Jak-stat och g-protein-kopplade receptorsignaleringsvägar förändras ofta i epiteliotropisk tarmcelllymfom | leukemi

Jak-stat och g-protein-kopplade receptorsignaleringsvägar förändras ofta i epiteliotropisk tarmcelllymfom | leukemi

Anonim

ämnen

  • Cancergenetik
  • Cancergenomik
  • Cancerterapi
  • Cell signalering
  • Sequencing
  • T-celllymfom

Abstrakt

Epiteliotropiskt tarmcelllymfom (EITL, även känt som typ II enteropati-associerat T-celllymfom) är en aggressiv tarmsjukdom med dålig prognos och dess molekylära förändringar har inte uttömmats i stort. Vi siktade på att identifiera möjliga förändringar på skärmen som skulle möjliggöra bättre diagnostik och / eller behandling av denna dödliga sjukdom. Genom att utföra hel exome-sekvensering av fyra EITL-tumörnormala par, följt av amplikondjup-sekvensering av 42 tumörprover, upptäcktes frekventa förändringar av JAK-STAT och G-protein-kopplad receptor (GPCR) signalvägar i en stor del av prover. Specifikt muterades STAT5B i anmärkningsvärda 63% av fallen, JAK3 i 35% och GNAI2 i 24%, varav majoriteten inträffade vid kända aktiverande hotspots i viktiga funktionella domäner. Dessutom bar STAT5B- lokuset kopieringsneutralt förlust av heterozygositet, vilket resulterade i duplicering av mutantkopian, vilket antydde vikten av mutant STAT5B- dosering för utvecklingen av EITL. Dysregulering av JAK-STAT- och GPCR-vägarna stöds också av genuttrycksprofilering och ytterligare verifierades i patientens tumörprover. Överuttryck in vitro av GNAI2- mutanter ledde till uppregleringen av pERK1 / 2, en medlem av MEK-ERK-vägen. Det är anmärkningsvärt att hämmare av både JAK-STAT och MEK-ERK-vägar effektivt minskade livskraften hos patient-härledda primära EITL-celler, vilket indikerar potentiella terapeutiska strategier för denna neoplasma utan någon effektiv behandling för närvarande tillgänglig.

Introduktion

Enteropati-associerat T-celllymfom (EATL) är ett sällsynt aggressivt primärt tarmceller utan Hodgkin-lymfom som står för 5, 4% av perifera T-celllymfom och 10–25% av alla primära tarmlymfom. 1, 2, 3 EATL ingick i Världshälsoorganisationens klassificering av hematolymfoida neoplasmer för första gången 2008 och består av typ I och typ II. 1 Klassisk eller typ I EATL är känd för att associera med celiaki, HLA-DQ2 och DQ8 haplotyper, och är den vanligaste formen i väst. 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 Tvärtom, typ II EATL är vanligare i Asien och flera studier har misslyckats med att bekräfta en associering med celiaki. 9, 10, 11, 12 Med tanke på de distinkta klinikopatologiska kännetecknen av typ II EATL som beskrivs nedan och bristen på associering med celiaki är termen "enteropati-associerad" i dess nomenklatur inte lämplig och olika namn inklusive monomorf tarm-T-cell lymfom 11 och epiteliotropiskt tarmcell-lymfom (EITL) 13 har föreslagits. I denna studie kommer vi att hänvisa till denna neoplasma som EITL framöver.

EITL har en extremt dålig prognos med en median total överlevnad på bara 7 månader. 13 Det finns för närvarande ingen effektiv behandling eller riktade terapier för denna sjukdom. Ett antal publikationer har fokuserat på den kliniska och patologiska karaktäriseringen av EITL. Tillsammans med andra har vi beskrivit histologin för denna komplexa sjukdom. 11, 13 Kort sagt, EITL visar zonvariation med centrala invasiva ark av monomorfa neoplastiska lymfocyter, en perifer zon av slemhinna infiltrerad av morfologiskt atypiska intraepitelialymfocyter (IEL) och en avlägsen zon med slemhinna med normal villös arkitektur men ökat antal morfologiska normala IEL . Den förmodade ursprungscellen är en tarm-IEL och klonalitetsanalyser har visat att IEL: erna i den avlägsna slemhinneszonen delar klonalt förhållande till det invasiva lymfom. 13, 14 CD8 + CD56 + -fenotyp och omfattande kärnuttryck av megakaryocyt-associerat tyrosinkinas är särdrag som skiljer sig från klassisk EATL, 13, 15 med majoriteten av neoplastiska celler som uttrycker CD8aa-homodimerer. 13 Meningen är fortfarande delad om dessa celler huvudsakligen uppvisar T-cellreceptor (TCR) aP- eller γδ-fenotyper. 11, 13

Cytogenetiska studier har visat vinster och translokationer av MYC (8q24) 10, 13, 16 i EITL, även om de också kan ses i klassisk EATL. 17 Omvänt är vinster på 1q32.2-q41 och 5q34-q35.2 vanligare i EATL jämfört med EITL, medan 9q31.3-vinst och 16q21.1-förlust kan observeras i både klassisk EATL och EITL. 1, 3 Nyligen rapporterades att en aktiverande STAT5B p.N642H-mutation är vanlig i T-celllymfom härrörande från y T-celler, inklusive några fall av EITL. 18 Vi använde nästa generations sekvenseringstekniker i en multicenterstudie för att beskriva de frekventa genetiska förändringarna i EITL. Vi tillhandahåller här den första hel-exome sekvenseringsstudien (WES) av denna sjukdom och visar i den största serien som hittills publicerats att STAT5B- aktiverande mutationer finns i EITL-tumörer av både TCRaP och TCRyδ-ursprung. Vi presenterar flera linjer med bevis för att JAK-STAT och G-protein-kopplad receptor (GPCR) signalvägar är starkt aktiverade i EITL, och, viktigast av allt, hämning av dessa vägar genom målinriktad terapi minskar effektiviteten hos primära EITL-celler.

Material och metoder

Patienter och prover

EITL definierades som ett primärt T-celllymfom i tarmen med karakteristisk morfologi, typiskt med cytotoxisk, CD3 + CD8 + CD56 + EBER-fenotyp. Fem frysta primära tumörer och matchade helblodsprov erhölls från SingHealth Tissue Repository. Patienterna rekryterades från 2010 till 2014 och alla gav undertecknat informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Ytterligare 41 arkivformalin-fixerade paraffin-inbäddade prover som samlats in från 2003 till 2014 erhölls från följande centra: National Cancer Center Singapore, Singapore General Hospital, National University Hospital och Tan Tock Seng Hospital i Singapore, Guangdong General Hospital och Sun Yat- sen University Cancer Center i Kina, University of Malaya och Hospital Raja Permaisuri Bainun i Malaysia, Samsung Medical Center i Korea, Chi Mei Medical Center i Taiwan och Mahidol University i Thailand. Fjorton av dessa användes också i vår tidigare studie med samma identifierare. 13 klinikopatologiska egenskaper listas i tilläggstabell 1. Tumörcellinnehåll bedömdes med hematoxylin och eosinfärgning. Studien godkändes av SingHealth Centralized Institutional Review Board (2004/407 / F).

Sekvens- och mutationsanalys

Detaljerade metoder beskrivs i den kompletterande informationen. Kortfattat sekvenserades fyra tumörnormala par av EITL genom fullständig exome med användning av SureSelectXT Human All Exon V4 + UTRs-fångst (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) och HiSeq 2000 Sequencing System (Illumina, San Diego, CA, USA). Alla kandidatvarianter inspekterades visuellt i Integrative Genomics Viewer. 19, 20 Endast Integrative Genomics Viewer-true mutationer ansågs somatiska och varianter med frekvens 15% validerades ytterligare genom Sanger-sekvensering (kompletterande tabell 2).

Prevalensscreening utfördes för GNAI2- , JAK3- och STAT5B- gener i 42 tumörprover med användning av djup amplikonsekvensering. Endast vanliga hotspots rapporterade i COSMIC v.72 och regioner identifierade genom WES sekvensbestämdes för varje gen (kompletterande tabell 3). CREBBP- mutationsfrekvens bestämdes i en partiell prevalensgrupp (16 fall) med användning av Single Primer Anrichment Technology (NuGEN Technologies, San Carlos, CA, USA).

SNP-genotypningsuppsättning och allelspecifik kopianalysanalys av tumörer

Genomiskt DNA från fyra tumörnormala par hybridiserades till Genome-Wide Human Single-Nucleotide Polymorphism (SNP) Array 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) chips. Allelspecifik kopienummeranalys av tumörer utfördes såsom beskrivits tidigare. 21

Stabil cellinjekonstruktion och western blot

GNAI2- cDNA i full längd amplifierades med användning av AccuPrime Pfx-DNA-polymeras (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och klonades till retroviral vektor MIGR1 (Addgene; plasmid nr. 27490) 22 vid Xho I och Eco RI-ställen. GNAI2- mutationer (c.535C> T för p.R179C och c.535C> A för p.R179S) genererades av QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) och bekräftades genom Sanger-sekvensering.

HuT78- och Jurkat-cellinjerna var från ATCC (Manassas, VA, USA) och upprätthölls i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (Invitrogen) kompletterat med 20% fetalt bovint serum (HyClone; GE Healthcare, Little Chalfont, UK) och RPMI-1640 (Invitrogen) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (HyClone; GE Healthcare). Kulturerna kontrollerades rutinmässigt för mycoplasma-kontaminering. Stabila cellinjer genererades genom retroviral infektion och sortering av gröna fluorescerande proteinpositiva celler med användning av BD FACSAria III Cell Sorter (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Proteinextrakt framställdes i RIPA-celllysbuffert (150 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, 0, 5% deoxikloratnatrium, 200 mm NaF, 200 mm PMSF, 1% NP-40 och 1 mm EDTA) i närvaro av färskt tillsatt proteas hämmare (Roche, Basel, Schweiz). HuT78-linjer genomgick serum-svält i 24 timmar före insamling av proteinlysater. Totala proteinextrakt separerades på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel och överfördes till Trans-Blot Turbo Mini PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De använda antikropparna listas i tilläggstabell 4. Signaler visualiserades med hjälp av ChemiDoc MP System (Bio-Rad).

Exvivo-cellviabilitetsanalys i primära EITL-celler

Primära EITL-celler från patient 065T injicerades subkutant i NOD scid gamma (NSG) mus (P1; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), följt av ytterligare passering av de subkutant bildade tumörcellerna genom subkutan och intraperitoneal injektion (P2 ). Åtta veckor gamla kvinnliga djur användes i varje passage. P2-mus presenterade med mycket svullna bukhinnor och tarm- och buktavlar. Alla prover, inklusive peritoneala vätskeceller från P2, karakteriserades histologiskt av en senior hematopatolog (SYT) och diagnostiserade EITL. På grund av den konsekventa fenotypen mellan patientens primära tumör och P2 peritoneala vätskeceller, kommer vi att hänvisa till den senare som primära EITL-celler framöver. Sanger-sekvensering bekräftade närvaron av alla somatiska mutationer identifierade i den ursprungliga tumören (kompletterande tabell 5) också i de primära cellerna. Djurförsök överensstämde med etiska föreskrifter från SingHealth Institutional Animal Care and Use Committee.

Primära EITL-celler upprätthölls i RPMI-1640 (Invitrogen) kompletterat med 10% humant serum (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) och 500 IE / ml interleukin-2 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). För att testa genomförbarheten av målinriktad terapi i EITL, sås 5 × 103 celler i 96-brunnars plattor i tre tekniska replikat och behandlades med Stattic (CAS 19983-44-9; Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) och MEK-hämmare PD0325901 (CAS 391210-10-9; Axon Medchem, Groningen, Nederländerna) under 72 timmar, och Tofacitinib (CP 690550; Selleck Chemicals), Trametinib (GSK 1120212; Axon Medchem) och Gefitinib (ZD 1839; Axon Medchem) för 96 h vid angivna koncentrationer. Cellviabilitet mättes med användning av CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA). Effektiviteten av hämmare utvärderades vidare genom deras effekt på nedströmsmål med användning av Western blot. Celllysat för PD0325901, Trametinib och Tofacitinib uppsamlades 2 timmar och för Stattic 24 timmar efter behandling. Dos-svarskurvor plottades med hjälp av programvaran Prism (GraphPad, La Jolla, CA, USA). Alla läkemedelsbehandlingsexperiment upprepades minst två gånger med varje hämmare.

Anslutningsnummer

Sekvensdata från WES, Single Primer Anrichment Technology och amplicon deep sequencing har deponerats i European Nucleotide Archive med anslutningsnumret PRJEB9720. Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 och GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array-data finns tillgängliga i Gene Expression Omnibus 23 med accessnumret GSE70654.

resultat och diskussion

Identifiering av somatiska varianter av WES

För att identifiera somatiska mutationer i EITL utförde vi WES av fyra tumörer med matchande helblodsprover (figur 1a). För att maximera variantdetektering från en begränsad provstorlek applicerades tre olika varianter som ringde - Genomanalys Toolkit, 24 MuTect 25 och Strelka. 26 Det genomsnittliga täckningsdjupet var 126 × och i genomsnitt täcktes 88% av riktade baser av minst 20 läsningar (kompletterande tabell 6). Sangervalidering av 296 kandidatvarianter visade en falsk-positiv hastighet på 3, 72%. EITL-prover uppvisade en hög mutationsbörda med i genomsnitt 85 mutationer per prov (intervall 59–137). Totalt 340 identiska somatiska mutationer identifierades i 313 gener. Sju av dessa gener innehöll också tysta somatiska mutationer (kompletterande tabell 5). De nonsynonyma varianterna innefattade 284 missense- och 16 nonsensmutationer, 13 bildskiftindelar, 25 splitsningsstationer och 2 mutationer vilket resulterade i förlust av stoppkodon (kompletterande figur 1a). Som observerats i de flesta andra cancerformer kännetecknades 27, 28 EITL-mutationsspektrum av övervägande av C> T-övergångar (kompletterande figur Ib).

Image

Grafisk översikt av studien samt mutations- och subklonalitetsprofil för EITL-tumörer. ( a ) Typer analyser som utförts och antalet prover som använts för varje experiment. Snäppfrysta fall listas med deras respektive ID. ( b ) Venn-diagram som illustrerar de återkommande mutationerna i upptäcktskohorten. ( c ) Den subklonala arkitekturen för EITL-prov 013T härledd från SciClone-analys. Den övre plottingen visar uppskattning av kärntäthet och de nedre variantens allelfrekvenser plottade mot läsdjupet (20 × täckning) i kopieringsneutral förlust av heterozygositetsfria regioner. CNA, kopieringsnummeranalys; FFPE, formalin-fixerad paraffin-inbäddad; GEP, genuttrycksprofilering.

Bild i full storlek

Totalt 14 gener hittades återkommande muterade (figur Ib och kompletterande tabell 5). Bland dessa var kalciumjonbindande genmultipla EGF-liknande domäner 6 ( MEGF6 ), regulator för cellstorlek p rolinrik 16 ( PRR16 ) och det jätte muskelproteinet Titin ( TTN ), gener med funktioner i neuronal migration, axon vägledning och kemoattraktion - R eelin ( RELN ), rondellen 1 ( ROBO1 ) och Semaphorin 3 A ( SEMA3A ) -och med funktioner i rörelse och transport av cilia- Dynein 9 ( DNAH9 ) och Intraflagellar Transport 140 ( IFT140 ). Dessutom identifierades mutationer i histonacetyltransferas- CREB-bindande protein ( CREBBP ) och två (förmodade) histonmetyltransferaser - ytterligare könskamliknande transkriptionell regulator 3 ( ASXL3 ) och SET-domäninnehållande 2 ( SETD2 ) -störande den epigenetiska dysreguleringen kan ha en roll i EITL.

Intressant nog presenterade tre av de återkommande muterade generna med kända aktiverande hotspot-varianter. Dessa inkluderade två viktiga medlemmar av JAK-STAT-vägen, en central signaleringskaskad i immunceller - janus kinase 3 ( JAK3 ) och signalomvandlare och aktivator för transkription ption 5B ( STAT5B ) - och G-protein alfa-hämmande aktivitetspolypeptid 2 ( GNAI2 ), en medlem av familjen av G-proteiner. Anmärkningsvärt muterades STAT5B i alla fyra fallen, vilket antydde en kritisk roll i EITL-bildningen. Tre prover hade den vanliga p.N642H-mutationen, medan den fjärde innehöll en komplex substitutionshändelse i början av exon 17, vilket resulterade i två aminosyraförändringar - p.V712E och p.S715L (se kompletterande anmärkning och kompletterande figur 2). Både JAK3 och GNAI2 muterades i anmärkningsvärda 2/4 fall. JAK3- förändringar inträffade vid två distinkta aktiverande positioner (p.V674A och p.M511I), medan GNAI2 muterades i samma kodon i båda proverna (p.R179C och p.R179S).

För att förstå den klonala arkitekturen för EITL-tumörer använde vi SciClone 29 för att identifiera populationer av celler som innehöll specifika mutationer. Samtliga fyra upptäcktskohortprover visade påtaglig intratumor heterogenitet med fem subkloner närvarande i varje tumörprov (figur 1c, kompletterande figur 3 och kompletterande tabell 7). Eftersom endast kopierneutral förlust av heterozygositetsfria segment analyserades, kunde vi inte fastställa om JAK3- och STAT5B- mutationerna var belägna i olika underkloner. Men respektive korrigerade variant allelfrekvenser indikerar att dessa mutationer är belägna inom två separata kloner (kompletterande tabell 5).

Prevalensscreening av GNAI2 , JAK3 , STAT5B och CREBBP

Den höga frekvensen för STAT5B- , JAK3- och GNAI2- mutationer i en liten upptäcktskohort av endast fyra prover var spännande, vilket fick oss att ytterligare analysera prevalensen av dessa mutationer i en större serie EITL-prover. Fyrtiotvå ytterligare EITL-tumörer (1 snäppfryst och 41 arkivprover) screenades med avseende på GNAI2 , JAK3 och STAT5B- mutationer med användning av djup amplikonsekvensering. Totalt 57 identifierade mutationer täcktes av i genomsnitt 20 004 läsningar (intervall 104–175 515; kompletterande tabell 8). Eftersom amplikonerna endast täckte vanliga mutationshotspots rapporterade i COSMIC v.72 och positioner identifierade i upptäcktskohorten, är det troligt att våra resultat är lägre bundna uppskattningar av den verkliga mutationsfrekvensen för dessa tre gener.

Figur 2 sammanfattar resultaten från både upptäckts- och prevalensgrupperna. STAT5B- mutationer detekterades i 25/42 (60%) fall, med 24/42 (57%) som bär kända aktiverande mutationer (p.N642H) i Src-homologin 2-dimeriseringsdomänen (figur 2b). JAK3 muterades i 14/42 (33%) prover med 13/42 (31%) innehållande aktiverande mutationer (p.M511I, p.A573V och p.V674A / F), majoriteten lokaliserad i pseudokinasdomänen (figur 2c) . Vi identifierade två prover som bär två separata JAK3- aktiverande mutationer och en anmärkningsvärd tre aktiverande mutationer identifierades i ett tredje fall som indikerade djup förändring av JAK3- funktion hos dessa patienter. Noterbart innehöll ingen av dessa prover en aktiverande STAT5B- mutation (figur 2a). Sammantaget ändrades JAK-STAT-vägen i 32/42 (76%) fall. Det är anmärkningsvärt att en stor delmängd av tumörer har samverkande aktiverande mutationer i två medlemmar av samma väg. Ett liknande fenomen beskrivs nyligen för JAK1 och STAT3 i systemiska ALK-negativa anaplastiska stora T-celllymfom. 30 Dessutom visades dessa mutanter att fungera i synergi för att konstitutivt aktivera nedströms STAT3-signalering. Ytterligare studier för muterad JAK3 och STAT5B är således motiverade och kan belysa EITL-tumorigenes.

Image

Ofta muterade gener i EITL identifierade med WES och amplicon djup sekvensering. ( a ) Mutationsfrekvenser för STAT5B , JAK3 och GNAI2 som korrelerar med CD8-dimer och TCR-typ. Distribution av mutationer i ( b ) STAT5B , ( c ) JAK3 och ( d ) GNAI2 gener. Frekvensen för varje förändring anges inom parentes efter dess etikett. Fyllda cirklar indikerar kända mutationshotspots och tomma cirkelmutationer med okänd funktionell konsekvens. * Totalt fyra identifierade missense-mutationer identifierade vilket resulterade i förändring av två aminosyror. G, GTP-bindning; ND, inte gjort; SH2, Src Homology 2; TA, transkriptionell aktiveringsdomän; TCR, T-cellreceptor.

Bild i full storlek

GNAI2- mutationer observerades i 9/42 (21%) prover. Två viktiga hotspots identifierades - p.R179 och p.T182 - båda lokaliserade i GTP-bindande domän (figur 2d) och är kända aktiveringsvarianter. 31, 32, 33 Ett enda fall visade sig innehålla båda mutationer. Även om de uppvisar en lägre mutationsincidens jämfört med STAT5B och JAK3 , har det föreslagits att de lägre frekvenserna för G-protein a-subenheter kan förklaras med mutationer i receptorer kopplade till dessa G-proteiner. 34 På den anmärkningen har både GNAI2 -upptäcktskohortprover av vildtyp somatiska mutationer i GPCR: er (kompletterande tabell 5). Det skulle därför vara intressant att analysera mutationsprevalensen av GPCR och andra medlemmar av Gai i signalering i en större kohort för att bestämma frekvensen vid vilken denna kaskad ändras i EITL.

Förändringar i alla tre generna befanns inte vara ömsesidigt exklusiva ( JAK3 vs STAT5B : P- värde = 0.2527; GNAI2 vs STAT5B : P- värde = 0.5118; GNAI2 vs JAK3 : P- värde = 0.9998; ensidig Fishers exakta test med CoMEt 35 ). På grund av det begränsade antalet händelser kunde vi inte analysera subklonaliteten för amplicon djup sekvenseringsdata; emellertid antyder korrigerade variant-allelfrekvenser att flera mutationer i alla tre generna kan hittas både inom samma såväl som i olika subkloner (kompletterande tabell 8).

Vi analyserade också mutationsfrekvensen för CREBBP i en partiell prevalenskohort av 16 prover. Mutationer identifierades i 2/16 (13%) fall, och totalt muterades CREBBP i 6/20 (30%) prover (kompletterande figur 4 och kompletterande tabell 9). Inaktiverande CREBBP- mutationer har rapporterats i ett antal maligniteter, inklusive B-celllymfom, 36, 37 och mutationerna har beskrivits som tidiga händelser associerade med sämre resultat. 38, 39 Även om varje identifierad variant förutsågs vara störande i våra serier, inträffade alla mutationer i prover med sammanfallande STAT5B- och / eller JAK3- mutationer, vilket antyder att CREBBP- mutationer kanske inte är den viktigaste initierande händelsen och ytterligare stödjer vikten av aktiverade JAK- STAT-väg i EITL.

Korrelation av mutationer med patologiska drag

Den identifierade STAT5B- mutationsfrekvensen är nästan dubbelt så stor som i en tidigare publicerad studie av EITL med TCRyδ-uttryck. 18 Eftersom den senare förlitade sig på Sanger-sekvensering kan denna skillnad åtminstone delvis förklaras av den lägre känsligheten för Sanger-sekvensering. Våra observationer stöder emellertid inte hypotesen att STAT5B- aktiverande mutationer endast förekommer i TCRyδ-linjen för EITL: er som aktiverande varianter identifierades lika i TCRaP, TCRγδ, dubbelnegativa och avvikande dubbelpositiva fall (20%, 36%, 32 % respektive 12% i varje delmängd; Figur 2a och kompletterande tabell 10). En liknande observation gjordes också för JAK3- och GNAI2- aktiverande mutationer.

Vi separerade proverna ytterligare genom expression av CD8-dimer. Aktiverande mutationer av varje gen var närvarande i tumörer med CD8aα, CD8aβ och dubbelnegativa T-celler, med mer än hälften av prover med STAT5B- aktiverande varianter av typen CD8aα (61% CD8aα, 26% CD8aβ och 13% dubbel negativa ; Tilläggstabell 10). Detta överensstämmer med uppfattningen att EITL huvudsakligen är en tumör av CD8aα IEL. 13 Det är viktigt att det inte finns någon fenotypisk variation mellan de mutanta fallen med olika TCR- och / eller CD8-uttryck (kompletterande figurer 5 och 6).

Kopiera nummerändringar i EITL

För att karakterisera kromosomavvikelserna i EITL, profilerade vi alla prover från upptäcktskohorten på ett genom-brett SNP-array. Alla tumörer var ungefär diploida. Vi identifierade var och en av de tidigare rapporterade frekventa kromosomala förändringarna (förlust av 16q12, 1 och vinster på 9q31, 3 och 8q24) 1, 3, 10, 13 återkommande förändrade i 2/4 prover (kompletterande tabell 11). Detta inkluderar amplifiering av MYC- genen (fyra kopior i två prover). Det är viktigt att inga vinster på 1q32.2-q41 och 5q34-q35.5, förändringar vanligare i klassisk EATL jämfört med EITL, identifierades. Andra återkommande förluster inkluderade 8p, 11q och 12p och en vinst på 7q (detaljerade regioner i tilläggstabell 11).

Det är anmärkningsvärt att alla fyra proverna visade kopierneutral förlust av heterozygositet vid kromosom 17q där STAT5B är beläget (figur 3a och b). Detta fenomen har tidigare observerats i JAK2 och JAK3 i andra hematologiska neoplasmer, 40, 41 och tros uppstå från somatiska rekombinationshändelser. Så vitt vi vet är detta första gången förvärvad uniparental disomi har beskrivits för STAT5B och indikerar vidare den avgörande roll som denna gen har spelat i utvecklingen av EITL. I överensstämmelse med detta avslöjade immunohistokemisk analys av prover med muterad STAT5B märkbar uppreglering av fosforylerad STAT5 (kompletterande tabell 12), ett exempel på vilket visas i figur 3c. Det skulle vara intressant att se om det finns en övergång från heterozygositet till homozygositet antingen histologiskt från avlägsna slemhinnor till central tumörzon eller kliniskt från primär diagnos till återfall som representerar klonal evolution som observerats i andra tumörer. 41, 42

Image

Förvärvat uniparental disomi i STAT5B- lokuset. ( a ) Allel-specifik kopienummeranalys av tumör (ASCAT) närbilder av två STAT5B-mutantprover som belyser kromosom 17q. De övre panelerna visar SNP: s råa (röda) och segmenterade (gröna) B-allelfrekvenser (BAF). De nedre panelerna visar alla-specifika kopieringsnummerprofiler - röda linjer indikerar de högre och gröna de lägre kopiorna kromosomala haplotyper. Den gröna linjen är noll, vilket indikerar förlust av heterozygositet. ( b ) Sanger-sekvensering av elektropherogram som visar närvaron av STAT5B somatisk mutation i samma prover. ( c ) Representativa bilder av pSTAT5 immunohistokemisk färgning i STAT5B vildtyp och mutantfall. Förstoring × 400. VAF, variant allelfrekvens från WES.

Bild i full storlek

Vi identifierade också två prover med amplifiering av PIK3CG- genen (respektive fem och fyra kopior) som också var tydlig på proteinnivå både för PIK3CG själv och nedströms PAKT i ett prov (kompletterande figur 7). Förekomsten av sådan amplifiering bör studeras i en större kohort eftersom det kan öppna nya möjligheter för riktad terapi. Den första PI3K-hämmaren används redan för behandling av vissa B-cell-maligniteter med många fler för närvarande under utveckling. 43

Vägar och biologiska funktioner påverkas av EITL

För att identifiera viktiga biologiska funktioner och signalvägar som påverkades i EITL, användes två olika tillvägagångssätt - Ingenuity Pathway Analys (IPA) av muterade gener från WES och Gene Set Anrichment Analysis (GSEA) efter genuttrycksprofilering av EITL-tumörer.

Bland alla muterade gener hittades huvudsakliga cellulära funktioner såsom celldöd, överlevnad, utveckling, differentiering, homeostas och proliferation signifikant berikad (kompletterande tabell 13), varav många påverkade lymfocyter eller T-celler specifikt. Dessutom var muterade gener också signifikant associerade med komponenter involverade i T-cell- och tarmmorfologi och gener kända för att vara involverade i cancer och lymfoida maligniteter. Det är viktigt att anrikning av cellsignalering och DNA-bindning noterades också. Alla dessa antyder att viktiga cellfunktioner är involverade i utvecklingen av EITL och korrelerar väl med sjukdomen.

Ytterligare stöd för våra genomiska fynd, kanonisk JAK-STAT och GPCR-signalering var bland de toppanrikade IPA-vägarna (falsk upptäcktsfrekvens q- värde = 0, 24 respektive 0, 03; tilläggstabell 14). Dessutom förändrades flera andra aspekter av dessa kaskader, vilket indikerar vikten av GNAI2 , JAK3 och STAT5B- mutationer som beskrivits ovan. Dessa inkluderar rollen för JAK1 och JAK3 i yc-cytokinsignalering, Oncostatin M-signalering, interleukin-2 och interleukin-9-signalering, cAMP-medierad signalering och Ga-signalering. Molekylära mekanismer för cancer konstaterades också berikade, vilket tyder på att klassiska cancergener deltog i denna sjukdom. Det senare stöds av upptäckten av minst en muterad tumörsuppressor eller onkogen i båda fallen (kompletterande tabell 5). Eftersom IPA inte beaktar återfall av genförändringar, upprepade vi analysen med listan över återkommande muterade gener. Det är viktigt att alla de ovannämnda vägarna, med undantag av Gαi-signalering, hittades signifikant berikade i EITL (kompletterande tabell 15).

För att verifiera ovanstående genom ett icke-relaterat tillvägagångssätt utförde vi genuttrycksprofilering av fyra EITL-tumörer, två av CD8aa och två med CD8aP-ursprung. Eftersom EITL föreslås komma från CD8 + IEL: er, 13 integrerade vi våra data med offentligt tillgänglig profil av CD8aα och CD8aβ T-celler från friska donatorer. 44 Det var totalt 1760 gener signifikant uppreglerade i EITL-tumörer ( P <0, 05 och vikningsändring 1, 5; kompletterande tabell 16). GSEA mot molekylära signaturer databasgenuppsättningar 45 användes för att identifiera deregulerade vägar. De använda genuppsättningarna och all statistik från GSEA visas i kompletterande tabell 17. Det är anmärkningsvärt att GSEA oberoende bekräftade resultaten från IPA-analys med användning av muterade gener från WES. Flera aspekter av GPCR-signalering hittades signifikant berikade i EITL-prover inklusive GPCR-ligandbindning, signalering med GPCR och, viktigare, Ga-signalering (Kompletterande figur 8). Dessa antyder tydligt en markerad avreglering av Ga-signalering i EITL och indikerar vidare den funktionella betydelsen av upptäckta GNAI2- mutationer.

Dessutom identifierade vi också KEGG JAK-STAT signalväg som betydligt berikad i EITL: er. Q- värdet på den högre sidan (kompletterande tabell 17) är i detta avseende inte förvånande eftersom aktiveringen av JAK-STAT-vägen är känd för att ske genom proteinfosforylering och inte ökat uttryck av mRNA. Ännu viktigare identifierades en enastående förening med gener som innehöll STAT5B- bindningsställen i deras promotorer, både för det kortare och längre konsensusmotivet. Vi bekräftade detta ytterligare av GSEA mot allmänt tillgängliga genuppsättning av STAT5 -målgener. 46 Det fanns en signifikant anrikning mellan STAT5- mål och gener som var uppreglerade i EITL (normaliserad anrikningsscore = 1, 78, falsk upptäcktsgrad q- värde <0, 001; Kompletterande figur 8d).

Genuttrycksprofileringsdata validerades genom realtids-PCR för slumpvis utvalda gener (kompletterande tabell 18). Värdena från de två experimenten var konstanta, även om korrelationen inte var statistiskt signifikant på grund av den lilla provstorleken (kompletterande figur 9). Sammanfattningsvis visades JAK-STAT och GPCR-signalvägar som signifikant berikade i EITL-tumörer med användning av två olika datamängder och metoder.

Riktad terapi hämmar livskraften hos primära EITL-celler

Medan aktivering av mutationer i gener som kodar för a-underenheter av G-proteiner förekommer i många humana cancerformer, finns onkogena förändringar i de hämmande underenheterna av G-proteiner med en mycket lägre frekvens. 34 Onkogen form av GNAI2 ( GNAI2 p.R179C / H), kallad gip2 , 32 identifierades först i endokrina tumörer i binjurebarken och äggstocken, 31 och p.T182A beskrivs därefter också som en konstitutivt aktiverad mutant. 33 Noterbart visade sig att gip2 konstitutivt aktiverade mitogen-aktiverat proteinkinas, 47 troligen genom hämmande effekt på intracellulära cAMP-nivåer. 48

För att bättre förstå ovanstående skapade vi stabila cellinjer som överuttryckte vildtyp- och mutantformer (p.R179C och p.R179S) av GNAI2 . En stark uppreglering av fosforylerad ERK1 / 2-nivå detekterades i båda mutanta celler, medan de totala ERK1 / 2-proteinnivåerna förblev oförändrade (figur 4a). Samma observation gjordes i två oberoende cellinjer. I överensstämmelse med detta avslöjade immunhistokemisk analys av GNAI2- mutanta fall också uppreglering av fosforylerad ERK1 / 2 (kompletterande tabell 12), exempel som visas i figur 4b, vilket antyder att MEK-ERK-signalvägen är avvikande aktiverad i dessa EITL-tumörer.

Image

Effektiv målinriktad terapi av JAK-, STAT- och MEK-hämmare i primära EITL-celler. ( a ) Stabila cellinjer skapades genom överuttryck av GNAI2 vildtyp och mutanter i HuT78- och Jurkat-celler. Uttrycket av relevanta proteiner bedömdes med Western blot. ( b ) Representativa bilder av pERK1 / 2-immunohistokemisk färgning i GNAI2 vildtyp och mutanta tumörer. Förstoring × 400. ( c ) Representativ e x vivo -cellviabilitetsanalys i primära EITL-celler behandlade med PD0325901 och Stattic under 72 timmar, och Tofacitinib, Trametinib och Gefitinib under 96 timmar. Alla resultat normaliseras till kontrollen (dimetylsulfoxid (DMSO)) och presenterades som medelvärde ± sd. Experimentet upprepades minst två gånger med varje hämmare. ( d ) Immunoblots av indikerade proteiner i primära EITL-celler behandlade med PD0325901, Tofacitinib och Trametinib för två och Stattic under 24 timmar vid indikerade koncentrationer.

Bild i full storlek

Speciellt erbjuder identifiering av aktiverade vägar i EITL nya behandlingsmöjligheter. JAK3 och STAT5B är båda direkt målbara av små molekylinhibitorer, och eftersom mutant GNAI2 aktiverar MEK-ERK-vägen, kan MEK-hämmare vara effektiva för behandlingen av EITL. För att ytterligare bekräfta involveringen av JAK-STAT och GPCR-signalvägar i överlevnaden av EITL, utvärderade vi effekten av två hämmare av båda vägarna i primära EITL-celler - Tofacitinib (pan-JAK-hämmare), Stattic (STAT3-hämmare) och MEK-hämmare Trametinib och PD0325901. Alla fyra hämmare minskade cellviabiliteten på ett dosberoende sätt jämfört med den fordon-behandlade kontrollen (figur 4c). Det är viktigt att de primära cellerna var resistenta mot en hämmare av en icke relevant bana, EGFR-hämmaren Gefitinib, vilket antydde att den observerade effekten inte berodde på allmän cytotoxicitet. Dessutom inhiberade alla fyra läkemedlen tydligt nedströms signaleringskaskader, vilket visades genom undertryckande av STAT3, STAT5 och ERK1 / 2-fosforylering (figur 4d).

Dessa primära EITL-celler har mutationer i både JAK3 och nedströms STAT5B , vilket kan förklara Tofacitinibs underlägsen känslighet jämfört med Stattic. Ytterligare stöd för våra data, JAK-STAT-kaskadinaktivering antingen genom knockdown av banmedlemmar eller målinriktad terapi minskar också effektivt cellviabiliteten hos kutana T-celllymfomceller som har en aktiverande p.A573V JAK3- mutation. 49, 50, 51, 52 Trots bristen på GNAI2- mutation i de primära EITL-cellerna är flera andra medlemmar av GPCR-vägen - GPCR: er HTR1F , GRM5 , MRGPRX3 och GPR179 och proteintyrosinfosfatas DUSP4 (kompletterande tabell 5) - alla förändras i dessa celler som potentiellt kan leda till nedströmsaktivering av GPCR-vägen. Det är viktigt att DUSP4 är känt för att inaktivera ERK1 / 2. 53 Den p.R300W-mutation som identifierats i de primära EITL-cellerna är placerad mitt i DUSP4-katalytiska fosfatas-domänen med dubbelspecificitet. Som vanligt observerats för mutationer inom de funktionella domänerna för enzymer är det troligt att den identifierade p.R300W-mutationen orsakar inaktivering av DUSP4-proteinet som leder till aktivering av ERK-proteiner och kan förklara effektiviteten av MEK-hämning i dessa celler. Dessutom är GPCR, Ga och MEK-ERK-vägar alla anmärkningsvärda anrikade i det ursprungliga tumörprovet (kompletterande figur 8a och c), vilket ytterligare stödjer den avvikande aktiveringen av dessa signalvägar. Sammantaget indikerar dessa resultat att målinriktad terapi kan vara användbar vid behandling av EITL-patienter.

Slutsatser

Detta är den första studien som omfattande karaktäriserar de molekylära förändringarna i EITL och ger ny insikt om patogenesen för denna sjukdom. Vi har tydligt visat förändringar i JAK-STAT och GPCR signalvägar på flera nivåer, inklusive mutationer, kromosomala förändringar och transkriptionell uppreglering. Den höga mutationsfrekvensen och platsen för mutationer i viktiga funktionella domäner indikerar vikten av dessa varianter och kan särskilt ge nya möjligheter för målinriktade terapier eller bättre diagnostik. Detta stöds av våra in vitro- data som visar svar från primära EITL-celler på hämmare av båda vägarna. Ytterligare studier krävs för att stödja dessa resultat och för att funktionellt utvärdera dem i en sjukdomsspecifik modell.

anslutningar

Genuttryck Omnibus

  • GSE70654
  • PRJEB9720

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabeller

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)