Maximal adamantylsubstituerad retinoidrelaterad molekylinducerad apoptos kräver nf-kb icke-kanonisk och kanonisk vägaktivering | celldöd & differentiering

Maximal adamantylsubstituerad retinoidrelaterad molekylinducerad apoptos kräver nf-kb icke-kanonisk och kanonisk vägaktivering | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • apoptos
  • cancer
  • Genexpression
  • NF-kappaB

Abstrakt

NF- K- transkriptionsfaktorer har en avgörande roll för att reglera cellöverlevnad och apoptos. Vi har tidigare visat att 4- (3-Cl- (1-adamantyl) -4-hydroxifenyl) -3-klorocinnaminsyra (3-Cl-AHPC), en adamantylsubstituerad retinoidmolekyl, inducerade apoptos och erfordrade NF-KB aktivering i prostataceller och bröstkarcinomceller. Här visar vi att 3-Cl-AHPC aktiverade både I-B-kinas (IKK) a och IKK- p med efterföljande aktivering av de kanoniska och icke-kanoniska NF- k- vägarna i det humana bröstkarcinom och leukemicellinjer. 3-Cl-AHPC-medierad aktivering av den kanoniska NF-KB-vägen inträffade inom 6 timmar, medan maximal aktivering av den icke-kanoniska NF-B-vägen krävde 48 timmar. Knockout av IKK α- eller IKK ß- uttryck i musembryonala fibroblastceller och knockdown av IKK α eller IKK ß i MDA-MB-468 celler resulterade i hämning av 3-Cl-AHPC-medierad apoptos, vilket indikerar att aktivering av kanoniska och icke-kanoniska vägar krävs för maximal 3-Cl-AHPC-medierad apoptos. 3-Cl-AHPC-aktivering av den icke-kanoniska vägen föregicks av kaspasmedierad minskning av E3-ligas c-IAP1 med efterföljande stabilisering av NF- K -inducerande kinas (NIK) -uttryck, ökad bindning av NIK med TRAF3, aktivering av IKK α , och de resulterande ökade nivåerna av RelB och p52. Ökat uttryck av c-IAP1 blockerade 3-Cl-AHPC-medierad stabilisering av NIK-nivåer och 3-Cl-AHPC-medierad apoptos. Cdc37-expression krävdes för aktivering av IKK a och IKK p med 3-Cl-AHPC. Dessa fynd tyder på att NF- K- vägar har en viktig roll i 3-Cl-AHPC-medierad apoptos.

Huvudsaklig

Förmågan hos en ny klass av föreningar, benämnda adamantylsubstituerade retinoidrelaterade molekyler (ARR) av flera utredare att inducera apoptos i maligna celler har dokumenterats väl. 1, 2 Samtidigt som maligna celler dödades har flera studier dokumenterat att dessa föreningar inte har några skadliga effekter på normala celler. 3, 4 Dessutom genomgår ST1926, en analog av moderföreningen CD437, nu kliniska fas I-studier. 3 Vi har tidigare visat förmågan hos den retinoidrelaterade molekylen 4- (3-Cl- (1-adamantyl) -4-hydroxifenyl) -3-klorocinnaminsyra (3-Cl-AHPC) att inducera apoptos i ett antal maligna celltyper. 5 Vidare har vi och andra också rapporterat att apoptosinduktion med 3-Cl-AHPC kräver aktivering av NF-kB. 1, 6

NF- K representerar en komplex familj av proteiner som har nyckelroller i olika cellulära processer, inklusive onkogenes, proliferation, inflammatorisk och stressrespons samt apoptos. 7, 8 NF- K- familjen består av p50, p52, RelA (p65), c-Rel och RelB. 7, 8 Nyligen genomförda undersökningar har dokumenterat närvaron av följande tre huvudsakliga NF-B-aktiverande vägar. 7, 8 (1) En kanonisk väg där yttre stimuli genom ett antal intracellulära kaskader aktiverar IKB- kinas (IKK) -komplexet som i sin tur fosforylerar I KB och p105 följt av deras polyubikitinering av SCF ß TrCP E3-ligaskomplexet och deras efterföljande förstörelse. Dessa händelser resulterar i sin tur i frisläppandet av p50, p65 och c-Rel; deras lokalisering i kärnan; bildning av heterodimerer och modulering av gentranskription. (2) En icke-kanonisk väg som involverar bearbetning av NF- K B2 p100 för att generera p52-innehållande komplex föregången av NF-B-inducerande kinas (NIK) aktivering av ett unikt IKK-signalosom bestående av IKK a- homodimerer. 7, 8 (3) DNA-skada eller syrestress inducerad NF- K- aktivering med användning av en IKK-oberoende process. 9 Otaliga studier som använder in vitro- och in vivo- modellsystem har dokumenterat en roll för NF- K i cellöverlevnad och hämning av cellulär apoptos. 10, 11, 12 Knockout av RelA resulterade i en embryonal letal fenotyp i transgena möss på grund av RelA: s misslyckande med att hämma tumörnekrosfaktor (TNF) -inducerad hepatocytapoptos. 10 Dessutom visade sig NF-KB blockera TNF-medierad apoptos i ett antal maligna och icke-maligna cellinjer. 11

Nyare studier har starkt föreslagit att NF-B-aktivering under specifika situationer kan ha en viktig roll i induktionen av apoptos i vissa celltyper. Många av studierna undersökte effekterna av hämning av NF- K- aktivering på apoptosinduktion och har visat att NF- κ B-hämning blockerade cellulär apoptos. 1 Andra studier har visat att NF- K- aktivering med ett antal terapeutiska medel främjade celldöd. 13 NF- K- aktivering med doxorubicin och daunorubicin i U2OS osteosarkomceller främjade celldöd. 13 Liknande observationer gjordes i kolorektal karcinomcellinjer där aktivering av NF-B krävdes för doxorubicininduktion av apoptos i dessa celler. 13 Även om vissa observationer har antytt att NF-B-medierad induktion av apoptos kan vara relaterad till aktiveringen av specifika familjemedlemmar, har andra studier antydt att detta inte är fallet och att familjemedlemmar som c-Rel och RelA kan fungera som både pro-apoptotiska eller anti-apoptotiska medel beroende på sammanhanget i vilket NF-KB är aktiverat. 14 Här avgränsade vi vägarna genom vilka 3-Cl-AHPC aktiverar NF- K B. Vi visar också att maximal 3-Cl-AHPC-medierad apoptos och NF- K- aktivering kräver den kombinerade aktiveringen av både IKK α i den icke-kanoniska och IKK p i de kanoniska vägarna. 3-Cl-AHPC förmedlar det förbättrade uttrycket av NIK, som sedan aktiverar IKK a . Aktiverad IKK α resulterar i fosforylering och bearbetning av NF-B2 B2p100 och efterföljande generering och kärntranslokation av p52.

Resultat

3-Cl-AHPC aktiverar de kanoniska och icke-kanoniska NF- K- vägarna

Vi fann att hämning av 3-Cl-AHPC-medierad NF- K- aktivering i humant DU145-prostata och MDA-MB-468 bröstcancerceller blockerade 3-Cl-AHPC-induktion av apoptos. 1 Vi undersökte rollen för NF-kB-aktivering i 3-Cl-AHPC-apoptosinduktion i KG-1 humana leukemiceller med användning av NF-kB-hämmaren JSH-23 som selektivt blockerar kärntranslokation av NF-kB p65 / RelA. underenhet och dess transkriptionella aktivitet. 15 Behandling med 3-Cl-AHPC resulterade i en tvåfaldig NF-kB-aktivering vid 24 timmar i KG-1-celler (figur la). Hämning av denna aktivering med JSH-23 resulterade i en 35% hämning av 3-Cl-AHPC-medierad apoptos (figur Ib). JSH-23 blockerar endast NF-KB-kanoniken och inte den icke-kanoniska vägen som fortfarande är aktiverad i de JSH-23- och 3-Cl-AHPC-behandlade cellerna; båda vägarna bidrar till maximal apoptos (se nedan), varför den icke-kanoniska vägen fortfarande förbättrar apoptos även i närvaro av JSH-23. Vi har tidigare visat att 3-Cl-AHPC-behandling av DU145- och MDA-MB-468-celler resulterade i IKK- a- kinasaktiveringen vid 24 timmar, vilket indikeras av den ökade fosforyleringen av GST- IKBa . 1 3-Cl-AHPC-aktivering av IKK- p- kinas noterades inte vid 24 timmar. Fosforylering av aktiveringsslingorna för IKK a och IKK ß har associerats med deras konformationella förändring och IKK kinasaktivering. 7, 16 Vi undersökte 3-Cl-AHPC-aktivering av IKK a och IKK p genom att bedöma 3-Cl-AHPC-medierad fosforylering av deras aktiveringsslingor vid både tidiga och sena tidpunkter. 3-Cl-AHPC-behandling av MDA-MB-468-celler resulterade i snabb IKK- p- aktivering med maximal fosforylering 7, 5-faldigt noterat vid 6 timmar och dess minskning till 3-faldigt vid 24 timmar och total förlust vid 48 timmar (figur 1c och kompletterande Figur S1a). 3-Cl-AHPC förbättrade IKK a fosforylering i MDA-MB-468 celler 1, 5 gånger vid 6 och 24 timmar med maximal IKK a fosforylering 3, 2 gånger som inträffade vid 48 timmar efter tillsatsen av 3-Cl-AHPC (figur 1c och Kompletterande figur S1a). 3-Cl-AHPC-medierad IKK- p- fosforylering i KG-1-celler visade ett liknande mönster som noterades i MDA-MB-468-celler med en 5, 2-faldig ökning noterad vid 6 timmar och 2, 9-faldig ökning noterad vid 24 timmar efter 3 -Cl-AHPC-exponering (figur 1c och kompletterande figur S1a). Basal IKK a- aktiveringsslinga fosforylering observerades före 3-Cl-AHPC exponering i KG-1-celler. Förbättrad IKK-fosforylering noterades vid 6 timmar (1, 4 gånger), 24 timmar (1, 2 gånger) och 48 timmar (1, 2 gånger) efter tillsatsen av 3-Cl-AHPC (figur 1c och kompletterande figur S1a).

Image

3-Cl-AHPC-medierad fosforylering av IKK a och IKK p , och aktivering av NF-KB kanoniska och icke-kanoniska vägar. ( a ) 3-Cl-AHPC aktiverar NF-B i KG-1-celler; celler transducerades med lentivirala NF- K- reporter (GFP) -partiklar övergående under 48 timmar och behandlades sedan med 1 mikrometer 3-Cl-AHPC under 24 timmar. ( b ) NF- K- aktiveringsinhibitor JSH-23 blockerar 3-Cl-AHPC-medierad apoptos. Induktion av apoptos och celldöd bedömdes med användning av Annexin V-FITC-märkning med propidiumjodid (PI) -färgning; andelen apoptotiska celler motsvarar summan av procent noterat i övre högra höger (sena apoptotiska celler, annexin V och PI-positiva celler) och nedre högra (tidiga apoptotiska celler, annexin V-positiva, PI-negativa) kvadranter. KG-1-celler exponerades för 1 μ M 3-Cl-AHPC under 24 timmar. ( c ) 3-Cl-AHPC förbättrar fosforylering av IKK a och IKK p . ( d ) 3-Cl-AHPC inducerar fosforylering av NF- K Bp65 / RelA vid Ser276. ( e ) 3-Cl-AHPC förbättrar fosforylering av NF- K B2p100 följt av bearbetning till p52 i båda cellinjerna. ( f ) 3-Cl-AHPC inducerar ökat RelB-uttryck och RelB-bindning med NF- K B2p100 / p52. Celler odlades och exponerades för bärare eller 3-Cl-AHPC (1, 0 μM ) under olika tider som beskrivs i avsnittet Material och metoder. Kolumner representerar medelvärdet av två oberoende experiment. Felfält indikerar standardavvikelser. * och ** skiljer sig väsentligt från kontrollceller; och JSH-23 + 3-Cl-AHPC från 3-Cl-AHPC-behandlade celler, respektive ( P- värde är <0, 05 och <0, 01, bestämd med t- test)

Bild i full storlek

3-Cl-AHPC-aktivering av den kanoniska vägen dokumenterades genom ökad fosforylering av NF- KB p65 / RelA vid Ser276, medan dess aktivering av den icke-kanoniska vägen dokumenterades genom fosforylering av NF- K B2p100 och generering av p52 (figur 1d och e). Exponering av MDA-MB-468 för 3-Cl-AHPC åtföljdes av ökad fosforylering av NF- K B2p100 med maximal fosforylering noterad vid 24 och 6 timmar i MDA-MB-468 respektive KG-1-celler (figur 1e). I båda cellinjerna var det associerade och korrelerade ökningar i NF-B2 B2p100-nivåerna och p52-nivåerna (figur 1e). Aktivering av den icke-kanoniska vägen har visats generera en ökning av RelB / p52-heterodimernivåer med bindningen till unika konsensus-sekvenser. 17 3-Cl-AHPC-medierad aktivering av den icke-kanoniska vägen resulterade också i de markant ökade RelB-nivåerna och bindningen av RelB till NF- K B2p100 / p52 (figur 1f).

Hämning av den 3-Cl-AHPC-medierade aktiveringen av antingen de kanoniska eller icke-kanoniska vägarna blockerar 3-Cl-AHPC-medierad apoptos

Ablation av IKK a , IKK p eller IKK y i musembryonfibroblastceller (MEF) resulterade i minskningar med 99, 95 respektive 85% i den 3-Cl-AHPC-medierade apoptosen vid 48 timmar (figur 2a och b) . Knockout av IKK ß och IKK y av MEF-kontrollceller visade 30 respektive 35% apoptos; 3-Cl-AHPC förstärkte endast 2 och 7% apoptos i IKK p - / - respektive IKK y - / - celler, medan det förbättrade 52% apoptos i vildtypceller vid 48 timmar. Således krävdes aktivering av både IKK a och IKK p för maximal 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MEF-cellerna (figurerna 2a och b). Vi undersökte också effekten av IKK α och IKK ß knockdown på 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MDA-MB-468 celler. Knockdown av IKK a och IKK p utfördes i MDA-MB-468 celler med användning av liten hårnål (sh) RNA-IKK a och shRNA-IKK p såsom beskrivits i avsnittet Material och metoder (Kompletterande figur S1b). Vi fann att knockdown av IKK a eller IKK p resulterade i en ungefär 50% reduktion i 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MDA-MB-468-celler (figur 2c och d). Således krävs aktivering av både IKK a och IKK p för maximal 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i både MEF- och MDA-MB-468-celler. Som förväntat resulterade knockdown i IKK a- och IKK ß nivåer i minskade fosforylerade IKK a- och IKK ß nivåer i MDA-MB-468 celler efter exponering för 3-Cl-AHPC (figur 3a). Därefter undersökte vi effekten av knockdown av IKK a och IKK ß på 3-Cl-AHPC-medierad NF- k B2p100 fosforylering i MDA-MB-468 celler. Knockdown av IKK ß hade ingen effekt på 3-Cl-AHPC-medierad NF- k B2p100 fosforylering, medan knockdown av IKK a fördröjde NF- k B2p100 fosforylering till 48 timmar och minskade halterna av fosforylerad NF- K B2p100 (figur 3b). Total hämning av NF- lation B2p100-fosforylering förväntades inte eftersom aktiverad IKK α fortfarande var närvarande men på reducerade nivåer.

Image

Knockout (KO) och knockdown (KD) av IKK: er dämpar 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MEF- och MDA-MB-468-celler. ( a och b ) Knockout av IKK a , IKK p och IKK y inhiberade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MEF-celler. ( c och d ) Knockdown av IKK a och IKK p inhiberade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i IKK a -KD och IKK p- KD MDA-MB-468 stabilt transfekterade celler under 24 timmar. Celler odlades och exponerades för vehikel eller 3-Cl-AHPC (1 μM ) under den angivna tiden. Apoptos av celler bedömdes med flödescytometri. Kolumnerna representerar medelvärdet av tre oberoende experiment, och felfält indikerar standardavvikelser. ** signifikant skiljer sig från sh-vektor- och MEF-vildtyp 3-Cl-AHPC-behandlade celler ( P- värdet är <0, 01 respektive, bestämt med t- test)

Bild i full storlek

Image

Knockdown av IKK α och IKK β sänker IKK och NF- κ B fosforyleringsnivåer, 3-Cl-AHPC-medierad NIK-stabilisering och bindning av TRAF3 med NIK i NF- κ B icke-kanonisk väg. ( a ) fosforylering av IKK a , IKK p i knockdown (IKK a- KD och IKK p- KD) MDA-MB-468 celler och ( b ) förlust av IKK a men inte av IKK p uttryck inhiberade fosforyleringen av NF- k B2p100 och generering av p52 i IKK a- KD-celler. ( c ) 3-Cl-AHPC ökar uttrycket av NIK vid 24 timmar och den densitometriska analysen av NIK-nivåer (höger panel). ( d ) Proteasom-hämmare MG132 (20 μM ) ökade NIK-uttrycket mer än den ökning som noterades med 3-Cl-AHPC. Celler odlades och förinkuberades med MG132 under 2 timmar och exponerades sedan för vehikel eller 3-Cl-AHPC (1 μM ) under 24 timmar. ( e ) 3-Cl-AHPC-medierat TRAF2- och TRAF3-uttryck i celler. ( f ) TRAF3 ökade bindningen med NIK i 3-Cl-AHPC-behandlade celler. Celler odlades och exponerades för vehikel eller 3-Cl-AHPC (1 μM ) under olika angivna tider

Bild i full storlek

NIK: s roll i aktiveringen av den icke-kanoniska vägen NF-B har visats väl. 17, 18 Vi bedömde därför effekten av exponering av 3-Cl-AHPC på NIK-nivåer. Vi fann att inkubation av MDA-MB-468-celler med 3-Cl-AHPC resulterade i en sexfaldig ökning av NIK-nivåerna (figur 3c). NIK-uttryck i celler har visat sig regleras tätt av c-IAP1 och c-IAP2. 18 E-3-ligaserna c-IAP1 och c-IAP2 har visat sig hämma NIK-expression genom dess förstörelse med hjälp av proteasomvägen och därmed hämma aktivering av den icke-kanoniska NF-kB-vägen. 19 Som förväntat resulterade hämning av proteasomvägen i en markant ökning i NIK-nivåer i frånvaro och närvaro av 3-Cl-AHPC (figur 3d).

Nya rapporter tyder på att nedbrytning av c-IAP1 och c-IAP2 av NIK kräver bildning av ett reglerande komplex innehållande c-IAP1, c-IAP2, TNF-receptorassocierade faktorer (TRAF) TRAF2 och TRAF3 med efterföljande bindning av NIK. 20, 21, 22 TRAF2 och TRAF3 verkar ha separata och unika roller. 20, 22 Exponering av MDA-MB-468-celler för 3-Cl-AHPC resulterade i ökat uttryck av TRAF2 och TRAF3 men endast en ökning av TRAF3-nivåer noterades i KG-1-celler efter tillsatsen av 3-Cl-AHPC (figur 3e), som åtföljdes av minskad bindning av NIK med TRAF2 (figur 3e). Intressant nog inträffade en signifikant minskning av bindning av c-IAP1 genom TRAF3 men inte med TRAF2 i MDA-MB-468-celler efter exponering av 3-Cl-AHPC (figur 4a). Ökning i NIK-nivåer i cellerna efter exponering för 3-Cl-AHPC föregicks av en minskning av c-IAP1- och XIAP-nivåer inom 6 timmar (figur 4b). Vi ansåg därför att den 3-Cl-AHPC-medierade minskningen av c-IAP1-nivåer hade en viktig roll i den tillhörande ökningen av NIK-nivåer. Vi bedömde effekten av överuttryck av c-IAP1 på 3-Cl-AHPC-medierad aktivering av den icke-kanoniska vägen och induktion av apoptos i MDA-MB-468 celler. Förhöjda c-IAP1-nivåer hämmade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos samt 3-Cl-AHPC-medierad ökning i NIK-nivåer (figur 4c – e; kompletterande figur S2a). Vi undersökte de potentiella mekanismerna genom vilka 3-Cl-AHPC inhiberade c-IAP1-nivåer med hjälp av hämmare till proteasome (MG-132), lysosomal (CA074Me) och caspase (ZVAD-fmk) -vägar. Inhibering av proteasomvägen blockerade inte 3-Cl-AHPC-medierad minskning av c-IAP1-nivåer (kompletterande figur S2b) och apoptos (kompletterande figur S2c) i MDA-MB-468-celler. Dessutom fanns inga belägg för ubikitinering av c-IAP1 efter exponering av 3-Cl-AHPC (data visas inte). Användning av en hämmare av den lysosomala vägen, CA074Me, hade inte heller någon effekt på 3-Cl-AHPC-medierad minskning i c-IAP1-nivåer (kompletterande figur S2d). Behandling av cellerna med proteasom- eller lysosomala hämmare resulterade i nedbrytning av c-IAP1, medan tillsatsen av kaspasvägsinhibitorn ZVAD-fmk fullständigt blockerade 3-Cl-AHPC-medierad minskning av c-IAP1-nivåer (kompletterande figur S2d) .

Image

3-Cl-AHPC apoptosinduktion kräver nedbrytning av c-IAP1. ( a ) 3-Cl-AHPC minskar TRAF3-bindning med c-IAP1. ( b ) 3-Cl-AHPC inducerar förlust av c-IAP1 och XIAP-uttryck i MDA-MB-468 och KG-1-celler. ( c ) Överuttryck av c-IAP1 inhiberade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i pcDNA3-Flag-c-IAP1-expressionsvektor stabilt transfekterade MDA-MB-468-celler. Celler odlades och exponerades för vehikel eller 3-Cl-AHPC (1 μM ) under 24 timmar såsom beskrivs i avsnittet Material och metoder. Apoptos bedömdes med flödescytometri. ** signifikant skiljer sig från 3-Cl-AHPC-behandlade vektorceller ( P- värdet är <0, 01 såsom bestämdes med t- test). ( d ) Överuttryck av c-IAP1 blockerade 3-Cl-AHPC-medierad NIK-stabilisering och ( e ) densitometrisk analys av NIK-proteinuttryck

Bild i full storlek

Roll av Cdc37 i 3-Cl-AHPC-medierad IKK-fosforylering

Vi har tidigare visat att 3-Cl-AHPC-medierad IKK-aktivering är associerad med den förbättrade bindningen av HSP90-bindning till IKK a . 1 Föreningen mellan chaperoner Cdc37 och HSP90 med IKK-komplexet krävs för ligandmedierad IKK-aktivering, inklusive TNF a- medierad IKK-aktivering. 8, 23 Det har visats att Cdc37 rekryterar HSP90 till IKK-komplexet genom den direkta växelverkan mellan Cdc37 och den katalytiska regionen av IKK a / p . 23 Exponering av MDA-MB-468-celler för 3-Cl-AHPC resulterade i den ökade bindningen av Cdc37 till IKK a vid 6 timmar (figur 5a); detta åtföljdes av en förbättrad associering mellan Cdc37 till HSP90 (figur 5a). Vi undersökte därför om Cdc37 har en roll i 3-Cl-AHPC-medierad IKK α / ß- aktivering och induktion av apoptos med användning av shRNA för att minska Cdc37-uttryck i MDA-MB-468-celler (kompletterande figur S2e). Knockdown av Cdc37 inhiberade 3-Cl-AHPC-medierad fosforylering av både IKK a och IKK p (figur 5b) och inhiberade både 3-Cl-AHPC- och TNF a- medierad NF- kB-aktivering i celler (figur 5c) också som 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MDA-MB-468-celler (figur 5d). Dessutom inhämtade knockdown av Cdc37-nivåer i MDA-MB-468-celler markant 3-Cl-AHPC-medierad förbättrad HSP90-bindning till IKK a (figur 5e). Således är rekryteringen av Cdc37 av HSP90 till IKK: er väsentlig för 3-Cl-AHPC-medierad NF- K- aktivering och induktion av apoptos.

Image

Interaktioner mellan Cdc37 och HSP90 och IKK a är väsentliga för 3-Cl-AHPC-medierad NF- kB-aktivering och apoptos. ( a ) 3-Cl-AHPC-medierad Cdc37 ökade bindningen med HSP90 och IKK a och 3-Cl-AHPC induktion av Cdc37-proteinuttryck efter exponering av 3-Cl-AHPC. ( b ) Fosforylering av IKK a och IKK p i Cdc37-KD celler. ( c ) Förlust av Cdc37-expression inhiberade 3-Cl-AHPC- och TNF-medierad NF- kB-aktivering. ( d ) Knockdown av Cdc37-expression inhiberade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos, och apoptos analyserades med flödescytometri. ( e ) Hämning av Cdc37-expression i celler (Cdc37-KD) blockerade HSP90-bindning med IKK a . Celler odlades och exponerades för vehikel eller 3-Cl-AHPC (1 μM ) under olika tid; immunutfällningar och immunoblots utfördes såsom beskrivs i avsnittet Material och metoder. Kolumnerna representerar medelvärdet av två oberoende experiment, och felfält indikerar standardavvikelser. * och ** signifikant skiljer sig från 3-Cl-AHPC-behandlade sh-vektorceller ( P- värdet är <0, 05 respektive <0, 01, bestämt med t- test)

Bild i full storlek

TNF a- mellanprodukter IKK-fosforylering i MDA-MB-468 och KG-1-celler

TNF a- exponering resulterade i IKK- p- fosforylering och aktivering vid 6 timmar i MDA-MB-468 och KG-1-celler med frånvaro av IKK- p- fosforylering noterad vid 24 timmar (figur 6a). Ingen aktivering av IKK a noterades i TNF a- exponerade MDA-MB-468-celler. KG-1-celler uttrycker konstitutivt fosforylerad IKKa som inte modulerades av närvaron av TNF a i KG-1-cellerna (figur 6a); emellertid var det en signifikant ökning av IKK- p- fosforylering / aktivering. Exponering för TNF a resulterade inte i modulering av XIAP-, c-IAP1- eller fosfo-Bad-nivåer, som noterades efter exponering av 3-Cl-AHPC i varken MDA-MB-468- eller KG-1-celler (figur 6b). Dessutom resulterade inte exponering av TNF a i signifikant induktion av apoptos i varken MDA-MB-468 eller KG-1-celler (figur 6c och d). Trots TNF- a- medierad ökning i IKK- p- fosforylering och aktivering och närvaron av konstitutivt fosforylerad / aktiverad IKK- a i KG-1, var det varken induktion av apoptos (figurerna 6a och c) och det fanns inte heller någon minskning av c-IAP1, XIAP eller fosfo-Bad-nivåer i dessa celler (figur 6b). Dessa resultat antyder att förutom 3-Cl-AHPC-förbättrad IKK a och IKK p- fosforylering / aktivering måste ytterligare 3-Cl-AHPC-medierade händelser inträffa för induktion av apoptos.

Image

TNF a förmedlar IKK ß fosforylering / aktivering. ( a ) TNF a (10 ng / ml) inducerar fosforylering av IKK p men inte av IKK a . ( b ) TNF a har ingen effekt på cIAP1, XIAP och p-Bad proteinnivåer. ( c och d ) TNF a och 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MDA-MB-468 och KG-1 cellinjer vid 24 timmar. Cellerna behandlades med TNF a (10 ng / ml) 2 timmar innan de tillsattes 3-Cl-AHPC (1 μM ). Apoptos analyserades med flödescytometri såsom beskrivs i avsnittet Material och metoder. Felfält indikerar standardavvikelser

Bild i full storlek

Diskussion

NF-KB är välkänt för att fungera på ett anti-apoptotiskt sätt, men vi har tidigare rapporterat att 3-Cl-AHPC-medierad apoptos kräver NF-kB-aktivering. 1 Här visade vi att 3-Cl-AHPC-medierad fosforylering och aktivering av både IKK a och IKK p krävs för maximal induktion av 3-Cl-AHPC apoptos. Knockout och knockdown av antingen IKK a eller IKK p hämmade 3-Cl-AHPC-medierad apoptos i MEF såväl som i MDA-MB-468 celler. Vi fann att 3-Cl-AHPC induktion av IKK a och IKK p fosforylering uppvisade signifikant olika tidskurser. Vidare var 3-Cl-AHPC-medierad IKK a och IKK ß fosforylering / aktivering oberoende av varandra; knockdown av IKK- p hade ingen effekt på 3-Cl-AHPC-medierad IKK-fosforylering / aktivering. Vi har tidigare visat att HSP90 krävs för 3-Cl-AHPC-aktivering av IKK a och IKK p . 1 Vi har nu visat att Cdc37 också är väsentlig för 3-Cl-AHPC-medierad IKK α och IKK β- aktivering; hämning av Cdc37-expression resulterade i minskad associering av IKK a med HSP90 såväl som hämning av 3-Cl-AHPC-medierad apoptos.

3-Cl-AHPC-förstärkt NIK-uttryck resulterade i den ökade bindningen av NIK till TRAF3. Vi spekulerar i att komplexet av NIK och TRAF3 resulterade i aktiveringen av IKK α genom NIK-fosforylering av IKK α . Ett antal utredare har dokumenterat att IKK ß- medierad NF- κ B-aktivering sker genom den kanoniska vägen, medan IKK α- medierad NF- κ B-aktivering sker främst genom den icke-kanoniska vägen. 18, 24, 25 NIK uttrycks vanligen vid extremt låga nivåer i celler. 25 TRAF3 som har ubiquitin E3-ligasaktivitet riktar sig till NIK-nedbrytning genom proteasomvägen, och induktionen av den icke-kanoniska vägen involverar TRAF3-nedbrytning med tillhörande förbättring av NIK-uttrycket. 24, 25, 26 Vi har funnit att MDA-MB-468 exponering för 3-Cl-AHPC resulterade i ökat NIK-uttryck, vilket åtföljdes av ökningar i TRAF2- och TRAF3-nivåer. NIK visade sig fosforylera T-loop-serinet av IKK a vilket resulterade i IKK a- aktivering med den efterföljande IKK a- medierade fosforyleringen av NF- K B2p100 vid de C-terminala serinerna för att utlösa ubiquitination och proteasomal behandling av NF- K B2p100. 18, 24 3-Cl-AHPC-förbättrat NIK-uttryck resulterade i IKK a- aktivering med samtidig NF-B2 B2p100-fosforylering, vilket åtföljdes av ökade p52-nivåer. Intressant nog fann vi en ökning i NF-B2 B2p100-nivåer snarare än en minskning under 3-Cl-AHPC-förbättrad fosforylering / nedbrytning av NF-B2 B2p100. En liknande observation gjordes av Varfolomeev et al. 26 som fann att det fanns en progressiv ökning i NF-B2 B2p100 och p52 nivåer efter behandling av EVSA-T humana bröstcarcinomceller med en IAP-antagonist. Lombardi et al. 27 fann att underenheten NF- κ Bp65 förbättrar aktiveringen av NF- κ B2-promotorn. Vi har tidigare rapporterat att 3-Cl-AHPC förbättrar nedbrytning av IBB genom proteasomvägen med frisättningen av NF-ß Bp65-subenheten och dess omplacering till kärnan. Således spekulerar vi att 3-Cl-AHPC-aktivering av p65 kan resultera i förbättrat NF- k B2p100-uttryck.

TRAF3 har visat sig vara associerat med NIK, vilket gör det möjligt att rekrytera TRAF2 tillsammans med tillhörande c-IAP1 eller c-IAP2. Den rekryterade c-IAP1 eller c-IAP2 kan sedan katalysera NIK-ubikitinering och nedbrytning. 20, 21, 26 Således kan den 3-Cl-AHPC-medierade minskningen i c-IAP1-nivåer resultera i förbättrade NIK-nivåer och IKK- a- aktivering. c-IAP1 och c-IAP2 såväl som XIAP verkar ha väsentliga roller i genotoxisk stressinducerad NF- K- aktivering. 28 XIAP reglerar aktiveringen av uppströms kinas TAK1 och par aktiverade TAK1 till IKK-komplexet. XIAP-uttryck är viktigt för kamptotecin- och etoposidmedierad NF- K- aktivering. c-IAP1 medierade NEMO-ubikvitinering i samma väg, medan c-IAP2 reglerade en nedströmshändelse och var också väsentlig för kamptotecin- och etoposidmedierad såväl som doxorubicin-medierad NF- K- aktivering. 28 Valli et al. 3 har visat att ST1926 och CD437, analoger av 3-Cl-AHPC, inducerar DNA-dubbelsträngsbrott i den akuta myelogena cellinjen NB4; dessa utredare spekulerade i att detta kan vara den mekanism genom vilken ST1926 och CD437 inducerar celldöd. Det faktum att 3-Cl-AHPC hämmar uttrycket av c-IAP1 såväl som av XIAP och ändå kräver NF-kB-aktivering för apoptosinduktion tyder på att genotoxisk stressinducerad NF-kB-aktivering inte är involverad i 3-Cl- AHPC-medierad apoptos. Den 3-Cl-AHPC-medierade minskningen i c-IAP1-nivåer blockerades genom tillsatsen av kaspasinhibitorn ZVAD-fmk. Detta är något förvirrande eftersom vi inte hittade bevis för aktivering av kaspasvägen vid 6 timmar när minskningen i c-IAP1-nivåer noterades i KG-1-celler.

Ett antal utredare har visat att även om IKK α och IKK ß- aktivering båda är involverade i NF-ß B-aktivering, sänder IKK β och NEMO-komplexet distinkta signaler och reglerar uttrycket av olika gener än vad som noterats med IKK α . 29, 30 Detta stöds vidare av observationen att IKK α och IKK ß knockout-möss visar markant olika fenotyper. 31 Förutom NF- κ B-aktivering reglerar IKK α ett antal NF- κ B-oberoende utvecklingsprocesser. Det har visats att nukleär IKK a kan ha en roll i transkriptionell aktivering av ett antal gener på histonnivå genom dess förmåga att fosforylera och modifiera histonstruktur. 31

Ett antal olika mekanismer har föreslagits genom vilka adamantylsubstituerade retinoider inducerar apoptos i maligna celler; 32, 33, 34 om dessa är celltypspecifika återstår att bestämma. Dessa vägar har inkluderat aktivering av c-JunNH2-terminalt kinas, DNA-adduktbildning och TR3-translokation till mitokondrier och dess bindning till Bcl-2. Intressant nog har flera utredare funnit att adamantylarotinoider som har en intern kalkongrupp hämmar IKK- p- kinaset. 34, 35 Huruvida närvaron av kalkongruppen är helt ansvarig för denna skillnad i biologisk aktivitet återstår att bestämma. Vi fann att 3-Cl-AHPC såväl som moderföreningen AHPN och dess analoger binder till den orphan receptorn SHP. 36 Även om SHP har visat sig heterodimerisera till ett antal kärnreceptorer vilket resulterar i hämning av deras förmåga att inducera den transkriptionella aktiviteten hos ett antal gener har SHP visat sig binda till NF-ß Bp65 underenheten och aktivera NF- KB- kärnreceptor. 37 Inhibering av SHP-uttryck blockerar ARR-medierad NF- K- induktion och apoptos. 38 Således verkar SHP och NF- K båda vara sammanlänkade och väsentliga för induktion av ARR-apoptos.

På grundval av våra resultat föreslog vi en modell för att illustrera 3-Cl-AHPC-medierad NF- K- aktivering i kanoniska och icke-kanoniska vägar (figur 7). I denna modell har vi funnit att exponering av celler för 3-Cl-AHPC resulterade i förbättrad bindning av Cdc37 / HSP90 till IKK a och aktivering av både NF-kB-kanoniska och icke-kanoniska vägar (figur 7). Aktivering av den kanoniska NF-kB-vägen resulterade i proteasomal nedbrytning av IKB α , omlokalisering av p50 och p65 till kärnan och NF-kB-aktivering (figur 7). 1 Aktivering av den icke-kanoniska vägen resulterade i stabilisering av NIK, fosforylering och bearbetning av NF- K B2p100 och det förbättrade uttrycket av p52 och RelB med deras efterföljande DNA-bindning och genmodulering. Huruvida RelB / p52 heterodimer reglerar uttrycket av unika gener vars produkter är pro-apoptotiska undersöks. De initiala stegen genom vilka 3-Cl-AHPC aktiverade de kanoniska och icke-kanoniska vägarna har inte avgränsats. Deltagande av signalkomplex inklusive TRAF2, TANK och TBK1 studeras också. 39 Våra resultat avslöjar att NF-kB-aktivering bidrar till en roll i ARR-medierad apoptotisk väg och aktivering av båda NF-kB-vägarna krävdes för maximal 3-Cl-AHPC-medierad apoptos.

Image

3-Cl-AHPC-medierad aktivering av NF- K kanoniska och icke-kanoniska vägar. 3-Cl-AHPC förbättrade bindningen av HSP90 till Cdc37 och bindningen av detta komplex till IKK a och aktivering av IKK a och IKK p i NF-kB kanonisk väg, och sammanfattas i texten. I den icke-kanoniska vägen NF-KB resulterade 3-Cl-AHPC-exponering i en snabb minskning av c-IAP1 och aktivering av NIK. Förbättrat NIK-uttryck inträffade inom 6 timmar efter exponering av 3-Cl-AHPC med den ökade bindningen av NIK till TRAF3, aktivering av IKK a , fosforylering av NF-B2 B2p100, dess efterföljande behandling genom proteasomvägen och ökningen av p52-nivåer

Bild i full storlek

Material och metoder

Reagens

3-Cl-AHPC syntetiserades såsom beskrivits. 5 DMEM-F12 och RPMI 1640 medium och fetalt bovint serum (FBS) köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Antikroppar och deras källor var som följer: antikroppar för fosfo-IKK a / ß (2681) och fosfo-NF- k B2p100-p52 (4810), icke-fosfo-NF- k B2p100-p52 (3017), fosfo-NF - K Bp65 (3037), fosfo-Bad (9291); IKK y (2695), NIK (4994), RelB (4922), XIAP (2045) och NF-kB-icke-kanonisk sökvägsantikroppsamplarutrustning (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA); anti-NIK, IKK a / p (sc-7609), TRAF2 (sc-877), TRAF3 (sc-6933), Cdc37 (sc-17758), NF- K Bp65 (sc-7151) och HSP90 (sc-7949) antikroppar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-c-IAP1-antikropp från (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA); och anti- a- tubulinantikropp (Oncogene Research Products, Boston, MA, USA). TNF a och caspase-hämmare ZVAD-fmk var från BIOMOL International (Plymouth Meeting, PA, USA). NF- K- aktiveringsinhibitor II JSH-23, proteasom-hämmare MG132 och lysosomal hämmare CA-074Me från EMD Biosciences (Gibbstown, NJ, USA); och Cdc37 shRNA-expressionsvektor från Open Biosystems (Frederick, MD, USA). Vildtyp och IKK α - / -, IKK β - / - och IKK γ - / - knockout MEF: s tillhandahöll generöst av Dr. Michael Karin (University of California, San Diego, CA, USA). Uttrycksvektorn pcDNA3-Flag-c-IAP1 var en vänlig gåva från Dr. John C Reed (Burnham Institute for Medical Research, La Jolla, CA, USA).

Cell kultur

KG-1 human leukemi och MDA-MB-468 bröstcarcinomcellinjer och MEF: er bibehölls i RPMI 1640 och DMEM-F12 medium innehållande 5 respektive 10% FBS och gentamicin.

shRNA-plasmid och expressionsvektorkonstruktion

shRNA-IKK a- och shRNA-IKK p expressionsvektorer konstruerades genom riktningskloning av 5'- Bam HI och 3 Eco RI-överhängande nukleotider i en pSIREN-RetroQ-vektor enligt tillverkarens instruktioner (Clontech, Mountain View, CA, USA). IKK a- och IKK p -målsekvenser erhölls från den kodande sekvensen för PubMed-anslutningsnummer NM_001278 respektive NM_001556 och syntetiserades av Integrated DNA Technology Inc. (Coralville, IA, USA). shRNA-regioner i plasmidryggraden bekräftades genom sekvensering. shRNA-IKK a och shRNA-IKK p- plasmider transfekterades stabilt i MDA-MB-468 cellinjer, standardkalciumfosfatmetoden. Stabila cellinjer valdes med puromycin. Sh-vektorn innehållande förvrängda sekvenser, 5'-GTTATTACTGTTCGATCGC-3 'och 5'-CTTAAGATGACAGCCGAGATCCA-3', i pSIREN-RetroQ-vektorn användes som en kontroll. Cdc37 shRNA pLK01 expressionsvektorklon ID RCN0000116635 slog ner Cdc37 mer effektivt i MDA-MB-468 celler än andra kloner från en uppsättning av fem kloner köpta från Open Biosystems (Huntsville, AL, USA).

apoptos

IKK a- knockdown (KD), IKK p- KD och Cdc37-KD stabila cellinjer härledda från MDA-MB-468 celler behandlades med 3-Cl-AHPC under 24 timmar före proliferation och apoptos bedömdes med flödescytometri. Apoptos av vildtyp MEF och MEF IKK a - / -, IKK ß - / - och IKK y - / - -knockout stabila cellinjer bestämdes genom flödescytometri med användning av Annexin V-FITC märkning med propidiumjodidfärgning (Annexin V-FITC apoptosis Detection Kit 1; BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Det fluorokromkopplade Annexinet V binder till fosfatidylserin i apoptotiska celler, som är exponerat på plasmamembranets yttre broschyr; 40 resultaten analyserades enligt riktlinjerna från Galluzzi et al. 40 Datainsamling utfördes på en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences) och analyserades med CellQuest-programvaran (BD Biosciences).

Western blots och immunutfällning

Celler extraherades med lysbuffert innehållande 25 mM Tris-Cl-buffert (pH 8, 0), 150 mM NaCl, 0, 2% nonidet P-40, 10% glycerol, 10 mM NaF, 8 mM p- glycerofosfat, 0, 2 mM Na3 VO4, 1 mM DTT och 10 μl / ml proteasinhibitcocktail (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) för detektion av fosfoprotein. Immunutfällningar och västra blott utfördes som vi tidigare beskrev. 1

transfektion

Transfektion av MDA-MB-468-celler för NF-B-aktivering utfördes med användning av kalciumfosfatmetoden. 1 celler behandlades med 3-Cl-AHPC efter 36 timmar efter transfektion av NF-kB-reporterplasmid och inkuberades under 24 timmar innan luciferas- och p- galaktosidasanalyser utfördes. Cignal lentiviral NF-B-reporter (GFP) -partiklar användes för att transducera KG-1-celler antingen övergående med användning av tillverkarens instruktioner (SABiosciences, Frederick, MD, USA) och luciferasanalys och GFP-fluorescensreporterproteinanalyser utfördes med användning av BioTek Synergy HT (BioTek, Winooski, VT, USA).

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_001278
  • NM_001556

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

Ordlista

CD437

6- [3 '- (1-adamantyl) -4'-hydroxifenyl] -2-naftalenkarboxylsyra

IKK

Hämmare av kärnfaktor-kB-kinaskomplex

SCF

Skp1-Cullins-F-box-proteiner

c-IAP

cellulär hämmare av apoptosprotein

XIAP

X-kopplad hämmare av apoptosprotein

HSP90

värmechockprotein 90

ZVAD-fmk

Z-Val-Ala-Asp (OMe) -fluormetylketon

NEMO

Nukleär faktor-kB väsentlig modulator

SHP

liten heterodimer-partner

TANK

TRAF-associerad NF-kB-aktivator

TBK1

TANK-bindande Kinase 1

Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Cell Death and Differentiation (//www.nature.com/cdd)