En laboratorieundersökning av interaktioner mellan denitrifierande anaerob metanoxidation (damo) och anammoxprocesser i anoxiska miljöer | vetenskapliga rapporter

En laboratorieundersökning av interaktioner mellan denitrifierande anaerob metanoxidation (damo) och anammoxprocesser i anoxiska miljöer | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Mikrobiell ekologi
  • Vattenmikrobiologi

Abstrakt

Denna studie undersöker interaktioner mellan nyligen identifierade denitrifierande anaerob metanoxidation (DAMO) och anaerob ammoniumoxidations (anammox) processer i kontrollerade anoxiska laboratoriereaktorer. Två reaktorer ympades med samma inokula innehållande DAMO-organismer Candidatus Methanoperedens nitroreducens och Candidatus Methylomirabilis oxyfera och anammoxorganism Candidatus Kuenenia stuttgartiensis. Båda matades med ammonium och metan, men en matades också med nitrat och den andra med nitrit, vilket gav anoxiska miljöer med olika elektronacceptorer. Efter att det stabila tillståndet uppnåtts på flera månader blev DAMO-processen enbart / primärt ansvarig för nitratreduktion medan anammoxprocessen blev ensam ansvarig för nitritreduktion i båda reaktorerna. 16S rRNA-genamplicon-sekvensering visade att den nitratdrivna DAMO-organismen M. nitroreducens dominerade både den nitratmatade (~ 70%) och den nitritmatade (~ 26%) reaktorerna, medan den nitritdrivna DAMO-organismen M. oxyfera försvann i båda samhällena. Elimineringen av M. oxyfera från båda reaktorerna var troligtvis resultatet av denna organisme som kompeterades av anammoxbakterier för nitrit. K. stuttgartiensis detekterades vid relativt låga nivåer (1-3%) i båda reaktorerna.

Introduktion

Anaerob ammoniumoxidation (anammox) och denitrifierande anaerob metanoxidationsprocesser (DAMO) upptäcktes båda under de senaste decennierna och har viktiga konsekvenser för den globala kvävcykeln. Anammoxprocessen demonstrerades först experimentellt i slutet av 1980-talet i en avloppsreningsverk, där ammonium och nitrit konsumerades för att producera kvävgas och nitrat 1 . Senare befanns anammox vara allestädes närvarande i många naturliga miljöer 2, 3, 4, inklusive anoxiska marina system där det har föreslagits att anammox kan bidra till upp till 50% av kvävgasproduktionen 5 . DAMO-mikroorganismer anrikades först 2006 av Raghoebarsing et al. från sötvattenkanalsediment 6 . Anrikningskulturen dominerades av Candidatus Methylomirabilis oxyfera (~ 80%), medan en grupp av anaerob metanotrofisk (ANME-2d) archaea också detekterades (~ 10%). Med användning av metagenomics, Ettwig et al. avslöjade att M. oxyfera kan reducera nitrit till kväveoxid och sedan uppnår metanoxidation med användning av in-situ producerat syre från nedbrytningen av kväveoxid 7 . Hu et al. rapporterade den framgångsrika anrikningen av en DAMO-kultur som dominerades av ANME-2d som också innehöll M. oxyfera 8 . Baserat på den relativa prestanda hos alla tidigare rapporterade DAMO-kulturer, Hu et al. föreslog att ANME-2d kan spela en viktig roll i nitratreduktion 8 . Med användning av metagenomiska och metatranscriptomiska tillvägagångssätt har Haroon et al. bekräftade att dessa ANME-2d, kallad Candidatus Methanoperedens nitroreducens, kan oxidera metan till koldioxid genom omvänd metanogenes och reducera nitrat till nitrit 9 . Hittills inkluderar de kända DAMO-mikroorganismerna M. nitroreducens , en nitratdriven DAMO archaea och M. oxyfera , en nitritdriven DAMO-bakterie.

Tidigare har det spekulerats att både anammox- och DAMO-processerna troligen uppträder vid det oxiska / anoxiska gränssnittet i sediment eller vattenspelar, där metan och kvävehaltiga föreningar finns tillgängliga 10, 11 . I dessa miljöer kan anammox- och DAMO-organismer samexistera och interagera genom tvärmatning eller underlagskonkurrens. M. nitroreducens kan reducera nitrat till nitrit 9, vilket är ett substrat för anammoxbakterier och även för M. oxyfera . Å andra sidan producerar anammoxbakterier nitrat, ett substrat för M. nitroreducens . Faktum är att en anrikad samodling av anammoxbakterier och M. oxyfera har rapporterats av Luesken et al. 12 i en sekventiell satsreaktor matad med nitrit, ammonium och metan, en samodling av M. nitroreducens och anammox-bakterier anrikades i en bioreaktor matad med nitrat, ammonium och metan 9, medan en samkultur av M. nitroreducens , M Oxyfera och anammox-bakterier anrikades i en membranbiofilmreaktor (MBfR) som också matades med nitrat, ammonium och metan 13 .

I denna studie utför vi en detaljerad undersökning av interaktioner mellan DAMO och anammoxorganismer i kontrollerade anoxiska miljöer. Två reaktorer ympade med samma inokula som innehöll en blandning av anammoxbakterier, M. oxyfera och M. nitroreducens , matades med nitrat respektive nitrit, utöver metan och ammonium, och kördes under 10–12 månader. De mikrobiella gemenskaperna i reaktorerna övervakades med användning av fluorescens in situ- hybridisering (FISH) och 16S rRNA-genamplicon-sekvensering. Metan-, nitrat-, nitrit- och ammoniumförbrukningshastigheterna och kvävgasproduktionshastigheten mättes under experimentet för att övervaka aktiviteterna hos DAMO- och anammox-mikroorganismer. En konceptuell modell som karakteriserar interaktioner mellan DAMO och anammoxorganismer i anoxiska miljöer föreslås baserat på den uppmätta reaktionen och mikrobiella samhällets data.

Resultat

Den nitratmatade reaktorn

Figurerna la och Ib visar de temporära massprofilerna av NO 3 -, NO 2 -, NH4 +, CH4 och N2 i den nitratmatade reaktorn, som användes för att bestämma den veckovisa förbrukningen eller produktionshastigheten för nitrat, nitrit, ammonium, metan och kvävgas med linjär regression. Massan av NO3-, NO2- och NH4 + beräknades genom att multiplicera respektive uppmätta koncentrationer med vätskevolymen. Massan av CH4 och N2 beräknades genom att beakta dessa ämnen både i gas (uppmätt) och vätskefaser (med Henry's Law som tidigare förklarats i Hu et al. 8 ). r anammox (NO 2 - konsumtionsgraden med anammox), r DAMO-nitrit (NO 2 - konsumtionsgraden med DAMO) och r DAMO-nitrat (NO 3 - konsumtionsgraden med DAMO), bestämd utifrån ammonium, nitrit och nitrathastighetsdata (se Metodavsnitt) presenteras i figur 1c. Efter reaktorstart observerades DAMO-aktivitet omedelbart, indikerat av konsumtion av metan och nitrat som visas i figurerna la och Ib och även r DAMO-nitrat- och r DAMO-nitritdata som visas i figur 1c. Däremot fanns det försumbar ammoniumförbrukning under de första 33 dagarna, vilket antydde att det inte fanns någon anammoxaktivitet under denna period (r anammox = 0), och r DAMO-nitrit motsvarade r DAMO-nitrat . En möjlig förklaring av dessa resultat är att under denna period ingen nitrit producerad från nitratreduktion av DAMO-organismer fanns tillgänglig för anammox. Mellan dag 33 och 80 minskade nitritkonsumtionshastigheten med DAMO (r DAMO-nitrit ) långsamt, samtidigt som en ökning av anammoxaktiviteten (r anammox ). Efter dag 80 tycktes det finnas försumbar reduktion av nitrit med DAMO (r DAMO-nitrit = 0). Nitrit producerad av DAMO från nitratreduktion förbrukades fullständigt genom anammoxprocessen.

(a): temporära profiler av metan (

) och kvävgas (

), som representerar den totala mängden av dessa ämnen i både gas- och vätskefaserna; (b): temporära profiler av ammonium (

nitrat (

) och nitrit (

). Koncentrationen av nitrit (

) var nästan noll det mesta av tiden; (c): NO 2 - reduktionsgraden med anammox (

, r anammox ), NO 2 - reduktionshastighet med DAMO (

, r DAMO-nitrit ) och NO 3 - reduktionshastighet med DAMO (

(r, DAMO-nitrat ) beräknat baserat på vätskefasmätningar och reaktionsstökiometri.

Bild i full storlek

Ett stabilt tillstånd uppnåddes efter dag 120, med förbrukningshastigheterna av metan, ammonium och nitrat, och produktionshastigheten för kvävgas var alla stabila. Nitrit upptäcktes inte vid något tillfälle. Den genomsnittliga mängden ammonium- och nitratförbrukning var ungefär 1, 33 mmol NH4 + -N / d respektive 1, 48 mmol NO3 -N / d. Den uppmätta N2-produktionshastigheten var cirka 2, 75 mmol N2-N / d, vilket är mycket nära summan av ammoniumförbrukningshastighet och nitratförbrukningshastighet (2, 81 mmol N2-N / d). Den slutna kvävebalansen indikerar att all ammonium och nitrat omvandlades till kvävgas, och det fanns ingen eller försumbar produktion av andra kvävehaltiga produkter i bioreaktorn. I själva verket bekräftade N20-mätningar på dagarna 53, 115, 199 och 260 med användning av en N20-mikrosensor att N20 inte kunde detekteras i reaktorn (data visas inte), vilket antyder att allt reducerat nitrat och nitrit konverterades till kvävgas.

Elektronproduktionshastigheten från ammoniumoxidation till kvävgas beräknas vara 4, 0 mmol e - / d. Som jämförelse beräknas elektronförbrukningsgraden för reduktion av nitrat till kvävgas till cirka 7, 4 mmol e - / d. Metanförbrukningshastigheten förblev stabil vid ungefär 0, 43 mmol / d, vilket gav elektroner vid 3, 4 mmol e - / d. Detta matchade mycket bra med det extra elektronbehovet genom nitratreduktion (7, 4 mmol e - / d - 4, 0 mmol e - / d = 3, 4 mmol e - / d). Sammantaget antyder kväve- och elektronbalansen att ammonium och nitrat omvandlades till kvävgas och metan oxiderades till koldioxid.

Baserat på reaktionsstökiometri användes 40% av metan som oxiderats av DAMO-organismerna för nitratreduktion till nitrit, och resten för nitritreduktion till kvävgas under de första 33 dagarna. Efter att anammoxprocessen började konsumera all nitrit (dag 80 och framåt) använde DAMO-organismerna alla elektroner som erhållits från den anaeroba oxidationen av metan för att reducera nitrat till nitrit, vilket resulterade i en ökning av nettonitratreduktionshastigheten från 0, 68 till 1, 48 mmol / dag, vilket överensstämmer med reaktionens stökiometri (reaktionerna 1-3 i metoderna). Nitrat är också en biprodukt av anammoxreaktionen (reaktion 1), och således var den uppenbara nitratborttagningshastigheten lägre än den verkliga nitratreduktionshastigheten hos DAMO-organismerna (reaktion 3).

Molekylär karakterisering av mikrobiellt samhälle i den nitratmatade reaktorn genomfördes med användning av FISH och 16S rRNA-genamplikonsekvensering. Ursprungligen var M. nitroreducens , M. oxyfera och anammox-bakterier ( Kueneniaceae ) de dominerande mikroorganismerna i bioreaktorn (figur 2a). Populationen av M. oxyfera minskade efter påbörjandet av anammoxaktiviteten (dag 33) och efter dag 100 kunde inte längre detekteras (figur 2b). I det senare skedet av studien (dag 259) dominerade M. nitroreducens slamgemenskapen (~ 70%; figur 2b). Analys av 16S rRNA-genamplikonsekvenser från bioreaktorsprovet från Day 259 bekräftade att M. nitroreducens omfattade ~ 71% av samhället och M. oxyfera inte längre var närvarande i systemet (detektionsgräns: 0, 02%) (figur 2c). Sekvenseringsresultaten visade också att Kueneniaceae endast utgjorde 0, 6% av samhället, vilket var mycket lägre än den uppskattade andelen från visuell undersökning av FISH-bilder (figur 2b). En möjlig förklaring av denna avvikelse är att 16S-primeruppsättningen (926F och 1392R) som användes för amplikonsekvensering föredraget förstärkta specifika linjer jämfört med andra som tidigare rapporterats 14, 15, därför täckte mindre än den anammoxspecifika AMX-820. Det andra DNA-provet, samlat på dag 360 och därefter sekvenserades, avslöjade en liknande mikrobiell samhällsstruktur, med M. nitroreducens och Kueneniaceae som representerade 78% respektive 0, 7% av samhället, medan M. oxyfera förblev oupptäckta. Även om mikrobiellt samhälle förändrades väsentligt, var VSS-koncentrationen av denna reaktor stabil vid cirka 1, 1 g / L under hela experimentet. Den stabila VSS-koncentrationen för hela experimentet antyder att biomassesyntesen var försumbar, vilket är förenligt med tidigare rapporter.

FISK-bilder av slamprover fixerade på dag 0 (a) och dag 259 (b) efter hybridisering med specifika sonder: Cy3 ARC872 för M. nitroreducens (röd), Cy5 NC1162 för M. oxyfera (blå) och FITC AMX820 för anammoxbakterier ( grön). (c) Mikrobiell gemenskapssammansättning bestämd genom sekvensering i bioreaktorn på dag 259.

Bild i full storlek

Rollen för Phycisphaerales och Chloroflexi (innefattande 11% respektive 6% av samhället på dag 259 och på liknande nivåer i provet Day 360) återstår att klargöra. Phycisphaerales har tidigare hittats i anammoxreaktorer, även om det inte har funnits några tydliga bevis som visar att denna grupp kan utföra anammoxreaktionen. Kloroflexi upptäcktes tidigare i en M. oxyfera- anrikning 16 och en AOM-kultur som reducerade mangan och järn 17 .

Den nitritmatade reaktorn

Efter ympning ökades nitritbelastningshastigheten gradvis från 0, 75 mmol / d till 2, 74 mmol / d på 18 dagar utan nitritansamling i kulturen (figur 3b). Både DAMO- och anammoxaktiviteterna observerades från konsumtion av metan, ammonium och nitrit och produktion av kvävgas (figur 3). För att eliminera nitratet innehållande inokulen och producerat av anammox reducerades nitritbelastningen till 2, 29 mmol / d på dag 57 för att reducera nitratproduktionen med anammox. Förändringarna resulterade i en fullständig konsumtion av nitratet som ackumulerats under dag 83. Nitrat ackumulerade emellertid igen mellan dagarna 118 och 198, med skäl att ytterligare diskuteras. Kväveoxid låg under detektionsnivån (0, 7 μM) under hela studieperioden (data har inte presenterats).

(a) och (b): Förbrukningen av metan (

ammonium (

) och nitrat (

) och produktion av kvävgas (

observerades. Laddningshastigheten för nitrit (-) var konstant från dag 57 och framåt förutom mellan dagarna 230 till 234, där nitrat och nitrit tillsattes manuellt under satsvisa test (data visas inte). (c): NO 2 - reduktionsgraden med anammox (

, r anammox ), NO 2 - reduktionshastighet med DAMO (

, r DAMO-nitrit ) och NO 3 - reduktionshastighet med DAMO (

(r, DAMO-nitrat ) beräknat baserat på vätskefasmätningar och reaktionsstökiometri.

Bild i full storlek

Utvecklingen av r anammox, r DAMO-nitrit och r DAMO-nitrat (beräknat från profiler av nitrat, nitrit och ammonium) är ritade i figur 3c. Mellan dag 18 och 78 var reaktorns prestanda relativt stabil. Nitritkonsumtionshastigheten med anammox var omkring 2, 0 mmol / d, lägre än nitritbelastningshastigheten (2, 74 mmol / d mellan dag 18 och 54 och sedan 2, 29 mmol / d), vilket antydde att DAMO också avlägsnade en del av den tillsatta nitriten. I själva verket beräknades nitritkonsumtionshastigheten med DAMO till att vara ungefär 1, 0 mmol / d, vilket inkluderar inte bara en del av nitrit som tillhandahålls externt och även den som producerades genom nitratreduktion med DAMO.

Efter det (dag 75) minskade nitritförbrukningstakten med DAMO långsamt, samtidigt som en ökning av anammoxaktiviteten. Med en stabil nitratförbrukningshastighet med DAMO minskade metanoxidationshastigheten från ~ 0, 5 till 0, 12 mmol / d. Efter dag 125 verkade det finnas en försumbar reduktion av nitrit med DAMO med anammox som avlägsnade all tillgänglig nitrit. Observera att anammox inte bara konsumerade all tillsatt nitrit utan också den nitrit som produceras av M. nitroreducens genom reduktion av nitrat, vilket är en biprodukt av anammoxaktiviteten. Följaktligen var r anammox högre än nitritbelastningshastigheten. Den ökade anammoxaktiviteten producerade nitrat med en hastighet som överstiger nitratförbrukningshastigheten med DAMO (r DAMO-nitrat ) från dag 118 till dag 160, vilket resulterade i nitratansamling under denna period. Därefter ökade nitratreduktionshastigheten för DAMO-organismerna (figur 3c) och det ackumulerade nitratet avlägsnades långsamt (figur 3b). Från dag 216 och framåt nåddes ett stadigt tillstånd. Anammox konsumerade all nitrit som levererades externt och producerades av DAMO, medan DAMO-organismerna levde på nitratet producerat av anammoxbakterierna.

Mikrobiologisk analys med FISH avslöjade att mikrobiellt samhälle förändrades väsentligt under studien (figur 4). NP10-bakteriepopulationen minskade långsamt efter ökningen av anammoxaktiviteten och blev odetekterbar från dag 219. Samtidigt förblev M. nitroreducens på en låg men stabil nivå. Klustren av M. nitroreducens blev större med tiden och omringades av anammoxbakterierna i slutet av studien (figur 4a och 4b), vilket tyder på synergistiska interaktioner mellan de två populationerna. Analys av 16S rRNA-genamplikonsekvenser från provet Day 259 visade att mikrobiellt samhälle bestod av medlemmar som liknar den nitratmatade reaktorn, men med högre mångfald. I överensstämmelse med FISH-resultaten var M. oxyfera inte längre närvarande i systemet (figur 4c). M. nitroreducens utgjorde ~ 26% av samhället, vilket tyder på dess möjliga roll i att avlägsna nitrat producerat genom anammoxreaktion. Kueneniaceae omfattade cirka 2, 6% av samhället men FISK med användning av Kuenenia- specifik AMX-820-sond uppvisade en högre andel av samhället märktes med sonden (fig. 4b). Som nämnts tidigare kan denna skillnad ha uppstått från grundförspänning. I likhet med den nitratmatade reaktorn befanns Phycisphaerales , Chloroflexi och Proteobacteria också vara närvarande i betydande nivåer som omfattade 12%, 15% och 21% av samhället. Det andra DNA-provet, samlat på dag 360, visade en liknande mikrobiell samhällsstruktur (data visas inte). VSS-koncentrationen av denna reaktor var stabil vid cirka 1, 1 g / L under hela studien.

FISK-bilder av slamprover fixerade på dag 0 (a) och 259 (b) efter hybridisering med specifika sonder: Cy3 ARC872 för M. nitroreducens (röd), Cy5 NC1162 för M. oxyfera (blå) och FITC AMX820 för anammoxbakterier (grön) ). (c): Mikrobiell gemenskapssammansättning bestämd genom sekvensering i den nitritmatade reaktorn på dag 259.

Bild i full storlek

Diskussion

Processdata antyder starkt att DAMO- och anammoxprocesserna i båda reaktorerna var gemensamt ansvariga för kväve- och kolomvandlingarna. Oberoende av formerna av oxiderat kväve (nitrat kontra nitrit) i fodret, var M. nitroreducens ansvarig för nitratreduktion till nitrit och anammoxprocessen som var ansvarig för nitritreduktion, när stabila tillstånd uppnåddes. Detta fynd stöds av mikrobiella samhällsdata, som visade att M. nitroreducens , som kunde reducera nitrat till nitrit med metan som elektrondonator 9, var rikligt i båda reaktorerna, medan M. oxyfera , som kunde reducera nitrit till kvävgas med metan som elektrondonator 7, var inte närvarande i de statiska samhällena. Kueneniaceae , en känd anammoxbakterie, hittades också i båda samhällena trots dess relativt låga överflöd som antydde en eventuell närvaro av andra anammoxorganismer.

I ympningen för båda reaktorerna var M. oxyfera närvarande i betydande överflöd (uppskattat till ~ 20% av samhället). Vi antar att M. oxyfera försvann från båda kulturerna eftersom det var uttömt av anammoxbakterier och M. nitroreducens . Nitrit är ett nyckelsubstrat för både M. oxyfera och anammox-bakterier. Även om både M. oxyfera- och anammox-bakterier har låg affinitetskonstant för nitrit 5, 18, var nitritkonsumtionsgraden rapporterade i litteraturen av anammox-bakterier mycket högre än M. oxyfera . Tidigare studier har också visat att DAMO-kulturer innehållande M. nitroreducens kan reducera nitrat i mycket högre hastigheter jämfört med DAMO-kulturer som endast innehåller M. oxyfera , vilket antyder antingen att M. oxyfera inte kan reducera nitrat 7, eller att dess nitratreduktionshastighet sannolikt vara mycket lägre än för M. nitroreducens .

Baserat på resultaten från aktuell studie och information tillgänglig i litteratur har vi föreslagit en hypotetisk konceptuell modell för att visa de potentiella interaktionerna mellan DAMO och anammox-mikroorganismer i anoxiska miljöer rik på ammonium och metan med antingen nitrat eller nitrit externt tillhandahållet (figur 5) . I diagrammet inkluderade vi fortfarande DAMO-processen från nitrit till kvävgas som en möjlighet eftersom den inträffade under övergående perioder i båda reaktorerna. Det bör också betonas att vår förståelse av tillväxtkinetiken för DAMO archaea och bakterier och miljöfaktorerna som reglerar deras konkurrens för närvarande är mycket begränsad, och därför kan det inte uteslutas att M. oxyfera kan utgöra en viktig medlem av i miljön som skiljer sig från de som används i detta arbete. En ny studie visade faktiskt att M. oxyfera samexisterar med M. nitroreducens och anammox-bakterier i en MBfR-reaktor, där ammonium / nitrat och metan överfördes till biofilmen genom motdiffusion 13 .

Materialflöde och elektronflöde visas med solida respektive streckade linjer.

Bild i full storlek

Resultaten av denna studie kan ha viktiga konsekvenser för kväve- och kolomvandlingen i naturliga miljöer. I vissa naturliga miljöer, som vattenvägar som får näringsrika avrånningar från gårdar, kan nitrat och ammonium i vattendraget komma i kontakt med metan som produceras i sediment. Eftersom nitrat är den primära oxiderade kvävehaltiga föreningen, kan M. nitroreducens vara en av de denitrifierande mikroorganismerna som reducerar nitrat till nitrit och blir partner till anammoxbakterier. Samarbetet mellan anammox- och DAMO-processer kan väsentligt påverka kol- och kväveomvandlingen i dessa miljöer. Isotopisk spårningsmetod skulle krävas för framtida studier av denna interaktion i naturliga system på grund av de förväntade extremt låga reaktionsgraden.

Samodlingen av M. nitroreducens och anammox-bakterier kan potentiellt användas för avloppsrening. Anammoxprocessen används redan i full skala för kväveborttagning från avloppsvatten 1 . Emellertid produceras nitrat som en biprodukt, vilket kräver nedströmsbehandling för att åstadkomma hela denitrifikationsprocessen. I vissa andra fall kan nitrat finnas i fodret tillsammans med ammonium och nitrit. Denna studie visar att DAMO- och anammox-processerna kan kombineras i en reaktor för att samtidigt avlägsna nitrat och ammonium, med metan som en ytterligare elektrondonator. Detta är särskilt attraktivt eftersom metan kan produceras i en avloppsreningsverk genom anaerobt avloppsvatten eller slamfördjupning 19 . Möjligheten att använda en samodling av DAMO och anammoxorganismer för avloppsrening har undersökts nyligen 14 . Den samkultur som användes i den studien bestod emellertid av M. oxyfera och anammox-bakterier, som inte tar bort nitrat, och i själva verket kanske inte är stabilt om ammoniumfoder är över 14 . Samodlingen av M. nitroreducens och anammox-bakterier skulle vara en mer lämplig kandidat för denna process. En viktig utmaning för framtida forskning är att förbättra reaktionshastigheterna för att möta kravet på industriell tillämpning. Denitrifikationshastigheten erhållen här är cirka 20 mgN / gVSS.d, vilket är en storleksordning mindre än denitrifikationshastigheten som kan uppnås med metanol 20 . En annan utmaning för framtida forskning är att odla biomassan på kort tid, eftersom båda dessa mikroorganismer är välkända långsamma odlare.

Resultaten av den aktuella studien visade att vår förståelse av DAMO-organismer och deras potentiella interaktioner med andra mikrobiella grupper långt ifrån är fullständig. Det syntrofiska förhållandet mellan DAMO och anammox-mikroorganismer bör undersökas ytterligare för att förstå dess konsekvenser för kväve- och kolcykler i naturliga miljöer. De potentiella interaktionerna mellan DAMO-organismer och andra mikrobiella grupper, såsom nitrit / nitratproducenter / reduktionsmedel, återstår också att undersöka.

metoder

inokulat

Ett anrikningskulturprov på 800 ml togs från en laboratorieskala anammox / DAMO-reaktor, som matades med ammonium, nitrit och metan och kördes vid 35 ° C. Vid tidpunkten för provtagningen var nitritbelastningshastigheten cirka 1, 4 mmol / Ld, och VSS-koncentrationen var ~ 1, 2 g VSS / L. FISH-analys visade att cirka 40% av den mikrobiella populationen var anammoxbakterier ( Kueneniaceae ) och ~ 20% var bakterier relaterade till M. oxyfera . Inga archaea upptäcktes i detta slam. Ytterligare 800 ml slamprov togs från en andra bioreaktor matad med nitrat och metan 8 . Vid tidpunkten för provtagningen var nitratförbrukningsgraden ~ 1, 1 mmol / Ld och VSS-koncentrationen var ~ 1, 0 g VSS / L. FISH-analys visade att ~ 60% av de mikrobiella populationerna i denna kultur var archaea relaterade till M. nitroreducens , och 30% var bakterier relaterade till M. oxyfera . De specifika sonderna som används för att rikta mikroorganismerna ovan kan hittas i FISH- avsnittet.

Reaktordrift

Inokulumet på 1, 6 1, erhållet genom blandning av de två slamproven, fördelades lika till två 2 L-glasreaktorer, var och en fylldes upp till 1, 6 1 arbetsvolym med 800 ml mineralmedelslösning framställd enligt Raghoebarsing et al 6 . Reaktorerna var utrustade med vattenmantel och arbetade vid 35 ° C och blandades kontinuerligt med magnetiska blandare vid 200 rpm. För att tillhandahålla metan som kol- och energikällor användes en blandad gas (90% CH4, 5% N2 och 5% CO2) för att spola 0, 4 L huvudutrymme för varje reaktor regelbundet för att bibehålla metanpartietrycket mellan 0, 5 atm och 1 atm. Helium (~ 80 ml) injicerades i huvudområdet efter varje spolning för att öka trycket till cirka 1, 2 atm och dess partiella tryck övervakades för att bekräfta att inget gasläckage inträffade.

För den nitratmatade reaktorn injicerades nitrat- och ammoniumförrådslösningar (nitrat vid 5, 7 M och ammonium vid 3, 4 M) varje vecka för att nå 15 mmol / L efter varje injektion. Dessa stamlösningar framställdes med avgasat milli-Q-vatten och lagrades i förseglade flaskor med kväveatmosfär.

För den nitritmatade reaktorn matades 1 ml koncentrerad nitrit halvkontinuerligt för att undvika ackumulering av nitrit och därmed dess potentiella toxiska effekter 21, med varierande dagliga belastningshastigheter som ska detaljeras i resultatavsnittet. Matningspumpen var påslagen i 1 min var 72: e minut, vilket gav nitritmatningen i 20 pulser varje dag. Ammonium tillsattes varje vecka genom injektion av en koncentrerad stamlösning (3, 4 M) för att uppnå en ammoniumkoncentration av ~ 15 mmol / L efter varje injektion.

Var fjärde vecka fick kulturerna sedimentera i 20 minuter och 400 ml supernatant från varje reaktor byttes ut med färskt medium. pH i reaktorerna övervakades med pH-prober (TPS, Australien) och kontrollerades mellan 7, 0 och 7, 5 genom manuell tillsats av en 1 M HCl-lösning. Bioreaktorerna drevs under ett år, under vilka mikrobiella samhällen undersöktes med FISH och sekvensering, och deras aktiviteter kvantifierades genom att mäta metan, nitrat, nitrit och ammoniumförbrukning och kvävgasproduktion, vilket kommer att beskrivas ytterligare nedan.

Reaktorövervakning

Nitrat-, nitrit- och VSS-analys

Flytande prover togs från varje reaktor varje arbetsdag för att övervaka biotransformationsprocesserna i reaktorn. Flytande prover (1 ml) filtrerades med 0, 22 um filter för att få 0, 5 ml filtrat. Ammoniumkoncentrationerna (NH4 + ), nitrat (NO 3 - ) och nitrit (NO 2 - ) analyserades med användning av en Lachat QuickChem8000 Flow Injection Analyzer (Lachat Instrument, Milwaukee, WI). Ammonium (NH4 + ), nitrat (NO 3 - ) och nitrit (NO 2 - ) konsumtionshastigheter, betecknade rNH4 +, rNO 2 -, rNO 3 -, bestämdes från respektive koncentrationsprofil genom linjär regression. Vätskeprover av 5-10 ml togs också från reaktorn varje månad för att mäta VSS-koncentrationen i varje reaktor enligt APHA-standardmetoderna.

Gasformiga kväveföreningar och metananalys

Regelbundet (tisdag – fredag) togs gasprover av 0, 5 ml ut med en gastät glasinspruta (Sge, Australien) genom gummisepta ovanpå reaktorerna. Kvävegas, metan och helium mättes med en gaskromatograf (Shimazu, Japan) utrustad med en Porapak Q-kolonn och en termisk konduktivitetsdetektor som arbetade vid 160 ° C, såsom tidigare beskrivits 8 . N20 i vätskefasen mättes med en N20-mikrosensor (N2025, Unisense A / S, Aarhus, Danmark) med en detektionsgräns på 0, 7 μM. Metanförbrukningen och kvävgasproduktionshastigheterna, betecknade rCH4 respektive rN2, bestämdes från de uppmätta metan- och kvävgasprofilerna genom linjär regression.

Definition av reaktioner och beräkning av reaktionshastigheter

Följande reaktioner används för att beskriva kol- och kväveomvandlingen i reaktorerna:

(nitritreduktion med anammox, reaktionshastighet r anammox )

(nitritreduktion med DAMO, reaktionshastighet r DAMO-nitrit )

(nitratreduktion med DAMO, reaktionshastighet r DAMO-nitrat )

Reaktionshastigheter r anammox, r DAMO-nitrit, r DAMO-nitrat beräknades utifrån den uppmätta ammoniumförbrukningshastigheten (rNH4 + ), nitritansamlingshastigheten (rNO 2 - ) och nitratförbrukningshastigheten (rNO 3 - ) genom att lösa följande massbalansekvationer:

r anammox, r DAMO-nitrit och r DAMO-nitrat bestämd från ekv. 4–6 tillät därefter beräkningen av den "förutsagda" kvävgasproduktionshastigheten (rN 2- p) och metanförbrukningstakten (rCH 4- p) (ekv. 7–8), som sedan jämfördes med den uppmätta rN 2 och rCH 4 värden för verifieringsändamål.

Mikrobiell communityövervakning

FISK

Varje månad proverades biomassa från kulturen, fixades, lagrades och hybridiserades för FISH som beskrivits tidigare 8 . Följande sonder hybridiserades till bioreaktorprover med användning av 40% formamid: S - * - NC10-1162-aA-18 (5'- GCCTTCCTCCAGCTTGACGCTG-3 ') för NC10-bakterier 8, S - * - Amx-820-aA-18 ( 5′-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3 for) för anammoxbakterier 22, S - * - Darc-872-aA-18 (5′-GGCTCCACCCGTTGTAGT-3 ′) för DAMO archaea 6, den allmänna bakteriella sonden EUBmix och den allmänna archaeal-sonden SD- arch-0915-aA-20. Procentsatser av fylogenetiska grupper kvantifierades baserat på 30 bilder tagna från varje brunn med DAIME-programvara som beskrivits tidigare 21 .

Nukleinsyraekstraktion och 16S rRNA-genamplicon-sekvensering

Genomiskt DNA extraherades från reaktorssamhällets prover med hjälp av FastDNA SPIN for Soil kit (MP Biomedicals, USA) och Fastprep-pärlemaskiner (Bio101, USA) enligt tillverkarens protokoll. 16S rRNA-genen amplifierades och sekvenserades såsom tidigare beskrivits 9 . I korthet användes oligonukleotidprimrar med bred specificitet 926F (5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3 ') och 1392R (5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3') innehållande multiplexidentifierare och LibL-adaptersekvenser (ej visade) för att generera amplikoner. Amplikonerna sekvenseras på en Genome Sequencer FLX Titanium sequencer (Roche, USA).

Sekvensanalys

Pyrotagsekvenser behandlades och analyserades med användning av Pyrotagger, som beskrivs av Kunin och Hugenholtz 23 . I korthet avlägsnades streckkoderna och amplikon-primersekvenserna och ändarna på läsningarna trimmades med LUCY 9 baserat på deras kvalitetsvärden. Avläsningarna grupperades med 97% nukleotidlikhet med användning av Markov Cluster-algoritmen. Klusterrepresentativa sekvenser tilldelades taxonomiskt genom jämförelse med Greengenes-databasen med användning av blastn 24 . Potentiella chimära sekvenser identifierade med användning av Bellerophon 14 utesluts från ytterligare analys. Pyrotagger genererade en OTU-tabell som visar det relativa överflödet och taxonomiska uppdrag.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.