I dieter med låg proteinreglering reglerar microrna-19b ureasyntes genom att rikta sig till sirt5 | vetenskapliga rapporter

I dieter med låg proteinreglering reglerar microrna-19b ureasyntes genom att rikta sig till sirt5 | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biokemi
  • Molekylärbiologi

Abstrakt

Ammoniakavgiftning, som sker via leverureacykeln, är avgörande för kvävehomeostas och fysiologiskt välbefinnande. Det har rapporterats att en minskning av dietproteinet minskar ureakväve. MicroRNA (miRNAs) är viktiga reglerande icke-kodande RNA som har betydande effekter på flera metaboliska vägar; emellertid är lite känt om huruvida miRNA reglerar syntesen av leverurea i lever. Syftet med denna studie var att utvärdera miRNA-uttrycksprofilen i en lågproteindiet och identifiera miRNA som är involverade i regleringen av leverureacykeln med hjälp av en svinmodell. Avvunna 28 dagar gamla smågrisar matades en normal majs-sojaböns normal proteindiet (NP) eller en majs-sojaböna lågproteindiet (LP) under 30 dagar. Lever- och blodprover uppsamlades och miRNA-expressionsprofilen utvärderades genom sekvensering och qRT-PCR. Dessutom utvärderade vi den möjliga rollen för miR-19b i ureasyntesreglering. Det fanns 25 differentiellt uttryckta miRNA mellan NP- och LP-grupperna. Sex av dessa miRNA förutsågs vara involverade i ureacykelmetabolismen. MiR-19b negativt reglerad ureasyntes genom att rikta sig till SIRT5, som är en positiv regulator av CPS1, det hastighetsbegränsande enzymet i ureacykeln. Vår studie presenterade en ny förklaring av ureagenesreglering av miRNA.

Introduktion

Kvävsmetabolism, som främst involverar urea och ammoniakmetabolism, är nödvändig för normal hälsa. Ammoniakavgiftning är avgörande för fysiologiskt välbefinnande hos däggdjur 1, och leverureacykeln spelar en dominerande roll när det gäller bortskaffande av ammoniak och omvandlar ammoniak till urea för utsöndring 2 . Tidigare studier har visat att en minskning av dietproteinet representerar en effektiv och praktisk metod för att minska ureakväve hos svin 3, 4 människor 5 och råttor 6, 7 . Kostrekommendationer för patienter med genetisk hyperammonemi och ureacykelstörningar inkluderar dietproteinbegränsning och komplettering med ureacykelsubstrat för att begränsa ammoniaksyntes och / eller förbättra ammoniakutsöndring 5, 8, 9 . Dessutom har studier visat att aktiviteten och uttrycket av en ureacykel enzymer i levern varierar baserat på näringsstörningar 10, 11 . I modern boskapsproduktion anses reduktion av kvävehaltigt avfall, särskilt kväveoxid och ammoniak, vara en viktig strategi för att minska miljöavfall och förbättra produktiviteten.

MikroRNA (miRNA) spelar en nyckelroll i regleringen av genuttryck genom att modulera stabiliteten och / eller översättningseffektiviteten för mål-mRNA 12, ett antal miRNA har en posttranskriptionell reglerande effekt på gener involverade i olika biologiska processer inklusive utveckling 13, differentiering 14, cellproliferation 15, cellcykel 16, energimetabolism, fettmetabolism 17 och glukoshomeostas 18 . MiRNA-nivåer i hepatocyter har mättes med hjälp av djupa sekvenseringsmetoder 19 . Förändringar i lever-miRNA-profiler kan återspegla underliggande leverskada eller inflammation. MiR-122, som står för 70% av det totala miRNA i levern, har varit målet för omfattande forskning på grund av dess associering med kolesterolmetabolism och hepatocellulärt karcinom och dess roll i att främja hepatit C-virusreplikation 20, 21 . Endast fyra miRNA, dvs miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p och miR-326-3p, induceras av ammoniak och främjar ammoniakinducerad tillväxtstopp och senescens i odlade astrocyter från råtta 22 . Det finns dock lite information om effekten av miRNA på ureagenes. Dessutom är det fortfarande okänt om en lågproteindiet minskar ureasyntes via miRNA-medierad post-transkriptionell reglering.

I vårt arbete fann vi reducerade serumurea kväve (SUN) nivåer i avvunna smågrisar med matad reducerad CP. Proteomanalys avslöjade att proteinuttryck av CPS1 och SIRT5 reducerades (data visas inte). Här mätte vi miRNA-uttryck i levervävnad hos grisar som matade olika proteindieter med användning av Solexa / Illumina djup sekvensering för att få en omfattande vy för att avslöja deras funktioner i ureametabolism och specifikt för att identifiera kritiska miRNA som spelar nyckelroller i regleringen av ureacykeln under dieter med lågt protein.

Resultat

Olika uttryckta lever-miRNA i LP-grupp

Solexa / Illumina djup sekvensering användes för att bestämma den hepatiska miRNA-uttrycksprofilen i LP-gruppen. Unika sekvenser identifierades baserat på mogna miRNA-sekvenser i miRBase (frisättning 20, 0), inklusive 301 kända gris-miRNA, och 116 miRNA-kort mappades till grisgenomet (tabell S2). Bland de 116 miRNA: er, miR-122, ett leverspecifikt miRNA, uttryckt i höga nivåer i mänsklig lever och vuxen mus 23, 24, var det vanligaste miRNA i smågrisar. Totalt 755 nya miRNA, märkta som PC-3p eller PC-5p, identifierades. Generellt uttrycktes de nya miRNA: erna på mycket låga nivåer. Endast tre miRNA (PC-3p-391_4946, PC-5p-1261_1347 och PC-5p-1464_1159) hade expressionsnivåer> 300 RPM. Som ett resultat av deras låga uttrycksnivåer eliminerade vi de flesta av de nya miRNA: erna från efterföljande analyser.

Det fanns 25 differentiellt uttryckta miRNA mellan NP- och LP-grupperna; 19 uppreglerades och sex nedreglerades med expressionsnivåer> 1, 5-faldigt (P <0, 05; tabell S3). För att validera miRNA-expressionsprofilen erhållen från sekvensering valde vi slumpmässigt 10 differentiellt uttryckta miRNA för stam-loop RT-qPCR. Med undantag av miR-6516-3p detekterades nio miRNA med framgång med RT-qPCR, och deras uttrycksprofiler stämde överens med de som erhölls från sekvensering (fig 1). Jämfört med NP hade LP ett högre uttryck av ssc-miR-19b (2, 81 gånger högre baserat på qRT-PCR och 1, 64 gånger högre baserat på sekvensering).

* P <0, 05. LP: lågt protein dör, NP: normal proteindiet.

Bild i full storlek

MiRNA-målprognos och KEGG-vägsanalyser

För att bättre förstå rollerna för olika miRNA i smågrismetabolismen undersöktes potentiella mål för miRNA. Tjugofem olika miRNA förutsågs inriktas på 1 905 potentiella transkript med RNA-hybrid. KEGG-anrikningsanalysanalys kopplad till DAVID-funktionell kommentar identifierade 27 anrikade vägar (P <0, 05, fig. 2; tabell S4). Vägar som involverar arginin och prolin, som reglerar kvävmetabolismen, berikades 25 .

Bild i full storlek

Mål för miRNA i ureacykeln

Sex gener, dvs OTC, ARG1, SIRT5, NRC31, K1F15 och OAT, spelar viktiga roller i ureametabolismen 25, 26, 27, 28, 29 . För att bättre förstå interaktioner mellan miRNA och deras målgener konstruerades ett miRNA-mRNA-nätverk (fig. 3). Intressant nog, miRNA-målinriktade gener involverade i ureacykeln uppreglerades i LP-gruppen jämfört med NP-gruppen.

De olika miRNA: erna analyserades; sex miRNA deltog i ureacykeln.

Bild i full storlek

Urea kväveanalys och expression av SIRT5 och CPS1 i LP- och NP-grupper

En minskning av CP bidrog till låga karbonnivåer i serum och lever (Fig. 4A) som tidigare rapporterats 30, 31, 32, 33 . Dessutom reducerades CPS1-proteinuttrycksnivåer (data visas inte) signifikant i LP jämfört med NP. Western blot-resultat avslöjade att SIRT5- och CPS1-expressionsnivåer var lägre i LP än i NP (fig. 4B).

( A ) Serumurea kväve; ( B ) CPS1 och SIRT5 proteinuttryck. Data presenteras som medelvärde ± SD. (* P <0, 05, ** P <0, 01, n = 6). LP: lågt protein dör, NP: normal proteindiet.

Bild i full storlek

Målprognos för miR-19b och verifiering med användning av luciferasrapportanalys

För att verifiera målförhållandet mellan ssc-miR-19b och 3'-UTR för svin SIRT5 (fig. 5A) infördes fullängdssekvensen 3′-UTR för SIRT5 i pmirGLO-vektorn (Promega) för att konstruera den rekombinanta Dual -Luciferasreportervektor pGLO-SIRT5-3′UTR. Dessutom muterades eller raderades utsädessekvensen för att störa miR-19b-bindningsstället (fig. 5B). Vildtyp (pGLO-SIRT5 3'-UTR) eller mutant (pGLO-SIRT5 3'-UTR-mut och pGLO-SIRT5 3'-UTR-del) plasmid samtransfekterades med en miR-19b-mimik i CHO-celler . Såsom visas i fig. 5C reducerades luciferasaktiviteten hos vildtypen SIRT5-reporter signifikant (P <0, 05) med ssc-miR-19b-efterlikning jämfört med den negativa kontrollen 48 timmar efter transfektion. Reduktionen räddades både genom mutation och borttagning av utsädessekvensen (fig. 5C).

( A ) Tre 3'-UTR-sekvenser innehållande normala, mutagena eller borttagna bindningsställen infördes nedströms luciferasreporteren. Åtta nukleotider av SIRT5 3 UTR muterades eller deleterades för att störa bindningen med fröregioner med miR-19b. ( B ) Schematiskt diagram som visar dubbel-luciferasreporterkonstruktioner av gris SIRT5 3 TR UTR med förmodad bindningsställe för miR-19b-3p. ( C ) Konstruerade vektorer transfekterades till CHO-celler med NC eller miR-19b-efterlikning. Resultaten av luciferasanalysen avslöjade signifikanta skillnader mellan NC- och miR-19b-mimiska grupper transfekterade med vektorer innehållande normal SIRT5 3'-UTR (* P <0, 05, n = 8).

Bild i full storlek

Identifiering av primära hepatocyter av svin

För att identifiera de isolerade primära hepatocyterna observerades cellulär morfologi. De isolerade cellerna i cellsuspension i ett enda fritt decentraliserat tillstånd och cellkroppen är runda och ljusa (fig. S1A), efter inkubation under 4 timmar, fästes hepatocyt enkelt på plattan (fig. S1B), medan andra celler förblev suspenderade i mediet och eliminerades genom sköljning med odlingsmedium. När kulturen fortskrider från 24 timmar till 48 timmar visade hepatocyten uppenbara morfologiförändringar med en typisk polygonal morfologi med runda kärnor, mellan celler formad ö-anslutning (fig. S1C, D). Dessa resultat var i enlighet med tidiga rapporter 28, 34 och visade att det var möjligt för ytterligare experiment.

Bekräftelse av ureasyntesreglering med miR-19b i primära svinhepatocyter

Vi utvärderade effektiviteten hos miR-19b-mimik under hela experimentprocessen genom att transfektera det i primära svinhepatocyter. Jämfört med kontrollgruppen ökade nivåerna på miR-19b dramatiskt vid 48 timmar efter transfektion (Fig. 6A). Däremot reducerades expressionsnivåerna för miR-19b med hjälp av hämmare i primära hepatocyter av svin (P <0, 05) relativt iNC (fig 6B). Dessa resultat antydde att mimik av miR-19b var möjlig för ytterligare experiment.

Primära hepatocyter från gris behandlades med miR-19b-efterlikning, miR-19b-hämmare eller motsvarande negativa kontroller. MiR-19b-uttryck i primära hepatocyter från gris mättes med qRT-PCR efter 48 timmar efter transfektion. ( A, B ) Data presenteras som medelvärde ± SD (* P <0, 05, *** P <0, 001, n = 6).

Bild i full storlek

För att få ytterligare inblick i rollen som miR-19b i syntesen av hepatisk urea mättes ureaproduktion av primära hepatocyter av svin vid 48 timmar efter transfektion med miR-19b-efterliknande, hämmare eller NC. Såsom visas i fig. 7 hade primära hepatocyter med svin med miR-19b en signifikant reduktion i ureakvävenivåer, och miR-19b-hämmare räddade denna reduktion (fig. 7A, B). Western blotting-resultat visade att miR-19b efterliknade minskade SIRT5- och CPS1-proteinnivåer (P <0, 05, fig. 7C) och effekten räddades av miR-19b-hämmare (fig. 7D). Resultaten avslöjade att reduktionen i SIRT5- och CPS1-aktivitet förmedlades av miR-19b, vilket var korrelerat med förändringar i ureasyntes.

( A ) Ureakoncentration i hepatocyter behandlade med miR-19b efterliknar, hämmar eller negativ kontroll. Data presenteras som medelvärde ± SD (* P <0, 05, ** P <0, 01, n = 6). ( B ) Western blot-resultat visade att SIRT5-protein- och CPS1-proteinuttryck i primära hepatocyter minskade signifikant genom miR-19b-efterliknande kontra kontroll; miR-19b-hämmare räddade denna effekt. Data presenteras som medelvärde ± SD (* P <0, 05, n = 6).

Bild i full storlek

För att ytterligare undersöka förhållandet mellan miR-19b och SIRT5 utförde vi samtransfektionsexperiment med miR-19b-hämmare eller kontrolloligos och siSIRT5 eller icke-specifik kontroll-siRNA. Knockdown SIRT5 minskade signifikant ureasyntes; därför hade SIRT5-hämning liknande effekter som de som observerades med överuttryck av miR-19b (Fig. 8A). Intressant nog räddades denna effekt med tillsats av miR-19b-hämmare (hämmare + siSIRT5). Western blotting-resultat bekräftade vidare den direkta regleringen av miR-19b på SIRT5 (fig. 8B). MiR-19b-hämmaren räddade inhiberingen av siRNA på SIRT5; därför är det troligt att miR-19b direkt reglerade SIRT5.

Kombinationsstudie av miR-hämmare och SIRT5 siRNA Primära hepatocyter samtransfekterade med SIRT5 siRNA och miR-19b-hämmare eller hämmare negativ kontroll, ( A ) ureakoncentration i hepatocytes supernatant analyserades med urea kväveanalyssats. Data presenteras som medelvärde ± SD (* P <0, 05, ** P <0, 01, n = 6); ( B ) Proteinuttrycket av SIRT5 och CPS1 detekterades samtidigt genom western blotting. Data presenteras som medelvärde ± SD (* P <0, 05, n = 6).

Bild i full storlek

Diskussion

Hos smågrisar minskade SUN-nivåerna med låga CP-nivåer i kosten, som tidigare rapporterats 30, 31, 32, 33 . Ureacykeln omvandlar ammoniak till vattenlöslig och icke-toxisk urea och spelar en viktig roll i regleringen av syra-basbalansen hos däggdjur. I flera arter, inklusive svin, kan blodurea-kväve (BUN) användas för att kvantifiera kväveutnyttjandet och utsöndringsgraden 35 . Höga BUN-koncentrationer indikerar låg diet- eller aminosyraanvändning 36 . Dessutom är BUN-koncentrationer indikativa för kroniska njursjukdomar och / eller leversjukdomar 37, 38 .

Det fanns 25 differentiellt uttryckta lever-miRNA mellan de låga och normala proteingrupperna. Bland dessa miRNA: er, sex kandidat-miRNA, dvs ssc-miR-19a, ssc-miR-19b, ssc-miR-10a-3p, ssc-miR-7138-5p, ssc-miR-133a-3p och hsa-miR -6516-3p, spela en roll i ureacykeln. Intressant nog uppreglerades dessa sex miRNA i gruppen med låg protein. Dessutom observerades en signifikant uppreglering av miR 19b i gruppen med låg protein som kvantifierades med qPCR. Så vitt vi vet är detta den första studien som identifierar miRNA som är förknippade med leverureasyntes.

MiR-19b tillhör gruppen MiR-17/92, som spelar en roll är cancerpatogenes, cellproliferation, leverförnyelse och andra sjukdomar 39, 40, 41 . Studier har visat att miR-19 har de huvudsakliga onkogena effekterna av hela klustret 42 . Specifikt kan miR-19b vara involverad i patogenesen av kardiovaskulära sjukdomar 43, neuroinflammation 44, koloncancer 45 och adipocytdifferentiering 46 ; dock var lite känt om rollen för miR-19b i ureametabolismen. Denna studie ger de första bevisen på att miR 19b har en reglerande roll vid ureasyntes.

Bioinformatik förutspådde att miR-19b binder till 3′UTR i SIRT5. Luciferasanalysen bekräftade att miR-19b direkt riktade frösekvensen i SIRT5 3′-UTR, eftersom både miR-19b efterliknar och mutation / borttagning av utsädessekvensen minskade luciferasaktiviteten. Vidare avslöjade Western blotting-resultaten att SIRT5-proteinnivåerna minskades med överuttrycket av miR-19b och att SIRT5-proteinnivåerna ökade när miR-19b hämmades.

SIRT5 är en unik medlem av Sirtuin-familjen med flera funktioner i cellulär metabolism 47 . SIRT5 deacetylerar och aktiverar CPS1 48, det hastighetsbegränsande enzymet vid leverureagenes 49 . Minskad ureagenes i dieter med lågt protein hos däggdjur är associerad med en minskning av CPS1-genuttrycket i levern. En ny rapport har visat att uppreglering av CPS1 och deacetylering av CPS1 med SIRT5 observeras i dieter med högt protein och att ammoniak i SIRT5-knockout-möss är betydligt högre än hos vildtypsmöss efter en 48- timmars snabb 28, 50 . Dessutom är CPS1-aktivitet och ureaproduktion i Sirt5-Tg-möss högre än i vildtypsmöss 48 . Våra resultat visade att en reduktion i SIRT5-proteinuttryck med miR-19b-efterlikning resulterade i nedreglering av CPS1 med en samtidig minskning av ureasyntes i primära hepatocyter från gris. MiR-19b-hämmaren hade motsatta effekter än de som erhölls med miR-19b-härma. Dessutom bekräftade användningen av siRNA mot SIRT5 förhållandet mellan miR-19b och SIRT5, eftersom siRNA påverkar genuttrycket 51 . Resultaten har visat att miR-19b-hämmare räddade nedregleringen av SIRT5 och CPS1 och den siRNA-inducerade reduktionen av urea, vilket gav ytterligare bevis på den direkta effekten av miR-19b på SIRT5.

Störningar i ureacykeln orsakar livshotande hyperammonemia 52, och utbyte av miRNA kan vara en effektiv terapi 53 . Dessutom har miRNA utvärderats som diagnostiska markörer för leversjukdomar 54 . Därför kan miR 19b vara ett användbart terapeutiskt och diagnostiskt medel vid ureacykelstörningar.

Sammanfattningsvis påverkades miRNA-uttryck hos smågrisar som konsumerade en lågproteindiet och miR-19b inhiberade ureagenes genom att rikta sig mot SIRT5. Vår studie lyfte fram en ny förklaring av ureagenesreglering av miRNA och gav en ny strategi för ureagenesreglering hos människor och djur.

metoder

Etik uttalande

Djuren hanterades i strikt överensstämmelse med reglerna för välfärd och etik för laboratoriedjur som upprättats av den kinesiska föreningen för djurvetenskap. Alla djurförfaranden utfördes enligt protokollet SCAU-AEC-2010-0416, som godkändes av Institutionen för djuretikkommittén vid South China Agricultural University.

Djur och prover

Matningsförsöket genomfördes vid Institute of Subtropical Agriculture of The Chinese Academy of Science (Changsha, Kina) som tidigare rapporterats 55 . I korthet förvärvades totalt 12 avvunna smågrisar (Duroc × Landrace × Yorkshire) från försöksområdet för djurobservationsstationen i South China Agricultural University. Smågrisarna (28 d ålder) med en initial kroppsvikt (BW) på 9, 57 ± 0, 64 kg tilldelades slumpmässigt till en av två grupper med sex djur per grupp: en normal (20%) råprotein (NP) diet ( n = 6) och en låg (17%) diet för råprotein (LP) (n = 6). Dieterna, som uppfyllde National Research Council (NRC; 2012) näringsspecifikationer för 11–20 kg BW-grisar (tabell 1), baserades på majs-sojabönor och gav 14, 6 MJ / kg matsmältbar energi. Under hela utfodringsförsöket hade smågrisarna ad libitum-tillgång till foder och vatten. Innan matningsstudien började genomgick smågrisarna en sju dagars anpassningsperiod till de nya dieterna. I slutet av utfodringsförsöket (30 d) samlades blodprover (ungefär 10 ml) från varje gris genom venepunktur och smågrisarna avlivades omedelbart. Efter centrifugering av blodprover vid 3000 x g överfördes supernatanten (serum) till rör och frystes i flytande kväve. Levarna skars ut aseptiskt, sköljdes i iskall saltlösning och förvarades i flytande kväve medan de transporterades till laboratoriet, där de lagrades vid -80 ° C.

Full storlek bord

Urea kväve analys

Den primära hepatocyten ympades i plattor med 6 brunnar med en densitet av 1 x 106 per brunn. Efter transfektion med mimik / hämmare av miR-19b och NC / iNC uppsamlades cellernas supernatant för urea-kväve-analys. Urea kväve (UN) av serum och cellsupernatant mättes med användning av ett kommersiellt kit (C0132, NanJingJianCheng Bioengineering Institute, NanJing, Kina) baserat på metoden urease Berthelot colorimetry. Urea kvantifierades med användning av den inre standardurea genom att mäta absorptionen av reaktionsprodukter vid 640 nm. Cells totala protein detekterades med användning av BCA Protein Detection Kit (Bioteke Corporation, Peking, Kina) för normalisering av cellureakoncentration.

Total RNA-isolering

Totalt RNA extraherades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, CA, USA) och behandlades med DNas för att eliminera spår genomiskt DNA. Total RNA-integritet bestämdes genom undersökning av 28S och 18S rRNA-band på etidiumbromidfärgade agarosgeler. Total RNA-kvantitet och renhet utvärderades i en Bioanalyzer 2100 och RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA).

Konstruktion och sekvensering av små RNA-bibliotek

Två bibliotek genererades från det totala RNA extraherat från LP- och NP-gruppen. Databehandling utfördes som tidigare rapporterats 56 . I korthet underkastades råavläsningar ett Illumina-rörledningsfilter (Solexa 0, 3) för att erhålla kartläggbara sekvenser med användning av ACGT101-4.2 (LC Sciences, Hangzhou, Kina) baserat på däggdjursdata i miRBase 20.0. Modifierade avläsningar per miljon läsningar (RPM) användes för att kvantifiera de normaliserade avläsningarna. De unika sekvenserna uppnåddes och användes för efterföljande analys. Alla sekvensdata har lämnats in till NCBI Gene Expression Omnibus (//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) under anslutning NO. SRP074399.

Kvantitativ PCR i realtid för miRNA och mRNA

Omvänd transkription utfördes med 1 μg totalt RNA med användning av M-MLV omvänt transkriptas och en specifik hårnålprimer för miRNA (tabell S1) 57 . Kvantitativ PCR i realtid (RT-qPCR) utfördes i en Bio-Rad CFX-96 realtid PCR-termocykler (Bio-Rad, USA) med användning av miScript II RT och miScript SYBR Green PCR-kit (Qiagen) med en miRNA-specifik framgrundsfärg (tabell S1) och en universal omvänd primer. PCR-reaktionen (20 mikroliter) bestod av 2 mikroliter cDNA, 1, 5 mikrometer av varje primer, 10 mikroliter 2 × SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan) och destillerat vatten. Reaktionerna behandlades under 1 min vid 94 ° C, följt av 40 cykler på 15 s vid 95 ° C, 15 s vid 58 ° C och 40 s vid 72 ° C. MiRNA-expressionsnivån normaliserades till nivån för den interna kontrollen U6 i varje prov. Expression standardiserades därefter till miRNA med metoden 2 ΔΔCt .

Målprognos och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analyser

Målprognos och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -vägsanalyser utfördes. Porcine miRNA-mål erhölls vid hela svingenomnivån (sscrofa10.2, www.ensembl.org/ Sus_scrofa /) 58 . KEGG-bananalyser utfördes med användning av DAVID-bioinformatikresurser (//david.abcc.ncifcrf.gov/).

Western blot-analys

Hepatiska homogenater framställdes genom homogenisering av frysta lever i kall RIPA-buffert innehållande proteashämmare (Boston Bio Products, MA). Hepatiskt protein (20 μg) utsattes för NuPAGE 5–10% Bis-Tris gelelektrofores och överfördes till polyvinylidenfluoridmembran (0, 45 μm), som sedan blockerades med 5% mjölk, inkuberades över natten vid 4 ° C med primära antikroppar mot CPS1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) och SIRT5 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, USA) följt av sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur. P-aktin (Abcam, Cambridge, UK) användes som kontroll. Dubbla experiment genomfördes för alla leverproteiner. Fläcken skannades i en FluorChem M (ProteinSimple, Santa Clara, Kalifornien, USA). Data analyserades med Image J-programvaran och uttrycktes som vikningsförändring relativt kontrollgruppen efter normalisering mot p-aktin.

Cell kultur

Fem dagar gamla nyfödda grisar (Landrace, SCAU, Guangzhou, Kina) lever blev perfuserade och hepatocyter isolerades och renades med en tvåstegsprocedur 59, 60 . I korthet fastades svin under 12 timmar och avlivades med natriumpentobarbitalinjektion (50 mg / kg). Leverna perfuserades initialt via den underordnade vena cava med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7, 2, saknar kalcium och magnesium) innehållande 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piCperazinetansulfonsyra (HEPES) och 5 mM etylendiaminetetraättiksyra till avlägsna blodceller och hydrolyseras med 0, 4 mg / ml kollagenas IV (SIGMA, Kina, C125 kollagen-matsmältningsenheter per mg) i PBS buffrat med 10 mM HEPES. De perfuserade leverna passerade genom en sikt med 400 mesh och hepatocyterna uppsamlades efter centrifugering vid 800 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Efter tvättning av cellerna två gånger sådes isolerade hepatocyter in i 6-brunnsodlingsplattor med en densitet av 1 x 105 celler / cm ^ i Williams 'E-odlingsmedium (SIGMA, Kina) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS, GIBCO, Kina), 1% SITE flytande medium (innehållande 1, 0 mg / ml bovint pankreasinsulin, 0, 55 mg / ml järnfritt humant transferrin, 0, 5 μg / ml natriumselenit och 0, 2 mg / ml etanolamin), 10 μg / ml glukagon, 10 nM dexametason (SIGMA, Kina) och 100 U / ml antibiotikum (SIGMA, Kina). Celler odlades på kollagenbelagda plattor vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Efter 4 timmar ersattes mediet med färskt Williams 'E-odlingsmedium innehållande 10% FBS och 100 U / ml antibiotikum, och plattorna inkuberades under 24–36 timmar. Kinesiska hamsteräggstockceller (CHO) bibehölls i Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (GIBCO) kompletterat med 10% FBS.

Plasmidkonstruktion

3'-UTR-sekvenserna av svintranskript i hela genomet erhölls från NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3-UTR för SIRT5 (tillträdesnummer: EU357901.1) innehåller de mycket konserverade bindningsställena för miR19b, och sekvensen 486bp är som tabell S5, vidare infördes 3'-UTR-sekvensen i pmirGLO Vector (Promega) med XhoI och Xbal dubbel digerering för att konstruera rekombinant Dual-Luciferase reportervektor, benämnd som pGLO-SIRT5-3′UTR (Fig. 1A). Under tiden konstruerades mutagena och raderade SIRT5 3′UTR-reportervektorer Tabell S5, dvs pGLO-SIRT5-3′UTR-mut respektive pGLO-SIRT5-3UTR-del med sju utbytade nukleotider eller en raderad målplats via DNA-syntes (Sangon Biotech, Shanghai).

Luciferas reporteranalys

CHO-celler ympades med en densitet av 3 x 104 celler per brunn i plattor med 96 brunnar. När cellerna nådde 60-70% sammanflytning, vildtyp (pGLO-SIRT5 3'-UTR) eller mutant (pGLO-SIRT5 3'-UTR-mut och -del) plasmid samtransfekterades med miR-19b efterliknande eller negativ kontroll (NC) in i CHO-celler. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) användes för att förmedla transfektionen. Celler samlades in 48 timmar efter transfektion och luciferasanalysen utfördes med Dual-Luciferase reporteranalyssystemet (Promega), luciferasaktiviteten normaliserades genom renillaaktivitet. Statistiska skillnader mellan behandlings- och kontrollgrupper bestämdes med användning av Students t-test vid P <0, 05.

MiR-19b efterliknar, miR-19b-hämmare och siRNA för SIRT5

MiR-19b-mimik, miR-19b-hämmare, negativ kontroll (NC och iNC) och siRNA för svin SIRT5 med siNC förvärvades från Shanghai GenePharma Co. När de primära hepatocyterna från grisen nådde 60–70% sammanflytning, efterliknade miR-19b eller hämmare (100 pmol) transfekterades in i cellerna. NC och iNC användes som negativa kontroller för respektive miR-19b-mimik respektive miR-19b-hämmare. Transfektion utfördes med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). SiSIRT5 / siNC samtransfekterades med miR-19b-hämmare / iNC. Efter 48 timmar uppsamlades cellsupernatanter och lagrades vid -80 ° C för efterföljande mätningar av ureakväve. Hepatocyter sköljdes två gånger med PBS och lagrades vid -80 ° C.

Statistisk analys

Data presenterades som medelvärde ± SD. Dataanalys utfördes med Students t-test eller envägs ANOVA med användning av SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). P <0, 05 ansågs vara statistiskt signifikant och betecknades med en asterisk, P <0, 01 betecknades med två asterisker och P <0, 001 betecknades med tre asterisker.

referenser

  1. 1.

    Adeva, MM, Souto, G., Blanco, N. & Donapetry, C. Ammonium metabolism in human. Metabolism 61, 1495–1511 (2012).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  2. 2.

    Braissant, O. Aktuella koncept i patogenesen av ureacykelstörningar. Molekylär genetik och metabolism 100, S3 – S12 (2010).

      • Artikel
      • Google Scholar
  3. 3.

    Wu, G. Aminosyror: ämnesomsättning, funktioner och näring. Aminosyror 37, 1–17 (2009).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  4. 4.

    Wang, W., Qiao, S. & Li, D. Aminosyror och tarmfunktion. Aminosyror 37, 105–110 (2009).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  5. 5.

    Wu, G. et al. Kostbehov av "näringsmässiga icke-essentiella aminosyror" av djur och människor. Aminosyror 44, 1107–1113 (2013).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  6. 6.

    Christowitz, D., Mattheyse, F. & Balinsky, J. Kost- och hormonreglering av en ureacykel-enzymer i råttlever. Enzym 26, 113–121 (1980).

      • Google Scholar
  7. 7.

    Nebes, VL & Morris Jr, SM Reglering av ribonukleinsyranivåer för messenger för fem ureacykelenzym i odlade hepatocyter från råtta. Krav på cyklisk adenosinmonofosfat, glukokortikoider och pågående proteinsyntes. Molecular Endocrinology 2, 444–451 (1988).

      • Artikel
      • Google Scholar
  8. 8.

    Hook, D. et al. Protein- och kaloriintag hos vuxna och barn med ureacykelstörningar som deltar i kliniska studier av glycerolfenylbutyrat. Molecular Genetics and Metabolism Reports 6, 34–40 (2016).

      • Artikel
      • Google Scholar
  9. 9.

    Dam, G., Ott, P., Aagaard, NK, Gluud, LL & Vilstrup, H. In Branched Chain Amino Acids in Clinical Nutrition 101–112 (Springer, 2015).

      • Google Scholar
  10. 10.

    Wraight, C. & Hoogenraad, N. Kostreglering av ornitintranskarbamylas-mRNA i levern och tunntarmen. Australisk tidskrift för biologiska vetenskaper 41, 435–440 (1988).

      • Artikel
      • Google Scholar
  11. 11.

    Davis, PK & Wu, G. Kompartement och kinetik för en ureacykelenszymer i svin-enterocyter. Jämförande biokemi och fysiologi Del B: Biokemi och molekylärbiologi 119, 527–537 (1998).

      • Artikel
      • Google Scholar
  12. 12.

    Bartel, DP MicroRNA: genomik, biogenes, mekanism och funktion. Cell 116, 281–297 (2004).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  13. 13.

    Henao-Mejia, J. et al. MicroRNA miR-181 är en kritisk cellulär metabolisk reostat som är väsentlig för NKT-cellontogenes och lymfocytutveckling och homeostas. Immunity 38, 984–997 (2013).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  14. 14.

    Jung, KH et al. MicroRNA-194 reglerar hepatocytisk differentiering av stamceller genom att rikta YAP1. Stamceller (2016).

      • Google Scholar
  15. 15.

    Yuan, J. et al. MiRNA-125a-5p hämmar glioblastomcellproliferation och främjar celldifferentiering genom att rikta in sig på TAZ. Biokemisk och biofysisk forskningskommunikation 457, 171–176 (2015).

      • Artikel
      • Google Scholar
  16. 16.

    Kim, HS et al. MicroRNA-31 fungerar som en tumörsuppressor genom att reglera cellcykeln och epitel-mesenkymala övergångsreglerande proteiner i levercancer. Oncotarget 6, 8089 (2015).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  17. 17.

    Pan, S., Zheng, Y., Zhao, R. & Yang, X. MicroRNA-130b och microRNA-374b medierar effekten av maternärt protein på avkomma lipidmetabolism hos Meishan-grisar. British Journal of Nutrition 109, 1731–1738 (2013).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  18. 18.

    Ramírez, CM et al. MicroRNA 33 reglerar glukosmetabolismen. Molecular and cellular biology 33, 2891–2902 (2013).

      • Artikel
      • Google Scholar
  19. 19.

    Gamazon, ER et al. En genomömsintegrativ studie av mikroRNA i mänsklig lever. BMC genomics 14, 1 (2013).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  20. 20.

    Li, R. et al. Koordinerade miRNA / mRNA-uttrycksprofiler för att förstå rasspecifika metaboliska karaktärer i levern mellan Erhualian och stora vita grisar. PloS one 7, e38716 (2012).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  21. 21.

    Jopling, C. Lever-specifik mikroRNA-122: Biogenes och funktion. RNA biology 9, 137–142 (2012).

      • Artikel
      • Google Scholar
  22. 22.

    Oenarto, J. et al. Ammoniak-inducerade miRNA-uttryck förändras i odlade råttastrocyter. Vetenskapliga rapporter 6 (2016).

      • Google Scholar
  23. 23.

    Bandiera, S., Pfeffer, S., Baumert, TF & Zeisel, MB miR-122 - en nyckelfaktor och terapeutiskt mål för leversjukdom. Journal of hepatology 62, 448–457 (2015).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  24. 24.

    Girard, M., Jacquemin, E., Munnich, A., Lyonnet, S. & Henrion-Caude, A. miR-122, ett paradigm för mikroRNA: s roll i levern. Journal of hepatology 48, 648–656 (2008).

      • Artikel
      • Google Scholar
  25. 25.

    Morris Jr, SM Reglering av enzymer i ureacykeln och argininmetabolismen. Årlig granskning av näring 22, 87–105 (2002).

      • Artikel
      • Google Scholar
  26. 26.

    Christoffels, VM et al. Glukokortikoidreceptor, C / EBP, HNF3 och proteinkinas A aktiverar koordinativt glukokortikoidresponsenheten i genen för karbamoylfosfatsyntetas I. Molecular and cellular biology 18, 6305–6315 (1998).

      • Artikel
      • Google Scholar
  27. 27.

    Jeyaraj, D. et al. Klf15 orkestrerar cirkadisk kvävehomeostas. Cellmetabolism 15, 311–323 (2012).

      • Artikel
      • Google Scholar
  28. 28.

    Nakagawa, T., Lomb, DJ, Haigis, MC & Guarente, L. SIRT5 Deacetylates karbamoylfosfatsyntetas 1 och reglerar ureacykeln. Cell 137, 560–570 (2009).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  29. 29.

    Kuo, FC, Hwu, W., Valle, D. & Darnell, JE Kolokalisering i pericentrala hepatocyter hos vuxna möss och likhet i utvecklingsuttrycksmönster för ornitinaminotransferas och glutaminsyntetas-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 88, 9468–9472 (1991).

      • Artikel
      • Google Scholar
  30. 30.

    Figueroa, J. et al. Kvävsmetabolism och tillväxtprestanda hos gyltar som matas med vanlig majs-sojabönmjöl eller lågrått protein, aminosyratillskott. Journal of Animal Science 80, 2911–2919 (2002).

      • Artikel
      • Google Scholar
  31. 31.

    Toledo, J. et al. Effekt av minskningen av råproteinhalten i dieter kompletterade med essentiella aminosyror på prestandan hos smågrisar som väger 6–15 kg. Livestock Science 168, 94–101 (2014).

      • Artikel
      • Google Scholar
  32. 32.

    Pfeiffer, A., Henkel, H., Verstegen, M. & Philipczyk, I. Påverkan av proteinintag på vattenbalansen, flödeshastigheten och uppenbar smältbarhet av näringsämnen vid distala ileum hos växande grisar. Livestock Production Science 44, 179–187 (1995).

      • Artikel
      • Google Scholar
  33. 33.

    Le Bellego, L. & Noblet, J. Prestanda och användning av dietenergi och aminosyror i smågrisar som matas med lågprotein. Livestock Production Science 76, 45–58 (2002).

      • Artikel
      • Google Scholar
  34. 34.

    Seglen, PO Beredning av råttleverceller. Experimental Cell Research 82, 391–398 (1973).

      • Artikel
      • Google Scholar
  35. 35.

    Kohn, R., Dinneen, M. & Russek-Cohen, E. Användning av ureakväve för att förutsäga kväveutsöndring och effektivitet för kväveanvändning i nötkreatur, får, getter, hästar, grisar och råttor. Journal of Animal Science 83, 879–889 (2005).

      • Artikel
      • Google Scholar
  36. 36.

    Waguespack, A. et al. Teknisk anmärkning: Effekt av att bestämma baseline-ureakvävekoncentrationer på efterföljande plasmakoncentrationer av urea i 20 till 50 kg grisar. Journal of Animal Science 89, 4116–4119 (2011).

      • Artikel
      • Google Scholar
  37. 37.

    Weiner, ID, Mitch, WE & Sands, JM Urea och ammoniak metabolism och kontrollen av utsöndring av kväve i njurarna. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 10, 1444–1458 (2015).

      • Artikel
      • Google Scholar
  38. 38.

    Suh, SJ et al. PO-022: Blodurea-kväve till kreatinin-förhållande återspeglar nuvarande varicealblödning hos patienter med levercirros. Liverweek 2015, 92–92 (2015).

      • Google Scholar
  39. 39.

    Lu, Y., Thomson, JM, Wong, HYF, Hammond, SM & Hogan, BL Transgen överuttryck av mikroRNA-miR-17-92-klustret främjar proliferation och hämmar differentiering av lungepitelceller. Utvecklingsbiologi 310, 442–453 (2007).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  40. 40.

    Zhou, Y. et al. MiR-17 ~ 92 ablation försämrar leverregenerering på östrogenberoende sätt. Journal of cellular and molecular medicine (2016).

      • Google Scholar
  41. 41.

    Boggs, RM, Moody, JA, Long, CR, Tsai, KL & Murphy, KE Identifiering, amplifiering och karakterisering av miR-17-92 från hundvävnad. Gen 404, 25–30 (2007).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  42. 42.

    Mu, P. et al. Genetisk dissektion av miR-17 ∼ 92-klustret av mikroRNA i Myc-inducerade B-celllymfom. Gen & utveckling 23, 2806–2811 (2009).

      • Artikel
      • Google Scholar
  43. 43.

    van Almen, GC et al. MicroRNA-18 och microRNA-19 reglerar CTGF- och TSP ‐ 1-uttryck vid åldersrelaterad hjärtsvikt. Åldrande cell 10, 769–779 (2011).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  44. 44.

    Ashraf, U. et al. MicroRNA-19b-3p modulerar japansk encefalit virusmedierad inflammation via målriktning RNF11. Journal of virology 90, 4780–4795 (2016).

      • Artikel
      • Google Scholar
  45. 45.

    Kurokawa, K. et al. Roll av miR-19b och dess mål-mRNA i 5-fluorouracilresistens i tjocktarmscancerceller. Journal of Gastroenterology 47, 883–895 (2012).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  46. 46.

    Ashraf, U. et al. MicroRNA-19b-3p modulerar japansk encefalitvirusmedierad inflammation via målriktning RNF11. Journal of virology, JVI. 02586-02515 (2016).

      • Google Scholar
  47. 47.

    Yang, X., Liu, B., Zhu, W. & Luo, J. SIRT5, fungerar i cellulär metabolism med flera enzymatiska aktiviteter. Science China Life Sciences 58, 912–914 (2015).

      • Artikel
      • Google Scholar
  48. 48.

    Ogura, M. et al. Överuttryck av SIRT5 bekräftar sitt engagemang i deacetylering och aktivering av karbamoylfosfatsyntetas 1. Biokemisk och biofysisk forskningskommunikation 393, 73–78 (2010).

      • Artikel
      • Google Scholar
  49. 49.

    Morris Jr, SM Reglering av enzymer av urea och argininsyntes. Årlig granskning av näring 12, 81–101 (1992).

      • Artikel
      • Google Scholar
  50. 50.

    Tan, M. et al. Lysin glutarylering är en proteintransplantationsmodifiering som regleras av SIRT5. Cellmetabolism 19, 605–617 (2014).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  51. 51.

    Grandori, C. En siRNA-screeningplattform med hög kapacitet för att identifiera MYC-syntetiska dödliga gener som terapeutiska mål för kandidaten. The Myc Gen: Metoder och protokoll. 187–200 (2013).

      • Google Scholar
  52. 52.

    Pekkala, S. et al. Förstå brist på karbamoylfosfatsyntetas I (CPS1) med hjälp av uttrycksstudier och strukturbaserad analys. Human Mutation 31, 801–808 (2010).

      • Artikel
      • Google Scholar
  53. 53.

    Kota, J. et al. Terapeutisk leverans av mikroRNA undertrycker tumörgenes i en murin levercancermodell. Cell 137, 1005–1017 (2009).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  54. 54.

    Kosaka, N., Iguchi, H. & Ochiya, T. Cirkulerande microRNA i kroppsvätska: en ny potentiell biomarkör för cancerdiagnos och prognos. Cancervetenskap 101, 2087–2092 (2010).

      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  55. 55.

    Wu, L. et al. Effekter av att minska dietproteinet på uttrycket av näringsavkännande gener (aminosyratransportörer) hos avvunna smågrisar. J. Zhejiang Univ. Sci. B 16, 496–502, 10.1631/jzus.B1400259 (2015).

      • Artikel
      • Google Scholar
  56. 56.

    Huang, H. et al. Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in abdominal adipose tissues in chickens. Scientific reports 5 (2015).

      • Google Scholar
  57. 57.

    Chen, C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem (2005).

      • Google Scholar
  58. 58.

    Chen, T. et al. Exploration of microRNAs in porcine milk exosomes. BMC genomics 15, 1 (2014).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar
  59. 59.

    Fang, X.-L. et al. Roles of α-linolenic acid on IGF-I secretion and GH/IGF system gene expression in porcine primary hepatocytes. Molecular biology reports 39, 10987–10996 (2012).

      • Artikel
      • Google Scholar
  60. 60.

    Nakagawa, T. et al. Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death. nature 434, 652–658 (2005).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikel
      • Google Scholar

Ladda ner referenser

Tack

The authors thank Tiejun Li research group of the Institute of Subtropical Agriculture, The Chinese Academy of Science for animal feeding experiment and providing piglets liver samples. This work supported by grants from the Natural National Basic Research Program of China (973 Program) [grant number 2013CB127304], the Chinese Transgenic Animal Project [grant number 2014ZX-08009-048B], the National Natural Science Foundation of China [grant numbers 31472163, 31272529], the Guangdong Provincial NSFC key Project of China [grant number S2013120012766], The Chinese National Key Project (2016YFD0500503) and Hainan Provincial research institutes technology development key Project of China [grant number KYYS-2015-02].

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

XML files

  1. 1.

    Kompletterande tabell S1

  2. 2.

    Kompletterande tabell S2

  3. 3.

    Kompletterande tabell S3

  4. 4.

    Supplementary Table S4

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.