Lägre fosfoinositid 3-kinas (pi 3-kinas) aktivitet och differentiella uttrycksnivåer för selektiva katalytiska och reglerande pi 3-kinas subenhet isoformer i prefrontala cortex och hippocampus hos självmordspersoner | Neuropsychopharmacology

Lägre fosfoinositid 3-kinas (pi 3-kinas) aktivitet och differentiella uttrycksnivåer för selektiva katalytiska och reglerande pi 3-kinas subenhet isoformer i prefrontala cortex och hippocampus hos självmordspersoner | Neuropsychopharmacology

Anonim

Abstrakt

Fosfoinositid 3 (PI 3) -kinas är ett av de viktigaste signalerande enzymerna som deltar i en mängd fysiologiska funktioner i hjärnan och används av neurotrofiner för att förmedla neuronal plasticitet, cellöverlevnad och hämning av apoptos för flera neuronala subtyper. Vår senaste demonstration av att uttryck av neurotrofiska faktorer och aktivering av receptortyrosinkinas B har signifikant förändrats i hjärnan efter självmord från mödrar fick oss att undersöka om självmordshjärnan är förknippad med förändringar i PI 3-kinas signalering. I förmåner med prefrontalt cortex (PFC), hippocampus och självmord ( n = 28) och icke-psykiatrisk kontroll ( n = 21) undersökte vi katalytisk aktivering av PI 3-kinas och mRNA och proteinnivåer av regulatoriska (p85 a , p85 p ) och katalytiska (pl10a, p110p) subenheter av PI 3-kinas. Det observerades att den katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas minskade signifikant i PFC och hippocampus hos självmordspersoner jämfört med icke-psykiatriska kontrollpersoner. Konkurrenskraftig PCR-analys avslöjade signifikant minskad mRNA-expression av p85 p och p110 a och ökad expression av p85 a subenhet isoformer i PFC och hippocampus hos självmordspersoner. Förändringar i dessa katalytiska och regulatoriska underenheter åtföljdes av förändringar i deras respektive proteinnivåer. Dessa förändringar fanns inte i cerebellum hos självmordspersoner. Dessa förändringar var också närvarande i alla självmordspersoner oavsett psykiatrisk diagnos. Våra resultat om reducerad aktivering och förändrat uttryck av specifika PI 3-kinasreglerande och katalytiska underenhetsisoformer visar abnormiteter i denna signalväg i självmordspersoner efter postmortem och föreslår möjlig inblandning av avvikande PI 3-kinas signalering i de patogena mekanismerna för självmord.

INTRODUKTION

Fosfoinositid-signalering (PI) har blivit en mycket viktig del av signaltransduktionsforskningen. PI 3-kinaser är en underfamilj av lipidkinaser som fosforylerar det tredimensionella läget för inositolringen i PI som alstrar andra budbärare som är involverade i många fysiologiska funktioner, inklusive cellproliferation, cellöverlevnad, cellmorfologi, synaptisk plastisitet, proteinsyntes, och membranhandel (Lin et al, 2001; Cantley, 2002; Rodgers och Theibert, 2002; Wymann et al, 2003; Downes et al, 2005; Downward, 2004; Engelman et al, 2006).

PI 3-kinasproteiner har delats in i tre klasser som skiljer sig i struktur, substratspecificitet, vävnadsfördelning och i funktioner. Dessa benämns klasser IA / IB, II och III. Bland dem är de viktigaste PI 3-kinaserna de som tillhör underklassen IA, eftersom det är dessa kinaser som aktiveras av extracellulära stimuli, såsom neurotrofiska och andra tillväxtfaktorer, via receptorer med inre proteintyrosinkinas (Trk) -aktivitet (Fruman et al, 1998; Segal, 2003). Aktivering av PI 3-kinas leder till generering av PI-3, 4, 5-P3 från PI-4, 5-P2 (Hawkins et al, 1992). PI-3, 4, 5-P 3 fungerar som en kritisk andra budbärare och deltar i fysiologiska funktioner.

Underklass IA PI 3-kinasenzymer är heterodimerer sammansatta av en katalytisk underenhet av 110 kDa och en adapter-regulatorisk p85-subenhet (Hiles et al, 1992; Hu et al, 1993). Tre separata gener, PIK3CA , PIK3CB och PIK3CD, kodar klass IA-katalytisk underenhet, betecknad p110 a , p110 ß respektive p110 5 . Av dessa är pl10 a och p110 p rikligt i hjärnan, medan pl 110 5 är begränsad till leukocyter. Tre gener, PIK3R1 , PIK3R2 och PIK3R3 , kodar p85 a , p85 β och p55 y isoformerna av p85-regulatorisk underenhet, respektive (Vanhaesebroeck et al, 2005; Engelman et al, 2006). PIKR31- genen kan också ge upphov till två mindre regulatoriska underenheter, 50 a och 55 a , men mindre är känt om deras specifika reglerande funktioner. p85 a och p85 p har bred vävnadsfördelning, medan p55 y visar begränsad vävnadsuttryck.

Associering av den katalytiska p110-subenheten med p85-regulatoriska underenheter är kritisk för PI 3-kinasaktivering med Trk-receptorer. De katalytiska pl 110-subenheterna har en N-terminal p85-bindande domän, en Ras-bindande domän, en C2-domän, en PI-kinasdomän och en C-terminal katalytisk domän. p85 består av en N-terminal Src-homologi 3 (SH3) -domän, en brytpunkt-kluster-region-homologi (BH) -domän flankerad av två prolinrika regioner och två C-terminala SH2-domäner. Vid stimulering av tillväxtfaktorer binder SH2-domänerna i p85 till fosforylerad tyrosin i ett YxxM-motiv (Y är fosforylerad tyrosin och X är aminosyra), närvarande i många receptor-Trks och deras substrat (Songyang et al, 1993). Denna bindning lindrar hämningen av p110 och förmedlar rekrytering av den katalytiska underenheten till plasmamembranet (Okkenhaug och Vanhaesebroeck, 2001). PI-3, 4, 5-P3, bildad som svar på fosforylering av PI-4, 5-P2, rekryterar sedan proteiner som innehåller en pleckstrinhomologi (PH) -domän till plasmamembranet. Tillsammans med den direkta rekryteringen av PI 3-kinas, rekryterar många Trks också adapterproteiner, såsom Shc, Grb2, Gab-1, via fosforylerade tyrosinrester i receptorn (Kaplan och Miller, 2001; Patapoutian och Reichardt, 2001). Vissa av dessa adaptrar binder SH2-domänerna i den regulatoriska underenheten p85 och rekryterar PI 3-kinas till plasmamembranet. Dessa adapterkomplex kan aktivera PI 3-kinas.

Nyligen visade vi att uttryckningsnivåer av hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) och dess kognatreceptor TrkB reduceras signifikant i prefrontal cortex (PFC) och hippocampus hos självmordspersoner (Dwivedi et al, 2003a). Dessutom observerade vi att uttryck av andra neurotrofiner, såsom neurotrofin (NT) -3, NT-4/5 och NGF, också är onormalt i självmordspersoner efter postmortem (Dwivedi et al, 2005a). Eftersom många fysiologiska funktioner, inklusive prosurvival effekter av neurotrofiner, sker genom aktivering av PI 3-kinas (Yao och Cooper, 1995; Crowder och Freeman, 1998; Hetman et al, 1999; Liot et al, 2004), är det viktigt att undersöka huruvida detta signalsystem förändras i självmordspersoner efter hjärnan och därför spelar någon roll i självmords patofysiologiska mekanismer. En ny studie indikerar att den katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas minskas i ockipitalt cortex hos självmordsindivider (Hsiung et al, 2003), vilket antyder att PI 3-kinas kan involveras i självmord. Den aktuella studien genomfördes för att omfattande undersöka PI 3-kinas signalering i hjärnan efter självmord med självmord med och utan en historia av major depression. För detta ändamål undersökte vi mRNA och proteinuttryck av olika katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas såväl som PI 3-kinas-katalytisk aktivitet i PFC, hippocampus och cerebellum hos självmordsindivider. Vi valde dessa hjärnområden eftersom PFC och hippocampus spelar viktiga roller i humörreglering (George et al, 1994) och kognition (Sweatt, 2004), respektive, och har varit inblandade i självmord (Rajkowska, 1997; Dwivedi et al, 2003a, 2005a, 2006). Dessutom är hippocampus det primära hjärnområdet som påverkas av stress (Sala et al, 2004), en av de viktigaste faktorerna för självmordsbeteende (Clayton, 1985; Monk, 1987). Vi valde cerebellum eftersom detta hjärnområde i stort sett inte påverkas av depression och självmord.

MATERIAL OCH METODER

ämnen

Studien utfördes i PFC (Brodmanns område 9, BA9) och hippocampus erhållen från självmordspersoner ( n = 28) och icke-psykiatriska kontrollpersoner ( n = 21), nedan kallade normala kontroller. Hjärnvävnader erhölls från Maryland Brain Collection vid Maryland Psychiatric Research Center, Baltimore, MD. Efter avlägsnande från kraniet skars hjärnorna i sex huvuddelar (fyra cerebrala kortikala lober, basal ganglia-diencephalon och nedre hjärnstamm-cerebellum), frystes snabbt på torr is och lagrades vid -70 ° C tills dissektion. Under dissektion skivades de främre flikarna i 1–1, 5 mm tjocka koronalsektioner vid en temperatur mellan 0 och 10 ° C. För att hålla proverna frusna utfördes dissektionerna på en metallplatta över en behållare fylld med torr is. PFC-proverna skars ut från koronalsektionerna med en fin mikrodissekterande (Graefes) kniv under ett stereomikroskop med låg förstoring. Den dorsomediala PFC (Brodmanns område 9) togs bara dorsal till det frontopolära området inklusive den mest polära delen av överlägsen och delvis den mellersta överlägsna gyrusen mellan överlägsna och mellanliggande frontala sulci. I sektionerna i det dissekerade kortikala området separerades gråa och vita ämnen och gråmaterialet användes i denna studie. Hippocampus isolerades genom trubbig dissektion i laterala ventriklar för att demonstrera hippocampus vid golvet i den laterala ventrikeln. Innan frysa resten av den temporala loben avlägsnades hippocampus genom att skära genom linjen i fimbrien och inkludera CA1-4 och dentate gyrus. Vi använde 80–100 mg PFC eller hippocampus för att utföra Western blot och bestämma katalytisk aktivitet och ytterligare 100 mg vävnad för att bestämma mRNA-nivåer. För att säkerställa att samma område användes för varje analys, efter dissektion skars varje vävnad i hjärnområdet i mycket små bitar, blandades och användes sedan för analys.

Alla vävnader från normala kontroller och självmordspersoner screenades för bevis på neuropatologi av erfarna neuropatologer. Närvaron av Alzheimers sjukdom, infarkt, demyeliniserande sjukdomar eller atrofi (eller klinisk historia av dessa störningar) diskvalificerade personer från studien. Blod / urinprover från alla självmord och kontrollpersoner erhölls systematiskt. Dessa biologiska prover gör det möjligt att genomföra en systematisk toxikologisk screening för alkohol och ett omfattande batteri för olaglig droganvändning, samt screening för antidepressiva / psykoaktiva läkemedel som tas före dödsfallet. Denna information, tillsammans med medicinhistoriken (erhållen från sjukhusregister) och överensstämmelseshistoriken (erhållen genom intervjuer med familjemedlemmar), identifierar individer som har tagit antidepressiva medel, psykoaktiva läkemedel eller missbruk av ämnen före självmord. Personer som visade alkohol och / eller kokain i blod eller urin i toxikologin och anges som missbrukare i tabell 2 var beroende av dessa läkemedel. Självmordspersoner som inte var beroende av droger eller alkohol och visade alkohol / kokain endast under screening av toxikologi indikeras inte som alkohol- eller drogmissbrukberoende.

I båda fallen utfördes screening för förekomst av HIV i blodprover och alla HIV-positiva fall utesluts. Hjärnans pH mättes i cerebellum i alla fall som beskrivits av Harrison et al (1995).

Diagnostiska metoder

Minst en familjemedlem genomgick, efter att ha gett muntligt informerat samtycke, en intervju baserad på Diagnostic Evaluation After Death (DEAD) (Salzman et al, 1983) och den strukturerade kliniska intervjun för DSM-IV (SCID) (Spitzer et al, 1995). Intervjuerna genomfördes av en utbildad psykiatrisk socialarbetare. Två psykiatriker granskade självständigt skrivningen från denna intervju, liksom SCID som slutfördes från den, som en del av deras diagnostiska bedömning av fallet. Deras diagnoser gjordes från de uppgifter som erhölls i denna intervju, medicinska journaler från fallet och journaler som erhållits från läkarundersökarens kontor. De två diagnoserna jämfördes och skillnaderna löstes med en konsensuskonferens. Kontrollerna verifierades som fria från mentala sjukdomar med användning av dessa konsensusdiagnostiska procedurer. Denna studie godkändes av Institutional Review Board vid University of Illinois i Chicago.

Beredning av vävnad

Vävnader homogeniserades i lysbuffert innehållande 20 mM Tris-HC1 (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, fosfatasinhibitorer (2, 5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM p- glycerofosfat, 1 mM natriumortovanadat ) och en cocktail av proteashämmare. Lysatet centrifugerades vid 1400 g under 30 minuter vid 4 ° C. Proteinnivåer i lysat mättes enligt Lowry et al (1951).

PI 3-kinasaktivitetsanalys

P13-K-aktivitet mättes väsentligen med förfarandet beskrivet av Hsiung et al (2003). Hjärnlysat för postmortem (600 μg protein) immunutfälldes med en antikropp riktad mot p85-subenheten och inkuberades på is under 60 minuter. Protein A / G-agaros (30 ul) tillsattes sedan, och inkubation fortsattes under 60 minuter vid 4 ° C. Lysatet centrifugerades och pelleten tvättades med 500 ul lysbuffert innehållande 25 mM HEPES (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM natriumortovanadat och en cocktail av proteashämmare. Pelleten tvättades igen med 500 pl kinasbuffert (30 mM HEPES (pH 7, 5) och 30 mM MgCl) och suspenderades i sonikerad sojabönfosfatidylinositol (20 mik) och 35 mik kinasanalysbuffert. Reaktionen initierades genom tillsats av 50 mikrometer ATP och 5 mikCi [ y 32P] ATP (3000 Ci / mmol) i 5 pl kinasbuffert, inkuberades under 10 minuter vid 30 ° C och stoppades genom tillsats av 100 ul 1 N HCl. Lipider extraherades med 200 ul kloroform: metanol (1: 1), fläckades på silikagel G-60 TLC-plattor och utvecklades i en mobil fas bestående av kloroform, aceton, metanol, ättiksyra och vatten (40: 15 : 13: 12: 7; v / v / v / v / v). Fläckar motsvarande fosfatidylinositol 3-fosfat (PI (3) P) detekterades genom autoradiografi och identifierades på basis av deras samvandring med en känd standard. PI 3-kinasaktivitet kvantifierades genom att skära de fläckar som motsvarade PI3-P från plattan och analysera dem genom vätskescintillationsräkning.

Western Blot of Catalytic and Regulatory Subenits of PI 3-Kinase

Provlysat kokades under 5 minuter, virvlades och centrifugerades sedan i 2 minuter. Lika mängder av prover (35 μg protein) laddades på en 7% (vikt / volym) polyakrylamidgel med användning av Mini Protein II gelapparat (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Gelerna kördes med 25 mM Tris-bas, 192 mM glycin och 0, 1% (vikt / volym) SDS vid 150 V. Proteinerna överfördes därefter elektroforetiskt med användning av 25 mM Tris-bas, 0, 2 M glycin och 20% metanol (pH 8, 5 ) till ett förstärkt kemiluminescens (ECL) nitrocellulosamembran med Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) vid 0, 15 A konstant ström. Membran tvättades med TBST (10 mM Tris-bas, 0, 15 M NaCl och 0, 05% Tween 20) buffert under 5 minuter. Fläckarna blockerades genom inkubering med 5% (vikt / volym) pulveriserad icke-fettsmjölk i TBST, 0, 2% (volym / volym) Nonidet P-40 och 0, 02% (vikt / volym) SDS (pH 8, 0) under 1 timme och var inkuberades över natten vid 4 ° C med primär antikropp för p85 a (1: 750), p85 p (1: 500), pl 110 a (1: 650) eller p110 p (1: 500) erhållna från olika källor (p85 a , BD Pharmingen, San Jose, CA, USA; p85 P , GeneTex, San Antonio, TX, USA; p110a, Cell Signaling, Beverly, MA, USA; p110 P , Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Membranen tvättades tre gånger i 10 minuter vardera med TBST, och därefter inkuberades membranen med HRP-konjugerad anti-get-sekundär antikropp (1: 1000-utspädning) under 5 timmar vid rumstemperatur. Membran tvättades tre gånger, 10 minuter vardera med TBST. Membranen avdrevs med användning av strippbuffert (Chemicon International, Temecula, CA, USA) och behandlades med primär p- aktin-antikropp (1, 1 mg / ml; 1: 3000 utspädning) under 3 timmar och sekundär HRP-bunden antikanin / musantikropp (1: 5000 utspädning) under 2 timmar. P- aktin användes som ett hushållningsprotein för att minska variationen i interblot. Membraner inkuberades sedan med ett kemiluminescerande detekteringsreagens (New England Bio Labs Inc., Beverly, MA, USA) vid rumstemperatur. Membranen exponerades på ECL-autoradiografiska filmer. Före experimentet standardiserades utspädningen av antikroppen och varaktigheten av exponeringen av nitrocellulosamembranen på autoradiografisk film. Banden på autoradiogrammen kvantifierades med användning av Loats Image Analys System (Westminister, MD, USA), och den optiska densiteten (OD) för varje prov korrigerades med OD i motsvarande p- aktinband. Värdena presenteras som en procent av kontrollen.

Bandets specificitet på autoradiogrammet kontrollerades med användning av ett 100-faldigt överskott av blockerande peptid (i förhållande till antiserumets molaritet) motsvarande epitopen som användes för att generera PI 3-kinas-subenheterna. Vi undersökte också antikropparna genom att inkludera positiva celler (K-562 helcelllysat; SH-SY5Y; SK-N-SH) tillsammans med human PFC och hippocampus för western blot och observerade att banden i PFC och hippocampus var av samma storlek som observerats i cellinjer. Dessutom, för att validera våra data, bestämde vi initialt immunmärkningen i PFC och hippocampus av självmord och kontrollpersoner med fem olika koncentrationer av protein (10–80 μg). Bandets OD ökade linjärt med ökad koncentration av protein (data visas inte).

Bestämning av mRNA-nivåer av katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas

Förfarandena för RNA-isolering och konkurrenskraftig RT – PCR-analys har i stor utsträckning använts av oss (Dwivedi et al, 2002, 2003a, 2003b, 2006). Hjärnvävnader homogeniserades i 4 M guanidinisotiocyanat, 50 mM Tris / HCl (pH = 7, 4) och 25 mM EDTA, och det totala RNA isolerades genom CsCl2 ultracentrifugering. Utbytet av totalt RNA bestämdes genom att mäta absorptionsförmågan för en alikvot av det utfällda beståndet vid en våglängd av 260/280 nm. Prover med ett förhållande under 1, 8 avvisades. Kvaliteten på det totala RNA bestämdes genom visuell bedömning av 28S: 18S rRNA-förhållandet på en denaturerande agarosgel. För att bestämma RNA: s integritet analyserades dessutom alla prover med användning av Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. RNA späddes till en koncentration av 100 ng / ul, och en alikvot på 1 ul analyserades med användning av lab-on-a-chip-tekniken för Agilent Bioanalyzer. Endast prover med ett RNA-integritetsnummer> 6 användes i denna studie.

MRNA-nivåerna för de olika katalytiska och reglerande underenheterna av PI 3-kinas kvantifierades med användning av interna standarder. Vi bestämde också mRNA-nivåer av cyklofilin och neuronspecifikt enolas (NSE), som användes som hushållningsgener. Kloning och syntes av interna standarder har beskrivits i våra tidigare publikationer (Dwivedi et al, 2002, 2006). Sekvenserna av externa och interna primrar för katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas, cyklofilin och NSE anges i tabell 1. Ensträngiga interna standarder designades och syntetiserades identiskt med målgenen mRNA, med en specifik deletionsmutation infördes mellan PCR-primrarna. Detta gjordes för att möjliggöra differentiering mellan målgenen mRNA och den interna standarden genom gelelektrofores. Var och en av de interna standarderna syntetiserades i två PCR-steg, börjar med en cDNA-mall omvänd transkriven från det totala RNA. De interna standardmallarna klonades först i en pGEM4Z-vektor med användning av M13-primrar och transkriberades sedan med användning av SP6 RNA-polymeras. För NSE genererades intern standard genom platsriktad mutagenes för att införa ett Xho I-restriktionsställe mellan amplifieringsprimrarna så att matsmältningen av amplikonet skulle generera två fragment med ungefär lika molekylstorlek. För att säkerställa att amplifierade sekvenser av PI 3-kinas-katalytiska och regulatoriska underenhetsisoformer och av cyklofilin och NSE matchar de motsvarande sekvenserna rapporterade i GenBank, sekvenserades de interna standarderna med användning av M13-primer.

Full storlek bord

Kvantitativa analyser av katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas utfördes med konkurrerande RT – PCR såsom beskrivits tidigare (Dwivedi et al, 2002). En konstant mängd av totalt RNA och fem minskande mängder intern standard (en tvåfaldig utspädningsserie) användes för att bestämma mängden mål-RNA närvarande i varje prov. Minskande koncentrationer av p85 a (50–3, 125 pg), p85 ß (400–25 pg), p110 α (200–12, 5 pg), p110 β (25000–1562, 5 pg), cyklofilin (200–12, 5 pg) eller NSE ( 100–3, 125 pg) interna standardRNA tillsattes till 1 μg totalt RNA. PCR-blandningen amplifierades under 30 cykler. Efter amplifiering kördes alikvoter på en 1, 5% agarosgel.

För att kvantifiera mängden produkt motsvarande det omvänd-transkriberade och amplifierade mRNA, skars de etidiumbromidfärgade banden och räknades. Resultaten beräknades som de räkningar som införlivades i den amplifierade cRNA-standarden dividerad med de räknade inkorporerade i motsvarande mRNA-amplifieringsprodukt mot en känd mängd intern standard-cRNA tillsatt till testprovet. Resultaten uttrycks som attomoler mRNA per mikrogram totalt RNA.

Statistisk analys

Dataanalyser utfördes med användning av SPSS-version 15 (Chicago, IL, USA). Data rapporteras som medelvärde ± SD. Alla beroende variabler underkastades först tester av normalitet. Antagandet om normalitet testades med Shapiro – Wilk-testet. Både normala kontroller och självmordsgrupper testades för normalitet separat. För att justera för mångfald av tester baserat på flera slutpunkter (dvs beroende variabler) applicerades en multipelanalys av kovarians (MANCOVA) på data för varje hjärnområde (dvs. PFC, hippocampus och cerebellum). Ålder, kön, pH i hjärnan, ras och postmortemintervall (PMI) användes som kovariater. Antagandet om variansens homogenitet testades med användning av Boxs test av likvärdighet av kovariansmatriser. I närvaro av en signifikant MANCOVA för ett givet hjärnområde, utfördes ANCOVA för varje beroende variabel. Om en MANCOVA inte var signifikant, utfördes ingen ytterligare analys för det hjärnområdet. För analysen i två grupper (normala kontroller mot självmordspersoner) följdes MANCOVA av ANCOVA. För tre-gruppsanalysen (normala kontroller, deprimerade självmordsindivider, självmordspersoner med andra psykiatriska störningar), om ANCOVA för den beroende variabeln var signifikant, utfördes pariwise jämförelser mellan grupper för varje beroende variabel.

Skillnaderna i ålder, kön, pH i hjärnan och PMI mellan självmordsindivider och normala kontroller analyserades med användning av det oberoende provet ' t ' -test. Dessutom bestämdes förhållanden mellan mRNA- och proteinnivåerna, såväl som den katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas och PMI, ålder och pH i hjärnan med användning av Pearson produkt-moment-korrelationsanalys. Effekterna av kön på olika mått bestämdes också med ett oberoende provtest som jämför män och kvinnor. På liknande sätt användes ett oberoende " t " -test för att jämföra de deprimerade försökspersonerna som visade närvaron av antidepressiva vid dödsfallet med de deprimerade försökspersonerna som inte gjorde det.

RESULTAT

De demografiska kännetecknen för självmordsindivider och normala kontrollpersoner tillhandahålls i tabell 2. Det fanns 17 män och 4 kvinnor i kontrollgruppen, och 19 män och 9 kvinnor i självmordsgruppen. Åldersintervallet var 21–87 år; PMI-intervallet var 5–32 timmar. Det fanns inga signifikanta skillnader i ålder ( t = 0, 63, df = 47, P = 0, 53) eller PMI ( t = 0, 29, df = 45, P = 0, 77) mellan självmordsindivider och normala kontrollpersoner. De genomsnittliga hjärnans pH-värden för självmordsindivider och normala kontroller var 6, 1 ± 0, 1 respektive 6, 2 ± 0, 4, vilka inte var statistiskt olika mellan dessa grupper ( t = 1, 00, df = 47, P = 0, 32).

Full storlek bord

Övergripande analys av data

Vi mätte PI 3-kinasaktivitet, mRNA och proteinnivåer av p110 α , p110 β , p85 α och p85 β i PFC och hippocampus (totalt nio beroende variabler), och PI 3-kinasaktivitet och proteinnivåer för p110 a p110 p , p85 a och p85 p (totalt fem beroende variabler) i hjärnområden i hjärnan. Alla beroende variabler i de tre hjärnområdena utsattes först för normala tester med Shapiro – Wilk-testet. Vi hittade obetydliga P- värden (> 0, 05) för tester av normalitet för alla beroende variabler i PFC, hippocampus och cerebellum för både normal kontroll- och självmordsgrupper, vilket indikerar att vi inte kan avvisa nollhypotesen att data normalt distribueras. Vi använde Boxs test av jämlikhet mellan kovariansmatriser för att testa antagandet om jämlikhet mellan grupper. Inga signifikanta skillnader mellan grupperna hittades för kovariansmatriser i PFC ( P = 1, 01), hippocampus ( P = 0, 08) eller cerebellum ( P = 0, 94). Den totala MANCOVA för alla nio beroende variabler justerade för kovariater var signifikant för PFC (F = 11, 95, df = 9, 32, P <0, 001) och hippocampus (F = 17, 10, df = 9, 27, P <0, 001), men var inte signifikant för cerebellum (F = 2, 4, df = 5, 36, P = 0, 07), när den normala kontrollgruppen jämfördes med självmordsgruppen. I följande avsnitt beskriver vi resultaten av de individuella ANCOVA: erna för varje beroende variabel för PFC och hippocampus.

PI 3-kinasaktivitet

PI 3-kinasaktivitet bestämdes i lysat framställda från PFC, hippocampus eller cerebellum. Representativa autoradiogram som visar PI 3-kinasaktivitet i PFC, hippocampus och cerebellum hos två normala kontroller och två självmordsindivider visas i figur la, och medelvärden presenteras som stapeldiagram i figur Ib. Vi observerade att relativ katalytisk aktivitet hos normala kontrollpersoner var nästan densamma i dessa tre hjärnområden. Den katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas minskade signifikant i PFC ( t = 4, 41, df = 47, P <0, 001) och hippocampus ( t = 4, 26, df = 40, P <0, 001) av självmordspersoner jämfört med normala kontroller (figur 1b).

Katalytisk aktivitet av PI 3-kinas i PFC, hippocampus och cerebellum hos självmordsindivider och normala kontroller. (a) Representativa autoradiogram som visar PI 3-kinasaktivitet i PFC, hippocampus och cerebellum bestämda efter immunutfällning med användning av p85-antikropp. Reaktionen initierades genom tillsats av 50 μM ATP och 5 μCi [γ32P] ATP (3000 Ci / mmol) i 5 μl kinasbuffert, inkuberades under 10 minuter vid 30 ° C och stoppades genom tillsats av 100 μl 1 N HC1. Lipider extraherades med 200 ul kloroform: metanol (1: 1), fläckades på silikagel G-60 TLC-plattor och utvecklades i en mobil fas bestående av kloroform, aceton, metanol, ättiksyra och vatten (40: 15 : 13: 12: 7; v / v / v / v / v). (b) Genomsnitt ± SD för PI 3-kinasaktivitet i PFC, hippocampus och cerebellum hos självmordsindivider och normala kontroller. PFC-prover var från 21 normala kontroller och 28 självmordspersoner; hippocampus och cerebellumprover var från 21 normala kontroller och 21 självmordspersoner. * P = 0, 001.

Bild i full storlek

Western Blot of PI3-Kinase Regulatory and Catalytic Subunits

Immunolabeling av regulatoriska p85 a och p85 p och av katalytiska pl 110 a och p110 p undersöktes i samma lysat i vilka katalytisk aktivitet bestämdes, och representativa västra blott visas i figur 2. Vi observerade att p85 a och p85 p migrerade till 85 respektive 82 kDa, medan pl10 a och p110 p migrerade till 110 kDa. P- Aktin migrerade till 46 kDa. OD-förhållanden mellan regulatoriska eller katalytiska underenheter med p- aktin beräknades och representerade som procent av kontrollen.

Representativa västra blott som visar immunmärkningen av p85 a , p85 p , p110 a , p110 β och ß- aktin i lysat av PFC och hippocampus hos fyra normala kontroller och fyra självmordsindivider. Proteinprover underkastades 7% polyakrylamidgelelektrofores och överfördes till ECL-nitrocellulosamembran, vilka därefter inkuberades med primär antikropp specifik för p85 a , p85 p , p110 a , p110 p eller p- aktin och motsvarande sekundär antikropp. Banden kvantifierades enligt beskrivningen i avsnittet "Material och metoder". Förhållanden mellan den optiska densiteten för p85 a , p85 p , p110 a eller p110 p till den för p- aktin beräknades och rapporterades som procent av kontrollen.

Bild i full storlek

Jämförelse av regulatoriska p85-subenheter mellan normala kontroller och självmordspersoner

Såsom visas i figurerna 2 och 3 observerade vi att proteinnivån för p85 a ökades signifikant i PFC (df = 1, 40, F = 17, 67, P <0, 001) och hippocampus (df = 1, 35, F = 12, 15, P = 0, 001) självmordspersoner jämfört med normala kontroller. Emellertid minskades nivån av p85 ß signifikant i dessa två hjärnområden hos självmordspersoner (PFC: df = 1, 40, F = 10, 51, P = 0, 002; hippocampus: df = 1, 35, F = 9, 88, P = 0, 003 ).

Medel ± SD för immunolabeling av p85 a , p85 p , p110 a eller p110 p i PFC (a), hippocampus (b) och cerebellum (c) från normala kontroller och självmordspersoner. PFC-prover var från 21 normala kontroller och 28 självmordspersoner; hippocampus och cerebellumprover var från 21 normala kontroller och 21 självmordspersoner. Självmordsgruppen jämfördes med kontrollgruppen. * P = 0, 003, ** P = 0, 002, *** P = 0, 001, **** P <0, 001.

Bild i full storlek

Jämförelse av katalytiska p110-subenheter mellan normala kontroller och självmordspersoner

När proteinnivåer av katalytiska underenheter av PI 3-kinas jämfördes mellan normala kontroller och självmordspersoner observerades att proteinnivån för plOa a minskade i både PFC (df = 1, 40, F = 11, 20, P = 0, 002) och hippocampus (df = 1, 35, F = 18, 33, P <0, 001), medan ingen signifikant förändring observerades i proteinnivån av pl 110 (PFC: df = 1, 40, F = 0, 72, P = 0, 40; hippocampus: df = 1, 35, F = 0, 05, P = 0, 82).

mRNA-nivåer av PI3-kinasreglerande och katalytiska subenheter

Eftersom vi observerade förändringar i proteinnivåer av p85 α och p85 ß och p110 α i PFC och hippocampus, bestämde vi deras mRNA-nivåer genom kvantitativ RT – PCR med användning av interna standarder i dessa två hjärnområden. Vi undersökte också expressionsnivån för pl 110. mRNA-nivåer av cyklofilin och NSE bestämdes som hushållningsgener. Förhållanden mellan mRNA-nivåer av katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas mot cyklofilin eller NSE-mRNA beräknades. Representativa gelelektroforeser som visar den konkurrerande RT – PCR för p85 a , p85 p , p110 a och p110 ß totalt RNA isolerat från PFC hos ett normalt kontrollperson ges i figur 4a, c, e respektive g, medan konkurrerande PCR-analyser ges i figur 4b, d, f respektive h. Det observerades att amplifieringsprodukterna för p85 a , p85 p , p110 a och pl 110 p uppstår från mRNA-mallen vid 347, 353, 332 och 322 bp. Nedbrytningsprodukterna från p85 a , p85 p , p110 a och pl 110 p uppstår från cRNA vid 241, 243, 211 respektive 217 bp.

Representativa gelelektroforeser som visar konkurrerande PCR-analys för p85 a (a), p85 P (c), p110 a (e) eller p110 P (g) mRNA-innehåll i PFC erhållet från en normal kontrollperson. Minskande koncentrationer av internt standard-cRNA (p85 α , 50–3, 125 pg; p85 ß , 400–25 pg; 110 α , 200–12, 5 pg) tillsattes till en konstant mängd (1 μg) av totalt RNA, med undantag för 110 ß , för vilken 2500–156, 25 pg intern standard sattes till 0, 1 μg totalt RNA. Blandningarna omvänd transkriberades och PCR-amplifierades i närvaro av spårmängder av [32P] dCTP; alikvoter elektroforeserades på 1, 5% agarosgel. Det högre molekylära bandet motsvarar amplifieringsprodukten som härrör från mRNA, medan de lägre banden härrör från cRNA genererat från den interna standarden; bl representerar tomt. Data härrörande från agarosgelen plottas som de räkningar som införlivats i den amplifierade p85 a (b), p85 ß (d), p110 a (f) eller p110 ß (h) cRNA-standarden dividerad med de räkningar som är införlivade i motsvarande mRNA amplifieringsprodukt kontra den kända mängden internt cRNA som tillsatts till testprovet. Ekvivalenspunkten representerar mängden av respektive mRNA.

Bild i full storlek

Relativa mRNA-expressionsnivåer av PI3-kinasreglerande och katalytiska underenheter i PFC och hippocampus i normala kontroller

Som visas i figur 5 observerade vi att expressionsnivån för p85 a var liknande i hippocampus och PFC. Å andra sidan var uttrycket av p85 p större i PFC än hippocampus. Emellertid var expressionsnivåerna för p85 ß cirka 5–10 gånger större i PFC och hippocampus än för p85 α . Vid jämförelse av fördelningarna av p110 a och p110 p observerade vi att uttrycksnivån för p110 a var nästan densamma i PFC och hippocampus, medan uttrycket för p110 β var nästan fem gånger större i PFC än hippocampus. Jämförelse av p110 α och p110 ß- isoformer i PFC och hippocampus visade att nivån på 110 β var cirka 80–100 gånger större än uttrycket för p110 α i PFC, medan i hippocampus var nivån på 110 β cirka 20–30 gånger större än uttrycket av p110 a .

mRNA-nivåer av olika katalytiska och regulatoriska underenheter av PI 3-kinas i PFC och hippocampus hos självmordsindivider och normala kontroller. Data är de genomsnittliga ± SD-PFC-proverna från 21 normala kontroller och 28 självmordspersoner; hippocampusprover var från 21 normala kontroller och 21 självmordsindivider. * P = 0, 01, ** P = 0, 003, *** P <0, 001.

Bild i full storlek

Jämförelse av mRNA-nivåer av PI3-kinasreglerande och katalytiska underenheter mellan normala kontroller och självmordspersoner

ANCOVA visade att mRNA-nivån för p85 a ökades signifikant i PFC (df = 1, 40, F = 9, 93, P = 0, 003) och hippocampus (df = 1, 35, F = 16, 08, P <0, 001), medan mRNA nivån av p85 ß minskade signifikant i PFC (df = 1, 40, F = 32, 85, P <0, 001) och hippocampus (df = 1, 35, F = 15, 73, P <0, 001) av självmordspersoner jämfört med normala kontrollpersoner ( Figur 5). Å andra sidan minskade mRNA-nivån för p110 a signifikant i PFC (df = 1, 40, F = 6, 30, P = 0, 016) och hippocampus (df = 1, 35, F = 17, 32, P <0, 001) självmord ämnen. Ingen signifikant förändring noterades i mRNA-nivå av p110 ß , varken i PFC (df = 1, 40, F = 0, 06, P = 0, 81) eller hippocampus (df = 1, 35, F = 0, 99, P = 0, 33) av självmordsindivider (Figur 5).

Jämförelse av mRNA-nivåer av cyklofilin och NSE och förhållanden mellan mRNA-nivåer av PI3-kinasreglerande och katalytiska underenheter till cyklofilin och NSE mellan normala kontroller och självmordspersoner

Vi använde cyklofilin och NSE som gener för hushållning. Vi hittade ingen signifikant skillnad i mRNA-nivåer av cyklofilin mellan normala kontroller och självmordspersoner, varken i PFC (kontroller: 776, 66 ± 112, 5, självmord: 801, 53 ± 117, 34 attomol / μg totalt RNA) eller i hippocampus (kontroller: 783, 47 ± 110, 12, självmord: 768, 34 ± 102, 76 attomol / μg totalt RNA). På liknande sätt observerades ingen signifikant skillnad i mRNA-nivåer av NSE i PFC (kontroller: 360, 23 ± 47, 68, självmord: 344, 04 ± 43, 97 attomol / μg totalt RNA) eller hippocampus (kontroller: 349, 80 ± 38, 15, självmord: 345, 91 ± 81, 36 attomol / μg totalt RNA) mellan normala kontroller och självmordspersoner.

Förhållandena mellan p85 a , p85 p , p110 a eller p110 p mot cyklofilin eller NSE mRNA i PFC och hippocampus ges i figurerna 6 respektive 7. Det observerades att mRNA-nivån för p85 a ökades signifikant (PFC: P = 0, 008; hippocampus: P <0, 001) och att nivåerna av p85 p (PFC: P <0, 001; hippocampus: P = 0, 007) och p110 a ( P = 0, 001; hippocampus: P <0, 001) minskade signifikant i PFC och hippocampus hos självmordsindivider också när de uttrycktes som ett förhållande till cyklofilin-mRNA (figur 6). På samma sätt, när mRNA-förhållanden av NSE till katalytiska eller regulatoriska underenheter av PI 3-kinas beräknades, ökades nivån för p85 a signifikant i PFC ( P = 0, 001) och hippocampus ( P <0, 001) och nivåerna av p85 p och p110 a minskade signifikant i PFC (p85 p : P <0, 001; p110 a : P <0, 001) och hippocampus (p85 p : P = 0, 03; p110 a : P = 0, 002) (figur 7). Dessutom noterades inga signifikanta förändringar i p110 ß- mRNA varken i PFC eller i hippocampus när de uttrycktes som ett förhållande till cyklofilin (PFC: P = 0, 99; hippocampus: P = 0, 47) eller till NSE (PFC: P = 0, 27; hippocampus: P = 0, 80) mRNA.

mRNA-nivåer av olika katalytiska och reglerande underenheter av PI 3-kinas visade som ett förhållande till cyklofilin i PFC och hippocampus hos självmordsindivider och normala kontroller. Data är de genomsnittliga ± SD-PFC-proverna från 21 normala kontroller och 28 självmordspersoner; hippocampusprover var från 21 normala kontroller och 21 självmordsindivider. * P <0, 008, ** P = 0, 001, *** P <0, 001.

Bild i full storlek

mRNA-nivåer av olika katalytiska och reglerande underenheter av PI 3-kinas visade som ett förhållande till NSE i PFC och hippocampus hos självmordsindivider och normala kontroller. Data är de genomsnittliga ± SD-PFC-proverna från 21 normala kontroller och 28 självmordspersoner; hippocampusprover var från 21 normala kontroller och 21 självmordsindivider. * P <0, 03, ** P = 0, 004, *** P = 0, 002, **** P = 0, 001, ***** P <0, 001.

Bild i full storlek

Effekter av confounding-variabler

Effekterna av potentiella förvirrande variabler, nämligen ålder, kön, PMI, pH i hjärnan, antidepressiva behandling, närvaro av alkohol och metod för självmord utvärderades med avseende på PI 3-kinasaktivitet och mRNA och proteinnivåer av PI 3-kinas regulatoriska och katalytiska underenheter.

Effekter av ålder, PMI, kön, hjärnans pH och självmordsmetoder

Vi fann inga signifikanta effekter av ålder på PI 3-kinasaktivitet (PFC: r = 0, 09, P = 0, 52; hippocampus: 0, 17, P = 0, 27). På liknande sätt hade ålder ingen signifikant effekt på proteinnivåer av p85 p eller p110 a , varken i PFC (p85 a , r = 0, 13, P = 0, 37; p85 p , r = 0, 08, P = 0, 60; p110 a , r = 0, 01, P = 0, 91) eller i hippocampus (p85 P , r = 0, 08, P = 0, 61; p110 a , r = 0, 18, P = 0, 25). Dessutom observerades ingen signifikant ålderseffekt på mRNA-nivåer av p85 p eller p110 a varken i PFC (p85 p , r = 0, 15, P = 0, 52; p110 a , r = 0, 07, P = 0, 63) eller i hippocampus (p85 p R = 0, 15, P = 0, 35; p110 a , r = 0, 06, P = 0, 68). Emellertid observerades en signifikant negativ korrelation mellan ålder och p85 a mRNA i PFC ( r = −0, 29, P = 0, 04) men inte i hippocampus ( r = 0, 19, P = 0, 23).

PMI hade inte heller någon effekt på mRNA för de angivna katalytiska och regulatoriska underenheterna (PFC: p85 a , r = 0, 08, P = 0, 59; p110 a , r = 0, 03, P = 0, 82; hippocampus: p85 a , r = 0, 01, P = 0, 93; p110 a , r = 0, 04, P = 0, 81) eller på deras proteinnivåer (PFC: p85 a , r = 0, 12, P = 0, 40; p85 p , r = 0, 07, P = 0, 66; p110 a , r = 0, 09, P = 0, 55; hippocampus: p85 a , r = 0, 09, P = 0, 56; p85 p , r = 0, 02, P = 0, 88; p110 a , r = 0, 001, P = 0, 99), med undantag för en negativ korrelation av p85 ß mRNA i hippocampus ( r = −0, 49, P = 0, 001) men inte i PFC ( r = 0, 19, P = 0, 41). PI 3-kinasaktivitet påverkades inte heller av PMI (PFC: r = 0, 05, P = 0, 72, hippocampus: r = 0, 03, P = 0, 83).

Det fanns 17 män och 4 kvinnor i kontrollgruppen. Jämförelsestudier visade inga signifikanta skillnader i PI 3-kinasaktivitet mellan män och kvinnor i PFC ( t = 0, 23, df = 19, P = 0, 82) eller hippocampus ( t = 0, 42, df = 19, P = 0, 68). På liknande sätt noterades inga signifikanta skillnader i mRNA-nivåer av p85 a (PFC: t = 1, 03, df = 19, P = 0, 32; hippocampus: t = 0, 05, df = 19, P = 0, 96), p85 p (PFC: t = 1, 01, df = 19, P = 0, 32; hippocampus: t = 0, 14, df = 19, P = 0, 89), eller p110 a (PFC: t = 0, 53, df = 19, P = 0, 59; hippocampus: t = 0, 93, df = 19, P = 0, 36) mellan män och kvinnor. Proteinnivåer av p85a (PFC: t = 0, 19, df = 19, P = 0, 85; hippocampus: t = 1, 63, df = 19, P = 0, 12), p85 p (PFC: t = 0, 13, df = 19, P = 0, 89; hippocampus: t = 0, 23, df = 19, P = 0, 82), eller pl10 a (PFC: t = 0, 16, df = 19, P = 0, 87; hippocampus: t = 0, 05, df = 19, P = 0, 96) var inte heller olika mellan män och kvinnor.

Dessutom hade hjärnans pH ingen signifikant effekt på PI 3-kinasaktivitet varken i PFC ( r = 0, 11, P = 0, 47) eller i hippocampus ( r = 0, 03, P = 0, 83). Vidare fann vi inga signifikanta effekter av hjärnans pH på mRNA-nivåer av p85 a (PFC: r = 0, 22, P = 0, 12; hippocampus: r = 0, 14, P = 0, 38), p85 p ( r = 0, 07, P = 0, 62) ; hippocampus: r = 0, 006, P = 0, 97) eller pl10 a ( r = 0, 01, P = 0, 92; hippocampus: r = 0, 11, P = 0, 49). Vi undersökte också effekterna av hjärnans pH på mRNA-nivåer av NSE och cyklofilin men inga signifikanta effekter av hjärnans pH observerades på dessa hushållsgener i någon av PFC (NSE: r = 0, 18, P = 0, 21; cyklofilin: r = 0, 06, P = 0, 69) eller hippocampus (NSE: r = 0, 11, P = 0, 49; cyklofilin: r = 0, 02, P = 0, 91).

För att undersöka om självmordsmetoden hade någon effekt på måtten på PI 3-kinas jämförde vi självmordsoffer som dött på våldsamma sätt ( n = 20) med dem som dog genom överdosering / förgiftning av narkotika ( n = 8). Inga signifikanta skillnader i mRNA (PFC: p85 a , t = 0, 53, df = 26, P = 0, 60; p85 p , t = 1, 04, df = 26, P = 0, 25; p110 a , t = 0, 74, df = 26, P = 0, 46; hippocampus: p85 a , t = 0, 09, df = 19, P = 0, 93; p85 p , t = 1, 90, df = 19, P = 0, 07; p110 a , t = 1, 09, df = 19, P = 0, 29) proteinnivåer (PFC: p85 a , t = 1, 64, df = 26, P = 0, 11; p85 p , t = 0, 89, df = 26, P = 0, 38; p110 a , t = 0, 03, df = 26, P = 0, 98 ; hippocampus: p85 a , t = 0, 37, df = 19, P = 0, 71; p85 p , t = 0, 65, df = 19, P = 0, 52; p110 a , t = 0, 88, df = 19, P = 0, 39), eller katalytisk aktivitet av PI 3-kinas (PFC: t = 0, 28, df = 26, P = 0, 78; hippocampus: t = 0, 23, df = 19, P = 0, 82) observerades mellan dessa två grupper.

Effekten av större depression

För att undersöka om förändringarna i olika mått på PI 3-kinas där vi fann signifikanta skillnader mellan självmordspersoner och normala kontroller var relaterade till depression eller fanns i alla självmordspersoner undersökte vi effekten av major depression på dessa åtgärder. För detta ändamål delade vi upp självmordsoffer i dem som fick diagnosen major depression och de som fick diagnosen andra psykiatriska störningar eller inte hade någon psykisk sjukdom. Av de 28 självmordsindividerna hade 12 större depression. I självmordsgruppen med andra psykiatriska störningar ( n = 16) fanns det 5 med justeringsstörning, 2 med schizoaffektiv störning, 2 med bipolär sjukdom, 3 med missbruk av drog / alkohol och 3 hade ingen diagnostiserad psykiatrisk sjukdom; för två självmordspersoner var diagnosen inte tillgänglig. Hippocampi var tillgängliga från 21 av de 28 självmordsindividerna. Alla normala kontroller och självmordspersoner för hippocampusstudierna var desamma som beskrivs (tabell 2). Hippocampi från dessa självmordspersoner var inte tillgängliga: 4 självmordspersoner med major depression, 2 självmordspersoner vars diagnoser av psykiatrisk sjukdom inte var tillgängliga och 1 självmordsperson med justeringsstörning. Den totala MANCOVA för alla beroende variabler justerade för kovariater visade en signifikant skillnad för jämförelse av normala kontroller, deprimerade självmordspersoner och självmordspersoner med andra psykiatriska störningar (PFC: F = 4, 85, df = 18, 64, P <0, 001; hippocampus F = 3, 62, df = 18, 54, P <0, 001). MANCOVA för cerebellum visade inga signifikanta skillnader mellan de tre grupperna (F = 0, 32, df = 10, 72, P = 0, 22). ANCOVA följt av parvisa jämförelser mellan grupper avslöjade att den katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas och mRNA- och proteinnivåerna för p85 a , p85 p och p110 a inte skilde sig mellan självmordspersoner med major depression och självmordspersoner med andra psykiatriska störningar i både PFC (tabell 3) och hippocampus (tabell 4). Emellertid visade grupperna av självmordspersoner med major depression och självmordspersoner med andra psykiatriska störningar båda signifikanta skillnader i dessa åtgärder i både PFC (tabell 3) och hippocampus (tabell 4) jämfört separat med normala kontrollpersoner.

Full storlek bord

Full storlek bord

Effekt av antidepressiva toxikologier eller tidigare behandling med antidepressiva

För att undersöka om de observerade förändringarna i mått på PI 3-kinas i självmordsgruppen var relaterade till närvaron av antidepressiva medel, jämförde vi självmordsindividerna som testade positivt för antidepressiva under skärmen vid dödsfallet och de som gjorde inte. Vi hittade inte signifikanta skillnader i mRNA (PFC: p85 a , t = 0, 89, df = 26, P = 0, 38; p85 p , t = 0, 93, df = 26, P = 0, 36; p110 a , t = 0, 41, df = 26, P = 0, 68; hippocampus: p85 a , t = 1, 2, df = 19, P = 0, 24; p85 P , t = 0, 91, df = 19, P = 0, 37; p110 a , t = 1, 34, df = 19, P = 0, 19), proteinnivåer (PFC: p85 a , t = 1, 14, df = 26, P = 0, 26; p85 p , t = 0, 77, df = 26, P = 0, 45; p110 a , t = 0, 39, df = 26, P = 0, 70; hippocampus: p85 a , t = 0, 05, df = 19, P = 0, 96; p85 p , t = 1, 04, df = 19, P = 0, 31; p110 a , t = 0, 70, df = 19, P = 0, 49 ) eller katalytisk aktivitet av PI 3-kinas (PFC: t = 0, 16, df = 26, P = 0, 88; hippocampus: t = 0, 18, df = 19, P = 0, 64) mellan de som visade en närvaro av antidepressiva medelst skärmen vid dödsfallet och de som inte gjorde det.

Vi undersökte också effekten av tidigare behandling med antidepressiva medel på PI 3-kinasåtgärder. Av de 12 deprimerade självmordsindividerna behandlades 2 (nr 1 och 10) med tricykliska antidepressiva 1 månad före döden och 4 (# 4, 6, 8, 21) behandlades med tricykliska antidepressiva 3 eller 6 månader före döden. Jämförelse av deprimerade självmordspersoner som behandlades med antidepressiva mot de som var obehandlade avslöjade inga signifikanta skillnader i PI 3-kinasaktivitet i PFC ( t = 1, 51, df = 25, P = 0, 14) eller hippocampus ( t = 0, 18, df = 18 P = 0, 86). På liknande sätt var mRNA- och proteinnivåer av PI 3-kinas-katalytiska och regulatoriska underenheter inte olika mellan dessa grupper varken i PFC (mRNA: p85 a , t = 0, 16, df = 25, P = 0, 87; p85 p , t = 1, 54, df = 24, P = 0, 14; p110 a , t = 0, 61, df = 25, P = 0, 54; protein: p85a, t = 0, 82, df = 25, P = 0, 42; p85 p , t = 0, 47, df = 25, P = 0, 64; p110 a , t = 0, 65, df = 25, P = 0, 52) eller i hippocampus (mRNA: p85 a , t = 0, 57, df = 18, P = 0, 58; p85 p , t = 0, 33, df = 18, P = 0, 74; p110 a , t = 0, 09, df = 18, P = 0, 92; protein: p85 a , t = 0, 42, df = 18, P = 0, 68; p85 P , t = 1, 42, df = 18, P = 0, 17; plOl a , t = 0, 44, df = 18, P = 0, 66).

Effekt av alkoholtoxikologi

Av de 28 självmordsindividerna visade 7 positiv toxikologi för alkohol. För att undersöka effekten av alkohol jämförde vi självmordspersoner som visade positiv toxikologi för alkohol med dem som inte gjorde det. Positiv alkoholtoxikologi hade ingen effekt på PI 3-kinasaktivitet (PFC: t = 1, 51, df = 25, P = 0, 14; hippocampus: t = 0, 18, df = 18, P = 0, 86) eller mRNA och proteinnivåer av PI 3- kinaskatalytiska och regulatoriska underenheter i PFC (mRNA: p85 a , t = 1, 63, df = 26, P = 0, 11; p85 p , t = 0, 74, df = 26, P = 0, 47; p110 a , t = 0, 67, df = 26, P = 0, 51; protein: p85 a , t = 0, 11, df = 26, P = 0, 91; p85 p , t = 0, 31, df = 26, P = 0, 76; p110 a , t = 1, 92, df = 26, P = 0, 07) eller i hippocampus (mRNA: p85 a , t = 1, 13, df = 19, P = 0, 20; p85 p , t = 1, 12, df = 19, P = 0, 21; p110 a , t = 0, 19, df = 19, P = 0, 85; protein: p85 a , t = 0, 84, df = 19, P = 0, 41; p85 p , t = 0, 54, df = 19, P = 0, 59; p110 a , t = 0, 41, df = 19, P = 0, 69) .

DISKUSSION

Denna studie ger bevis på avvikelser av PI 3-kinas, inte bara vid aktiveringsnivån utan också för första gången av differentiella uttrycksmönster för katalytiska vs reglerande underenheter av PI 3-kinas i postmortem hjärnan hos självmordspersoner jämfört med normala kontroller. Vi observerade att katalytisk aktivitet av PI 3-kinas minskade signifikant i PFC och hippocampus hos självmordsindivider. Å andra sidan, medan mRNA och proteinnivåer av regulatorisk p85 p och katalytisk pl10 a minskades, ökades expressionsnivåerna för regulatorisk p85 a . Inga signifikanta förändringar i expressionsnivåer för p110 B hittades. Inget av PI 3-kinasmåtten visade några signifikanta förändringar i cerebellum. Vår studie visar således inte bara att det finns minskad aktivering av PI 3-kinas utan också att specifika katalytiska och reglerande underenheter av PI 3-kinas uttrycks differentiellt i PFC och hippocampus hos självmordspersoner jämfört med normala kontroller. Dessutom verkar dessa förändringar vara specifika hjärnregioner, eftersom ingen förändring observerades i hjärnan. Dessutom observerade vi att förändringar i PI 3-kinas var närvarande i alla självmordspersoner oavsett om de diagnostiserades med major depression eller andra psykiatriska sjukdomar, vilket vidare antyder att dessa förändringar är relaterade till självmord snarare än någon specifik psykopatologi.

Ett antal studier har visat att alla katalytiska och regulatoriska isoformer av klass IA PI 3-kinas, med undantag av pl 110, är ​​mycket uttryckta i det centrala nervsystemet (Pons et al, 1995; Antonetti et al, 1996; Fruman et al, 1996 ; Inukai et al, 1997). När vi undersökte den relativa mRNA-fördelningen av katalytiska och regulatoriska underenhetsisoformer av PI 3-kinas, uppstod ett intressant uttrycksmönster i human PFC och hippocampus. Det observerades att mRNA-uttrycket av p85 p var mycket högre än det för p85 a i både PFC och hippocampus. Även om nivåerna av p85 a var lika i PFC och hippocampus, var nivån för p85 p högre i PFC än hippocampus. Vårt resultat är annorlunda än de som rapporterats i murin hjärna, där liknande uttrycksnivåer för både p85 a och p85 β hittades i hjärnbarken och hippocampus (Horsch och Kahn, 1999). Vår jämförande analys av p110 a i PFC och hippocampus visade att uttryckningsnivåerna för p110 a var nästan desamma i PFC och hippocampus, medan uttrycket för p110 ß var mycket högre i PFC än hippocampus. Å andra sidan uttrycktes 110 ß högre i både PFC och hippocampus än p110 a . Det är intressant att notera att samuttryck av alla isoformer av katalytiska och regulatoriska underenheter har rapporterats i neuroner (Shin et al, 1998). Våra resultat av differentiellt uttryck av regulatoriska och katalytiska underenhetsisoformer i PFC och hippocampus antyder möjligheten att olika regleringsmekanismer för uttrycket av varje underenhetsisoform kan existera. Huruvida de högre expressionsnivåerna av p85 p och p110 p i både PFC och hippocampus är associerade med olika substrataffiniteter eller för specifika funktionella förmågor, återstår att klargöra.

Mekanismen för den reducerade katalytiska aktiviteten för PI 3-kinas i självmordspersoner efter postmortem är inte klar för närvarande men verkar vara relaterad till det förändrade uttrycket av katalytiska p110 a och / eller regulatoriska p85-subenheter. Det har visats att regulatoriska p85 inte bara ansluter pl110-katalytiska underenheter för att aktivera transmembranreceptorer, utan stabiliserar också den katalytiska underenheten. Intressant nog fungerar p85 som en hämmare av p110 a- katalytisk aktivitet, och i många celltyper är p85 stökiometriskt överstigande p110, och fri p85 kan fungera som en dominerande negativ för att hämma PI3-kinas-signalering (Ueki et al, 2003). Våra upptäckter av ökat uttryck av p85 a indikerar intressant att den minskade katalytiska aktiviteten i självmordsindivider i hjärnan efter mortem kan möjligen vara förknippad med denna ökning, även om minskningen av p85 p- underenheten strider mot en sådan förening. Möjligheten att p85 a- och p85 p- underenheter kan vara lokaliserade i olika intracellulära fack (t.ex. membran mot cytosol) kan emellertid inte uteslutas, eftersom vi bestämde den katalytiska aktiviteten i total lysat. Ytterligare mekanismer kan också vara ansvariga för en sådan minskning. Det har visats att förutom att katalysera D3-fosforylering av PI: er, har p110-subenheter ser / thr-kinasaktivitet, och genom att fosforylera p85 a på en Ser 608, kan p110 a reducera kinasaktiviteten för heterodimer p110 a / p85 a (Carpenter et al, 1993; Dhand et al, 1994). Dessutom kan PI 3-kinas-katalytiska underenheter aktiveras av det lilla GTP-bindande proteinet Ras genom SHC och Grb-2 (Rodriquez-Viciana et al, 1994). Huruvida sådana mekanismer finns i den observerade nedregleringen av PI 3-kinasaktivitet i självmordspersoner efter hjärna är inte känt och behöver ytterligare undersökning. Det är intressant att notera att den syntetiska glukokortikoiden dexametason orsakar en ökning av uttrycket av p85-subenheten (Giorgino et al, 1997). Eftersom stress är en av de viktigaste faktorerna för självmord, och eftersom komponenter i hypotalam-hypofysen-binjurens axel har visats vara förändrade i postmortem-hjärnan hos självmordsindivider (Mann och Currier, 2007), reglerades PI3-kinas-subenheter av glukokortikoider kan inte uteslutas.

Den funktionella betydelsen av förändrade specifika katalytiska och regulatoriska PI-3-kinas-subenheter i självmordspersoner efter självmord återstår att klargöra; emellertid kan dessa förändringar få betydande fysiologiska konsekvenser i hjärnan. I själva verket gör både dess enzymatiska aktivitet och interaktion med många målproteiner PI 3-kinas till ett multifunktionellt enzym som bidrar till den centrala rollen för PI 3-kinas signaltransduktion vid kontroll av många cellulära funktioner. PI3-kinas är den huvudsakliga regulatorn för neurotrofinmedierad överlevnad i kortikala, hippocampala, sensoriska och motoriska neuroner (Yao och Cooper, 1995; Skaper et al, 1998; Dolcet et al, 1999; Hetman et al, 1999; Liot et al., 2004), såväl som glia (Rodgers och Theibert, 2002). Ett av de viktigaste målen för PI 3-kinas är Akt (Vanhaesebroeck och Alessi, 2000; Patapoutian och Reichardt, 2001), som aktiveras efter bindning med PI 3-kinas lipidprodukten PI-3, 4, 5-P3 eller genom fosforylering av ett annat mål för PI 3-kinas, det vill säga PI-beroende kinas-1 (PDK-1) (Alessi et al, 1997). Akt hämmar i sin tur Forkhead-transkriptionsfaktorer, ansvariga för att inducera uttryck av dödsgener; fosforylater och hämmar därför glykogensyntas-kinas-3- ß- aktivitet, involverad i neuronal apoptos (Patapoutian och Reichardt, 2001); inducerar expression av överlevnadsgener, såsom Bcl-2 och Bcl- xL, genom att aktivera cyklisktAMP-svarelementbindande protein och kärnfaktor-KB (Downward, 2004); fosforylerar och deaktiverar proapoptotisk dålig (Datta et al, 2000) och caspase-9 (Zhou et al, 2000); och blockerar proapoptotisk verkan av neurotrofinreceptorn p75 (Miller och Kaplan, 2001). Intressant nog leder aktivering av PDK-1 till fosforylering och aktivering av proteinkinas C (PKC) familjemedlemmar (Chou et al, 1998; Le Good et al, 1998) och PI-3, 4, 5-P 3 som svar på tillväxtfaktoraktivering förbättrar fosfolipas C (PLC) y- aktivitet (Falasca et al, 1998). Det är relevant att nämna att vi har hittat förändrad aktivering av PKC i hjärnan efter självmord (Pandey et al, 2004) och att PLC γ kan ha en viktig roll i depressivt beteende (Dwivedi et al, 2005b).

Nyligen visade Martin-Pena et al (2006) att PI 3-kinas styr cellstorlek och att ihållande PI 3-kinasaktivitet är nödvändig för underhåll av synap. Dessutom är PI 3-kinas viktigt vid dendritisk bildning i kortikala och hippocampala neuroner (Leemhuis et al, 2004; Dijkhuizen och Ghosh, 2005). Ett antal studier antyder att personer med affektiva störningar visar morfologiska förändringar i hjärnan, inklusive atrofi av neuroner och minskning i volymer av PFC och hippocampus (Sheline et al, 1996; Drevets et al, 1997, 1999; Bremner et al, 2000) . Flera hjärnstudier postmortem antyder också minskningar i cellantalet och i densitet och storlek hos kortikala och hippocampala neuroner (Rajkowska, 1997, 2000; Benes et al, 1998; Rajkowska et al, 1999, 2001). Altered brain structures have also been demonstrated in brain of suicide subjects (Altschuler et al, 1990; Rajkowska, 1997; Rajkowska et al, 2001). In addition, synaptic loss has been correlated with the cognitive disturbances associated with mood disorders (Duman, 2002; Fossati et al, 2004; Kolomeets et al, 2005). Our findings that activation of PI 3-kinase is reduced in PFC and hippocampus of suicide subjects suggest the possibility that the altered brain structure in depressed and suicide subjects could be a consequence of reduced PI 3-kinase activation.

Some studies suggest that PI3-kinase crosstalks to extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling. It has been shown that PI 3-kinase through its protein kinase activity, regulates Ras, Raf, or ERK kinase (MEK) (Hu et al, 1995; Pandey et al, 1999; Bondeva et al, 1998). PI 3-kinase can directly activate MEK through protein phosphorylation Bondeva et al, 1998), or PDK-1 can directly bind and activate MEK (Sato et al, 2004). In fact, recently Ou and Gean (2006) showed that PI 3-kinase inhibitors attenuate BDNF-induced ERK phosphorylation in rat amygdala, indicating that PI 3-kinase is an upstream regulator of MAP kinase activation. Recently, we observed altered ERK-1/2 signaling at multiple levels, including alterations in activation and expression of ERK-1/2 and B-Raf in postmortem brain of suicide subjects (Dwivedi et al, 2001, 2006). It is quite possible that ERK and PI 3-kinase signaling pathways may be regulating physiological functions in a coordinated fashion and that alterations in the signaling in these two pathways may be important in the pathophysiologic process of suicide.

In conclusion, our study clearly indicates abnormalities in activation and expression of PI 3-kinase in postmortem brain of suicide subjects. Recently it was reported that PI 3-kinase activity is decreased in occipital cortex of suicide subjects (Hsiung et al, 2003) and that ECS (Altar et al, 2004) or long-term lithium treatment (Chalecka-Franaszek and Chuang, 1999) increases PI 3-kinase activity. Given the role of PI 3-kinase in a plethora of biological functions, these and our present findings appear to be quite significant and suggest the possibility that dysfunction of PI 3-kinase signaling may be important in the pathophysiologic mechanisms of suicide.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • M22349
  • NM_005027
  • NM_006218
  • NM_006219
  • NM_181523
  • XM_371409

DISCLOSURE/CONFLICT OF INTEREST

The authors declare that, except for income received from the primary employer, no financial support or compensation has been received from any individual or corporate entity over the past 3 years for research or professional services and that there are no personal financial holdings that could be perceived as constituting a potential conflict of interest.