Mekanismer för inaktivering av mlh1 i ärftlig nonpolypos kolorektal karcinom: en ny metod | onkogen

Mekanismer för inaktivering av mlh1 i ärftlig nonpolypos kolorektal karcinom: en ny metod | onkogen

Anonim

Abstrakt

Mutationer i genen MLH1 för reparation av DNA-missanpassning är en viktig orsak till ärftlig nonpolypos kolorektal cancer (HNPCC). Ingen mutant fenotyp observeras innan den vilda typen (wt) allelen somatiskt inaktiveras i målvävnaden. Vi behandlade mekanismerna för MLH1- inaktivering i 25 kolorektal (CRC) och 32 endometriala cancer (EC) från MLH1- mutationsbärare (Mut1, genomisk deletion i ramen; Mut2, mutation utanför ramspaltning; Mut3, missense-mutation). Med en kvantitativ metod, matrisassisterad laserdesorption / jonisering-tid-för-flygning (MALDI-TOF), med användning av fyra intragena enkla nukleotidpolymorfismer och mutationer, förlust av heterozygositet (LOH) var närvarande i 31/57 (54, 4%) av tumörer. Wt-allelen visade LOH oftare än den mutanta allelen (23/57 mot 8/57, P = 0, 006). För Mut1 var LOH oftare i CRC än EC (10/11 mot 1/13, P <0, 0001), medan Mut2 och Mut3 visade motsatta LOH-mönster. Även om LOH dominerade i CRC oberoende av den predisponerande mutationen påverkade LOH ofta den mutanta allelen i EC från bärare av Mut2 och Mut3 (6/19, 31, 6%). MLH1- promotormetylering, som återspeglade en mer utbredd tendens för hypermetylering, inträffade i 4/55 (7, 3%) av tumörer och var omvänt associerad med LOH. Sammanfattningsvis skiljer sig mönstren för somatiska händelser (LOH och promotormetylering) beroende på vävnads- och groddmutationsmutationen, vilket delvis kan förklara den differentiella tumörkänsligheten hos olika organ i HNPCC. MALDI-TOF tillhandahåller en ny metod för upptäckt och kvantifiering av LOH.

Introduktion

Enligt Knudsons två-hit-teori för tumörundertryckningsgener är dominerande ärftliga cancerformer och deras sporadiska motsvarigheter mekanistiskt kopplade. I ärftlig form ärvs en mutation, den första "hiten", i en tumörsuppressorgen, och den andra "hiten" inträffar i (och är begränsad till) de somatiska cellerna i en målvävnad. I den sporadiska formen måste två "träffar", en i varje allel, förekomma somatiskt innan tumörstart (Knudson, 1971).

DNA-mismatch-reparationsgener (MMR), vars mutationer orsakar predisposition till ärftlig nonpolypos kolorektal cancer (HNPCC) fungerar huvudsakligen som tumörundertryckande gener. MLH1 (MutL homolog 1) är den viktigaste känslighetsgenen för HNPCC (Peltomaki och Vasen, 2004) och står också för en stor andel sporadiska kolorektala cancer (CRC) med mikrosatellitinstabilitet (MSI) (Kuismanen et al., 2000). I HNPCC-relaterade CRC: er tystas all rest av vildtyp (wt) ofta av förlust av heterozygositet (LOH) (Tannergard et al., 1997; Kuismanen et al., 2000; Potocnik et al., 2001; Yuen et al. ., 2002), medan (biallelic) metylering av MLH1- promotorn främst ligger under sporadiska mikrosatellit-instabila CRC: er (Cunningham et al., 1998; Veigl et al., 1998; Kuismanen et al., 2000). Betydligt mindre data finns tillgängliga om mekanismerna för inaktivering av wt-allelen i HNPCC-spektrumtumörer andra än CRC, särskilt endometrial cancer (EC) som är den vanligaste extrakoloniska maligniteten i HNPCC. I enstaka EG-tumörer som studerats från HNPCC-patienter har LOH (för MSH2 och MSH6 ; Ollikainen et al., 2005) och somatiska ramförändringsmutationer (för MSH6 ; Wijnen et al., 1999) implicerats. Sporadic EC liknar sporadisk CRC, genom att MLH1- promotormetylering verkar vara den primära mekanismen för MSI (Esteller et al., 1998; Simpkins et al., 1999). I allmänhet förklarar somatiska punktmutationer sällan MMR-geninaktivering i CRC (Tannergard et al., 1997; Kuismanen et al., 2000; Potocnik et al., 2001; Yuen et al., 2002) eller EC (Chadwick et al., 2001).

Nya observationer tyder på att teorin om ”två träffar” representerar en förenklad modell som kan behöva omvärderas. MMR-genmutationer dominerar inte alltid genom överföringsmönstret, såsom exemplifieras av PMS2 (De Rosa et al., 2000). På cellnivå är MMR-genmutationer inte alltid recessiva, men kan ha dominerande negativa effekter (Jager et al., 1997; Nicolaides et al., 1998) eller vara associerade med haploinsufficiens (Cejka et al., 2003; Takagi et al., 2003). Även om initiala studier antydde att alla LOH-händelser som inträffade i HNPCC-tumörer från MLH1- mutationsbärare (6/6, 100%) påverkar wt-allelen (Hemminki et al., 1994), fann en ny undersökning att upp till 40% (8 / 20) av LOH närvarande i HNPCC CRC kan rikta in sig på den mutanta allelen (Sanchez de Abajo et al., 2006). Författarna postulerade en "dubbel" roll för LOH: även om LOH kan bidra till inaktivering av wt-allelen ("andra hit LOH"), kan det också uppstå som en del av tumörprogression och påverka den mutanta allelen i tumörer där wt allel har redan inaktiverats på andra sätt (Sanchez de Abajo et al., 2006).

I HNPCC förblir det olöst varför olika organ är olika känsliga för cancer under lika genetisk predisposition, och mekanismerna för inaktivering av wt-allelen kan erbjuda en möjlig förklaring (de Wind et al., 1998). Vi undersökte därför en serie tumörer från MLH1- könsmutationsmutationsbärare för att först utvärdera rollen för LOH och promotormetylering i HNPCC-associerad CRC kontra EC, och för det andra användbarheten av en ny metodisk metod för LOH-analys, MassEXTEND-analys baserad på matrisassisterad laserdesorption / jonisering mass-spektrometri-tid-för-flygning (MALDI-TOF MS).

Resultat

Denna undersökning behandlade mekanismerna för inaktivering av MLH1 , den viktigaste känslighetsgenen för HNPCC, genom att undersöka 25 kolorektala och 32 endometriala tumörer från 47 HNPCC-patienter för LOH och promotormetylering. Alla tumörer visade förlorat MLH1-uttryck genom immunohistokemi. De respektive individerna var bärare av en av tre vanliga MLH1- grundande mutationer i Finland (Mut1, Mut2 eller Mut3) (Moisio et al., 1996; Nystrom-Lahti et al., 1996; Peltomaki et al., 2001).

Förlust av heterozygositet

LOH vid MLH1- genen studerades med en kvantitativ metod, MALDI-TOF, med användning av fyra intragena enstaka nukleotidsubstitutioner (polymorfismer i promotorregionen och exon 8 samt Mut2 och Mut3). För en metodologisk kontroll för MALDI-TOF undersöktes individer som är heterozygota för polymorfismen i MLH1 exon 8 oberoende av en semi-kvantitativ grundförlängningsbaserad metod (SNuPE). För en riktad LOH-analys i bärare av Mut1 (en genomisk deletion av exon 16) användes multiplex-ligeringsberoende sondamplifiering (MLPA) eftersom vår tidigare erfarenhet visade att MLPA var lämpligt att detektera LOH i bärare av stora genomiska deletioner (Zhang et al., 2006).

Resultaten för tumörer som visar LOH genom MALDI-TOF-analyser visas i tabell 1, och LOH-data för alla 57 tumörer som är informativa för MALDI-TOF (dvs. härledda från individer som konstitutionellt är heterozygota för minst en intragen polymorfism eller mutation) sammanfattas i tabell 2. Förutom 30 tumörer med LOH av MALDI-TOF inkluderar tabell 2 en ytterligare tumör (kolontumör från individuell 2: 6) som endast visade LOH med MLPA. LOH vid MLH1- genen observerades i 31/57 (54, 4%) av alla studerade CRC: er och EC: er (Tabell 1). I tumörer som var informativa för flera markörer var LOH-data erhållna med de olika markörerna överensstämmande, med några få undantag (se nedan). Likaså var MALDI-TOF- och SNuPE-resultaten baserade på exon 8-polymorfismen mycket samordnade (tabell 3).

Full storlek bord

Full storlek bord

Full storlek bord

Haplotype-bevarande förknippad med varje förfädernas grundmutation, såväl som nukleotidsubstitutionerna som definierade Mut2 och Mut3 i sig , tillät oss att avgöra om LOH påverkade wt eller den mutanta allelen i varje fall. I hela serien var wt-allelen det föredragna målet för LOH oavsett ursprungsvävnad eller den predisponerande mutationen (23/57, 40, 4% mot 8/57, 14, 0%, för wt vs mutant allel LOH, respektive, P = 0, 006) (tabell 2). För Mut1 var LOH vanligare i CRC än EC (10/11 vs 1/13, P <0, 0001), medan för Mut2 och Mut3 var LOH vanligare i EC än CRC. Även om wt LOH dominerade i CRC oberoende av den predisponerande mutationen, var wt och mutant allel LOH ungefär lika vanliga i EC från Mut2 och Mut3 bärare (8/19 vs 6/19 för wt och mutant allel LOH, respektive, med de två mutationer kombinerade).

Omfattningen av LOH i de 57 tumörerna som ingår i de intragena LOH-analyserna bedömdes med sex flankerande mikrosatellitmarkörer som sträckte sig över ett område på 4, 3 Mb runt MLH1 (se Material och metoder och tabell 4). Bland 20 informativa tumörer begränsades LOH till MLH1 i åtta (40%), medan i de återstående 12 tumörerna (60%) sträckte sig LOH upp till minst 2, 5 Mb till den telomera sidan av MLH1 (D3S1612) och 1, 8 Mb till centromerisk sida (D3S3521). Bland 19 tumörer informativa för markörer telomera mot MLH1 var LOH närvarande i 11 (57, 9%) och 2/7 (28, 6%) tumörer informativa för markörer centromera mot MLH1 visade LOH. Tumörer utan MLH1 LOH visade liknande frekvenser för omgivande LOH än de med MLH1 LOH, 5/8 (62, 5%) för telomerområdet och 3/12 (25%) för det centromera området (tabell 4). Oavsett närvaro och frånvaro av intragenisk LOH var det möjligt att bedöma utifrån de konserverade haplotyperna att alla LOH-händelser som observerades på den centromera sidan (5/5) påverkade wt-allelen, medan en majoritet av de som observerades på telomersidan (10/5) / 16) påverkade allelen som bär den predisponerande mutationen (tabell 4). Dessa data antyder att särskilt regionen telomerisk till MLH1 kan innehålla ytterligare mål för LOH oavsett MLH1 .

Full storlek bord

Promotormetylering

MLH1- promotormetylering studerades genom en nyutvecklad MS-MLPA-analys som innefattar ett CpG-ställe intill startkodonet för MLH1 . Metylering av denna promotorregion har visat sig resultera i tystnad av MLH1 . MLH1- promotormetylering inträffade i 4/55 (7, 3%) av tumörer, och alla fyra tumörerna var CRC (MLPA-analys misslyckades i två tumörer inkluderade i LOH-studier). MLH1- promotormetylering var vanligare i tumörer utan vs med LOH (3/23 vs 1/32) (tabell 5). I tumörer utan MLH1 LOH var promotormetylering dessutom vanligare i CRC jämfört med EC (3/8 mot 0/15, P = 0, 03). Den enda tumören med både metylering och LOH (CRC från individuell 26:15, tabell 4) hade förlorat den mutanta allelen, vilket antydde att metylering påverkade wt-allelen. Samma tumör innehöll promotormetylering i totalt 11/24 tumörsuppressorgener, vilket antyder en CpG-ö-metylatorfenotyp (Toyota et al., 1999). Analys av alla 24 tumörsuppressor loci inkluderade i analysen avslöjade en signifikant skillnad i antalet andra metylerade loci mellan tumörer med MLH1- metylering (medelvärde 10/23 metylerad loci) och tumörer utan MLH1- metylering (medelvärde 3/23 metylerad loci, P < 0, 0001). Den lägsta hastigheten för metylerad loci inträffade i tumörer med MLH1 vikt LOH (genomsnitt 2/24) jämfört med de med MLH1 mutant allel LOH eller ingen LOH (medelvärde 4/24, P = 0, 029) (tabell 5).

Full storlek bord

Jämförelse av molekylärdrag med klinisk fenotyp

Tabell 4 visar ålder vid diagnos, plats och klass och stadium för de studerade tumörerna (enligt Dukes-klassificering för CRC (Dukes, 1932) och FIGO-klassificering för EC (Benedet et al., 2000)). Medelåldern för diagnos var 48, 6 år för CRC och 49, 5 år för EC. Bland CRC: er korrelerade inte LOH-statusen vid MLH1 med diagnosåldern . Däremot diagnostiserades EC med wt LOH vid en signifikant tidigare ålder (medelvärde 43, 2 år) jämfört med EC utan LOH vid MLH1 (medelvärde 53, 6 år; P = 0, 003) (EC med mutant allel LOH diagnostiserades i genomsnitt 47, 5 år) . MLH1 LOH-status var inte associerad med tumörplats i tjocktarmen eller med tumörkvalitet eller stadium (för CRC eller EC).

För Mut1 var LOH vid MLH1 vanligare i CRC än EC ( P <0, 0001, tabell 2), medan det genomsnittliga antalet metylerade loci var lägre i CRC än EC (2, 1 mot 3, 1, statistiskt inte signifikant). Däremot, för Mut2 och Mut3, var LOH mer frekvent i EC än CRC, även om det inte var statistiskt signifikant (14/19 mot 6/14), och det genomsnittliga antalet metylerade loci var mindre frekvent i EC än CRC (2, 6 mot 5, 8, P = 0, 017). EC: er från Mut2 och Mut3-bärare uppvisade vanligare LOH vid MLH1 än de från Mut1-bärare (14/19 mot 1/13, P = 0.0003, tabell 2), och samma Mut2 och Mut3 EC hade förlorat sin mutanta allel relativt ofta när jämfört med Mut1 EC (7/19 mot 0/13, P = 0, 03). Således verkar LOH vara en viktig determinant för vävnadsspecifik cancerkänslighet och är omvänt förknippad med en tendens till promotor-hypermetylering av MLH1 och andra tumörundertryckande gener.

Diskussion

Frågan om ofullständig förståelse av wt-allelinaktivering i tumörer från MMR-gen-kimline-mutationsbärare och den senaste observationen av frekventa mutanta alleler LOH i HNPCC-CRC (Sanchez de Abajo et al., 2006) valde vi att studera LOH och promotor-metylering i CRC- och EG-tumörer från bärare av tre förfädernas grundmutationer i MLH1 . Vår totala frekvens för LOH vid MLH1 (31/57, 54, 4%) är kompatibel med frekvenser rapporterade för andra serier, huvudsakligen bestående av HNPCC-relaterade CRC (33–56%) (Kuismanen et al., 2000; Potocnik et al., 2001; Yuen et al., 2002; Sanchez de Abajo et al., 2006). Våra resultat visar att wt-allelen är det föredragna målet för LOH i både CRC och EC ( P = 0, 006, tabell 2). Uttryckt som en bråkdel av alla observerade LOH-händelser var frekvensen för mutant allel LOH 2/16 (12, 5%) för CRC, vilket är klart lägre än det (40%) rapporterat av Sanchez de Abajo et al. (2006). De relativt små storlekarna i studieserien kan delvis förklara denna skillnad. Mutant allel LOH stod för en större andel LOH i EC (6/15, 40%). Sanchez de Abajo et al. (2006) fann att förlusten av wt-allelen var förknippad med tidig ålder vid diagnos av CRC (under 50 år), och vi observerade en liknande förening för EC.

Vår undersökning visar att MALDI-TOF-metoden är lämplig för detektion och kvantifiering av LOH och är tillämplig på paraffin-härledd DNA. Jämfört med polymorfa mikrosatellitmarkörer kan MassEXTEND-metoden, som använder enkla nukleotidpolymorfismer, kräva ett högre antal polymorfismer för att få lika höga heterozygositetsvärden, men i slutändan är det billigare, har högre kapacitet och fungerar också för tumörer med hög MSI . Precis som med alla polymeras-kedjereaktionsbaserade metoder (PCR) -baserade metoder, kan allele-dropouts utgöra ett problem på grund av lågkvalitets-DNA, och detta kan i sin tur tolkas som LOH. Problemet med allele-dropout är emellertid mer uttalat när man använder mikrosatellitmarkörer (Utsuno och Minaguchi, 2004; Petkovski et al., 2005; Dixon et al., 2006). Följaktligen bör användningen av SNP-markörer samt noggrann DNA-kvantifiering och genotypning av flera parallella prover säkerställa tillförlitliga uppskattningar av LOH. Medan vårt papper var under förberedelse, van Puijenbroek et al. (2005) publicerade en studie om användning av MassEXTEND-tekniken för att undersöka LOH vid proteintyrosinfosfatasreceptor typ J locus i CRC, och dessa författare drog också slutsatsen att 'MassEXTEND LOH-analys är en känslig, hög genomströmning och kostnads- effektiv metod för att screena SNP-loci för LOH i formalin-fixerad paraffin-inbäddad vävnad.

Såsom visas i tabell 3 var MALDI-TOF- och SNuPE-resultaten för LOH vid MLH1 exon 8 samtidigt i alla fall. Likaledes var LOH-resultat som erhölls för olika intragena SNP genom MALDI-TOF-analys mestadels. Sex tumörer med mer än ett informativt intrageniskt SNP visade samma LOH-mönster för alla SNP: er (Tabell 1). För två tumörer med wt-allel LOH (EC: er från 108: 11 och 90:60) och för tre tumörer med mutant allel LOH (EC: er från 90:48, 90:29 och 105: 9) begränsades LOH till endast en intragenic SNP och påverkade inte andra informativa SNP: er. I de flesta av dessa tumörer reproducerade flankerande mikrosatellitmarkörer mönstret av LOH på vardera sidan av MLH1 vilket tyder på LOH-händelser som störde MLH1- genen (tabell 4). En tumör (EC från 108: 11) visade en isolerad LOH endast i promotorregionen. Med tanke på att graden av allelisk förlust låg inom det "förmodade" intervallet, bör denna LOH-händelse ses med försiktighet.

Vår observation av en frekvent mutant allel LOH i regionen telomer till MLH1 , särskilt, implicerade denna region som en möjlig plats för ytterligare mål för LOH oavsett MLH1 . Potentiella målgener inkluderar DCAMKL3 ( KIAA1765 ), som har dubblecortin och CaM-kinasliknande 3-motiv och kan fungera i cellsignalering (Nagase et al., 2000; Ohmae et al., 2006) och STAC (SRC-homologi 3 och cystein) -berikad domän), som kan spela en roll i cellproliferation, transformation och apoptos (Suzuki et al., 1996; Satoh et al., 2006). Regionen vid 3p21–22 tas ofta bort i humana epiteliala maligniteter (Protopopov et al., 2003), och framtida studier bör undersöka om DCAMKL3 eller STAC , eller andra gener från denna region, är direkt involverade i dessa tumörgenerande processer.

Förutom LOH kan MLH1- promotor-hypermetylering tjäna som en andra hit i HNPCC kolorektal tumörigenes. Detta är baserat på iakttagandet av en invers förening mellan LOH och hypermetylering, vilket indikerar att en enskilt kvarhållen allel (som bär könsmutationsmutationen) inte är hypermetylerad, medan i tumörer med båda allelerna bibehålls den wt-kopian ibland i 0–46% av tumörer (Herman et al., 1998; Kuismanen et al., 2000; Wheeler et al., 2000; Esteller et al., 2001; Potocnik et al., 2001). Andelen tumörer som visade MLH1- promotormetylering i den aktuella studien (4/55, 7, 3%) var något lägre än i vissa studier citerade ovan, vilket kan återspegla de olika regionerna i den studerade MLH1- promotorn, eller olika tekniker eller trösklar som användes för att detektera metylering. Vår analys utformades för att utvärdera MLH1- regionen D (Deng et al., 1999), vars metylering, tillsammans med den i region C, visar den närmaste föreningen med bristen på MLH1-proteinuttryck (Deng et al. (1999) och vår opublicerade data). Även om våra totala siffror är för små för några fasta slutsatser, var det faktum att MLH1- promotormetylering var mer frekvent i tumörer utan vs med MLH1 LOH (3/23 vs 1/32), och att i den enda tumören med både LOH och metylering mutant allel förlorades, är kompatibel med idén att MLH1- promotormetylering tjänade som en andra hit i dessa tumörer. Vår observation av tumörer med MLH1- promotormetylering som visade ett signifikant högre genomsnittligt antal andra metylerade tumörsuppressor-loci jämfört med de utan MLH1- metylering (10/23 mot 3/23 metylerad loci, P <0, 0001) antydde en mer generaliserad hypermetyleringstendens, med funktionell konsekvenser på många andra tumörundertryckningsgener förutom MLH1 .

I HNPCC finns det i allmänhet en dålig korrelation mellan typen av groddmutation (inklusive lokalisering och kodningskonsekvens) och klinisk fenotyp (Liu et al., 1996; Peltomaki et al., 2001). Vid familjär adenomatös polypos kan groddmutationen i APC påverka typen av "andra hit" och dessa två träffar bestämmer tillsammans de fenotypiska egenskaperna (Albuquerque et al., 2002; Groves et al., 2002). Dessutom kan mutationer i tumörundertryckningsgener ha haploinsufficienta fenotyper, och olika funktioner (MMR vs aktivering av en skadekontrollpunkt) kan kräva olika minimala doser av MLH1-proteinet (Cejka et al., 2003). I vår HNPCC-serie tjänade antingen LOH eller metylering som andra träffar (dvs påverkade Wt-allelen för MLH1 ) oftare i CRC jämfört med EC: er (18/25 vs 9/32, P = 0, 001), vilket kan återspegla olika dosbehov av MLH1 i dessa två vävnader. Den predisponerande groddmutationen kan teoretiskt modulera denna doskänslighet, till exempel genom varierande grader av återstående proteinaktivitet. I de nuvarande tumörerna med Mut1 var LOH vanligare i CRC än EC, medan Mut2 och Mut3 visade motsatt mönster (tabell 2); det faktum att CRC till EC-förhållandet är högre i familjer med Mut1 jämfört med dem med Mut2 eller Mut3 (våra opublicerade data) är i linje med det. Sammantaget kan beroendet av mönstren för LOH och metylering av tumörsuppressorgener på vävnadstyp och groddmutation som visas här delvis förklara den differentiella tumörkänsligheten hos olika organ i HNPCC.

Material och metoder

Patienter och prover

En kohort av 86 patienter, som representerade 37 finska HNPCC-familjer, valdes utifrån tillgänglighet för prov som skulle undersökas med avseende på konstitutionell heterozygositet (se avsnitt Förlust av heterozygositetsanalys). Den slutliga studiekohorten bestod av 25 CRC och 32 EC från 47 individer, var och en var en bärare av en av tre finska grundmutationer i MLH1 . Mut1 är en deletion in-frame (3, 5 kb genomisk deletion som påverkar kodonerna 578–632 av exon 16 och flankerande intronsekvenser), Mut2 är en ramförskjutningsmutation (g> a ​​vid 454-1 skarvacceptor av exon 6) och Mut3 är ett missense mutation (T> G vid nukleotid 320 i exon 4, 1107R). Mut1 och Mut2 står tillsammans för en majoritet av de finska HNPCC-familjerna som uppfyller de internationella diagnostiska kriterierna (Nystrom-Lahti et al., 1995), och patogeniciteten för missense-mutationen (Mut3) har verifierats med funktionella tester (Raevaara et al., 2005). De lämpliga institutionella granskningsnämnderna vid Helsingfors universitets centralsjukhus godkände denna studie.

DNA-extraktion

DNA bereddes från arkiverad paraffin-inbäddad tumör och matchande normala vävnadsprover enligt metoden enligt Isola et al. (1994). Områden med hög tumörprocent eller med rena normala celler selekterades och verifierades histologiskt och dissekerades därefter. Tumörprocentandelarna varierade mellan 50 och 95%.

immunohistokemi

Formalin-fixerade, paraffin-inbäddade vävnadssektioner färgades immunohistokemiskt med anti-MLH1 (Pharmingen, San Diego, CA, USA; klon G168-15), anti-MSH2 (Calbiochem / Oncogene Research, Darmstadt, Tyskland; klon FE-11) och anti-MSH6 (Transduction Laboratories, San Diego, CA, USA; klon 44). DAKO EnVision + -systemet (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) applicerades i enlighet med tillverkarens instruktioner med antigenupphämtningssteg genom mikrovågskokning under 10 minuter i etylendiaminetetraättikbuffert (pH 8, 0). Kärnfärgning av normalt endometrium och kolorektum inkluderat i varje tumorsektion användes som referens för utvärderingen av färgningsresultaten. Dessa data publicerades delvis i Schweizer et al. (2001).

Förlust av heterozygositetsanalys

Matrisassisterad laserdesorption / jonisering - tid för flygning.

Normala (blod) DNA-prover från 86 HNPCC-patienter genotypades för två SNP: er ( MLH1- promotor G> A rs1800734 och MLH1 exon 8 G> A rs1799977) och 40, 0 respektive 20, 2% var heterozygota. Individer som är heterozygota för antingen markör eller som bär en av två mutationer (Mut2, Mut3) valdes för LOH-analyser. MALDI-TOF användes för att bestämma LOH vid MLH1- genen med användning av de fyra intragena SNP: er och mutationer som nämnts ovan. Analyserna kalibrerades med användning av DNA-prover med kända genotyper (bestämd genom sekvensering). Baserat på titreringsexperiment med användning av PicoGreen-analysen (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), utsattes sedan prover av 5 ng DNA isolerat från normal och tumörvävnad hos patienterna för MassEXTEND-analys (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) som beskrivs i tilläggsmetoder på Oncogenes webbplats. SpectroCHIPS analyserades med en Autoflex MassARRAY-masspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA). Alla prover analyserades åtminstone i tre exemplar, och två personer utförde analysen oberoende. Alelfrekvensförhållandena för tumörprover delades med allelfrekvensförhållandet för motsvarande normala prov. Trösklarna för LOH definierades enligt Ollikainen et al. (2005).

Enkel nukleotidprimerförlängning

SNuPE-analysen baserades på A> G-polymorfismen vid nukleotid 655 i MLH1 exon 8 såsom beskrivits i Renkonen et al. (2003). Denna analys förlitar sig på införlivandet av en enda ddNTP som väljs för att möjliggöra differentiell förlängning av en fluorescerande märkt primer glödgad intill det polymorfa stället. Två fragment med olika längd framställs i enlighet med basen närvarande på det polymorfa stället. Primerförlängningsprodukterna separerades genom kapillärelektrofores (på ABI 3730 Automatic DNA sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) och analyserades med användning av Genemapper v4.0 (Applied Biosystems). Alleliska doser bestäms utifrån toppområdena för fragmenten och deras förhållanden i tumör-DNA i förhållande till normalt DNA beräknat.

Multiplex ligationsberoende sondamplifiering

Alla prover som bär Mut1 (en genomisk deletion av MLH1 exon 16) undersöktes för LOH med användning av MLPA (SALSA MLPA-kit P003, MRC-Holland, Amsterdam, Nederländerna) enligt tillverkarens instruktioner (www.mrc-holland.com). PCR-produkterna separerades genom kapillärelektrofores och analyserades med användning av GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems).

Mikrosatellitmarköranalys

Omfattningen av LOH studerades genom att analysera följande mikrosatellitmarkörer som omfattade en 4, 3-Mb-region runt MLH1 : ptel-D3S1612-D3S3512-D3S3718-D3S1611 ( MLH1 ) -D3S1298-D3S3521-cen. Alla primersekvenser är tillgängliga på www.ensembl.org/Homo_sapiens/markerview. PCR-produkter kördes, elektroforesades och analyserades såsom beskrivits ovan för SNuPE.

Metyleringsanalys

MLPA-metoden användes med SALSA MS-MLPA ME001-kit (MRC Holland, Amsterdam, Nederländerna) enligt tillverkarens instruktioner (www.mrc-holland.com). MS-MLPA-metoden är beroende av funktionsnedsättningen av Hha I-restriktionsenzym för att smälta metylerade målsekvenser, vilket ger en signal efter PCR-amplifiering om målsidan är metylerad. Satsen innehåller sondpar för 24 tumörsuppressorgener inklusive två sonder för MLH1- genen.

Baserat på våra titreringsexperiment med cellinjer som är kända för att ha en full metylering (RKO) eller en fullständig brist på metylering av MLH1 (HCT116) såväl som på studier där vi korrelerade metyleringsnivån och MLH1-proteinuttrycket genom immunhistokemisk analys, en dos förhållandet 0, 10 eller högre vid CpG-ön intill översättningsstartstället för MLH1 (motsvarande 10% metylerat DNA) ansågs indikera promotormetylering. Ett dosförhållande på 0, 15 eller högre applicerades på promotorerna för andra tumörundertryckningsgener eftersom detta tröskelvärde gav den bästa diskrimineringen av tumör-DNA i förhållande till parat normalt DNA där ingen metylering förväntades.

Statistisk analys

Betydelsen av skillnader mellan grupper utvärderades med Fishers exakta test eller med t- testet. P- värden under 0, 05 (två-tailed) tolkades för att indikera statistisk signifikans.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande metoder

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc).