Lokaliserad cellstimulering med kväveoxid med användning av en fotoaktiv porös koordinationspolymerplattform | naturkommunikation

Lokaliserad cellstimulering med kväveoxid med användning av en fotoaktiv porös koordinationspolymerplattform | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Oorganisk kemi
  • polymerer

Abstrakt

Funktionella cellulära substrat för lokaliserad cellstimulering med små molekyler ger en möjlighet att kontrollera och övervaka cellsignaleringsnät kemiskt i tid och rum. Trots förbättringar i den kontrollerade leveransen av bioaktiva föreningar förblir emellertid den exakta lokaliseringen av gasformiga biomolekyler på encellsnivån utmanande. Här riktar vi kväveoxid, en avgörande signalmolekyl med platsspecifika och koncentrationsberoende aktiviteter, och vi rapporterar en syntetisk strategi för att utveckla spatiotemporalt kontrollerbara kväveoxid-frisläppande plattformar baserade på fotoaktiva porösa koordinationspolymerer. Genom att organisera molekyler med dålig reaktivitet i polymerstrukturer observerar vi ökad fotoreaktivitet och justerbar frisättning med ljusbestrålning. Vi inbäddar fotoaktiva polymerkristaller i en biokompatibel matris och uppnår exakt kontrollerad kväveoxidavgivning på cellnivå via lokaliserad tvåfoton laseraktivering. Den biologiska relevansen av den exogena kväveoxiden som produceras genom denna strategi framgår av en intracellulär förändring i kalciumkoncentration, medierad av kväveoxid-responsiv plasmamembrankanalproteiner.

Introduktion

Kontrollerad cellstimulering med gasformiga bioaktiva molekyler är tilltalande för att undersöka cellulära mekanismer och signalnätverk och för att utveckla nya terapeutiska metoder 1, 2 . Utformningen av funktionella ställningar eller enheter som kan frisätta molekyler med exakt kontrollerad tidpunkt, dosering och placering förblir utmanande, särskilt för gasformiga molekyler, på grund av hanteringsproblem som uppstår till följd av deras höga reaktivitet och fysiska tillstånd. Kväveoxid (NO) är en av de mest undersökta gasöverföringarna och har en stor roll i många signalhändelser, inklusive spridning och vasodilatation 3, 4 . Dessutom tros mikro-miljömodulering genom endogen NO påverka både fysiologiska tillstånd, såsom synaptisk transmission, och även vävnader och cancerstamceller 5, 6 . En stor ansträngning har nyligen gjorts i utformningen av styrbara NO-frisläppande ställningar; emellertid har den exakta lokaliseringen av NO-leverans på cellnivå ännu inte visats. Vi fokuserar på utveckling av funktionella cellulära substrat som ger NO-frisättning på begäran på flera, väl definierade platser.

Stabila föreningar som kan producera NO genom en fotokemisk reaktion är ett lovande sätt att uppnå temporär kontroll över NO-frisättning, och en mängd NO-fotodonorer har nyligen utvecklats 7, 8, 9 . Ljus tillhandahåller en icke-invasiv trigger, som kan styras mycket med avseende på intensitet, våglängd eller varaktighet utan att påverka några viktiga fysiologiska parametrar. Dessutom kan fotoner enkelt manipuleras och fokuseras för att uppnå exakt lokal stimulering. För att dra full nytta av denna rumsliga egenskap är en koncentration av fotoresponsiva molekyler på definierade platser nödvändig för en konsekvent frisättning av målföreningen. Endast ett fåtal exempel på funktionalisering av en nanopartikelyta 10 eller infångning av fotodonorer i porösa, icke-funktionella ställningar såsom mesoporös kiseldioxid 11 har rapporterats.

Bortsett från andra makromolekylära ställningar 12 representerar porösa koordinationspolymerer (PCP) 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ett distinkt tredimensionellt (3D) ramverk, sammansatt från metalljoner eller kluster och funktionella organiska ligander som byggnadsenheter. Att utforma lämpliga NO-fotodonorligander skulle med fördel göra själva ramverket fotoaktivt, medan belastningen av NO-donatorer i porerna inte längre är nödvändig och potentiellt toxiska fotoaddukter förblir kemiskt bundna till ramverket. Liganderna koncentreras därmed i ett begränsat utrymme som uppvisar hög ljusskördning och NO-reservoarkapacitet. Dessutom kan de håligheter som är inneboende i ramverket erbjuda rumslig segregering mellan givarna och därmed förhindra aggregeringsinducerad kylning av reaktiva upphetsade arter 21, 22 .

I linje med strategin att applicera PCP på det biomedicinska fältet, med förlust på inrymning och efterföljande frisättning av läkemedelsmolekyler från porerna 19, har PCP-baserade NO-frisläppande material utvecklats baserat på reversibla kemiska interaktioner mellan NO och tillgängliga öppna metallplatser inom ramen 23, 24 . Nyligen, genom att utnyttja PCP: s hybridkaraktär, modifierades funktionella ligander post-syntetiskt till N- diazeniumdiolat-donatorer 25, 26 . I vart och ett av dessa exempel frisätter emellertid koordinationsramarna spontant läkemedelsmolekyler eller NO under fysiologiska förhållanden och leveransprocessen kan inte initieras eller avbrytas vid en viss tidpunkt.

Vi föreslår ett nytt tillvägagångssätt för att utveckla NO-leveransplattformar på begäran baserat på fotoaktiva PCP. Montering av nitroinnehållande imidazolatligander, som har låg fotoreaktivitet, i väl definierade kristallina koordinationsramar leder till en drastisk ökning av fotoreaktivitet, och de resulterande materialen kan effektivt frisätta NO, endast vid ljusbestrålning. Användbarheten av dessa ramar för lokaliserad cellulär leverans undersöks genom att utveckla hybridunderlag i vilka mikrokristaller av fotoaktiva PCP är inbäddade i en biokompatibel och gaspermeabel polymermatris för att möjliggöra cellvidhäftning. Två-fotonlaserscanning konfokala mikroskopi-experiment möjliggör kemisk modulering av den cellulära mikromiljön genom den spatiotemporalt kontrollerade frisättningen av NO. Den biologiska relevansen av det levererade NO demonstreras genom en kortvarig ökning av den intracellulära kalciumjonkoncentrationen i lokalt stimulerade celler efter aktivering av det NO-känsliga membranproteinet.

Resultat

Syntes och karaktärisering av NO-ramverk

Utvecklingen av fotoaktiva PCP: er 27, 28, 29, 30 är en av de kraftfulla strategierna för on-demand kontroll av porösa egenskaper. Detta tillvägagångssätt har emellertid aldrig tillämpats för fotoinducerad frisättning av biologiskt relevanta molekyler. Inspirerad av NO-fotodonorer baserade på nitroaromatiska föreningar, som genomgår fotoinducerade nitro-till-nitrit-omarrangemang och efterföljande bindningsklyvning för att ge NO-radikaler 31, 32, valde vi imidazolbaserade ligander, 2-nitroimidazol (2nIm) och 5-metyl-4- nitroimidazol (mnIm), som är lämpliga för konstruktion av robusta och mångsidiga zeolitiska imidazolatramar (ZIF) 33, 34, 35 . Den solvoterma reaktionen av zinknitrat med 2 nIm eller mnIm i dimetylformamid (DMF) gav enkla kristaller av [Zn (2nIm) 2 ] n (NOF-1) eller [Zn (mnIm) 2 ] n (NOF-2), respektive (NOF-1), INGEN ram). Alternativt syntetiserades homogena mikrokristallina pulver av NOF-1 och NOF-2 i en vatten / DMF-blandning vid rumstemperatur i närvaro av en natriumformiatmodulator, som inducerade snabbare kärnbildning genom ligand-deprotonering (kompletterande fig. S1) 36 . Enkristall röntgendiffraktionsmätningar (XRD) mätningar av både NOF-1 och NOF-2 (kompletterande data 1 och 2) avslöjade att imidazolat-liganderna binder zinkjonerna med en tetraedrisk koordinationsgeometri, vilket resulterade i bildandet av en porös 3D-koordination ramar med sodalit (sod) topologi. NOF-1 kristalliseras som ett kubiskt kristallsystem, I -43 m , vilket skapar en perfekt avkortad oktaedrisk sodalitbur (fig. 1a), medan i NOF-2 det trigonala kristallsystemet, R -3 m , uppvisar en långsträckt sodalitbur längs c- axel (fig. 1b). Tolv nitrofunktionaliteter exponeras i varje sodalitbur utan signifikant interaktion med angränsande atomer (kompletterande figur S2). Pulver-XRD-mätningarna, tillsammans med enkristall XRD-mätningarna, bekräftade entydigt att NOF-1 och NOF-2 är isostrukturella för de tidigare rapporterade ZIF-föreningarna, [Co (2nIm) 2 ] n (ref. 37) och [Zn ( bIm)] n (ref. 38), respektive (bIm, bensimidazol; fig. 1c och kompletterande tabeller S1 och S2).

( a, b ) De nitroinnehållande imidazolligandema 2nIm och mnIm reagerades oberoende i närvaro av zinkkationer för att bilda de porösa sodaliten zeolitimidazolatramarna NOF-1 och NOF-2. ( c ) Pulver XRD-topparna för NOF-1 och NOF-2 matchar simuleringsmönstren erhållna från enkristalldiffraktionsdata.

Bild i full storlek

För att karakterisera de optiska egenskaperna hos PCP-ramverket, registrerades de ultraviolet-synliga absorptionsspektra i fast tillstånd för NOF-1, NOF-2, [Co (2nIm) 2 ] n och imidazolliganderna, 2nIm och mnIm (Fig. 2). Båda liganderna uppvisar breda och intensiva absorptionsband i intervallet 260–430 nm, tilldelade övergångarna n - π * och π - π * av de aromatiska nitrofunktionaliteterna. Likheten mellan NOF-1- och 2nIm-absorptionsspektra ( X max = 375 nm) indikerar att ligandens elektroniska miljö förblir väsentligen opåverkad vid bildandet av den kristallina koordinationsramen; Zn (II) -jonerna blir inte elektroniskt involverade i varken marktillståndets beteende eller det exciterade tillståndets förfall av deras koordinerande kvävebaserade ligander 39 . Situationen är annorlunda för [Co (2nIm) 2 ] n , koboltanalogen till NOF-1; ett något utvidgat och badokromt skiftat ultraviolett absorptionsband och nya absorptionsband visas i det synliga området från 450 till 650 nm ( λ max = 550 nm), som kan tilldelas de spindelade d- d- övergångarna ( 4 A 2 (F ) → 4 T2 (P)) för Co (II) -centra i en tetraedrisk koordinationsmiljö 40 . I sin tur presenterar NOF-2 ett rödförskjutet absorptionsmaximum ( X max = 450 nm) med avseende på mnIm ( X max = 410 nm), vilket återspeglar en mer plan orientering av nitrogrupperna i ramverket, vilket leder till en ökning av elektroniska delokalisering i den aromatiska imidazolringen 41 .

( a ) Det karakteristiska absorptionsbandet tilldelat övergången belägen på nitrofunktionaliteten i 2nIm förblir opåverkad vid samordningen av Zn (II) i NOF-1. Som förväntat ger [Co (2nIm) 2 ] n upphov till ytterligare absorptionsband i det synliga området, som är karakteristiska för Co (II) i en tetraedrisk koordinationsmiljö. ( b ) En badokrom förändring i absorptionsbandet observeras i NOF-2, på koordinationen av zink, vilket antyder förbättrad π- konjugation i den nitroaromatiska liganden.

Bild i full storlek

Lättinducerad NO-frisättning

De NO-frisläppande egenskaperna hos NOF-1 och NOF-2 under ljusbestrålning (300-W Xenon-lampa, 7, 5 mW cm-2) undersöktes med användning av NO-selektiv ozon-kemiluminescens-teknik (fig. 3a). Först presenterade 2nIm- och mnIm-liganderna låg fotoreaktivitet och producerade endast begränsade kvantiteter NO efter 3 timmar med långvarig belysning (frisättningsutbyte = 1, 4% och 5, 9% för 2nIm respektive mnIm, baserat på omvandlingen av nitrogrupper till NO). Men när dessa ligander organiserades i kristallina ramverk, uppvisade deras fotoreaktivitet en ökning större än en storleksordning under samma belysningsförhållanden; NOF-1 och NOF-2 släppte 3, 4 och 2, 9 μmol mg −1 av NO, vilket motsvarar ett omvandlingsutbyte på 50% respektive 46%.

( a ) Fotoreaktiviteten för liganderna 2nIm och mnIm förbättrades drastiskt vid bildandet av PCP: er NOF-1 och NOF-2. [Co (2nIm) 2 ] n frigav inte en betydande mängd NO, förmodligen på grund av låg energiliggande övergångar lokaliserade på Co (II) -centret och gav effektiv avaktivering av de upphetsade tillstånden. ( b ) NO-flödet som produceras vid fotoaktiveringen av NOF-1 kan ställas in genom att variera ljuskällans intensitet. När bestrålningen avbryts upphör NO-produktionen direkt och inget läckage observeras i mörkt tillstånd.

Bild i full storlek

Även om värdena är jämförbara, uppvisar NOF-1 en måttligt överlägsen NO-frisläppande effektivitet som för NOF-2 (under en 300- till 600-nm ljusbestrålning), vilket kan förklaras med den förbättrade ljusabsorptionskapaciteten för NOF- 1 (fig. 2) på grund av nitrosubstitutionspositionen på imidazolringen; NOF-1 visar signifikant absorptionsanpassning inom intervallet 400–500 nm.

Absorptionsspektra antyder att ökningen i fotoreaktiviteten hos ramföreningarna över den för deras respektive ligander inte kan tilldelas störningen av ligandernas elektroniska miljö efter Zn (II) -koordination. Liksom med den fastställande luminescenssläckningseffekten som observerats i de flesta fluorescerande organiska föreningar, kan ineffektiviteten med vilken både mnIm och nIm frigör NO från sin aggregerade form vid lätt bestrålning förklaras genom intermolekylära interaktioner (gynnar bildningen av excimrar) som ger effektiva icke -reaktiva deaktiveringsvägar för de upphetsade tillstånden 42 . Däremot, som observerats från deras kristallstrukturer, tillhandahåller de porösa ramarna för NOF-1 och NOF-2 tillräcklig rumslig segregering för att förhindra intermolekylär ligandinteraktion och därmed en upphetsad aktivering 21, 22 . Bristen på NO-produktion av det metylimidazolatbaserade referensmaterialet, [Zn (MeIm) 2 ] n (ZIF-8) 36, stöder den fotokemiska involveringen av nitrogrupperna i bildningen av NO (kompletterande fig. S3). Som bekräftats genom gasskromatografimassaspektrometri-analys (GCMS) var NO den enda kväveoxidart som frisattes efter bestrålningen av NOF-1 (kompletterande fig. S4). Intressant nog misslyckades koboltramen [Co (2nIm) 2 ] n att frigöra betydande mängder NO (2%) jämfört med NOF-1 (fig. 2). Som observerats i det ultravioletta-synliga spektrumet kan ligandfältet och andra lågenergitillstånd som finns på koboltcentret inaktivera de upphetsade tillstånden som är lokaliserade på de funktionella ligandema och undanröja den fotokemiska deaktiveringsvägen. Dessa observationer understryker vikten av valet i metalljon för konstruktionen av effektiva fotoaktiva ramverk.

Vidare erhöll vi en tvådimensionell icke-porös ram, kallad NOF-3, sammansatt från 2nIm-liganden och Zn (II) -jonerna, [Zn (2nIm) (HCOO)] n , genom att modifiera reaktionsbetingelserna. Jämfört med NOF-1 reducerades mängden NO frigjord vid liknande belysning signifikant i det täta ramverket (1, 2 μmol mg −1 efter 3 timmar; Kompletterande figurer S5 – S9). Denna observation stöder vår designstrategi genom vilken effektiva NO-frisläppande egenskaper kan uppnås genom att konstruera lämpliga porösa ramverk från NO fotodonoriska byggstenar.

Förutom hög frisättningseffektivitet är spatiotemporal kontroll över det producerade NO-flödet viktigt för NO-leveranssystem. Vi undersökte belysningen av NOF-1 under variabel ljuskraft (fig. 3b och kompletterande fig. S10). NO släpps omedelbart vid fotoaktivering och NO-flödet kan enkelt justeras av både bestrålningsintensiteten och mängden bestrålat material. Som förväntat avbryts produktionen av NO omedelbart när bestrålningen upphör och dess koncentration sjunker snabbt till spårnivåer. NOF-pulver uppvisade ingen signifikant minskning i kristallinitet eller i NO-frisättning efter 8 månaders lagring under omgivande förhållanden (kompletterande fig. S11). Dessutom bekräftade bristen på signifikant NO-frisättning vid upphettning till 200 ° C, den termiska stabiliteten hos NOF-pulver och att NO produceras uteslutande genom en fotokemisk process (kompletterande fig. S12).

Spatiotemporalt kontrollerad frisättning i cellmedia

För att göra våra föreningar biologiskt tillämpliga, beredde vi NOF-baserade substrat lämpliga för cellkulturer och mikroskopisk avbildning (fig. 4a); NOF-1 mikrokristaller roterades först på en glasbotten. Därefter roterades ett biokompatibelt polydimetylsiloxan (PDMS) skikt ovanpå för att bädda in kristallerna fullständigt i en polymermatris med en reproducerbar tjocklek (20 ± 5 um). Märkbart tycktes kristallfördelningen på glasytan inte förändras av spin-beläggningsprocessen och NOF-kristallerna förblev på den nedre delen av polymerskiktet (fig. 4b och kompletterande fig. S13). Som bekräftats genom bestrålningsexperiment tillät det tunna PDMS-skiktet diffusion av frisatt NO (kompletterande figur S14). Även om den frisläppande kinetiken måttligt bromsade, förblev den totala mängden frisläppt NO jämförbar med den för det icke belagda materialet. Dessutom möjliggjorde fininställningen av ljusintensiteten ett långvarigt och justerbart flöde av NO under 2 timmar (250 pmol mg −1 s −1 under 1 timme, sedan 350 pmol mg −1 s −1 under ytterligare en timme med användning av ökat ljus effekt; tilläggsfigur S15).

( a ) Schematisk illustration av den lokaliserade cellstimuleringsplattformen. De PDMS-inbäddade NOF-1-kristallerna fotoaktiveras lokalt genom två-foton nära infraröd laserbestrålning. Det genererade NO diffunderar genom PDMS-skiktet och reagerar med en intracellulär NO-lysrörsindikator, DAF-FM. ( b ) Tvärsnittsskanningselektronmikroskopibild av NOF-1 / PDMS-underlag. Den vita pilen belyser det homogena PDMS-lagret. NOF-1-kristaller (gul) är lokaliserade på den undre delen av underlaget, vilket säkerställer deras isolering från det cellulära mediet (skalstång, 10 mikrometer). ( c ) Konfokala mikroskopibilder av NOF-1-inbäddade substrat odlade med HEK293-celler införda via DAF-FM. Den selektiva fotoaktiveringen av NOF-1-kristallerna (vita rutor) inducerade ett fluorescerande svar i de omgivande cellerna, vilket markerade den lokala NO-leveransen och upptagningen (skalfält, 100 mikrometer). ( d ) Ytterligare demonstration av spatiotemporal kontroll genom att skriva "NOF" vid aktivering av de valda regionerna (skalfält, 100 μm).

Bild i full storlek

För att leverera NO i en lokaliserad cellulär miljö, använde vi den höga spatiotemporala upplösningen av konfokal laserscanningsmikroskopi, vilket möjliggjorde exakt och lokal fotoaktivering av NOF-1 / PDMS-substraten och efterföljande snabb observation av det cellulära svaret. Eftersom absorptionen av vårt material var väsentligen i det ultravioletta området, använde vi en nästan infraröd två-fotonlaser för att fotoaktivera NOF-1, vilket sålunda reducerade risken för fotografering av cellerna med skadlig ultraviolett bestrålning, medan vi effektivt inducerade NO-frisättningen.

De steriliserade NOF-1 / PDMS belades med Matrigel för att underlätta cellvidhäftning och tillväxt och därefter odlades humana embryonala njurar 293 (HEK293) celler på detta substrat (kompletterande fig. S16). Jämfört med orörda PDMS-substrat inducerade inte närvaron av NOF-1 i polymerskiktet någon anmärkningsvärd cytotoxicitet (kompletterande fig. S17).

Vi förutspådde att den höga rumsliga upplösningen av den tvåfoton konfokala lasern skulle möjliggöra selektiv aktivering av alla kristaller som valts för att möjliggöra lokal NO-leverans till de omgivande cellerna. Innan aktiveringsexperimenten infördes DAF-FM DA (4-amino-5-metylamino-2 ', 7'-difluorofluoresceindiacetat) 43, en cellgenomsläpplig NO-fluorescerande indikator, i HEK293-cellerna. Såsom visas i fig. 4c, d inducerade den snabba fotoaktiveringen av en utvald region innehållande NOF-1-kristaller snabbt en ökning av fluorescensen hos de omgivande HEK293-cellerna.

Inom några sekunder kunde NO genererat från NOF-1 diffundera genom PDMS-skiktet till cellmembranet och reagerade vidare med NO-indikatorn för att bilda en fluorescerande addukt. Dessa resultat tyder tydligt på en hög grad av spatiotemporal kontroll över NO-leveransen med användning av en enkel, reproducerbar och extremt snabb två-foton fotoaktiveringsprocess. Som kontrollexperiment bestrålades [Zn (MeIm) 2 ] n mikrokristaller (saknar nitrofunktioner) och ett område av PDMS-substratet utan några mikrokristaller under identiska fotoaktiveringsförhållanden. Bestrålningen inducerade inte någon ökning av den intracellulära DAF-FM-fluorescensen i de omgivande cellerna (kompletterande fig. S18).

Efter att ha visat snabb NO-leverans i celler med spatiotemporal precision, syftade vi till att undersöka den biologiska relevansen av NO frisatt från fotoaktiv PCP genom att observera ett NO-aktiverat cellulärt svar. Kalciumjoner (Ca 2+ ) har en nyckelroll för att reglera många fysiologiska processer i däggdjursceller, inklusive neurotransmission, muskelkontraktion, spridning, befruktning och apoptos 44 . I detta sammanhang riktade vi oss mot en NO-avkännande transmembrankanalprotein, transient receptorpotentialkanal 5 (TRPC5), som genomgår en konformationell förändring i närvaro av NO, vilket möjliggör ett tillströmning av extracellulär Ca 2+ jon in i cellerna (kompletterande fig S19) 45 .

Vi undersökte om den fotoaktiverade frisättningen av NO från NOF-1 / PDMS-substrat kunde förändra den intracellulära kalciumkoncentrationen, [Ca2 + ] i , i HEK293-celler som är genetiskt modifierade för att uttrycka TRPC5-transmembrankanalen (HEK293-TRPC5). Efter att ha infört en fluorescerande Ca 2+ -indikator (Fluo-4) i cellerna, övervakade vi förändringarna i [Ca 2+ ] i i den nativa HEK293 och de modifierade HEK293-TRPC5-cellerna efter den två-foton fotoaktivering av NOF-1. Såsom visas i fig. 5, även om NO levererat till de kontrollerade nativa HEK293-cellerna inte påverkade [Ca2 + ] i , observerades ett snabbt [Ca2 + ] i- svar i de omgivande HEK293-TRPC5-cellerna vid fotoaktivering av jämförbara mängder av NOF-1-kristaller (kompletterande figurer S20 och S21 och kompletterande filmer 1 och 2). Dessa resultat indikerar att NO frisatt från den fotoaktiverade PCP reagerade med TRPC5-kanalen på cellmembranet och utlöste dess öppning. Observera att fluorescensintensiteten för Fluo-4 i cellerna toppade efter några till flera tiotals sekunder och i de flesta fall minskade mot dess initiala nivå inom några minuter. Denna observation är i överensstämmelse med den övergående naturen hos NO-leveransen som tillhandahålls av NOF-1-substratet med snabb initiering och avslutning av dess NO-frisättning. Som tidigare observerats i NO-övervakningsexperimenten utförda med användning av DAF-FM, bestrålningen av substrat som inkluderade [Zn (MeIm) 2 ] n förändrade inte [Ca 2+ ] i i HEK293- eller HEK293-TRPC5-cellerna (tilläggsfigur S22 ).

( a ) Utsläppsintensitetsprofil för Fluo-4 i HEK293-TRPC5-celler, med redovisning av den intracellulära kalciumjonkoncentrationen, [Ca 2+ ] i , före och efter fotoaktiveringen av NOF-1 (streckad linje indikerar initiering). Kurvorna hänvisar till fluorescensen hos de cirklade cellerna i fig. 5b. ( b ) Konfokal mikroskopibild erhållen efter bestrålningen av NOF-1-kristaller (gul rektangel) som visade ökad fluorescens av Fluo-4 i HEK293-TRPC5-cellerna som omger fotoaktiveringsområdet (skalstång, 100 mikrometer).

Bild i full storlek

Diskussion

Lättinducerad NO-frisättning från makromolekylära enheter eller fast tillståndsmaterial har uppnåtts väsentligen genom att immobilisera NO-fotodonorer på ytan av nanopartiklar 10 eller inrymma dem i värdställningar såsom mesoporös kiseldioxid 11 . Här föreslår vi ett annat tillvägagångssätt där NO-fotodonorerna själva är byggnadsenheterna, organiserade i porösa 3D-koordinationsstrukturer. Den rumsliga segregeringen av de funktionella komponenterna i porösa ramverk, med elektroniskt icke-involverade metallcentrum, möjliggjorde en drastisk ökning av fotoreaktiviteten genom att förhindra kylningen av de reaktiva upphetsade tillstånden. Denna fördelaktiga ansamling av fotoaktiva givare i PCP-arkitekturer leder till effektiva och inställbara ljusinducerade NO-frisläppande och placerar NOF-material (3, 4 μmol mg −1 för NOF-1) över de mest effektiva, kontrollerbara fastställe-NO-leveransställningar (1, 3 μmol mg −1 för nitrosotiol-modifierad kiseldioxid xerogels) 12 . Speciellt undviker deras utmärkta stabilitet under omgivande förhållanden behovet av försiktig hantering eller lagring (som krävs med ljuskänsliga metall-nitrosyler eller termiskt instabila nitrosotioler). Detta arbete antyder en stor potential av PCP för kontrollerbar ljusinducerad frisättning av biologiskt relevanta molekyler.

För att dra fördel av koncentrationen av fotodonorligander i PCP-strukturen beredde vi en ny NO-cellstimuleringsplattform genom att immobilisera NOF-1-mikrokristallerna i ett permeabelt och biokompatibelt polymerskikt, och vi bekräftade att bestrålningen av NOF-1 / PDMS kan generera relevant och långvarigt flöde av gasformigt NO, som lätt diffunderar genom polymerskiktet. En hög grad av spatiotemporal kontroll över NO-tillförseln uppnåddes med användning av ofarlig nästan infraröd tvåfoton laseraktivering och möjliggjorde en exakt lokal stimulering av celler som omger de fotoaktiverade kristallerna. Vi har vidare visat den biologiska relevansen av denna exogena NO-leverans genom att observera det efterföljande cellulära svaret, det vill säga en kortvarig ökning av den intracellulära kalciumkoncentrationen, utlöst av den konformationella förändringen i en NO-känslig transmembrankanal. Bortsett från de potentiella terapeutiska tillämpningarna tror vi att detta tillvägagångssätt kan ge värdefull grundläggande förståelse av de fysiologiska och patofysiologiska rollerna för NO, särskilt funktionerna av NO i hjärnkretsar där den spatiotemporala generationen av stimulerande molekyler i subcellulära domäner önskas.

metoder

Framställning av enstaka kristaller av NOF-1

2-nIm (113 mg, 1, 0 mmol) och Zn (NO 3 ) 2, 6H20 (149 mg, 0, 5 mmol) löstes i DMF (5 ml) i ett förseglat mikrovågsflaska. Lösningen upphettades till 100 ° C via mikrovågsbestrålning under 1 timme. Individuella gula kristaller dök upp på glaset. Utbytet kunde ökas genom att värma blandningen i en 100 ° C ugn under 24 timmar.

Framställning av enstaka kristaller av NOF-2

MnIm (25 mg, 0, 20 mmol) och Zn (NO 3 ) 2, 6H20 (21 mg, 0, 07 mmol) löstes i DMF (3 ml) i ett glasrör. Lösningen upphettades i en 100 ° C elektrisk ugn. Efter 48 timmar uppträdde ljusgula enstaka kristaller på glaset.

Framställning av enstaka kristaller av NOF-3

2-nitroimidazol (23 mg, 0, 20 mmol) och Zn (NO 3 ) 2 6H20 (30 mg, 0, 10 mmol) löstes i en DMF-H20-blandning (v / v 1/1, 1 ml) i ett glasrör och värmdes i ett oljebad vid 100 ° C under 36 timmar för att ge ljusgula plattliknande enskristaller.

Framställning av mikrokristallint NOF-1 och NOF-2-pulver

2-nIm (113 mg, 1, 0 mmol) eller mnIm (127 mg, 1, 0 mmol) och natriumformiat (136 mg, 2, 0 mmol) löstes i en DMF / H20 (v / v, 10/1) blandning (5 ml). En lösning av Zn (NO 3 ) 2 - 6H20 (149 mg, 0, 5 mmol) i H20 (5 ml) tillsattes senare, och reaktionsblandningen omrördes kraftigt vid rumstemperatur. Reaktionsblandningen blev molnig inom några minuter efter tillsats av zinklösningen. Efter 18 timmar centrifugerades fällningen och tvättades med vatten (2 x 15 ml) och DMF (3 x 15 ml) för att ge NOF-1 (68 mg, 27%) som ett ljusgult pulver eller NOF-2 (35 mg 13%) som ett vitt pulver. Ett lösningsmedelsutbytesförfarande utfördes genom att pulvren successivt nedsänktes i färsk metanol (4 x 15 ml under 48 timmar). Föreningarna upphettades sedan under reducerat tryck (80 ° C, 10 mbar) under 18 timmar. Anal. beräknat för NOF-1, C6H4N6O4 Zn = Zn (2nIm) 2 : C, 24, 89; H, 1, 39; N, 29, 03; funnet: C, 24, 77; H, 1, 61; N, 28.08. Anal. beräknat för NOF-2, C11H15N7O5 Zn = Zn (mnIm) 2 (DMF): C, 33, 82; H, 3, 87; N, 25, 10; funnet: C, 33, 27; H, 3, 57; N, 25, 20.

Framställning av mikrokristallint NOF-3-pulver

2-nitroimidazol (113 mg, 1, 00 mmol) och Zn (NO 3 ) 2 6H20 (297 mg, 1, 00 mmol) löstes i DMF (10 ml) genom mikrovågsbestrålning vid 100 ° C under 6 timmar. Den resulterande produkten tvättades med DMF (3 x) för att ge ett blekt gult pulver (200 mg, 90%). Anal. beräknat för C4H3N304Zn = Zn (2nIm) (HCO2): C, 21, 59; H, 1, 36; N, 18, 89; funnet: C, 21, 35; H, 1, 37; N, 18, 67.

Framställning av [Co (2nIm) 2] n (ZIF-65)

2-nitroimidazol (90 mg, 0, 80 mmol) och Co (NO 3 ) 2 6H20 (120 mg, 0, 40 mmol) löstes i DMF (4 ml) i ett glasflaska. Lösningen upphettades i en elektrisk ugn i 6 timmar vid 120 ° C och kyldes sedan till rumstemperatur inom 12 timmar. Blockkristall av [Co (2nIm) 2] n bildad på glasflaskan. Moderluten filtrerades snabbt medan den var varm. Efter några minuter fälldes ett mikrokristallint pulver av ZIF-65 vid rumstemperatur. Det lila pulvret centrifugerades och tvättades med DMF (3 x). Anal. beräknat för C9H13C0N7O6 = Co (2nIm) 2 · (DMF) (H20): C, 28, 89; H 3, 50; N, 26, 20; funnet: C, 28, 81; H, 3, 46; N, 25, 58.

Kristallstrukturbestämning

Enkelkristaller av NOF-1, NOF-2 eller NOF-3 placerades på en MicroLoops med Paraton-N (Hampton Research) och monterades på en Rigaku AFC10 diffraktometer med Rigaku Saturn Kappa CCD-system utrustat med ett MicroMax-007 HF / VariMax roterande -anode röntgengenerator med konfokal monokromatiserad MoKa ( y = 0, 71069 Å) strålning. Kristallstrukturerna löstes med en direkt metod och förfinades genom full-matris minsta kvadraters förfining med användning av SHELXL-97 (kompletterande tabeller S1 – S3 och kompletterande data 1, 2, 3). Alla icke-väteatomer förfinades anisotropiskt med väteatomer som genererades som sfärer som åkte koordinaterna för sina moderatomer. Lösningsmedelsmolekyler avlägsnades med SQUEEZE-procedur.

Röntgendiffraktion av pulver

Mätningar utfördes med en Bruker D8 som arbetade med Cu Ka-strålning ( X = 1, 54 Å) med en strömspänning på 40 kV och en ström på 40 mA.

Fältutsläppsskanningselektronmikroskopi

Observationer utfördes med ett JEOL Model JSM-7001F4 skanningselektronmikroskopisystem som arbetade vid 15, 0 kV. Proverna avsattes på koltejp och belades med osmium före mätning.

Gasskromatografi masspektroskopi

Analyser utfördes med en Shimadzu GCMS-QP5050A med användning av en ZB-1 (polymetylsyloxan) kolonn (60 m x 0, 32 mm och 5, 0 um tjocklek). Kolonnens temperatur var 40 ° C och injektionstemperaturen var 200 ° C med heliumgasbärare (tryck, 80 kPa; flödeshastighet, 2 ml min −1 ). Masspektrometer manövrerades vid 200 ° C med en joniseringsspänning på 70 eV och en joniseringsström på 60 mA.

Lättinducerad NO-frisättning

Metanolsuspensioner av NOF-mikrokristaller (~ 2 mg ml-1) roterades upprepade gånger (2000 rpm) på en 22 x 22 mm täckglas och aktiverades under reducerat tryck under 3 timmar (10 mbar, 85 ° C). Vikten på det avsatta materialet bestämdes korrekt med hjälp av en precisionsskala (typiska vikter, 80–120 μg). Proverna placerades i en skräddarsydd cell och bestrålades med en 300-W Xenon-lampa (Asahi Spectra Max-303 utrustad med en 300 till 600 nm ultraviolett synlig modul och × 1.0 kollimatorlins). Den infallande ljuseffekten vid 365 nm mättes med en Ushio UIT-201 intensitetsmätare. NO-frisättningsmätningarna utfördes med användning av en Sievers NOA 280i kemiluminescens NO-analysator. Instrumentet kalibrerades genom att leda luft genom ett nollfilter (Sievers, <1 ppb NO) och 640 ppb NO gas. Kvävebärarens gasflödeshastighet sattes till 200 ml min-1 med ett celltryck av 8, 5 Torr och ett syretryck av 6, 1 psig.

Substratberedning

A methanolic suspension of NOF-1 was repeatedly spin-cast (2, 000 rpm) onto a glass-bottomed culture dish. The crystals were embedded in a PDMS layer by spin-coating a pre-polymer/curing agent mixture (w/w, 10/1, Sylgard 184) at 3, 000 rpm for 1 min to allow the formation of a reproducible 15- to 20-μm-thick polymer layer (determined via laser scanning confocal microscopy and scanning electron microscopy). The substrate was heated at 80 °C under reduced pressure for an additional 18 h.

Cell culture

The HEK293 and HEK293-TRPC5 cells were cultured in medium consisting of DMEM supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum and 1% (v/v) penicillin/streptomycin in a humidified incubator (37 °C, 5% CO 2 ). The medium was changed every 2–3 days. The cells were passaged with trypsin-EDTA solutions. For the HEK293-TRPC5 cells, 100 μg ml −1 G418 was added to the culture medium for their selection.

Cell culture on an NOF-1/PDMS substrate

Before cell culture, a NOF-1/PDMS substrate was sterilized using 70% ethanol and coated with Matrigel (BD Bioscience, USA; certified for human embryonic stem cell culture) that had been diluted with DMEM/Ham F12 medium to facilitate cell adhesion and growth at 4 °C overnight. The substrate was then rinsed with cell culture medium twice to remove any excess Matrigel. The trypsinized HEK293 or HEK293-TRPC5 cells (1 × 10 5 cells) were introduced onto a substrate and cultured until the experiments were performed. For the HEK293-TRPC5 cells, a culture medium with 100 μg ml −1 G418 was used, but replaced with fresh culture medium without G418 1 day before the experiments.

Fluorescence imaging

A Fluo-4 (molecular probe; 1 μM) or DAF-FM (molecular probe; 5 μM) was introduced into the cells in culture medium 30 min before the imaging experiments. After the incubation period, the cells were quickly rinsed once with PBS and imaged in Tyrode's solution (129 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 30 mM glucose, 25 mM HEPES and 0.01 mM glycine).

Laser scanning confocal microscopy experiments

All fluorescent images used for cell imaging were acquired on an Axio Observer Z1 mounted with a live-cell imaging chamber, a motorized XY-stage, a Plan-Apochromat 20 × /0.80 objective (LSM780, Zeiss) and a Chameleon VISION II (680–1, 080 nm) two-photon laser (Coherent Inc.). The imaging parameters for the Fluo-4 and DAF-FM (excitation at 488 nm, emission at 493/545 nm) were determined based on information provided by the manufacturer.

Apoptosis assay

Cell apoptosis were detected with Annexin V apoptosis detection kit APC (eBioscience). Briefly, cells were washed twice with PBS and collected with 0.25% trypsin in PBS (Invitrogen). Cells were suspended in cell culture medium and placed in 15-ml tubes. After centrifugation at 1, 000 rpm for 5 min, the supernatant was removed. Cells were washed with PBS and binding buffer (eBioscience), and then counted. For staining, cells were diluted to 5 × 106 cells ml −1 in binding buffer. Annexin V labelled with allophycocyanin were added and incubated at room temperature for 15 min. Cells were centrifuged at 1, 000 rpm for 5 min and then washed with binding buffer. Cells were centrifuged and resuspended in binding buffer to which propidium iodide was added. Labelled cells were analysed with a FACS Canto II (BD Biosciences).

Additional information

Accession codes: The X-ray crystallographic coordinates and structure factors for NOF-1, NOF-2 and NOF-3 have been deposited at the Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC) under accession codes 917446 to 917448, respectively. These data can be obtained free of charge from the Cambridge Crystallographic Data Centre via //www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif.

How to cite this article: Diring, S. et al . Localized cell stimulation by nitric oxide using a photoactive porous coordination polymer platform. Nat. Commun. 4:2684 doi: 10.1038/ncomms3684 (2013).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Supplementary Figures and Supplementary Tables.

    Supplementary Figures S1-S22, Supplementary Tables S1-S3

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film 1

    Confocal microscopy of NOF-1/PDMS grown with HEK293-TRPC5 cells, before photoactivation.

  2. 2.

    Kompletterande film 2

    Confocal microscopy of NOF-1/PDMS grown with HEK293-TRPC5 cells, after photoactivation.

Crystallographic information files

  1. 1.

    Supplementary Data 1

    Crystallographic information file for NOF-1.

  2. 2.

    Supplementary Data 2

    Crystallographic information file for NOF-2.

  3. 3.

    Supplementary Data 3

    Crystallographic information file for NOF-3.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.