCR2 + cells were sorted as previously described 50 . Characterization of exosomes markers was performed as described previously 8, 17 . Aldehyde/sulfate latex beads (Life Technology) were coupled with 30 μg of exosomes, stained with fluorescein isothiocyanate -conjugated anti-CD63 (H5C6, BD Pharmingen) and analysed using FACS. Macrophages co-incubated with Orange Fluorescent Protein (OFP)-mitochondria-labelled MSCs were incubated with anti-F4/80 + and double-positive F4/80 + /RFP cells sorted using FACS. Analysis was performed using a FACS Canto II (BD Biosciences) and data analysed using the FlowJo v7.6.3 software.

Mitochondrial bioenergetics

Mitochondrial respiration in macrophages (3–5 × 10 8 ) was determined by measuring the OCR using an XF24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience). Macrophages were seeded at a density of 25, 500 cells per well on the customized Seahorse 24-well plates. Cells were incubated in XF24 assay media for 1 h. OCR was calculated by plotting the O 2 tension of the media in the chamber as a function of time (pmol min −1 ). Values were normalized to total protein content of each well. Data were collected from an average of six independent wells and experiments were conducted in triplicates. Where indicated, MSCs were stained with MitoSOX-Red (Invitrogen) to quantify mitochondrial superoxide production as previously described 28 . For microscopic analysis, 10 μM MitoSOX-Red was used, while 100 nM was used for fluorescent quantification. To confirm mitochondrial localization of the dye, cells were counterstained with 5 μM Mito-Tracker Green (Invitrogen) for 10 min. Normalization of fluorescent data was performed using counterstaining with Hoechst 33342 (1 μM) for 5 min. Fluorescent wavelength pairs for the individual dyes were 510 nm/580 nm for MitoSOX-Red, and 490 nm/516 nm for Mito-Tracker Green. To determine mitochondrial membrane potential, cells were grown to ∼ 80% confluence in 96-well plates and stained with 2 μM JC-1 for 10 min following anisomycin treatment. Green fluorescence (depolarization) was monitored at 488 nm and red fluorescence (polarized) at 590 nm on a Spectromax M5e plate reader (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, //www.moleculardevices.com). Actively growing cells were used as a negative control, and cells treated with 2 mM carbonyl cyanide p -trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) and 1 mM valinomycin were used as the positive control. Normalization to cell number was achieved as described above. Data are presented as per cent viable cells based on presumed 95–100% depolarization observed in FCCP/valinomycin-treated cells 37 .

DICER knockdown in human MSCs

Human MSCs (1 × 10 6 ) were infected with a lentivirus encoding a DICER-specific shRNA l (Santa Cruz Biotechnology) in complete αMEM containing 5 μg ml −1 Polybrene overnight at 37 °C 5% CO 2 . Clones expressing the virus were selected by their resistance to Puromycin (Sigma-Aldrich) and reduced DICER expression in selected cells was confirmed by western blotting using an anti-hDICER antibody (H-212, Santa Cruz Biotechnology).

Statistik

Results are presented as mean±sem from at least three experiments. Statistical differences between groups were analysed using one-way ANOVA followed by SNK test for post hoc pairwise comparisons (statview 4, Abacus Concenpt Inc, Berkely, CA). For microarray data, the significant differences were determined by one-way ANOVA with Holm–Sidak all pairwise multiple comparison procedure. The statistical significance of differences was set at P <0.05.

anslutningar

Genuttryck Omnibus

  • GSE71241

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer

    Supplementary Figures 1-4

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film 1

    Human MSC load mitochondria into LC3-labelled vesicles. Live cell imaging demonstrating that under normal culture conditions human MSC mitochondria are loaded in the cytoplasm into LC3-labelled vesicles and subsequently migrate towards the periphery of the cell where they are incorporated into outward budding blebs in the plasma membrane.

  2. 2.

    Kompletterande film 2

    Inhibition of mitophagy flux induces MSC apoptosis. Apoptosis of human MSCs cultured under normal serum conditions in the presence of low (3-5 μM) concentrations of chloroquine, which prevents lysosomal degradation and blocks the mitophagy flux of mitochondria in mitophagosomes.

  3. 3.

    Kompletterande film 3

    Human MSCs outsource mitophagy to macrophages. Live microscopy reveals that macrophages nibble the plasma membrane of human MSCs establishing cell contact at areas where membrane blebs are enriched in LC3 labeled vesicles, which are subsequently stripped by the macrophages.

  4. 4.

    Kompletterande film 4

    MSCs transfer mitochondria to macrophages. Cultured human MSCs establish physical interaction to transfer their GFP-labeled mitochondria, observed in filamentous form, to mouse macrophages.

  5. 5.

    Kompletterande film 5

    MSCs rapidly transfer mitochondria to macrophages. Cultured human MSCs establish physical interaction to rapidly transfer their GFP-labeled mitochondria to mouse macrophages. GFP signal is overcompensated to allow the tracking of the GFP-labeled mitochondria inside the acidic pH of the macrophage.

  6. 6.

    Kompletterande film 6

    Macrophages avidly phagocytose MSC-derived extracellular vesicles. Live cell imaging illustrating phagocytosis of extracellular vesicles by macrophages over a period of 18 minutes. Confocal images confirm that the engulfed Cy5-labeled vesicles resided within the cell body of the macrophages.

  7. 7.

    Kompletterande film 7

    Dextran Sulfate inhibits phagocytosis of hMSC-derived extracellular vesicles. Pre-incubation of macrophages with non-specific inhibitors of phagocytosis, such as dextran sulfate (100 μg/ml), inhibited the entrance of Cy5-labeled hMSC-derived extracellular vesicles inside the macrophage, which accumulated on the macrophage surface where they formed a cap.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.