Kinesin-14 och kinesin-5 reglerar antagonistiskt mikrotubulkärnbildning genom y-turc i jäst och humana celler | naturkommunikation

Kinesin-14 och kinesin-5 reglerar antagonistiskt mikrotubulkärnbildning genom y-turc i jäst och humana celler | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Bröstcancer
  • Cell signalering
  • mikrotubuli
  • mitos

Abstrakt

Bipolär spindelmontering är en kritisk kontrollpunkt för initiering av mitos genom kärnbildning och organisering av spindelmikrotubulor och regleras av kinesinliknande proteiner. I fissionjäst binder kinesin-14 Pkl1 y-tubulinringkomplexet (y-TuRC) mikrotubulorganiseringscentrum vid spindelpolerna och kan ändra dess struktur och funktion. Här visar vi att kinesin-14 blockerar mikrotubulär kärnbildning i jäst och avslöjar att denna hämning motverkas av kinesin-5-proteinet Cut7. Vidare demonstrerar vi att Cut7-bindning till y-TuRC och Cut7 BimC-domänen båda krävs för hämning av Pkll. Vi visar också att en jäst-kinesin-14-peptid blockerar mikrotubulär kärnbildning i två humana bröstcancercellinjer, vilket antyder att denna mekanism är evolutionsbesparad. Sammanfattningsvis, med hjälp av genetiska, biokemiska och cellbiologiska tillvägagångssätt, avslöjar vi antagonistisk kontroll av mikrotubulär kärnbildning vid y-TuRC av två kinesinliknande proteiner, vilket kan utgöra ett attraktivt antimitotiskt mål för cancerterapier.

Introduktion

Mikrotubulär cytoskelett är ett självmonterande nätverk som ligger till grund för specialiserade, ofta polariserade, cellulära funktioner i eukaryoter. Kunskap om dess mekanismer är grundläggande för att förstå normal utveckling och sjukdomar och förväntas hjälpa till ny teknik genom biomimik. Den mikrotubulbaserade mitotiska spindelapparaten är kanske den bäst studerade självmonteringsplattformen 1, 2 och ett primärt mål för cancerterapi 3 . Mikrotubulörorganiseringscentra för spindelpolar (MTOC) använder en y-tubulin-mall inom ett ringkomplex (y-tubulin ringkomplex, y-TuRC) för att orkestrera tillsats av a- / p-tubulin heterodimera mikrotubulära byggstenar i 25 nm polariserade mikrotubulor 4 5, 6, 7, 8, 9 . Konserverade proteinstrukturer hos y-TuRC MTOC har identifierats genom kristallografistudier från flera modellorganismer och inkluderar a- / ß-tubulin 10, y-tubulin 11, GCP4 (ref. 12) och det l-tubulin lilla komplexet (y -TuSC) cryo-EM-struktur 13 . Konserverade strukturella funktioner stöds dessutom av korsartanalys 14, 15 . Fortfarande okänt är hur dynamisk kontroll över MTOC-funktioner för mikrotubulär kärnbildning och organisation uppnås. Fissionjäst Schizosaccharomyces pombe tillhandahåller en ideal eukaryotisk plattform för att adressera konserverade MTOC-mekanismer 14, 15, 16, 17 .

Koordinering av spindelmikrotubulor till en bipolär grupp kräver kinesinliknande proteiner (Klps), men Klp-mitotiska funktioner är inte begränsade till interaktioner enbart på mikrotubuli. Studier av den funktionellt olika kinesin-14 Klp-familjen över eukaryoter har visat en förmåga av vissa medlemmar att påverka mikrotubulantal och organisation vid spindelpolerna 18, 19, 20, 21 . I fissionjäst interagerar kinesin-14 Pkl1 direkt med y-TuRC MTOC för att förändra dess sammansättning och funktion 17, 22, 23 . Bevarande av kinesin-14 y-TuRC-regleringsmekanismen förväntas från jäst till människa, eftersom humant kinesin-14 HSET ersätter fissionjästkinesin-14 Pkll (ref. 23) och alla humana y-TuSC-proteinkomponenter är också kompatibla 14, 15 . Nästan lika allestädes närvarande och komplexa i eukaryoter som kinesin-14 Klps är medlemmar i kinesin-5-familjen som motsätter sig kinesin-14-funktion. I fissionjäst motsätter kinesin-5 Cut7 verkan av kinesin-14 Pkl1 vid mitos, men den detaljerade mekanismen har ännu inte karaktäriserats. Att belysa denna mekanism kan vara informativ för att förstå γ-TuRC-reglering och spindelbipolaritet.

I denna studie utvidgar vi mekanismen för kinesin-14-reglering av y-TuRC. Studier från vårt laboratorium och andra beskriver genetiska interaktioner mellan Pkl1 och y-TuRC-proteiner 22, 24, 25, 26, kontrollpunktsvägar 20, 26 och spindelpolorganisation 20 . På senare tid har vi identifierat viktiga svanselement i Pkl1 som fungerar tillsammans med motorbindning till y-tubulin för att reglera γ-TuRC 17, 22, 23 . Här demonstrerar vi att kinesin-14 Pkl1 asymmetriskt blockerar mikrotubulär kärnbildning in vivo i fissionjäst och att en kinesin-14 Pkl1 svanspeptid på liknande sätt kan förhindra kärnbildning och generera mitotisk stopp i två humana bröstcancercellinjer. Vi avslöjar att kinesin-5 Cut7 i fissionjäst räknar Pkl1-förmågan att blockera kärnbildning genom att också associeras med y-TuRC och binda på liknande sätt till y-tubulin. Denna motåtgärd kräver den ytterligare konserverade kinesin-5 BimC-domänen. Balanserad reglering med kinesin-14 Pkll och kinesin-5 Cut7 genererar optimal mitotisk trohet, även om båda proteinerna är samutdelbara enligt bestämning genom genetisk analys av enstaka och dubbla mutanter, biokemiska metoder och timelapse fluorescensmikroskopi. Analys av pkl1Δ- singlar och pkl1Δ-cut7Δ- dubbla mutanter avslöjar också separata mitotiska roller för både kinesin-14 Pkl1 och kinesin-5 Cut7. Våra resultat identifierar kinesin-14 Pkl1 som en Klp-negativ regulator för mikrotubulär kärnbildning vid y-TuRC och visar bevarande av denna mekanism i mänskliga bröstcancerceller, vilket resulterar i mitotiskt stopp. Vi förväntar oss att dessa upptäckter är i stort sett relevanta för det mikrotubulära cytoskelettfältet med potential som en ny strategi och mål för framtida utveckling inom cancerterapi.

Resultat

Kinesin-5 kan dispenseras i frånvaro av kinesin-14 Pkll

Spindelbipolaritet i fissionjäst kräver kinesin-5 Cut7 (ref. 27). Mekanismen som ligger till grund för dess väsentliga natur förblir oklar eftersom en annan Klp, kinesin-6 Klp9, kan tvärbinda antiparallella mikrotubuli och krävs för spindelförlängning 28 . I eukaryoter är ett motsatt samband mellan kinesin-5 och kinesin-14 Klps i mikrotubulärreglering starkt bevarat. Vi har tidigare visat att kinesin-14 Pkl1 direkt binder och nedreglerar γ-TuRC-funktion 17, 23 . Vi testade hypotesen att en nödvändig roll av kinesin-5 Cut7 ( cut7- genen), som lokaliseras vid spindelpolarna, är att motverka kinesin-14 Pkl1 ( pkl1- gen). Genom homolog rekombination (fig. 1a) raderade vi samtidigt genen Cut7 samtidigt som vi markerade locus med ura4 ( cut7Δ :: ura4 + ) i en stam som raderats för Pkl1 ( pkl1Δ: his3 + ). Den dubbelmutanta stammen pkll ^ cut7Δ uppvisar robust livskraft genom seriella tillväxtanalyser, liknande celler av vildtyp (fig. Ib). Spindelpolskropps (SPB) -separation påverkas inte i den dubbla mutanta pkl1Δ-snitt7Δ kontra vildtyp (Fig. 1c, d) och inte påverkas mitotisk progression genom anafas jämfört med vildtyp eller pkl1Δ- stammar (Fig. 1c, e – g) . Spindelnedbrytningen försenas emellertid, vilket indikeras av en ihållande spindel efter anafas B-töjning (fig. 1c, g). Vi demonstrerar att kinesin-5 Cut7 kan fördelas i frånvaro av Pkl1, vilket indikerar att en kinesin-5-oberoende mekanism för spindelmontering kan existera i fissionjäst. Detta stöder också en nödvändig roll för Cut7 som är att motverka Pkl1, som är en direkt negativ regulator för y-TuRC MTOC.

Image

( a ) cut7 knockout och integration av ura4 + på detta lokus i pkl1Δ :: his3 + enda mutanten. Det PCR-baserade tillvägagångssättet som använde långa (500 nts) flankeringskanaler av homologi och den genomiska deletions- / integrationshändelsen bekräftades av kolonin PCR (spår 3: 5 ′, spår 5: 3 ′ oligonukleotidpar b och c, d respektive e ). Spår 1 är en positiv kontroll med användning av oligonukleotidpar a och b. Spår 2 och 4 är negativa kontroller med användning av oligonukleotidpar b och c på pkll ^ -mutanta celler. ( b ) Analyser för tillväxt av serieutspädning vid 25 ° C tillåtna och 36 ° C begränsande temperaturer (överst). Celler pläterades på rika YES-plattor vid ökande utspädning. Cellviabilitet analyserades med Phloxin B-färgning (botten). ( c ) Genomsnittlig spindelpolskroppsseparation kontra tid (Pcp1-GFP) för vild typ (grön kurva; n = 5 tidsserier), pkl1Δ enstaka mutant (röd kurva; n = 7 tidsserie) och pkl1Δ snitt7Δ dubbla mutantceller (lila kurva; n = 9 tidsserier) efter hydroxyurea-synkronisering. ( d ) Timelapse-fluorescensmikroskopi av profasaspindelpolskroppsseparation i vildtyp och pkll-cut7Δ- celler med användning av spindelpolmarkör Pcpl-GFP. Timelapse fluorescensmikroskopi av mitos från metafas visas för vild typ i ( e ), pkl1Δ i ( f ) och pkl1Δ cut7Δ i ( g ). GFP-Atb2 markerar mikrotubuli (grönt) och DNA färgas med Hoechst (blått). Skala bar, 5 μm.

Bild i full storlek

Kinesin-5 Cut7 binder γ-TuRC genom motor- och svansdomäner

Kinesin-14 Pkl1 reglerar negativt y-TuRC genom två interna proteindomäner som inkluderar element i dess Motor- och Tail-regioner 17, 22 . För att bestämma om Cut7 binder y-TuRC MTOC med en liknande mekanism, utförde vi Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) 15, 17 med V5-taggade borttagningsderivat av Cut7 som tidigare genererats 29, immunocytologi med nyligen genererade V5-taggade borttagning och plats- riktade mutagenesderivat och Pkll-peptid-samimmunutfällningsanalyser (fig. 2). Fraktionering av helcellsextrakt som bär V5-märkta fullängds Cut7 och två Cut7 trunkeringskonstruktioner (Cut7-Head-Stalk eller Cut7HS, aa 1–88; Cut7-Stalk-Tail eller Cut7-ST, aa 443–1, 085) undersöktes i pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanten och i gtb1-K5A- stammen som hämmar Pkll-reglering av y-TuRC genom att blockera dess motoriska domänbindning till y-tubulin (fig. 2a, b och 3a – c) 22 . En FLAG-märkt trunkerad Pkll-konstruktion som bibehåller full funktion och lokaliserar sig till y-TuRC ( pkl195 ) 23 användes som en positiv kontroll tillsammans med Alp4 (gammakomplexprotein GCP2-jästortolog) och y-tubulinproteiner som är kärnunderenheter i y -TuSC och> 2 000 kDa högmolekylär y-TuRC MTOC. Y-TuRC-topparna i FPLC-fraktionerna 15 och 16 (fig. 2b). Profiler för de tre cut7- konstruktionerna i pkl1Δ-cut7Δ- dubbla mutanta celler som är pREP81V5 / cut7 , pREP81V5 / cut7HS och pREP81V5 / cut7ST visas (fig. 2a, b). Western blot-analys efter FPLC-fraktionering avslöjar att Cut7, Cut7HS och Cut7ST uppvisar liknande profiler med hög molekylvikt som Pkl195 och alla toppar i identiska fraktioner till kärn-y-TuRC-proteiner y-tubulin och Alp4. För att ytterligare bekräfta Cut7ST-bindning till y-TuRC utförde vi samimmunutfällningar från högmolekylär FPLC-fraktion 15 i stam alp4-HA pREP81V5 / cut7ST (fig. 2d, e). Magnetiska pärlor med histidinaffinitet konjugerades till små His-taggade Pkll svanspeptider (PyT eller PyM) 17 som binder y-TuRC (PyT, inriktning) eller inte kan interagera med fissionjäst-y-TuRC (PyM, muterad). Med hjälp av detta tillvägagångssätt upptäcker vi y-TuRC-kärnunderenhetsproteiner y-tubulin och Alp4-HA utöver Cut7ST (V5-taggen) genom western blot-analys efter eluering av pärlor (PyT). Dessa proteiner utvanns inte av den muterade peptiden, som förväntat. Vi kunde inte upptäcka a- / p-tubulin i fraktioner med hög molekylvikt efter FPLC, vilket vidare antyder att detekterade Klps var direkt bundna till y-TuRC.

Image

( a ) Kinesin-5- och kinesin-14-konstruktioner som används i snabbproteinvätskekromatografi. V5-märkta Cut7 och två trunkeringskonstruktioner användes, förutom en FLAG-Pkl1 trunkerad konstruktion som behåller full Pkl1-aktivitet. Cut7-konstruktioner är V5-märkta i full längd Cut7 (aa 1–1, 085), Cut7-Head-Stalk (Cut7HS, aa 1–888) och Cut7-Stalk-Tail (Cut7-ST, aa 443–1, 085). ( b ) Western blot-profiler av helcellsextrakt fraktionerade med Separose 6 med användning av FPLC. ( c ) Västra blottar av Cut7-konstruktioner immunutfällda från helcellextrakt med användning av anti-V5 magnetiska pärlor med tomma belastningsnegativa kontroller. ( d ) Tecknadsdiagram över 6-His-taggad Pkl1 Tail peptid sam-immunutfällningsanalys med användning av magnetiska pärlor med His affinitet och FPLC-fraktion 15. ( e ) Pkl1 Tail peptid sam-immunutfällning av y-TuRC-kärnunderenheter och V5-Cut7ST med användning av en kort Pkl1 Svanspeptid (PyT). Muterad peptid PyM har signifikant minskat interaktion med fissionjäst-y-TuRC. Anti-HA-antikroppen detekterar det HA-märkta y-TuRC-proteinet Alp4.

Bild i full storlek

Image

( a ) FPLC-profiler av V5-märkt Cut7 och två trunkeringskonstruktioner i y-tubulin helix 11-mutant gtb1-K5A . ( b ) Strukturell modell av y-tubulin-K5A och -PL302-mutanter (till höger) visad med avseende på a- / p-tubulin-heterodimer (vänster). ß-tubulin helix 11 är en bevarad dockningsplats för Klp Motor-domäner och konserveras dessutom med fissionjäst-y-tubulin helix 11. ( c ) Fluorescenslokalisering och nivåer för uttryck av stabilitet från helcellextrakt av full längd V5- Cut7 i gtb1 av vildtyp kontra gtb1-K5A- mutanten. ( d ) Fluorescenslokalisering av V5-NLS-Cut7ST (Cut7ST, aa 443–1, 085) och V5-Cut7HS i stammen gtb1-K5A . ( e ) Fluorescenslokalisering av fyra cut7- deletion och BimC-platsriktade mutagenesderivat genererade i denna studie i pkll-cut7- celler fixerade vid 36 ° C. Raderingskonstruktioner som används är V5-taggade NLS-Cut7-Stalk-Tail, NLS-Cut7-Stalk-Tail 22 (Cut7ST 22, Pro to Ser i aa 1.021), NLS-Cut7-Tail (Cut7T, aa 888–1, 085) och NLS -Cut7-Tail 22 (Cut7T 22, Pro to Ser på aa 1.021). Skalstänger, 5 μm.

Bild i full storlek

Vi har tidigare visat att mutation av en konserverad lysinrest till alanin i y-tubulin helix 11 ( gtb1-K5A ) avskaffar Pkll Motor-domänbindning till y-TuRC och blockerar dess fulla funktion in vivo 22 . För att bestämma om Cut7 binder på liknande sätt till y-tubulin genom spiral 11, undersökte vi dess FPLC-profil i gtb1-K5A- stammen (fig. 3a). Den mutanta y-tubulin-K5A-fraktioneringen påminner på samma sätt som vildtyp-y-tubulin med FPLC. V5-Cut7-signalen i y-TuRC-fraktioner med hög molekylvikt reduceras signifikant i gtb1-K5A- stammen, medan stabilitetsuttrycksnivåer av V5-Cut7 i gtb1- vildtyp och gtb1-K5A-mutantbakgrunder genom western blot-analys av hela -cell-extrakt är liknande (fig. 3c). Fluorescensmikroskopi av V5-Cut7 i gtb1-K5A- mutanten avslöjar att medan polalokalisering reduceras, behåller Cut7 lokalisering till spindelmikrotubulor, vilket förbättras. Trunkerad Cut7HS som innehåller Cut7 Motor- och Stalk-domänerna och saknar svansen är helt frånvarande från y-TuRC-fraktioner med hög molekylvikt i gtb1-K5A- bakgrunden (fig. 3a). På liknande sätt som V5-Cut7 behåller det förmågan att binda till spindelmikrotubulor som observerats genom immunocytologi (fig. 3d). Intressant nog är det trunkerade Cut7ST-proteinet i denna stam som inte behåller Motor-domänen oförändrat i dess förening med y-TuRC (fig. 3a). V5-Cut7ST med en kondenserad kärnlokaliserings singel (NLS) för att möjliggöra nukleär lokalisering 29 är tillräcklig för att rikta spindelpolar i mitos (fig. 3d). Detta indikerar att, liknande Pkl1, Cut7 innehåller distinkta Motor- och Tail-domänelement som erbjuder oberoende bindningsställen till y-TuRC.

Kinesin-5 Cut7 BimC Tail-elementet riktar polinriktningen

Den eukaryota BimC-domänen är mycket bevarad över kinesin-5-medlemmar 30, 31 . Domänen identifierades först i Aspergillus nidulans kinesin-5 BimC-protein 32, men dess exakta roll i mitos har varit okänd i två decennier. För att undersöka konsekvenserna av en mutation till BimC-domänen i Cut7 på lokalisering av spindelpol, använde vi förlusten av funktionstemperaturkänslig allelskärning7-22 som innehåller en enpunktsmutation inom denna region (1 021 Pro till Ser) 22 . För att bestämma om BimC-rutan är det primära spindelpolinriktningsstället i Cut7 Tail-domänen använde vi V5-taggade Cut7-borttagning och / eller platsriktade mutageneskonstruktioner med en smält NLS (fig. 3e) 23 . Dessa konstruktioner kodar för fusionsproteinerna V5-NLS-Cut7ST, V5-NLS-Cut7ST 22 (punktmutation vid 1 021 Pro till Ser vilket resulterar i förlorad bipolaritet) 22, V5-NLS-Cut7T (Cut7-Tail, aa 888–1, 085) och V5 -NLS-Cut7T 22 och analyserades genom immunocytokemi av pkll-cut7'- celler som fixerades efter skift till 36 ° C. V5-NLS-Cut7ST och V5-NLS-Cut7T saknar Motor-domänen och behåller lokalisering av spindelpol. Däremot kan muterade V5-NLS-Cut7ST 22 och V5-NLS-Cut7T 22 konstruktioner inte lokalisera till poler men uttrycks och bibehålls i kärnan, vilket antyder att BimC-sekvensen utgör en nyckeldomän i Cut7 / y-TuRC-interaktionen . Tillsammans stöder våra data modellen där Cut7 interagerar fysiskt med y-TuRC MTOC på ett sätt som är tillräckligt för att möjliggöra motstånd mot Pkl1-aktivitet.

Pkl1 reglerar spindelmorfologin från y-TuRC

Mitotiska fenotyper i stammar som bär enstaka pkl1Δ- eller pkl1Δ-snitt7Δ- dubbla mutanter kontra vildtyp utvärderades genom levande cell- och timelapse-avbildning av mikrotubuli (a-tubulin som mCherry-Atb2 eller GFP-Atb2), spindelpoler (γ-TuRC pericentrinprotein 1, Pcp1 -GFP), antiparallella mikrotubuli och kromatin (anafas B och kromatinbindande kinesin-6-medlem Klp9-GFP) samt Hoechst-färgning av DNA. En ökning av spindeltjockleken observeras i pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutantstammen kontra vildtyp som ses vid enkelstammsavbildning (fig. 4a) eller genom levande cellavbildning av en blandad kultur med vildtypceller (fig. 4b). Denna ökade tjocklek finns också i pkll- stammen (Fig. 4c). I fig. 4b resulterade förhållandet mellan dubbelmutant och vildtypceller vid 2: 1 i en dragande ökning i förhållandet mellan tjocka: tunna spindlar. Tjocka spindlar (> 0, 5 μm i en spindel med längd 4 till 6 μm) observeras i 4 ± 2% av vildtypceller , 63 ± 8% pkl1Δ enstaka mutant och 68 ± 8% av pkl1Δ-snitt7Δ dubbla mutantceller (medelvärde ± sem, n = 90 celler för varje stam). Även om pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutantbakgrunden genererar en liten ökning av den tjocka spindelfenotypen ( P <0, 05 av Student's t- test), är förändringen mot pkl1Δ- enstaka mutanten ensam liten. Detta indikerar att det främst är förlusten av Pkl1 som inducerar denna fenotyp, som förvärras av ytterligare förlust av Cut7.

Image

( a ) Levande cellfluorescensavbildning avslöjar skillnader i spindeltjocklek mellan vildtyp ( pkl1 + cut7 + ) och pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanta celler. Två stadier av mitos visas med olika markörer. På vänster markerar GFP-Atb2 mikrotubuli (a-tubulin, grönt) och DNA färgas med Hoechst (blått). Till höger markeras mikrotubuli med mCherry-Atb2 (röd) och spindelpolskroppar är markerade med Pcp1-GFP (grön). ( b ) Skillnader i spindeltjocklek i en vild typ / pkl1Δ-snitt7Δ blandad kultur med levande cellfluorescensmikroskopi. ( c ) Frekvensen av tjocka spindlar i vild typ, pkl1Δ- och pkl1Δ-klipp7 mean- celler (medelvärde ± sem, n = 90 celler för varje, * P <0, 05 med Student's t- test). ( d ) Levande cellfluorescensmikroskopi av vild typ och pkl1Δ cut7Δ- celler med mCherry-Atb2 och Klp9-GFP antyder att den ökade spindeltjockleken vi observerar beror på parallella mikrotubulor som härrör från en enda pol (framhävd av tecknad schemat). Klp9-GFP markerar antiparallella mikrotubuli vid spindelens mittzon. I de schematiska, gula markeringarna överlappar Klp9-GFP / antiparallell mikrotubul, röda markerar parallella mikrotubulor som sträcker sig från endera polen (vit cirkel) och grön är Klp9-GFP-signal på kromatin. Bilderna var orienterade på samma sätt för att underlätta. Liknande resultat som pkll-cut7 ^ -celler observerades för den enkla mutanten pkl1 . ( e ) Plätering av vildtyp, pkl1Δ och pkl1Δ skära7Δ (topp till botten) celler på medium innehållande tre koncentrationer av mikrotubulis-depolymeriserande läkemedel TBZ (0 μg ml −1 kvar, 10 μg ml −1 mitten, 20 μg ml −1 höger). Skala bar, 5 μm.

Bild i full storlek

Karaktären hos den morfologiska förändringen till spindeltjockleken kan vara resultatet av en ökning i antalet antiparallella mikrotubulor från båda polerna, parallella mikrotubulor som härrör från en enda pol, eller på grund av omonterade mikrotubulor eller desorganiserade matriser 20 vid en enda pol. För att skilja mellan dessa möjligheter använde vi flera tillvägagångssätt. kinesin-6 Klp9-GFP tvärbindningar antiparallella mikrotubulära matriser 28 och kan användas för att företrädesvis markera omfattningen av mikrotubulöverlappning (vanligtvis midzon), och används med a-tubulin (mCherry-Atb2) för att visualisera spindelmikrotubulor och längden på den mitotiska spindeln . I vildtypceller sträcker sig Klp9-GFP-signalen hela spindelens mittzonbredd (fig. 4d, vänsterbilder), medan vi i den dubbla mutanten (fig. 4d, högerbilder) observerar mikrotubulärfärgning intill zonen för antiparallell överlappning som verkar komma främst från en enda pol. Vi upptäcker inte ökad resistens mot det mikrotubulus-depolymeriserande läkemedlet Thiabendazole (TBZ) i pkl1Δ- eller pkl1Δ-cut7Δ- stammar kontra vildtyp (fig. 4e) i överensstämmelse med inga eller begränsade förändringar av mikrotubulstalet. Vi föredrar tolkningen att ökad spindelbredd troligen beror på asymmetriska spindelpoleffekter (förlorad organisation) i frånvaro av Pkl1 sett 20 och till ett ökat antal spindelmikrotubulor.

Morfologiska förändringar i spindeltjockleken påverkar inte mitotisk progression i pkl1Δ-cut7Δ- dubbla mutanta celler genom anafas, sett av timelapse-avbildning och kymografisk analys mot vild typ (Fig. 5). Efter anafas B försenas emellertid snabb spindelnedbrytning i en betydande procentandel av pkl1Δ-cut7Δ- celler. I 78% av dubbelmutanta celler ( n = 15 timelapse-serier) förblir spindlar intakt betydligt längre än vildtyp ( n = 7 timelapse-serier) under ytterligare 24 ± 7 min, och kan kvarstå utöver bildning av ekvatoriella MTOC-arrayer (fig. 5a -c). Tre mönster av spindelmikrotubulitetens densitet i pkl1Δ cut7Δ-anafasceller observerades (fig. 5a – c, e) och benämns typ 1, typ 2 och typ 3. I typ 1 är den centrala mikrotubulens antiparallella överlappningen identisk med vildtypen. I typ 2 är mikrotubulodensiteten mycket partisk till en pol, och i typ 3 minskas de centrala mikrotubulorna jämfört med tjockare pol-partiska mikrotubulor. De relativa frekvenserna för dessa mönster i genomsnitt över tre tidpunkter efter hydroxyurea-synkronisering (120, 140 och 160 min) anges i ett staplat histogram (fig. 5f). Våra fynd indikerar att förändringar inträffar på spindelbredden och organisationen i både pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanten och pkl1Δ- mutantstammarna. Tjockleken längs spindellängden fördelas i tre mönster, två som skiljer sig från vild typ. Spindelmorfologifenotyper i pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanten ändras endast blygsamt mot den enda pkll- mutantstammen. Dessa fynd indikerar att kinesin-14 Pkll är den primära kinesinreglerande mikrotubulära organisationen vid y-TuRC, en förlust som resulterar i bredare spindlar med asymmetrisk mikrotubulitetens densitet längs spindellängden.

Image

( a - c ) Timelapse-fluorescensmikroskopi av ihållande anafas B-spindlar i dubbla mutanta celler. Tre typer av spindelmikrotubulitetens densitet observerades, visade i ( e ). ( d ) Mitotiskt index mot tid för vild typ (svart kurva), pkl1Δ (mörkgrå kurva) och pkl1Δ-klipp7Δ- celler (ljusgrå kurva) efter hydroxyurea-stopp och frisättning. Spindellängden mättes med användning av mikrotubulfärgning genom ICC. ( e ) Schematisk över tre typer av mikrotubulära täthet av anafas-spindel observerad i dubbelmutanta celler av pkl1Δ-cut7 . ( f ) Staplad histogramrepresentation av fenotyper av mikrotubulära densitet över spindlar över stammar. n = 300 celler i genomsnitt över tre tidpunkter per stam. ( g ) Kymografer av en vildtypspindel (övre; gul pil indikerar spindelnedbrytning) och en ihållande spindel (röd pil) som visas från tidsserien för typ 3. Skalstång, 5 μm.

Bild i full storlek

Dotterpolens desorganisation kvarstår i den dubbla mutanten

En asymmetrisk effekt på SPB-organisationen med förlust av det typiska plackliknande utseendet vid en pol har observerats genom TEM-analys av pkll- stammen 20 . På liknande sätt observerar vi i pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanten en asymmetrisk effekt på spindelpolar, inklusive förändrade astrala mikrotubulära matriser som tidigare visats 33 . Här identifierar vi dessutom dotterstången som främst påverkad (fig 6). Asymmetri i astrala mikrotubululängder från motstående poler observeras och orienteringen är parallell med spindelaxeln som börjar i tidig mitos. Asymmetriska astraluppsättningar observeras i 35 ± 6% av pkl1Δ- celler och 33 ± 6% av pkl1Δ-skurna7'- celler (fig. 6b; medelvärde ± sem, n = 200 celler per stam). En liten andel celler i båda stammarna (8 ± 3% respektive 6 ± 2%) uppvisar parallella matriser som är symmetriska, och resten av de undersökta cellerna har normalt uppträdande astrala arrayer. Celler utan astrala mikrotubuli observerades också, men utesluts från denna analys. Vi observerar inte utsprång i kärnhöljet som observerats genom samavbildning med kärnhölje och SPB-markörer som visas i fig. 6c ( n = 0/57 celler), vilket antyder att dessa matriser är cytoplasmiska. Sepinationsinitieringsnätet (SIN) -protein Cdc7 belastas främst till dotterpolen i mitos 34, 35 . Vi fann att de längre onormala astrala mikrotubulorna sträcker sig från poler som har Cdc7-GFP (68 ± 8% celler med en signal, n = 29 celler) och att detta också är polen med ökad tjocklek (Fig. 6a, d). Dessa data utökar den asymmetriska SPB-desorganiseringsfenotypen som observerades i pkll ^ -celler 20 och identifierar en roll för Pkll vid upprätthållande av dotterpolorganisationen från y-TuRC som indirekt förändrar astrala mikrotubulära matriser i cytoplasma. Vidare överensstämmer data med datorpol-desorganisering som bidrar till de tjockare spindelfenotyperna som vi observerar i både pkl1Δ- och pkl1Δ-cut7Δ-mutantceller .

Image

( a ) Levande cell timelapse-serie som visar asymmetrisk astral mikrotubule-grupp parallell med den mitotiska spindeln (vita pilar) i dubbelmutanten pkl1Δ cut7Δ . GFP-Atb2 markerar mikrotubuli (grönt) och DNA färgas med Hoechst (blått). ( b ) Frekvens av parallella symmetriska kontra parallella asymmetriska astrala mikrotubulära matriser i tre stammar. Endast celler som hade astrala mikrotubulära matriser inkluderades i statistisk analys ( n = 45 celler per stam). ( c ) Spindelpolskroppen (Pcpl-GFP) och kärnhölje (NE; P450-GFP) markörer i en mitotisk pkll-cut7Δ- cell uppvisar inte onormala NE-utsprång utöver någon av polerna ( n = 0/57 mitotiska celler). ( d ) Cdc7-GFP är en asymmetrisk polmarkör som primärt lokaliseras till dotterpolen vid mitos. Asymmetriska astrala mikrotubulära matriser som är parallella med den mitotiska spindeln i pkll-cut7Δ- celler sträcker sig främst från polen markerad med Cdc7-GFP (vit pil; n = 27 celler). Skala bar, 5 μm. ( e ) Jämförelse av parallella astrala mikrotubulor som sträcker sig från en pol markerad med Cdc7-GFP kontra den ommärkta polen i pkl1Δ cut7Δ dubbelmutant ( n = 45 celler).

Bild i full storlek

pkl1Δ och pkl1Δ cut7Δ delar kromosomsegregationsfel

Vi övervakade kromosomsegregation i den dubbla mutanten genom levande cell timelapse fluorescensmikroskopi och immunocytologi av mikrotubulor och DNA, liksom mini kromosomförlust (Fig. 7). Tre typer av kromosomsegregationsdefekter finns i den dubbla mutanten som är ojämn segregering, släpande kromosomer och förlorade kromosomer (Fig. 7a). Jämfört med vildtypceller har den dubbla mutanta stammen pkl1Δ cut7Δ ökat efterliggande kromosomer och ojämnt segregerade kromosomer, liksom en mindre ökning av förlorade kromosomer 36 . Men vi tillsammans med andra 20 konstaterar att effektiviteten för kromosomsegregation redan är markant minskad i frånvaro av kinesin-14 Pkl1. Jämfört med pkl1Δ-cut7Δ-dubbelmutantstammen observeras inga förlorade kromosomer i pkl1Δ och ojämn segregering reduceras, även om laggande kromosomer är framträdande. Figur 7b är en histogramrepresentation av de relativa frekvenserna för dessa fenotyper i vildtyp, pkl1Δ- enstaka mutant och pkll-cut7 -dubbelmutanta stammar. Som visas är frekvenser ( n = 500 celler) för ojämn segregering (typ 1; vildtyp: 0%, pkl1Δ : 7 ± 3% och pkl1Δ-snitt7Δ : 9 ± 3%, medelvärde ± sem), släpande kromosomer (typ 2; 3 ± 2, 23 ± 5 och 30 ± 5%) och kromosomförlust från spindeln (typ 3; 0, 0 och 1%). Vi kvantifierade ytterligare kromosommissegregering genom att övervaka förlustgraden för en mini-kromosom ( cen1-7L ) sup3E i de tre stammarna (fig. 7c). Minikromosomförlust i pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanten är större än den i vild typ (27% ökning) men minskad med 5% med avseende på pkl1Δ (32%). Våra fynd på kromosomsegregation med pkl1Δ överensstämmer med tidigare studier 20 och avslöjar både räddning (fördröjningskromosomer) och förvärring (ojämn segregering) av pkl1Δ- fenotypen i den dubbla mutanten tillsammans med den ytterligare förlorade kromosomfenotypen.

Image

( a ) Tre levande cell-timelapse-serier som visar kromosommissegregering i pkl1Δ cut7Δ- dubbla mutanta celler. ( b ) Frekvens av missegregeringsfenotyper över stammar ( n = 500 celler / stam). ( c ) Minikromosomförlustfrekvens i vild typ ( n = 0 / 1, 011, 0%), pkl1Δ enstaka mutant ( n = 316/986, 32%) och pkl1Δ cut7Δ dubbelmutanta celler ( n = 549 / 2, 035, 27%) . ( d ) pkll-cut7'- celler som uttrycker Mad2-GFP (grön) och mCherry-Atb2 (röd). ( e ) Ökad spindelmikrotubulitetens densitet vid en pol (gul pil) i pkl1Δ cut7Δ dubbelmutanta celler är associerad med liten eller ingen Mad2-GFP polär signal i anafas B (toppbilder). Den vita pilen indikerar moderpolen. Mad2-GFP uttrycks stabilt i pkl1Δ-cut7Δ- celler (bottenbild). I den nedre bilden, skalfält, 10 mikrometer Skala bar, 5 μm.

Bild i full storlek

I vildtypceller övervakar Mad2 korrekt bipolär vidhäftning av spindelmikrotubulor till kinetokoren (KT) och övergår sedan från KT: er till båda SPB: erna sammanfaller med anafas A-början. I anafas B blir Mad2 asymmetrisk och gör en efterföljande övergång från dotterpolen till ekvatorial MTOC, men förblir asymmetriskt lokaliserad vid moderpolen 26 . Vi observerar Mad2-GFP associerad med den förlorade kromosomen som är fäst med en intranukleär mikrotubuli (Fig. 7d), liknande det som tidigare observerades med den förlorade kromosomfenotypen 36 . Denna förlorade kromosomhändelse inträffar i 1% av pkl1Δ-cut7Δ- celler ( n = 3/300 celler) och observeras inte i pkl1Δ- celler. Mad2-GFP var också användbar för att bekräfta att den ökade spindelmikrotubultjockleken vi observerar i typ 2-morfologier (fig. 5b, e) är associerad med dotterpolen. Genom att avbilda celler med Mad2-GFP och mCherry-Atb2, sträcker sig den ökade spindelmikrotubultjockleken främst från dotterns spindelpol som är omärkt eller svagt markerad av Mad2-GFP i tidigt anafas B (fig. 7e), i överensstämmelse med vår Cdc7-GFP data (Fig. 6). Våra fynd indikerar att kromosomsegregationsdefekter i den dubbla mutanta stammen i allmänhet liknar de hos pkl1Δ förutom den ytterligare närvaron av den sällsynta förlorade kromosomfenotypen.

Ett asymmetriskt block på y-TuRC-kärnbildningskompetens av Pkl1

Vi har tidigare visat att kinesin-14 Pkl1 fysiskt interagerar med y-TuRC i profas för att nedreglera dess funktion och motsätta sig bipolär spindelmontering 17, 22 . Vi etablerade ett in vivo- analyssystem för att undersöka påverkan av förhöjda nivåer av Pkll i dubbla mutanta celler där kinesin-5 Cut7 är frånvarande (Fig. 8a). Multikopi-pkll uttrycktes med användning av den tiamin-repressibla nmt-promotorn med låg styrka (pREP81 / pkll ). De pkll-skurna7'- cellerna innehållande pREP81 / pkll odlades med eller utan 5 ug ml-tiamin och fixerades efter 17 timmar. Celler färgades för a-tubulin och DNA med användning av TAT1-antikropp respektive Hoechst (fig. 8a). Efter frisläppning av tiamin observerade vi att 89 ± 9% av cellerna arresterades med oformade spindlar. Denna frekvens var endast 6 ± 2% när celler odlades i närvaro av tiamin (Fig. 8c, vänsterplott; medelvärde ± sem, n = 200 celler för båda förhållandena). I celler med oformade spindlar koncentrerades tubulinsignal nära cellcentret. Vi kunde inte erhålla pkll-cut7 ^ -celler transformerade med pkll uttryckta under en högre hållfasthetspromotor (pREP90x / pkll ), även under promotor-undertryckande betingelser i närvaro av tiamin. Vi utförde dessutom levande cellfluorescensmikroskopi med GFP-Atb2 (a-tubulin) i den cut7-22 temperaturkänsliga stammen med eller utan den nativa pkll- genen (Fig. 8b). Celler synkroniserades med hydroxiurea under 4 timmar, frisattes vid 36 ° C-begränsande temperatur och avbildades 4 timmar efter frisättning. Vi observerade liknande oformade spindlar i 82 ± 9% av cellerna innehållande Pkll. De pkll ^ -skurna 7-22- celler som odlas på liknande sätt uppvisar robust spindelmontering (fig. 8c, höger plott; n = 200 celler för båda betingelserna), och dessa data överensstämmer med de seriella tillväxtanalyser som utförts med dessa två stammar vid 36 ° C (fig. 1b).

Image

( a ) Pkll inhiberar spindelbildning i pkl1Δ cut7Δ dubbla mutantceller . Cellerna inokulerades från tiaminplattor i selektiva media innehållande 0 μg ml −1 eller 5 μg ml −1 tiamin för nmt-promotortryck respektive induktion och fixerades med metanol efter 17 timmar. Prover färgades med anti-tubulin TAT1-antikropp och DNA färgades med Hoechst ( n = 200 celler för båda betingelserna). ( b ) Pkll inhiberar mitos i cut7-22 temperaturkänsliga celler vid 36 ° C. pkll + cut7-22 och pklll cut7-22 celler som uttrycker GFP-Atb2 synkroniserades i hydroxyurea under 4 timmar vid 27 ° C tillåten temperatur, frisattes vid 36 ° C i minimalt kompletterat medium och avbildades 4 timmar efter frisättning ( n = 200 celler per stam ). ( c ) Frekvensen av oformade spindlar i ( a ) och ( b ). *** P <0, 001 av Studentens t- test (medelvärde ± sem). ( d ) Tecknadsdiagram över tre möjligheter för sådd av MTOC-tubulin vid stolpar som inte tillåter spindelmontering. y-TuRC är i grönt och a- / p-tubulin-heterodimeren visas i vitt / lila. Kärnhuvudet visas med blått. ( e ) För att skilja mellan möjligheterna i ( c ) analyserades pkll + klipp7-22- celler som uttrycker mCherry-Atb2 (röd) och polmarkör Pcpl-GFP (grön) med det experiment som användes i ( b ). Inzoomade bilder är högkontrast Z-stackprojektioner med hög kontrast genererade i ImageJ. Vita pilar markerar distinkta poler, och staplar med vit skala är 1 mikrometer. ( f ) Mikrotubulär depolymerisation genom kall chock, kärnbildning och återpolymerisation vid 32 ° C i dubbla mutanta celler. pkll-cut7Δ- celler med integrerad GFP-Atb2 fixerades vid de angivna tidspunkterna för att bevara GFP-signal. Alla svarta skalor i denna siffra är 5 μm.

Bild i full storlek

Vi föreställer oss tre möjliga modeller i vilka spindelmontering skulle misslyckas via en spindelpolbaserad mekanism som är baserad på tubulärsådd vid y-TuRC (Fig. 8d). Detta inkluderar ingen tillsats av tubulin till y-TuRC, symmetrisk tillsats men utan mikrotubulär förlängning, eller asymmetrisk tillsats av tubulin vid en enda spindelpol. Våra data indikerar närvaron av korta mikrotubuli, utesluter modell 1. För att skilja mellan modeller 2 och 3, genererade vi stammen [ pkl1 + cut7-22 pcp1-GFP mCherry-atb2 ] för att samtidigt visualisera poler och mikrotubuli (jämför fig. 8b med Fig. 8e). Vår datastödsmodell 3. Vi observerar att i 100% av de arresterade cellerna där två distinkta poler kunde identifieras, var tubulinsignalen associerad med en enda pol ( n = 25 celler). In vivo- kärnbildning visad genom kall depolymerisation och reformering av mikrotubuli i fig. 8f visar att i pkll-cut7 ^ -celler kan y-TuRC nukleera både interfas- och spindelmikrotubulor, i överensstämmelse med våra andra data. Tillsammans överensstämmer in vivo- data här med vår modell där en nödvändig roll för Cut7 i spindelmontering är att binda y-TuRC att motsätta sig Pkl1-aktivitet. Av dessa Klps är kinesin-14 Pkll i fissionjäst den primära negativa regulatorn för y-TuRC-mikrotubulkärnbildning.

Kinesin-14 PyTR-peptid arresterar mänskliga bröstcancerceller

Alla humana y-TuSC-proteiner är funktionella i fissionjäst 14, 15 . Vi utvecklade tidigare biokemiska verktyg i form av kinesin-14 svanspeptider (fig. 2e) 17 som reglerar y-TuRC in vitro och testade här den bevarade förmågan hos dessa peptider för att blockera mikrotubulkärnbildning i humana MCF-7 bröstcancerceller (fig 9). Genom immunocytologi i fixerade MCF-7-celler demonstrerar vi att 6-His-märkt PyT riktar sig till centrosomen (fig. 9a) och samlokaliseras med y-tubulin (fig. 9b). Genom mikrotubulär kärnbildningsanalyser med eller utan y-TuRC undersökte vi också effekten av kinesin-14-peptider på human y-TuRC-kärnbildningskompetens in vitro (fig. 9c). Den kontrollinriktade peptiden PyT är otillräcklig för att blockera y-TuRC-mikrotubulkärnbildning ensam. PYTR som innehåller en ytterligare y-tubulinbindning och regleringssekvens 17 är emellertid en potent hämmare av kärnbildning. Peptiderna PyT och PYR (separerade TR-element) isolerar humana y-TuRC-komponenter in vitro liknande deras verkan i fissionjäst (fig 2e och 9d). Det vill säga PyT co-immunutfälls humant GCP2, jäst-Alp4-motsvarigheten förutom y-tubulin, medan PYR binder och tar bort y-tubulin från komplexet 17 .

Image

Bevarad åtgärd för den minimala Pkl1 Tail-domänen. ( a ) Lokalisering av y-TuRC riktad peptid PyT till centrosomer i fixerade humana MCF-7 bröstcancerceller. DNA visas i blått (Hoechst), mikrotubuli i grönt (a-tubulin) och PyT-peptid i rött. 6-Hans-märkta PYTR administrerades före tillsats av primära antikroppar. ( b ) Samlokalisering av y-tubulin och PyTR till centrosomer i mitotiska MCF-7-celler. Skalstänger i ( a ) och ( b ) är 10 μm. ( c ) In vitro- y-TuRC-mikrotubulkärnbildningsanalyser. Inga y-TuRC-negativa kontroller ger bakgrund för spontan mikrotubulbildning från tubulin (1, 5 μg μl −1 ). Alla andra prover använder helcellextrakt från mänskliga bröstcancerceller. y-TuRC-målriktning och regulatorisk peptid PyTR blockerar y-TuRC-kärnbildningseffektivitet. Skala bar, 20 mikrometer (medelvärde ± sd för antal mikrotubuli per fält, n = 3 experiment). ( d ) Magnetisk pärla co-immunutfällning av y-TuRC kärnproteiner GCP2 och / eller y-tubulin med användning av 6-His-märkt PyT (inriktning) och PyR (regulatoriska) peptider (se fig. 2d för metod). ( e ) Bilder med hög förstoring av MCF-7-celler arresterade av PYTR (levande celltransfektion). DNA är i blått (Hoechst) och PγTR är i rött (överst). Mikrotubuli visas i bottenpanelen i grönt. Skala bar, 10 μm. ( f ) Icke-arresterad MCF-7-cell innehållande låga nivåer av PYTR. Skala bar, 10 μm. ( g ) Mitotisk arrestering i MCF-7 (låg-aggressivitet; toppbilder) och MDA-MB-231-celler (hög aggressivitet; bottenbilder) 24 timmar efter transfektion med 1 μg (108 μM) y-TuRC-inriktning och regulatorisk peptid, PγTR. Vid denna tidpunkt räknade 43, 3% av MCF-7-celler (681/1 572 celler från n = 12 fält vid × 200) och 27, 7% av MDA-MB-231 celler (497/1 732 celler räknade från n = 12 fält vid × 200) transfekterades med peptid baserat på fluorescensfärgning med användning av 6-His-taggen. Av detta arresterades 39% av MCF-7-celler (613 / 1, 572) och 22, 6% av MDA-MB-231-celler i mitos. Vänsterbilder är Hoechst och högerbilder slås samman Hoechst + PγTR för båda cellinjerna. Skala bar, 50 μm.

Bild i full storlek

Genom levande celltransfektion av mänskliga MCF-7 bröstcancerceller som uppvisar låg aggressivitet eller MDA-MB-231 celler som är mycket aggressiva, visar vi att PyTR är en potent mitotisk spindelprotein (MSP) klassregulator för mitotisk stopp (fig 9e -g). Cellinjer transfekterades med 1 μg 6-His-märkt PYTR i 2 ml (108 μM) med användning av Chariot-systemet (Active Motif) och fixerades efter 24 timmar. Vid denna tidpunkt räknade 43, 3% av MCF-7-celler (681/1 572 celler från n = 12 fält vid × 200) och 27, 7% av MDA-MB-231 celler (497/1 732 celler räknade från n = 12 fält vid × 200) transfekterades med peptid baserat på fluorescensfärgning med användning av 6-His-taggen. Av detta arresterades 39% av MCF-7-celler (613 / 1, 572) och 22, 6% av MDA-MB-231-celler i mitos. Celler som saknade peptidsignal arresterade inte. Bröstcancerlinjer transfekterade med en kontroll 6-His hexamer arresterade inte heller, vilket indikerar att denna etikett inte bidrar till den anti-mitotiska effekten av PYTR. I en liten procentandel av populationerna (4, 3% MCF-7; 5, 1% MDA-MB-231) med mycket låga men detekterbara nivåer av peptid vid centrosomen, verkade cellerna normala (MCF-7 visas i fig. 9f). I arresterade celler finns kvarvarande klumpade mikrotubulor men verkar inte sträcka sig från centrosomer, vilket antyder att PyTR har en hämmande effekt på y-TuRC mikrotubulkärnbildning in vivo i humana celler. Dessa fynd antyder att kinesin-14-verkan vid y-TuRC bevaras från jäst-SPB till den mänskliga centrosomen. Vi förväntar oss att PγTR kommer att vara ett kraftfullt mekanistiskt verktyg för att belysa γ-TuRC-funktion för mikrotubulär kärnbildning i multipla modellorganismer och ett potentiellt terapeutiskt verktyg för att förhindra cellförökning vid sjukdom.

Diskussion

Organiseringscentra för mikrotubuli spelar stora roller i specialiserade eukaryota processer av stort intresse såsom spindelmontering, neuronal funktion och immunologisk synapsbildning som involverar cellpolarisering. Förstå de detaljerade mekanismerna för mikrotubulär kärnbildning kräver kombinerad kunskap om den underliggande strukturen tillsammans med reglerande insikter. I detta arbete visar vi att förmågan hos klyvningsjästkinesin-14 Pkl1 att binda och förändra y-TuRC-struktur och funktion 17 resulterar i blockerad mikrotubulkärnbildning in vivo som genererar misslyckad spindelbipolaritet och mitotisk stopp. Bevarande av denna mekanism avslöjas genom användning av en kinesin-14 Pkll-peptid PyTR i humana bröstcancerceller som lokaliseras till centrosomer och är tillräcklig för att stoppa kärnbildning i de två bröstcancercellinjer som undersökts genom att förhindra bipolär spindelbildning. I klyvningsjäst, kinesin-5 Cut7 men inte kinesin-14 Pkl1, är ett väsentligt mitotiskt protein 18, 27 . För att bättre förstå kinesin-14 Pkl1-funktion vid y-TuRC och kinesin-5-motverkan av denna Klp, använde vi genetisk analys, biokemi och timelapse-avbildning. Här visar vi att kinesin-5 Cut7 kan fördelas i frånvaro av kinesin-14 Pkl1 och att motverkning av Pkll med Cut7 kräver Cut7-bindning till y-TuRC genom dess Motor- och BimC-domäner. Dessa Klps är de första identifierade som direkt binder och reglerar y-TuRC, åtgärder som är tillräckliga för att påverka mikrotubulär kärnbildningskapacitet. Dessa fynd förväntas ha betydande inverkan på cytoskelettfältet, särskilt för att förstå MTOC-funktionen såväl som i potentiella terapeutiska anti-cancerapplikationer som använder mitotiska spindelproteinagonister.

Distinkta mitotiska fenotyper förekommer med förlust av antingen Pkll eller Cut7. Förlusten av pkl1 i närvaro av snitt7 , även om det är livskraftigt, resulterar i en asymmetrisk effekt på organisationen av spindelpolen som påverkar spindelbredden och försvårar kromosomsegregationen. Jämfört med den dubbla mutanta pkll-cut7Δ observeras ingen förbättring eller förvärring av pkll- fenotypen, vilket indikerar att dessa fenotyper sannolikt beror på förlust av Pkll. Den ytterligare förlusten av Cut7 resulterar emellertid i försenad nedbrytning av spindeln för mitotisk utgång. Cut7 lokaliserar till spindelens midzon i anafas 37, och även om det inte krävs för anafas B-spindelförlängning 29, tyder våra data på att det kan bidra till normal progression genom detta steg. En primär roll för kinesin-5 Cut7 är därför att motverka kinesin-14 Pkll vid y-TuRC. Endast i närvaro av Pkll tillåter avlägsnande av Cut7 eller inaktivering av Cut7 BimC-domänen ( cut7-22 ) att ett asymmetriskt block på y-TuRC mikrotubulär kärnbildning införs som resulterar i misslyckad spindelbipolaritet (Fig. 8).

Omfattande studier visar både vikten av kinesin-5-motorer i spindelmontering tillsammans med kinesin-5-oberoende mekanismer. I det senare arbetar kraftgenerering av andra mikrotubulormotorer såsom kärnhöljesassocierat dynein och kinesin-12 och inkluderar mikrotubulus-drivande krafter på den motsatta polen och kinetokore-medierade mikrotubulers interaktioner i profas 38 . Vår förmåga att ta bort kinesin-5 Cut7 i frånvaro av kinesin-14 Pkl1 avslöjar att det i klyvningsjäst finns kinesin-5-oberoende mekanismer för att upprätta spindelbipolaritet.

Spindelfenotyper i dubbelmutanta och enkla pkll- stammar inkluderar inte förändringar i tidpunkten för profas-SPB-separering eller mitotisk progression genom anafas B kontra vildtyp. Den ökning av spindeltjockleken på förlust av Pkl1 som vi observerar påminner om fenotyper inducerade av förlust av kinesin-14 Kar3 i spirande jäst 19 . Den tjocka spindelmorfologin resulterade inte i ökad resistens mot det mikrotubulära depolymeriserande läkemedlet TBZ vid 10 eller 20 μg ml −1 koncentrationer i enstaka eller dubbla mutanta bakgrunder kontra vildtyp, i överensstämmelse med ingen förändring i spindelmikrotubulantalet. Vi föredrar modellen som förändrade mikrotubulärorganisation av parallella mikrotubulor som härrör från dotterpolen resulterar i ökad spindelbredd vid denna pol i motsats till en ökning av spindelens mikrotubulantal. Detta överensstämmer med studier av ref. 20, i vilken TEM-analys av pkll ^ -celler avslöjade en minskning i polorganisation kännetecknad av förlust av den typiska plackliknande strukturen med uppenbart normalt mikrotubulantal. Replikationen av SPB och centrosomen är semikonservativ med moderpolen som en mall. För att identifiera om moder- eller dotterpolen påverkas av förlust av pkl1 , applicerade vi levande cellfluorescensmikroskopi med asymmetriska polmarkörer Cdc7-GFP och Mad2-GFP tillsammans med mCherry-Atb2 för att markera mikrotubuli. Våra studier avslöjar att dotterpolen påverkas i både pkl1Δ-mutantceller och pkl1Δ-cut7Δ -dubbelmutanta celler. Dotterpolers desorganisering påverkar dessutom cytoplasmatiska astrala mikrotubularsuppsättningar. Mitotiska händelser kan påverka licensiering och semikonservativ centrosomreplikation i den efterföljande G1 / S. I humana celler, separas och polokinas licenscentrosomer för duplikering i nästa cellcykel under mitos 39 . Huruvida förlust av kinesin-14 Pkl1 påverkar efterföljande cellcykelhändelser utanför mitos är inte känt. Emellertid indikerar förändringarna i dotterens spindelpolintegritet utan Pkl1 en bredare roll utöver mikrotubulär kärnbildning för spindelmontering, såsom mognad eller integritet hos dottern MTOC. Vi upptäckte inte en liknande roll med kinesin-5 på dottern MTOC och ytterligare förlust av Cut7 förvärrar inte dessa fenotyper. Begreppet asymmetriska händelser vid spindelpolar är välkänt. I spirande jäst har y-tubulin-mutanter isolerats som blockerar robust mikrotubulkärnbildning från en enstaka pol, sett av transmissionselektronmikroskopi 40 . I mänskliga celler påverkas modercentriole stabilitet asymmetriskt av kinesin-13 Kif24 (ref. 41). Regleringen av poler kan också vara asymmetrisk och observeras i mitotiska kontrollpunktsvägar 26, 34, 35, 42, 43, 44, 45, 46, 47 som övervakar spindelmontering, positionering och timing för att säkerställa den exakta segregeringen av kromosomer i celldelning.

I denna studie demonstrerar vi att rollen för kinesin-14 vid y-TuRC är att blockera mikrotubulär kärnbildning och att nyckeldomäner krävs för denna mekanism. Denna förmåga att lokalisera till y-TuRC vid spindelpolskroppar bevaras med y-TuRC i däggdjurscentrosomen. Vi identifierade dessutom förmågan hos kinesin-5 att binda y-TuRC som en nyckelkomponent i Klp / y-TuRC-regleringsmekanismen i fissionjäst. Pkl1 interagerar med y-TuRC genom två domäner, en motordomän som binder till y-tubulin spiral 11 och distinkt Tail-domänbindning till komplexet. De kombinerade domänerna ger starkaste interaktioner med y-TuRC 17 . Våra data indikerar att liknande Pkl1, är Tail-domänen i Cut7 det primära y-TuRC-inriktningselementet. Vi antar att Motor-domänen spelar en roll i assisterad inriktning på γ-TuRC-platsen vid spindelstänger och i konkurrens med Pkl1-bindning till denna webbplats. Consistent with our previously published findings on Pkl1, we observe that the combined domains of Cut7 provide the strongest interactions with γ-TuRC. However, unlike Pkl1 that has low affinity to microtubules 48, Cut7 retains the ability to bind strongly to spindle tubulins when γ-tubulin specific binding is prevented. This alternative site of interaction may lower the pool of Cut7 at γ-TuRC. Thus, as a consequence of blocked loading due to the helix 11 mutation and retained high microtubule binding affinity, we would expect reduced binding of Cut7 to γ-TuRC complexes with γ-tubulin-K5A present as compared with Cut7ST, as observed. Interestingly, the cut7-22 mutation lies within a MAP kinase phosphorylation consensus sequence in the conserved BimC sequence of the Cut7 Tail domain 29, indicating that phosphorylation at this or other kinase sites within this domain may be important in the γ-TuRC mechanism. Finally the dual regulatory relationship of kinesin-14 and kinesin-5 at the γ-TuRC in fission yeast, along with the ability of PγTR peptide to block nucleation and spindle bipolarity in breast cancer cells, is expected to be impactful in regard to cancer therapy 49 . We are interested in exploring development of this new class of mitotic spindle protein (MSP) reagents as an addition to combined cancer therapies, in particular with Ispinesib/Monastrol 50, 51 that targets human kinesin-5 or in response to taxol-resistant cancers.

Our findings are of particular interest in regard to multiple clinically oriented studies 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 that demonstrate overexpression of γ-tubulin and other centrosomal proteins is characteristic of tumorigenesis and human malignancies in multiple tissues. In this case supernumerary microtubule-nucleating centrosomes are often observed and result in abnormal multipolar mitoses, aneuploidy and ultimately cell death 58, 59, 61 . Similarly, overexpression of γ-tubulin in malignant cells can also produce ectopic microtubule nucleation in the cytoplasm. This is thought to result from γ-tubulin-centrosome decoupling as well as subcellular sorting changes to soluble cytoplasmic pools or insoluble centrosomal complexes 52, 57, 58, 60 as well as insoluble cytoplasmic aggregates 53 . Interestingly, an increase in the percentage of soluble cytoplasmic γ-tubulin is associated with cell lines of higher aggressiveness and poorer prognosis versus those of low or moderate aggressiveness 58 . Further, γ-tubulin can be incorporated within the α-/β-tubulin lattice of cytoplasmic microtubules that may impact drug resistance 58 . The ability of the PγTR peptide to target complexed γ-tubulin could allow a means to prevent ectopic microtubule nucleation, although currently this is untested. Regardless, the peptide can mitotically arrest both the MCF-7 low and MDA-MB-231 high aggressive cell lines with similar efficiency. The benefit of PγTR versus other anti-mitotic agents that solely target microtubules is yet to be determined but is of interest in particular for malignant cell lines that are difficult to arrest and that often develop resistance.

metoder

General yeast strains and growth conditions

Standard procedures for genetic manipulation of fission yeast are as described 62 ( S. pombe strains in Table 1). Cultures grown in fully supplemented YES-rich medium or minimally supplemented medium are also as described 62 . For yeast transformations, we used the EZ-YEAST Transformation Kit (MP Biochemicals). In growth assays, cells were grown to logarithmic phase in 10 ml rich YES media at 27 °C. Cells were counted by haemocytometer and equalized and spotted at an initial concentration of 2 × 10 7 cells ml −1 with followed by 1/10 serial dilutions. Plates at 30 °C and 36 °C were grown for 4–5 days ( n =3 experiments). Plates at 25 °C were grown for 7 days. For promoter induction using the pREP81 low strength 63 or pREP90x high strength 64 nmt plasmids, cells were maintained on plates containing 5 μg ml −1 thiamine before inoculation in 10 ml selective media with (control) or without (test) 5 μg ml −1 thiamine for 17 h. Plates used to assess viability contained 5 mg l −1 Phloxine B (Sigma-Aldrich). Mini chromosome loss was measured as described 65 . Growth curves were obtained using haemocytometer.

Full storlek bord

Yeast strain constructions

Integration of the ura4 gene at the cut7 locus was done using a PCR-based gene-targeting approach with long tracts of flanking homology as previously described 66 (Epicentre MasterAmp Extra-Long PCR Kit). We used 500 bp homology upstream and downstream of the cut7 open reading frame and verified stable integrants by colony PCR (Fig. 1a). Plasmid Integration was done with pREP vectors using homologous recombination at the autonomous replication site (Mlu1, New England Biolabs). All genetic crosses were done on minimal sporulation media, followed by marker selection and colony PCR.

Synchronous yeast culture

Cultures were grown overnight in YES-rich or selective minimal media at 27 °C using baffled flasks. Hydroxyurea (11 mM) was added to cultures in logarithmic phase and incubated for 4 h. Cells were then washed twice with 10 ml sterile water before release in fresh media. Depending on the experiment, cells were released at 27 °C (permissive temperature), 32 °C (microtubule repolymerization) or 36 °C (restrictive temperature).

FPLC sedimentation and immunoprecipitate analysis

Yeast whole-cell extracts were prepared using mechanical bead beating (Mini-Beadbeater-16, Biospec) in Buffer P (50 mM Na 2 PO 4 pH 7.2, 10% glycerol, 150 mM NaCl 5 mM ATP, 100 μM GTP])with protease inhibitors (PMSF-1 mM, Leupeptin-50 μM, Pepstatin-2 μM, Aproptinin-175 nM and Pefabloc-200 μM). Three centrifugations at 17, 000 g (1 min, 5 min, 30 min) were used to clarify cell extracts. Separose 6 FPLC was performed as described 15 . For immunoprecipitation, whole-cell extracts were incubated with anti-V5-tag mAb-Magnetic beads (MBL International) at 4 °C for 30 min. Beads were washed three times with Buffer P before elution by boiling and immediate analysis by western blotting. Pkl1 peptide co-immunoprecipitation assays were performed as previously described 17 . Antibodies used were primary mouse anti-γ-tubulin monoclonal (1:10, 000; Sigma-Aldrich cat. T5326), primary rabbit anti-HA epitope tag (1:5, 000; Rockland cat. 600-401-384), primary rabbit anti-FLAG polyclonal (1:320; Sigma-Aldrich cat. F7425), primary mouse anti-V5 monoclonal (1:5, 000; Life Technologies cat. R96025) or mouse anti-V5 IgG HRP conjugated monoclonal (1:5, 000; Life Technologies cat. R96125), goat anti-rabbit IgG HRP conjugate (1:20, 000; Millipore cat. 12-348) and goat anti-mouse IgG HRP conjugate (1:10, 000; Novagen cat. 71045).

Human lysates were prepared by harvesting confluent cells with 2 ml TrypLE (Life Technologies) and centrifuging for 5 min at 1, 000 rpm followed by two washes with 1 ml 1X PBS. Cells were lysed by incubation on ice in RIPA+ Buffer (Tris–HCl pH 7.5, 50 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 1% deoxycholic acid sodium salt, 0.1% SDS; supplemented with Leupeptin 5 mM, Pepstatin 2 μM, Aprotinin 175 nM, PMSF 1 mM+GTP 100 μM) for 45 min, mixing occasionally. Lysates were clarified by centrifugation at 14, 000 rpm (20, 817 g ) at 4 °C for 1 h. Peptide co-immunoprecipitation assays were performed as above. Antibodies used for western blots were primary mouse anti-γ-tubulin monoclonal (1:9, 000; Sigma-Aldrich cat. T5326) and primary rabbit anti-GCP2 polyclonal (1:2, 000; Thermo Scientific cat. PIPA521433). The secondary antibodies mentioned above were used for detection by HRP. Uncropped scans of western blots are provided in Supplementary Figs 1 and 2.

Breast cancer cell culture and peptide transfection

MCF-7 and MDA-MB-231 (ATCC) cells were maintained in 25 cm 2 tissue culture treated Corning flasks (Sigma-Aldrich) in DMEM complete medium with Glutamax-1 and supplemented with 10% fetal bovine serum. MCF-7 DMEM complete medium was additionally supplemented with 0.01 mg ml −1 bovine insulin (Sigma-Aldrich). Flasks were maintained at 37 °C in 5% CO 2, 95% air, and cells were passaged every 5–7 days using 1 ml TrypLE (Life Technologies).

For live cell peptide transfection we used the Chariot system (Active Motif) according to the manufacturer's instructions. Cells were seeded into 35 mm tissue culture-treated dishes containing coverslips and grown in complete medium to ~60% confluency. One microgram of kinesin-14 Tail peptide PγTR (GenScript) was diluted in 100 μl 1 × PBS on ice. Six microlitres of 1/10 PBS-diluted Chariot reagent was further diluted into 100 μl sterile water on ice in a separate tube. Diluted peptide and diluted Chariot were combined and incubated at room temperature for 30 min to allow the Chariot-peptide complex to form. Following incubation, media was aspirated from cells, which were then washed once in 1 × PBS. The entire 200 μl volume was added to cells in 400 μl serum-free media and gently rocked to ensure even delivery. Plates were returned to 37 °C for 1 h. Next, DMEM complete growth medium was added to 2 ml without removing the peptide delivery solution (108 μM peptide in 2 ml). Cells were further incubated at 37 °C overnight and fixed after 24 h.

Fluorescence microscopy and immunocytochemistry

Fluorescence microscopy was performed using Zeiss Observer.Z1 inverted microscope with 63X Plan-Apochromat 1.4 NA oil and × 100 oil 1.45 PlanFLUAR DIC objectives. Data were obtained using a Hamamatsu ORCA ER CCD camera with Zeiss Axiovision Rel 4.8 acquisition software. We acquired 20-image 0.1 μm Z-stacks. Timelapse series were acquired every 30 s to 6 min, with a median interval of 2 min. The 10-image 0.1-micron Z-stacks were superimposed on each timelapse image in a series. With live cells, GFP-Atb2 was imaged at 50–60 ms exposure and mCherry-Atb2 was imaged at 500 ms exposure. Only GFP-Atb2 was used in timelapse. Average temperature in the imaging room was 23 °C. Using −20 °C methanol fixation, we were able to preserve GFP signal for quantifying phenotypes. In immunocytochemistry, microtubules were stained with a primary TAT1 antibody (1:25) 67, followed by secondary goat anti-mouse Alexa Fluor 488 IgG (1:50; Life Technologies cat. A-11001) and DNA was stained in 1 μg ml −1 Hoechst. A monoclonal anti-V5 primary antibody conjugated to FITC was used for viewing V5-tagged Cut7 constructs in fixed cells (1:500; Life Technologies cat. R963-25). Cells were imaged immediately using the Zeiss Observer.ZI system. In Fig. 8e, zoomed images were made high contrast. Z-stacks were made into 2D projections using ImageJ. Cold depolymerization and repolymerization of in vivo microtubules was performed as previously described 68 . Wild type and pkl1Δ cut7Δ cells containing the integrated GFP-atb2 (α-tubulin) plasmid were fixed to preserve GFP signal and analysed using the Zeiss system.

Human cells were fixed on glass coverslips in −20 °C methanol for 10 min, washed with 1 × PBS and permeabilized in 0.5% Triton X-100 for 20 min. Following further washes, cells were blocked for 30 min in 1% bovine serum albumin/knock out serum replacement (BSA/KOSR). For peptide localization to centrosomes, 1 μg ml −1 of peptide was applied after blocking and before primary antibody application. Antibodies used were primary mouse anti-γ-tubulin monoclonal (1:5, 000; Sigma-Aldrich cat. T5326) or primary mouse anti-α-tubulin monoclonal DM1A (1:1, 000; Santa Cruz Biotech cat. sc-32293), primary His-tag polyclonal antibody (1:1, 000; Cell Signaling cat. 2365), secondary goat anti-mouse Alexa Fluor 488 IgG (1:1, 000; Life Technologies cat. A-11001) and secondary goat anti-rabbit Texas Red (1:1, 000; Life Technologies cat. T-6391). Antibodies were diluted in 1% BSA/KOSR antibody dilution buffer. After secondary antibody application and washes, DNA was stained with 1 μg ml −1 Hoechst solution in 1 × PBS for 10 min followed by three times final PBS washes and mounted on slides with ProLong Gold anti-fade (Life Technologies). The 40-image 0.1 μm Z-stacks were made into maximum intensity 2D projections using ImageJ.

In vitro microtubule nucleation assays

In vitro microtubule nucleation assays were performed in a total volume of 5 μl. That is, 3 μl for the sample and 2 μl of tubulin at a 1:5 ratio of Rhodamine:unlabelled tubulin (Cytoskeleton). Total tubulin concentration was 3.75 μg μl −1 in 2.5 × tubulin working buffer (2.5 × BRB80: 200 mM PIPES, 2.5 mM MgCl 2, 2.5 mM EGTA at pH 6.8 and 2.5 mM GTP). For whole-cell extract nucleation analysis with peptide, 2 μl of whole-cell extract was added with 1 μl of peptide at 300 nM for a final peptide concentration of 60 nM. This 3 μl combination was added first followed by tubulin working buffer. For samples with no peptide, the 5 μl final volume comprised 3 μl RIPA buffer and 2 μl of whole-cell extract. The 5 μl reaction was combined on ice, quickly spun and returned to ice before incubating in a 37 °C water bath for 4 min. Sample incubation was staggered at 20 s intervals to allow for pipetting. After 4 min, 50 μl of 1% glutaraldehyde fixing solution was added and tubes were incubated at room temperature for 3 min. Samples were completed by addition of 1 ml 1 × BRB80, inverting multiple times to mix. For analysis, 50 μl of this mixture per sample was sedimented by ultracentrifugation at 173, 000 × g through a 15% glycerol cushion onto glass coverslips and imaged by Rhodamine epifluorescence using the Zeiss system at × 630. Images of multiple fields were collected and the average microtubule number per field was determined.

Structural analysis

PyMol molecular visualization software (V1.5) was used for structural analysis of the conserved α-β-tubulin heterodimer 1TUB 10 and conserved γ-tubulin monomer 1Z5V 6, 11, 14, 69 in Fig. 3.

Statistisk analys

For statistical analysis of phenotypes, n values were chosen as number of cells per strain needed to ensure adequate power to detect significant outcomes. P -values were generated using Student's t -test and statistical significance was considered for P <0.05 as appropriate. All statistical data in this study are reported as mean±sd or ±sem, as indicated. For cell cycle arrest by 1 μg transfection of PγTR, 12 fields at × 200 were counted. Arrested cells with positive peptide signal were taken as a percentage of the entire population. Cells that were negative for peptide signal did not arrest.

Ytterligare information

How to cite this article: Olmsted, ZT et al . Kinesin-14 and kinesin-5 antagonistically regulate microtubule nucleation by γ-TuRC in yeast and human cells. Nat. Commun. 5:5339 doi: 10.1038/ncomms6339 (2014).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-2

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.