Ljusinducerade strukturella förändringar och platsen för bildning av o = o bindning i psii fångad av xfel | natur

Ljusinducerade strukturella förändringar och platsen för bildning av o = o bindning i psii fångad av xfel | natur

Anonim

ämnen

  • bioenergetik
  • Nanocrystallography
  • Fotosyntes

Abstrakt

Photosystem II (PSII) är ett enormt membranproteinkomplex som består av 20 olika underenheter med en total molekylmassa på 350 kDa för en monomer. Den katalyserar lättdriven vattenoxidation vid dess katalytiska centrum, det syreutvecklande komplexet (OEC) 1, 2, 3 . Strukturen för PSII har analyserats med 1, 9 Å-upplösning med synkrotronstrålning, vilket avslöjade att OEC är ett Mn 4 CaO 5- kluster organiserat i en asymmetrisk, "förvrängd stol" -form 4 . Denna struktur analyserades ytterligare med femtosekund röntgenfria elektronlaser (XFEL), vilket gav den "strålningsskadefria" 5- strukturen. Mekanismen för bildning av O = O-bindningar förblir emellertid oklar på grund av bristen på mellanstatliga strukturer. Här beskriver vi de strukturella förändringarna i PSII inducerade av två-blixtbelysning vid rumstemperatur med en upplösning av 2, 35 Å med användning av tidsupplösande seriell femtosekundkristallografi med en XFEL tillhandahållen av SPring-8 ångström kompakt frielektronelaser. En isomorf skillnad Fourier-karta mellan de två-blixt och mörkt anpassade tillstånden avslöjade två områden med uppenbara förändringar: runt Q B / icke-hemjärn och Mn 4 CaO 5- klustret. Förändringarna kring Q B / icke-hemjärnregionen återspeglade elektron- och protonöverföringarna inducerade av tvåblixtsbelysningen. I regionen runt OEC försvann en vattenmolekyl som låg 3, 5 Å från Mn 4 CaO 5- klustret från kartan efter två-blixtbelysning. Detta reducerade avståndet mellan en annan vattenmolekyl och syreatomen O4, vilket antydde att protonöverföring också skedde. Det är viktigt att den två-blixt-minus-mörka isomorfa skillnaden Fourier-kartan visade en uppenbar positiv topp runt O5, en unik μ4-oxo-bro som ligger i kvasi-mitten av Mn1 och Mn4 (refs 4, 5). Detta antyder införandet av en ny syreatom (O6) nära O5, vilket ger ett O = O-avstånd på 1, 5 Å mellan dessa två syreatomer. Detta tillhandahåller en mekanism för bildning av O = O-bindningar som överensstämmer med den föreslagna tidigare 6, 7 .

Huvudsaklig

Figur la visar organiseringen av elektronöverföringskedjan för PSII i pseudo-C2-symmetri med två underenheter, D1 och D2. Vattenoxidationsreaktionen fortsätter via S i- static cykel 8 (med i = 0–4), där dioxygen produceras i övergången S3 → (S4) → S 0 (Fig. 1b). De högupplösta strukturerna av PSII som hittills analyserats var för det mörkt stabila S1-tillståndet 4, 5, även om några få studier har erhållit lågupplösande mellanliggande S-tillståndstrukturer genom tidsupplöst seriell femtosekundkristallografi (TR-SFX) 9 10, 11 . Under revideringen av vårt manuskript, Young et al . rapporterade en tvåblixts (2F) -luminerad tillståndstruktur med 2, 25 Å-upplösning där inga synliga förändringar kring O5 observerades 12, även om uppskattningar av upplösningen kan ge något olika värden och därför kan små rörelser av vissa vattenmolekyler ha undkommit detektion. För att uppnå en upplösning tillräckligt hög för att upptäcka små strukturella förändringar inducerade av blixtbelysning samtidigt som övergången till S i- staten kan fortsätta effektivt, bestämde vi den optimala kristallstorleken för PSII med en maximal längd på 100 μm, som avledde upp till en upplösning 2.1 Å med en SPring-8 ångström kompakt frielektronelaser (SACLA) –XFEL-puls (Utvidgad data Fig. 1; Metoder). Vi upplyste de små kristallerna med 2F (Fig. 1; Metoder), vilket gav upphov till en population av 46% S 3 uppskattad med Fourier-transform infraröd (FTIR) skillnadspektroskopi (Utvidgad data Fig. 2; Metoder).

a, Organisation av elektronöverföringskedjan för PSII (röda pilar). b, S i- statcykel för OEC: s vattenoxidationsreaktion. hv, fotoner. c, Experimentell inställning för TR-SFX-experimenten på PSII. d, schematisk representation av tidpunkten för de två blixtbelysningarna och XFEL-puls som används i detta experiment. e, 2m F o - D F c- kartor erhållna från icke-för-blinkade mörktillståndsdata (grå konturerade vid 2 σ ) och mF o- D F c- karta (grön (negativ) och röd (positiv) konturerad vid ± 5 σ ) av ett område runt Chl D1- stället, innan de två vattenmolekylerna lokaliseras i närheten av Chl D1 . f, Stereobild av 2m F o - D F c kartor i en region runt OEC, med grå och cyan konturerade vid 2 σ respektive 8 σ .

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

PSII-mikrokristallerna blandades med en fettmatris och levererades till XFEL-strålen med en mikrovisionsinjektor 13 med hög viskositet, vilket kraftigt reducerade provförbrukningen och gav ett stabilt flöde för enhetlig excitation. För att säkerställa PSII-omsättningen tillsattes kaliumferricyanid till proverna och proverna förblixtes innan mätningarna för synkronisering av PSII till S1-tillståndet och oxidationen av tyrosin YD. Diffraktionsdata samlades också från prover utan pre-flash (icke-pre-flash), och de kommer att diskuteras i fall de skilde sig från de pre-flashed proverna.

Två datamängder samlades in för vart och ett av proverna (med eller utan förblixtar); det ena är från det mörka tillståndet och det andra från 2F-upplysta prover. De två datamängderna för de pre-blinkade proverna analyserades till 2, 35 Å-upplösning, och de för de icke-pre-flashade proverna analyserades till 2, 50 Å-upplösning (Utvidgad datafigur 1, Utvidgade datatabeller 1, 2); alla datamängder hade mycket höga mångfald (se Metoder). Fig. 1e, f visar en del av elektrondensitetskartan från det icke-för-blinkade mörka provet (liknande kartor erhölls med förblixtade prover, och vi fokuserar på resultaten från förblixtade prover här om inte annat anges), där elektronstätheten för orienteringen av aminosyrasidokedjor och vattenmolekyler är tydligt synliga. Vi kunde bygga 1 626 vatten för mörktillståndet och 1 584 vatten för 2F-staten. Manganatomerna och kalciumatomen i OEC utmärktes även i den anomala skillnaden Fourier-karta med toppintensiteter långt utöver ljudnivån på grund av den långa våglängden för den använda XFEL. Bland de 30 topparna i den anomala kartan över 2F-data (Protein Data Bank (PDB) -anslutning 5GTI) identifierades till exempel de 7 bästa topparna med intensiteter över 15, 0 σ som manganatomerna, och de andra 23 topparna identifierades som kalcium (inklusive det nyligen identifierade kalciumstället vid stromalsidan av CP43), klorid- eller svavelatomer (utvidgad data fig. 3, utvidgad datatabell 3), vilket indikerar att mätningen och integrationen av diffraktionen intensiteterna var korrekta. Ändå kunde de interatomära avstånden inom OEC inte förfinas exakt på grund av den begränsade upplösningen. Således användes snäva Mn – O-avståndsbegränsningar härrörande från S1-tillståndet 1, 95 Å-strukturen 5 under förfining av data om mörkt tillstånd och relativt lösa begränsningar tillämpades för 2F-tillståndsdata (Metoder). Därför fokuserar vi på de strukturella förändringarna som induceras av de två blixtarna baserat på den isomorfa skillnaden Fourier-kartan mellan de två datauppsättningarna.

De två datauppsättningarna från de två olika tillstånden var mycket isomorfa med en R- iso på 0, 068 vid 2, 35 Å-upplösning, vilket gjorde det möjligt för oss att identifiera subtila strukturella förändringar baserade på den isomorfa skillnaden Fourier-karta (Utvidgad datatabell 1). Överlagring av de två tillståndstrukturerna gav en genomsnittlig kvadratavvikelse på 0, 10 Å. Motsvarande R- iso- värden mellan de pre-blinkade och icke-pre-flashade proverna var mer än 0, 118 vid 2, 5 Å-upplösning; denna skillnad kan orsakas av de olika satserna av använda prover eller skillnader i efterkristallisationsprocesserna som används.

Två områden med större ljusinducerade strukturella förändringar observerades i den isomorfa skillnaden Fourier-kartan mellan 2F- och mörktillstånd ( F (2F) - F (mörk) skillnadskarta; Fig. 2). Dessa områden är lokaliserade runt QB / icke-hemjärnbindande ställe och OEC (prickade röda cirklar i fig. 2b), och liknande förändringar observerades i båda monomererna av dimeren (ett tredje område med uppenbar skillnad Fourier toppar var hittades i närheten av YD i icke-för-blixtade prover; se nedan och Utvidgad data Fig. 4). Alla dessa områden är relaterade till elektron- och protonöverföring i PSII, vilket antyder effektiv laserpulsexcitering. Topparna detekterades vid 8, 6 för QB-stället och 10, 7 σ för OEC i monomer A och 6, 9 σ för QB-stället och 12, 7 σ för OEC i monomer B. Den största Fourier-skillnadstoppen i de andra områdena av PSII var 4, 4 σ (fig. 2d), vilket indikerar att topparna som observerats i dessa två områden ligger långt över ljudnivån.

a, b, Isomorf skillnad Fourier-karta mellan 2F-tillståndet och det mörka tillståndet i grönt (positivt) och rött (negativt) konturerat vid ± 4, 5 σ med en vy ovanifrån från luminal-sidan ( a ) och en sidovy vinkelrätt mot membranet normalt ( b ). Röda streckade cirklar i b indikerar två regioner i vilka signifikanta skillnadstoppar observerades. c, Stereobild av regionen boxas av svarta streckade linjer i b . d, Histogram för den isomorfa skillnaden Fourier-karta, som visar uppenbara avvikelser av skillnaden Fourier-toppar från Gauss-fördelningen av ljudnivån utöver omkring ± 5 σ . Två pilar anger den största möjliga ljudnivån.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Q B bildar H-bindningar med His215 och Ser264 av D1; den förstnämnda är en ligand för icke-hemjärn. Isoprenoidsvansen från QB är belägen i en hydrofob miljö bildad av Phe211, Met214, Phe255 och Phe265 av D1, D2-pheophytin (Pho D2 ) och lipider (fig. 3a). I de högupplösta Si-tillståndskonstruktionerna 4, 5 uppvisade QB en svag elektrondensitet med en högre B- faktor än QA, möjligen på grund av dess blandade protonationstillstånd. Efter 2F-belysning observerades positiva elektrondensiteter i huvudgruppområdet av QB, medan ett par positiva och negativa tätheter observerades i isoprenoidsvansen i Fourier-skillnadskartan och medeltemperaturfaktorn för kinohuvudgruppen minskade från 116 Å 2 till 91 Å 2 . Denna förändring indikerar en rotation av huvudgruppen runt axeln vertikalt mot bensenringen med cirka 10 ° mot Ser264 och His215 av D1, vilket förkortar avståndet mellan huvudgruppen QB och dessa två rester med 0, 1–0, 2 Å och därför stärker H-banden mellan dem. Dessa rörelser kan förklaras på följande sätt. När vi tillsatte kaliumferricyanid till kristallerna långt före mätningarna föroxiderades icke-hemjärnet till Fe 3+, vilket gjorde det möjligt att acceptera en elektron vid blixtbelysning. Således resulterade 2F-belysningen i en dominerande art av QB -, vilket kommer att göra starkare H-bindningar med Ser264 och His215, vilket resulterade i rotation av huvudgruppen och minskningen av temperaturfaktorn. I förhållande till denna process rörde de hydrofoba resterna Phe211, Phe255, Phe265 och Met214 från D1, som omger isoprenoidsvansen också något för att justera kaviteten på QB-stället (fig. 3a, b). Noterbart är en slingregion som involverar Asn266 – Ser268 av D1, som skyddar hålrummet på QB-stället i den mörka strukturen, rörd med upp till 0, 8 Å vid 2F-belysning, vilket resulterar i den partiella öppningen av QB-stället, vilket kan antyda en rutt för kinonbytet.

a - d, Isomorf skillnad Fourier-kartor mellan 2F-tillståndet och mörktillståndet för de förblixtade proverna i grönt (positivt) och rött (negativt) konturerat vid ± 5, 0 σ . D1- och D2-underenheterna är färgade i gult respektive cyan i S1-tillståndet och grönt i S3-tillståndet. a, b, Strukturella förändringar kring Q B / icke-hem järnbindande plats. c, d, Strukturella förändringar kring OEC. I b - d indikeras rörelser av rester eller grupper med svarta pilar, och infogning eller förskjutning av vatten (syre) indikeras med streckade pilar. e, strukturen av Mn 4 CaO 5- klustret efter 2F-belysning överlagrad med 2m F o - D F c- kartan konturerad vid 10, 1 σ . f, Position för den nyinförda syretomen O6 relativt dess närliggande atomer. Ljusa mörka bollar märkta 1D – 4A representerar Mn-joner; röda och cyan kulor märkta 1–6 representerar syreatomer.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

I närheten av QB observerades en stark negativ topp mellan bikarbonat (BCT) och icke-hemjärn i skillnaden Fourier-kartan. Det fanns en mindre positiv topp på motsatt sida av BCT, vilket gav upphov till en positionsförskjutning av BCT med upp till 0, 5 Å och en ökning av avståndet mellan BCT och icke-hemjärn till 0, 2 Å (Fig. 3b). Dessa förändringar kan vara resultatet av omarrangemang av H-bindningsnätet kring BCT och / eller omorientering av BCT vid 2F-belysning, vilket kan orsakas av involvering av BCT i protonöverföringen för QB-protonering eller minskning av icke-hemjärn. Den möjliga involveringen av BCT i protonöverföringen överensstämmer med iakttagelsen att avlägsnande av BCT resulterade i fördröjning av kinonbytesreaktionen 14 . Till skillnad från Q B- webbplatsen hittades inga stora förändringar på QA-webbplatsen.

Ett antal Fourier-skillnadstoppar hittades i regionen runt OEC (fig. 3c, d); dessa toppar tillåter oss att identifiera följande större strukturella förändringar: (i) Mn4 rörde sig något mot utsidan av kubanen, vilket resulterade i en liten förlängning av dess avstånd från Mn1 med 0, 1–0, 2 Å. (ii) Ca 2+ flyttade också bort från Mn4 något. (iii) En ny, stark positiv topp hittades nära O5, som modellerades som en ny syreatom O6. (iv) Sidokedjan på Glu189 av D1 rörde sig bort från kubanen för att rymma O6. (v) En stark negativ topp hittades på vattenmolekylen W665, vilket indikerar att denna vattenmolekyl förflyttades från denna position efter 2F-belysning. I förhållande till detta rörde vattenmolekylen W567 (som är H bunden till O4 och W665) mot O4, vilket resulterade i ett mindre avstånd mellan W567 och O4. (vi) Medföljande av dessa förändringar uppvisade vissa andra ligandrester också små strukturella förändringar; dessa inkluderar Asp61, Asp170, His332 och Ala344 av D1.

Bland de strukturella förändringarna som beskrivs ovan gav förskjutningen av W665 och utseendet på den nya syreatomen O6 viktiga implikationer för mekanismen för vattenoxidation. På grund av förskjutningen av W665 bröts H-bindningen mellan detta vatten och W567. Detta orsakade rörelsen av W567 mot O4, eftersom de redan är H-bundna (fig. 3c). Medelavståndet mellan W567 och O4 efter 2F-belysning i de två monomererna bestämdes till 2, 32 Å. Detta avstånd är extremt kort, vilket kan antyda att W567 är en hydroxidjon snarare än ett vatten i S3-tillståndet. Detta ökar möjligheten att dessa två syresorter representerar ett tillstånd förberett för den kommande O = O-bindningsbildningen (Fig. 4). I själva verket har studier som använder W-band 17 O-elektron-elektron dubbelresonansdetekterad NMR antydt att antingen O4 eller O5 är utbytbara och sålunda kan fungera som kandidat för substratvattnet 15 . En tidigare teoretisk studie föreslog också att antingen O4 eller O5 kan vara ett av substraten för O = O-bindningsbildning 16 . Men om vi överväger de möjliga experimentfelen i de interatomiska avstånden som bestämts vid den nuvarande upplösningen, kan dessa två syreatomer fortfarande vara anslutna med en H-bindning istället för att bilda ett för-tillstånd för bildning av O = O-bindning. De strukturella förändringar som observerats antyder därför starkt förekomsten av protonöverföring runt denna region, i överensstämmelse med nyligen rapporterade att H-bindningsnätet med början från O4, W567 och W665 (Utvidgad data fig. 5) kan tjäna som en väg för protoner frisatta från OEC under övergången från S 0 till S 1 (ref 17, 18). Rörelsen av W665 som observerats i den aktuella studien kan vara relaterad till denna protonöverföring. Baserat på protonfrisättningsmönstret 1: 0: 1: 2 för S 0 → S 1 → S 2 → S 3 → S 4- övergångar, kan emellertid protonöverföringen från W567 till W665 ske i S 2 → S 3 övergång.

Den prickade cirkeln indikerar förskjutning av vattenmolekylen (W665) bredvid vattnet (W567) H bundet till O4, vilket resulterar i tillvägagångssättet från W567 till O4. Streckade pilar anger möjliga vägar för protonöverföring. De två paret av syreatomer inneslutna av streckade röda linjer representerar de möjliga platserna för O = O-bindningsbildning, varvid den mellan O5 och O6 har ett mycket kortare avstånd och representerar därför det verkliga stället för O = O-bindningsbildning.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

O6-atomen i 2F-upplyst tillstånd är mycket nära O5 (medelavstånd på 1, 5 Å för de två monomererna; fig. 3c – f), vilket gör att de kan bilda en peroxid eller superoxid, till exempel 19 . Detta antyder starkt att detta ställe är reaktionsstället för bildningen av O = O-bindningen (fig. 4), i överensstämmelse med modellen som föreslagits av Siegbahn et al . 6, 7, 20 såväl som resultaten av elektroniska paramagnetiska resonansmätningar 21, 22 och kvantmekanik / molekylmekanik (QM / MM) beräkningar 23 . De återstående strukturförändringarna kan lätt förklaras genom införandet av denna syreatom: förlängningen av avståndet mellan Mn4 och Mn1 beror uppenbarligen på kravet att rymma denna nya syreatom. I synnerhet är rörelsen av Glu189 av D1 bort från kubanen nödvändig för att rymma O6, eftersom det resulterar i ett genomsnittligt avstånd på 2, 70 Å mellan O6 och Glu189. Utan denna rörelse skulle avståndet mellan O6 och Glu189-OE2 vara 2, 30 Å, vilket skulle hindra införandet av syreatomen. Rörelsen görs möjlig genom det unika inslaget av Glu189 som en monodentatligand till OEC, jämfört med alla andra ligander som är bidentata. Vi bör också påpeka att O6 inte nödvändigtvis är en ny vattenmolekyl utanför PSII, eftersom en vattenmolekyl som redan finns i S1-tillståndet kan flytta till denna position 4, 19, 24 .

Förutom de två viktiga förändringsområdena i de förblixtprover som beskrivits ovan, hittades ett tredje område med strukturell förändring runt YD (Tyr160 av D2) i de icke-för-blixtade proverna. YD är delvis H bunden till vattenmolekylen W508, som uppvisar två konformationer, en H-bunden (W508I) och den andra inte H-bunden (W508II) till YD. I Fourier-skillnadskartan över de icke-för-blixtade proverna hittades en negativ topp vid positionen för W508I, vilket tyder på att denna vattenmolekyl förskjuts och H-bindningen med YD bryts (Utvidgad data Fig. 4a – c) . Detta konstaterande antyder att protonöverföring sker runt detta område efter 2F-belysning, i överensstämmelse med de senaste QM / MM-beräkningarna, i vilka den proximala W508I visade sig vara instabil vid oxidation av Y D 25 . Detta antyder i sin tur att 2F-belysning inducerar partiell oxidation av YD i de icke-för-blixtade proverna, antagligen på grund av ineffektiv elektrondonation från Mn 4 CaO 5- klustret i kristallerna. Oxidationen av YD kommer att resultera i protonöverföring från YD till bulklösningsmedlet, bryta H-bindningen mellan YD och W508I och flytta denna vattenmolekyl till distalt läge eller bulklösningsmedel 25, 26 . Således orsakas denna strukturella förändring igen av protonöverföring runt YD.

metoder

Ingen statistisk metod användes för att förutbestämma provstorleken. Experimenten randomiserades inte, och utredarna var inte blinda för tilldelning under experiment och utvärdering av resultatet.

Beredning och kristallisation av fotosystem II

Mycket aktiv PSII isolerades från Thermosynechococcus vulcanus och kristalliserades såsom beskrivits tidigare med små modifieringar 4, 27, 28 . De sista PSII-kärndimererna suspenderades i 20 mM Mes (pH 6, 0), 10 mM NaCl, 3 mM CaCl2, och den slutliga kristallisationsbufferten innehöll 20 mM Mes, 20 mM NaCl, 40 mM MgS04, 10 mM CaCl2, 5 –7% polyetylenglykol 1 450, 0, 85% n-heptyl-p-d-tioglukopyranosid (Dojindo). Inget omkristallisationsförfarande användes. Vi screenade olika storlekar av PSII-kristaller och behandlingsbetingelser efter kristallisation (se nedan) för att framställa lämpliga prover för TR-SFX med XFEL, och fann att för små kristaller inte diffraherade till en hög upplösning, medan större kristaller gav upphov till en lägre effektiviteten av S i- statens övergång inducerad av laser exciteringarna. Den optimala kristallstorleken bestämdes ha en maximal längd på 100 μm, som diffraherades upp till en upplösning av 2, 1 Å med en SACLA – XFEL-puls (Utvidgad data fig. 1) och en slutpopulation av 46% S3-tillstånd vid 2F-belysning (se nedan).

Alla förfaranden för beredning, kristallisation, belysning före blixt och diffraktion genomfördes i mörker eller i mycket svagt grönt ljus. För att framställa en stor mängd mikrostorlekar kristaller utfördes kristallisation i 1, 5 ml mikrosentrifugrör med en provvolym av 50 ul vid en koncentration av 2, 3 mg klorofyll per ml vid 20 ° C. Kristallerna dök upp på några timmar; när kristallstorleken nådde en maximal längd på 100 mikrometer, tillsattes 50 ul av kristallisationsbufferten i vilken koncentrationen av PEG1, 450 ökades med 1-2% från kristallisationsbetingelsen för att stoppa ytterligare tillväxt av kristallerna (se Utökad data Fig. La för en bild av typiska kristaller). Kristallerna tvättades flera gånger med denna buffert för att avlägsna PSII-prover som inte kristalliserades och lagrades över natten.

Före XFEL-experimenten överfördes kristallerna till färsk modervätska innehållande 10 mM kaliumferricyanid som en elektronacceptor för de pre-blinkande proverna och 2 mM kaliumferricyanid för proverna utan pre-flash (icke-pre-flash). Koncentrationen av "kryoskyddsmedel" ökades sedan till 22% glycerol, 9% PEG1, 450 och 9% PEG5 000 MME genom stegvis ersättning av moderlösningen under 1, 5 timmar. Slutligen blandades kristallerna försiktigt med en fettmatris, Super Lube-kärnfettfett (Synco Chemical Co.) och laddades i en mikroekstruderingsinjektor med hög viskositet såsom beskrivits tidigare 13 .

Även om SFX kan utföras vid rumstemperatur och det inte finns något behov att frysa kristallerna, fann vi att denna efterkristallisationsprocedur för att öka den kryo-skyddande koncentrationen var viktig för att erhålla goda diffraherande PSII-kristaller. När förfarandet efter kristallisation inte var tillräckligt gav vissa kristaller upphov till större enhetscelldimensioner av a = 129, 1 Å, b = 228, 8 Å och c = 305, 4 Å (Utvidgad data fig 6a – c). Diffraktionsfläckar från kristallerna med denna större enhetscell visade sig vara lägre än 3, 0 Å upplösning, troligen på grund av lös kristallpackning. Vi fann faktiskt att PSII-dimeren i denna kristallförpackning innehöll två PsbY-underenheter (en PsbY per monomer PSII; Utvidgad data Fig. 6e). Å andra sidan hittades endast en PsbY i PSII-dimer (en monomer innehöll PsbY medan den andra monomeren inte) i strukturen med enhetscelldimensioner av a = 126, 5 Å, b = 231, 2 Å och c = 287, 5 Å analyserad i denna studie (Utvidgad data Fig. 6f). När de två strukturerna överlagrades störde en av de två PsbY-underenheterna i dimerstrukturen med den större kristallpackningen den angränsande monomeren i strukturen med den mindre kristallpackningen (Utvidgad data Fig. 6d – f).

Förbelysning av PSII-kristaller

För att minska den möjliga föroreningen av S0-tillståndet i de mörkanpassade kristallerna belyses PSII-mikrokristaller med en för-blixt före behandlingen efter kristallisation. En alikvot av 100 ul lösning innehållande mikrokristaller av PSII överfördes till en dialysknapp, och förblixten tillhandahölls av en Nd: YAG-laser (Minilite-I, Continuum) vid 532 nm med en diameter av 7 mm (stor tillräckligt för att täcka hela provområdet) vid en energi på ~ 52 mJ cm −2 vid provpositionen. Efter belysningen före förblixten lagrades provet i 1-3 timmar i mörkret medan det överfördes till kryo-skyddande förhållanden. Denna mörka inkubationstid var tillräckligt lång för att tillåta de högre Si-staterna (S2 och S3) att förfalla till S1-tillståndet och därför för att minimera den eventuella föroreningen av S0-tillståndet i de mörkt anpassade kristallerna, om det finns några.

Uppskattning av S 3- populationen i PSII-kristallerna med ATR – FTIR-mätningar

Befolkningen i S3-tillståndet efter 2 blixtar i PSII-mikrokristallerna uppskattades med användning av ljusinducerad FTIR-skillnadspektroskopi kombinerad med den försvagade metoden för total reflektion (ATR). PSII-kristaller i samma buffert som SACLA-experimenten (inklusive 10 mM kaliumferricyanid) laddades på en tre-reflektion av kiselprisma och förseglades sedan med en transparent platta och en silikongummidistans. För mätning av standardspektra laddades PSII-kärnlösningen på kiselprismat och provtemperaturen hölls vid 20 ° C. FTIR-spektra registrerades med en upplösning på 4 cm med användning av en Bruker IFS-66 / S spektrofotometer utrustad med en MCT-detektor. Blixtbelysning tillhandahölls av en Q-omkopplad Nd: YAG-laser (Quanta-Ray INDI-40-10; 532 nm, ~ 7 ns FWHM, ~ 21 mJ cm −2 ). Mättnad av laserblixten bekräftades genom att kontrollera FTIR-signalens effektberoende. Efter två för-blixtar med efterföljande mörk anpassning under 30 min applicerades två blixtar med ett intervall på 10 s på provet och FTIR-skillnadspektra mättes vid varje blixt. Vi bekräftade att de högre S-staterna förfallit mycket lite under detta tio-s-intervall. Denna mätning upprepades 10 gånger för att öka signal-brus-förhållandet för spektra, varvid varje mätning separerades med 30 min mörk inkubation.

FTIR-skillnadsspektra erhållna vid den första (a) och 2: a (b) blinkningarna av PSII-komplex i lösning (svarta linjer) och kristaller (röda linjer) visas i utvidgad data, fig. 2. Spektra normaliserades till intensiteten hos amid II-bandet, vilket återspeglar proteinmängden. Effektiviteten av S-tillståndsövergångarna i PSII-kristallerna uppskattades enligt metoden som tidigare beskrivits 29, 30 . 1: e respektive 2: a-blixtspektra i PSII-kristallen, f 1 ( v ) respektive f 2 ( v ), var utrustade med linjära kombinationer av 1: e och 2: a-blixt-spektra i lösning, F1 ( v ) och F2 ( v ), respektive, som standardspektra: f1 ( v ) = c11F1 ( v ); f 2 ( v ) = c 21 F1 ( v ) + c 22 F2 ( v ), där c11 , c 21 och c 22 är koefficienterna för linjär kombination. De minsta kvadraterna anordnades utfördes i den symmetriska COO-regionen (Utvidgad data Fig. 2b). Koefficienterna beräknades vara c11 = 0, 73 ± 0, 02, c 21 = 0, 27 ± 0, 01 och c 22 = 0, 64 ± 0, 02. Effektiviteten för S1 → S2 och S2 → S 3- övergångar uttrycks som aa c 11 respektive α 0 ( c 22 / c 11 ), och populationen av S3-tillståndet efter den andra blixten beräknas som a 0 2 c 22 . Här är a 0 den genomsnittliga effektiviteten för S-tillståndsövergångar i lösning och det fastställdes att vara 0, 85 ± 0, 01 från oscilleringsmönstret för intensiteten vid 1 400 cm-1 (refs 31, 32) erhållet med 12 på varandra följande blixtar. Baserat på detta beräknas populationen i S3-tillståndet i PSII-mikrokristallerna efter två blixtar vara 0, 46 ± 0, 03.

Diffraktionsexperiment vid SACLA – XFEL

Enskild XFEL-datainsamling utfördes med användning av femtosekund röntgenpulser från SACLA vid BL3. Pulsparametrarna för SACLA var följande: pulsvaraktighet, 2–10 fs; Röntgenenergi, 7 keV; energibandbredd, 0, 5% (FWHM); pulsflöde, ~ 7 × 10 10 fotoner per puls; strålstorlek 3, 0 μm (H) × 3, 0 μm (W); repetitionsfrekvens, 30 Hz.

PSII-kristallerna blandade med fett laddades i en injektor med en munstycksdiameter på 150 mikrometer och placerades i en diffraktionskammare fylld med heliumgas i en installation som kallas Diverse Application Platform for Hard X-ray Diffraktion i SACLA (DAPHNIS) 33 . Flödeshastigheten sattes till 5, 6 μl min −1 (5, 28 mm s −1 ) för 2F-data och 2, 8 μl m −1 (2, 64 mm s −1 ) för mörka data. Diffraktionsmönstren registrerades med användning av en flersports CCD-detektor 34 . Eftersom exciteringslaserpulserna tillhandahölls vid 10 Hz och XFEL-pulserna hade en repetitionshastighet på 30 Hz, följdes varje "pump-on" -bild av två "pump-off" -bilder, som spelades in separat. Pump-on-bilderna användes för att analysera 2F-tillståndsstrukturen, medan diffraktionsdata för mörktillståndet samlades in genom en separat körning.

För att flytta PSII-proverna till S3-staten tillhandahölls två på varandra följande exciteringslaserblink från två separata Nd: YAG-laserkällor (Minilite-I, Continuum) till provet vid t = 0 ms och t = 10 ms (det vill säga, de två blixtarna separerades med 10 ms) för de pre-blinkade proverna, och t = 0 ms och t = 5 ms (separerade med 5 ms) för de icke-för-blinkade proverna. För att säkerställa tillräcklig excitation delades var och en av pumplasrarna i två balkar, och varje stråle från samma pumplaser (pump 1 eller pump 2) fokuserades på samma sampelpunkt med en vinkel på 160 ° i förhållande till varandra ( en nästan motförökande geometri). De två strålarna från pump 1 användes för den första blixtbelysningen, medan de andra två strålarna från pump 2 användes för den andra blixtbelysningen. Pumpens brännviddiameter sattes till 240 μm (topphatt) och dess energi var 42 mJ cm −2 från varje riktning. XFEL-pulserna tillhandahölls 93 μm nedströms från pumpens brännpunkt vid en tidpunkt av 10 ms för de förblixtade proverna och 15 ms för de icke-för-blixtade proverna efter den andra exciteringslaser (den totala tiden efter den första blixten är därför 20 ms i båda fallen) (Fig. 1d, e). Vid flödeshastigheten 5, 6 μl min −1 separerades varje pumpbelysad kristall för pumpa på XFEL-bilderna med 528 μm, vilket var tillräckligt länge för att undvika påverkan från de tidigare excitationslasrarna, som belysningspunkten för den sista lasern. sträcker sig till endast 120 μm från dess belysningscentrum.

Databehandling

Detektorns bakgrund uppskattades genom medelvärden av mörka bilder och subtraherades från diffraktionsmönster. Diffraktionsbilder filtrerades av programmet Cheetah 35, 36 anpassad till SACLA och behandlades av programmet CrystFEL 37 . Parametrarna "min-snr", "trösklar" och "min-gradient" som användes för toppdetektering under punktfyndning var följande: 6, 500 respektive 10 000 för förblixtade mörka data och pre-blinkade 2F-data; 5, 500 och 10 000 för de icke-för-blinkade mörka data; och 5, 500 och 5 000 för 2F-data som inte förblixt. Indexering utfördes med användning av DirAx 38 och Mosflm 39 med toppintegrationsparametrar int-radie = 3, 5, 7, där enhetscellinformationen tillhandahölls för att undvika integration av diffraktionsbilder från kristaller med en längre c- axel. Innan Monte-Carlo-integrationen kasserades de indexerade bilderna med antingen en diffraktion_upplösning_limit lägre än 4, 2 Å eller en num_peaks mindre än 400. Antalet totala insamlade bilder, träffbilderna som filtrerats av Cheetah, de indexerade bilderna och antalet bilder som användes för förfining för förblixtade prover var följande: 408, 071, 76, 047, 64, 985 respektive 27 497 för de mörka data; och 273, 550, 60, 885, 51, 482 och 21, 680 för 2F-data. Motsvarande siffror för de icke-för-blixtade proverna är 462 343, 70 083, 54 966 och 22 341 för de mörka data; och 876 874, 165 463, 63 711 och 23 903 för 2F-data (utökad datatabell 1). Lorentz-faktorn för stillbilder för stillbilder applicerades manuellt på de genomsnittliga intensiteterna hos de förblixtade mörka och 2F-datauppsättningarna 40 . Statistiken för datainsamlingen ges i utvidgade datatabeller 1, 2, som visar att våra data för både mörka och 2F-tillstånd hade en upplösning på 2, 35 Å för de förblixta proverna och 2, 5 Å för de icke-förblixtade proverna, baserat på avskärningsvärdet på cirka 50% för CC 1/2 . Vi bör påpeka att de övergripande mångfalden av alla våra data är mycket höga, och även i skal med högsta upplösning, översteg mångfalden 500. Tillsammans med fakta som: (i) värdena på CC 1/2 i skal med högsta upplösning är rimligt höga; (ii) CC 1/2 minskar gradvis utan några onormala störningar från låg upplösning till skal med högre upplösning; och (iii) värdet av CC 1/2 i skalet med högsta upplösning är rimligt förenligt med värdet på I / σ ( I ) (teoretiskt motsvarar 0, 5 av CC 1/2 2, 0 av I / σ ( I ), och väsentliga avvikelser från dessa värden är indikatorer för systematisk förspänning och / eller problem i felmodellen 41 ), vi anser att kvaliteten på data i den aktuella studien är tillräckligt hög för att vi ska kunna avslöja de små strukturella förändringar som orsakats av blixtbelysningarna .

Strukturell förfining för det förblixtade mörkt anpassade S1-tillståndet, det icke-för-blinkade S1-tillståndet och 2F-tillståndet

De initiala faserna upp till 4 Å-upplösningen erhölls genom molekylersättning med programmet Phaser i CCP4-sviten 42 med användning av 1, 95 Å-upplösningen XFEL-strukturen i PSII (PDB-anslutningskod 4UB6; ref. 5) som sökmodell, där OEC och dess direkta ligander, QB, vatten och glycerolmolekyler utelämnades. Efter några cykler av styv kroppsförfining och efterföljande modifiering av verklig rymdensitet med användning av lösningsmedelsutjämning, histogrammatchning och icke-kristallografisk symmetri i genomsnitt med programmet DM i CCP4-sviten 42 visade den erhållna elektrondensitetskartan funktioner som är tillräckligt tydliga för att vi skulle kunna bygga modellen med självförtroende. Strukturell förfining utfördes med Phenix 43 och modellen modifierades manuellt med COOT 44 . Efter några cykler med begränsad förfining placerades vattenmolekyler i positioner motsvarande vattenmolekylerna i strukturen med högre upplösning där positiva toppar högre än 3, 5 σ på kartan mFo-DFc tydligt identifierades. Sedan, baserat på den resulterande mFo- DFc- kartan, placerades dessutom vattenmolekyler och glycerolmolekyler när positiva toppar högre än 3 σ hittades. Q B, OEC och dess direkta ligandrester modellerades i det sista steget. I vår tidigare XFEL-strukturanalys med 1, 95 Å-upplösning 5 identifierades de exakta positionerna för oxobryggorna på mFo-DFc-kartan genom att utelämna oxo-överbryggade syreatomer; Men när den begränsade förfiningen utfördes på samma sätt i denna studie, konvergerades inte temperaturfaktorerna för mangan och / eller kalciumatomer i OEC, och gav upphov till mycket höga värden på grund av den begränsade upplösningen på 2, 35–2, 5 Å . Således byggde vi OEC-strukturen med hjälp av de geometriska begränsningarna baserade på Mn 4 CaO 5- klustret i 1, 95 Å-upplösningen XFEL-strukturen, och använde begränsade avståndsbegränsningar av σ = 0, 02 Å till Mn – O-bindningarna, Ca – O-bindningarna och Mn –Avstånd från resterande rester under förfining. Inga begränsningar gavs mellan Mn – Mn-avstånd och Mn – Ca-avstånd. De erhållna R- faktor- och R- fria värdena var 0, 133 respektive 0, 171 för det förblinkade mörka tillståndet, 0, 139 och 0, 166 för det icke-för-blinkade mörka tillståndet, och 0, 139 och 0, 177 för det icke-för-blinkade 2F-tillståndet ( Utökad datatabell 1).

Strukturell förfining för det förblinkade 2F-tillståndet

Med tanke på populationen i S 3- tillståndet uppskattat från FTIR-mätningen, förväntas diffraktionsdata erhållna från det 2F-upplysta provet att innehålla de delvis från S2- och S1-tillstånden i PSII, vilket innebär att den resulterande elektrondensiteten skulle vara en blandning av dessa S-tillstånd, inklusive S 3- tillståndet. Även med en högupplöst datauppsättning skulle strukturella förfining av blandade tillstånd (eller blandade strukturer) vara utmanande, särskilt när de blandade strukturerna är mycket lika, som i fallet med PSII. Eftersom vi inte hade strukturen som motsvarar S2-tillståndet, förfinade vi den förblinkade 2F-datauppsättningen som en blandning av S1-tillståndstrukturen och 2F-tillståndsstrukturen 45 . Ockupanterna för S1-strukturen och 2F-tillståndsstrukturen inställdes på 0, 2 respektive 0, 8, baserat på fördelningen av temperaturfaktorerna. Regionen i vilken strukturen förfinades i flera tillstånd valdes på grundval av de stora topparna som observerades i den isomorfa skillnaden Fourier-kartan, och resten förfinades som en enda konformation. Som ett resultat modellerades trettiofem aminosyrarester, fem vattenmolekyler, ett icke-hemjärn, en QB och en OEC per monomer PSII som flera tillstånd. Under den begränsade förfiningen fastställdes koordinaten för S1-tillståndsstrukturen. Relativt lösa geometriska begränsningar för avstånd, vinkel och plan med relativt höga sigma-värden (3–10 gånger större än standardvärden) applicerades på OEC och Q B under förfining. Stora positiva toppar på 10, 3 σ för monomer A och 9, 5 σ för monomer B, som finns på en position med avstånd från 1, 5 Å respektive 2, 3 Å från O5 respektive Mn1D, modellerades som en ny oxo-syre O6 med en beläggning på 0, 4, vilket gav upphov till en temperaturfaktor som liknar dess närliggande atomer. Detta är också i överensstämmelse med populationen av S 3 -staten uppskattad från FTIR-resultaten. De således erhållna R- faktor- och R- fria värdena var 0, 139 respektive 0, 176.

Data tillgänglighet

Strukturfaktorerna och atomkoordinaterna har deponerats i Protein Data Bank (PDB) med anslutningsnummer 5WS5 och 5WS6 för de förblixtna mörka stabila S1-tillstånden och 2F-tillstånden, och 5GTH och 5GTI för de icke-förblinkade mörka -stabilt S1-tillstånd respektive 2F-tillstånd. All annan information som är kopplad till detta manuskript är tillgänglig från författarna på rimlig begäran.

anslutningar

Primära anslutningar

Proteindatabank

  • 5GTH
  • 5GTH 3d-vy
  • 5GTI
  • 5GTI 3d-vy
  • 5WS5
  • 5WS5 3d-vy
  • 5WS6
  • 5WS6 3d-vy

Utökad data

Utökade datasiffror

  1. 1.

    Mikrostora kristaller av PSII, dess diffraktionsbild och kvaliteten på diffraktionsdatasätten.

  2. 2.

    Mätning av S3-statspopulationen efter 2F-belysning med FTIR.

  3. 3.

    Anomala signaler erhållna med XFEL-strålen.

  4. 4.

    Elektrondensitetskartor och strukturella förändringar kring YD mellan de icke-för-blinkade 2F- och mörka datauppsättningarna.

  5. 5.

    Elektrondensitetskartor för O4-vattenkedjan.

  6. 6.

    Fördelning av enhetscellparametrarna och kristallpackning av PSII för de icke-förblixtade proverna.

Utökade datatabeller

  1. 1.

    Statistik över diffraktionsdata och strukturella förfiningar för mörktillstånd och 2F-tillståndsdatauppsättningar av både pre-flashed och icke-pre-flashed prover, samlade på SACLA ( a ) och R iso- värdena mellan de olika datamängderna ( b )

  2. 2.

    Statistik för bearbetning av diffraktionsdata för det förblixtade mörka tillståndet ( a ), för-blinkat 2F-tillstånd ( b ), icke-för-blinkat mörkt tillstånd ( c ) och icke-för-blinkat 2F-tillstånd ( d ) samlas in på SACLA

  3. 3.

    Lista över de 30 anomala topparna som identifierats i datauppsättningar som inte förblixt och mörkt tillstånd och 2F

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.