Itraq-baserad proteomisk analys av epineel av svin-njurepitel 15 infekterade med pseudorabiesvirus | vetenskapliga rapporter

Itraq-baserad proteomisk analys av epineel av svin-njurepitel 15 infekterade med pseudorabiesvirus | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • proteomik
  • Sequencing

Abstrakt

Pseudorabiesvirus (PRV) är en av de viktigaste patogenerna av svin, vilket resulterar i allvarliga ekonomiska förluster för svinindustrin. För att förbättra vår förståelse för värdens svar på PRV-infektion applicerade vi isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) märkning i kombination med vätskekromatografi-tandem-masspektrometri för att kvantitativt identifiera de differentiellt uttryckta cellproteinerna i PRV-infekterade PK15-celler. Totalt identifierades relativa kvantitativa data för 4333 proteiner i PRV och mock-infekterade PK15-celler, bland vilka 466 cellproteiner uttrycktes differentiellt, inklusive 234 uppreglerade proteiner och 232 nedreglerade proteiner. Bioinformatikanalys avslöjade att de flesta av dessa differentiellt uttryckta proteiner var involverade i metabola processer, celltillväxt och proliferation, endoplasmatisk retikulum (ER) stressrespons, cellvidhäftning och cytoskelett. Dessutom bekräftades expressionsnivåer av fyra representativa proteiner, beta-catenin, STAT1, GRB2 och PCNA genom Western blot-analys. Detta är det första försöket att analysera proteinprofilen för PRV-infekterade PK15-celler med hjälp av iTRAQ-teknik, och våra resultat kan ge värdefull information för att förstå värdens svar på PRV-infektion.

Introduktion

Pseudorabiesvirus (PRV eller suid herpesvirus 1) är medlem i släktet Varicellovirus, familj Herpesviridae. PRV är det orsakande medlet vid Aujeszkys sjukdom, som kan orsaka neurologiska och andningsorganiska störningar hos unga smågrisar och döda fostret och / eller abort hos gravida suvor. PRV har alltså stora ekonomiska konsekvenser i svinodlingen 1, 2 . PRV har ett dubbelsträngat DNA-genom med en längd på cirka 150 kb och kan infektera ett brett spektrum av vilda och inhemska djurarter, inklusive idisslare, rovdjur och gnagare. Grisar är de enda naturliga värdarna för PRV 2, 3, 4 . Vacciner används ofta för att minska de ekonomiska förlusterna orsakade av PRV-infektion 5, 6 . Under 2012 orsakade dock ett oöverträffat storskaligt utbrott av pseudorabies hos grisar i norra och östra Kina enorma ekonomiska förluster för svinindustrin 6 .

Patogenesen för PRV-infektion och interaktioner mellan PRV och svinceller förstås för närvarande inte 7, 8, 9 . Proteomiska tillvägagångssätt tillhandahåller effektiva verktyg för att underlätta en omfattande karaktärisering av virus-värdinteraktioner, till exempel tvådimensionell gelelektrofores (2DE) och matrisassisterad laserdesorption-jonisering-mass-spektrometri-time-of-flight (MALDI-TOF / MS) har använts för att tillhandahålla proteomiska uttrycksprofiler för värdceller som svar på virusinfektioner, inklusive klassiskt svinpestvirus 10, svårt akut respiratoriskt syndrom 11, H1N1 influensavirus 12 och mjälte- och njurekrosvirus 13 . Stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) har också använts för att identifiera de differentiellt uttryckta proteinerna av virala infektioner, inklusive dengue-virus typ 2 14, porcint reproduktions- och respiratoriskt syndromvirus 15, Enterovirus 71 16 och herpes simplexvirus typ 1 17 . Dessa studier har gett omfattande insikt i att förstå värdens svar på viral infektion och har också lyfts fram de potentiella antivirala medlen som kan rikta in sig på de olika typerna av virusinfektion.

Isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) i kombination med LC-MS / MS-analys har framkommit som en kraftfullare kvantitativ proteomisk metod eftersom denna metod är mer känslig än traditionella proteomiska metoder, särskilt för att kvantifiera proteiner med låg mängd i de testade proverna 18 19, 20 . Den iTRAQ-baserade kvantitativa proteomiska tekniken har använts för studier av virus-värdinteraktioner, som inkluderar svincirkovirus typ 2 21, svinproduktivt och respiratoriskt syndromvirus 22, svinepidemisk diarrévirus 23, bluetongue-virus 24 och transmissibelt gastroenteritvirus 25 . Hittills har mekanismerna för PRV-patogenes och interaktionen mellan PRV och svinceller inte helt förståts. Det är välkänt att epitelceller från svin-njurar (PK15) används mest för PRV-isolering, förökning och grundforskning. I den aktuella studien använde vi iTRAQ i kombination med LC − MS / MS för att identifiera cellulära proteiner som uttrycks differentiellt i PK15-celler infekterade med PRV. Resultaten visade att 466 proteiner signifikant förändrades efter PRV-infektion. Dessa proteiner kan tjäna som potentiella biomarkörer för PRV-infekterade celler och ge ny insikt i den reglerande mekanismen för denna sjukdom.

Resultat

Kinetik för PRV-förökning i PK15-celler

För att bestämma kinetiken för PRV-propagering i PK15-celler och den optimala tidpunkten för proteomisk analys infekterades PK-15-celler med PRV och övervakades sedan med avseende på CPE och viralt proteinuttryck, utöver de virala titrarna, som detekterades vid 12, 24, 36 och 48 hpi. Såsom visas i fig. 1A var ingen uppenbar CPE synlig vid 12 hpi; emellertid blev CPE lätt uppenbar när infektionen fortsatte. Tydlig CPE observerades vid 24 hpi och blev signifikant vid 36 och 48 hpi, inklusive cellrundning, svullnad, granulär degeneration av cytoplasma, cellavskiljning och allvarligt sjuka cellmorfologi. Uttrycket av PRV-protein övervakades av IFA, och resultaten visade att nästan alla celler infekterades vid 24 hpi (fig. IB). Enstegs tillväxtkurva för PRV i PK-15-celler bedömdes också. Den virala titern toppade med 24 hpi och sjönk sedan gradvis (fig. 1C). Generellt observerades ingen överdriven cytopatisk effekt av värdceller. Tidspunkten då viral replikation förblir hög anses ofta vara den optimala tiden för proteomisk analys 23, 25 . Därför skördades PRV- och mock-infekterade celler med 24 hpi för ytterligare proteomisk analys.

Image

( A ) Morfologiska förändringar i PK15-celler vid 12, 24, 36, 48 timmar efter PRV-infektion, med håna infekterade celler som kontroll. ( B ) Bekräftelse av spridningen av PRV genom immunfluorescensfärgning i infekterade PK15-celler vid 12, 24, 36 och 48 hpi och mock-infekterade celler vid 24 timmar har en kontroll. ( C ) Ett-stegs tillväxtkurva för PRV i PK-15-celler.

Bild i full storlek

Proteinprofil erhållen genom iTRAQ-kopplad LC-MS / MS-analys

För att undersöka de differentiellt uttryckta proteinerna efter virusinfektion extraherades de totala proteinerna av PRV-infekterade och håravfallsmittade PK15-celler för iTRAQ i kombination med LC-MS / MS-analys. Genom denna metod detekterades och kvantifierades totalt 4333 proteiner (kompletterande fil 1). Ett kvantitativt förhållande över 1, 5 (vikningsändring> 1, 5 eller <0, 67) och en p- värde <0, 05 ansågs vara differentiellt uttryckta proteiner. Med hjälp av kriteriet uppreglerades 234 proteiner signifikant och 232 proteiner nedreglerades under PRV-infektion (kompletterande fil 2). Eftersom det nuvarande svingenomet är dåligt antecknat jämfört med den humana genomdatabasen fanns det 52 proteiner som förblev okarakteriserade bland de differentiellt uttryckta proteinerna (kompletterande fil 2). Därför garanteras ytterligare forskning att fokusera på funktionerna hos dessa proteiner.

Funktionell klassificering av differentiellt uttryckta proteiner

Dessa 466 differentiellt uttryckta proteiner klassificerades i 23 grupper baserat på deras funktion genom COG-kommentering. De fyra bästa grupperna som innehöll mer än 34 proteiner var post-translationell modifiering, proteinomsättning och chaperoner; energiproduktion och omvandling; Allmän funktion förutsägelse och översättning; och ribosomal struktur och biogenes (fig. 2 och kompletterande fil 3). För att ytterligare utvidga molekylär karakteriseringen av de differentiellt uttryckta proteinerna sökades databaserna för genontologi och UniProt, och dessa proteiner tilldelades deras olika biologiska processer, molekylära funktioner och cellulära komponenter (fig. 3 och kompletterande fil 4). För biologisk processanteckning var proteiner huvudsakligen involverade i cellprocess, metabolisk process, biologisk reglering, reglering av biologisk process och respons på stimulans. Bland proteinerna relaterade till metabolismprocessen berikades trikarboxylsyracykeln mest signifikant ( p = 3, 81E-10). Den cellulära komponentanteckningen avslöjade att dessa proteiner var väl fördelade i olika cellkomponenter, och det fanns 257 differentiellt uttryckta proteiner, varvid det mest signifikanta p- värdet (3, 49E-15) var placerat i membranet. De viktigaste funktionella kategorierna var bindning, katalytisk aktivitet, strukturella molekylaktiviteter och transporteraktivitet. I synnerhet berikades utbredd proteinbindning ( p = 5, 50E-09) mest signifikant (fig. 3 och kompletterande fil 4). KEGG-databasen användes för att identifiera vägen involvering av dessa differentiellt uttryckta proteiner med de flesta proteiner involverade i en metabolisk väg. De uppreglerade proteinerna var huvudsakligen involverade i proteinbearbetning i endoplasmatisk retikulum och citratcykel (TCA-cykel). Vägarna förknippade med nedreglerade proteiner var relaterade till cellvidhäftning, ECM-receptorinteraktion, tät övergång och reglering av aktincytoskelet (fig. 4 och kompletterande fil 5).

Image

Bild i full storlek

Image

Proteiner klassificerades i tre huvudkategorier: biologisk process, cellkomponent och molekylär funktion. Y-axeln anger procentandelen av en specifik kategori proteiner i varje huvudkategori.

Bild i full storlek

Image

Bild i full storlek

Validering av proteinidentifiering och kvantifiering med Western blot

För att validera de differentiellt uttryckta proteinerna identifierade via iTRAQ-märkt LC-MS / MS-analys valdes fyra proteiner (beta-catenin, STAT1, GRB2 och PCNA) baserat på intresse och förhållanden för analys med western blot (fig. 5). Förhållandena mellan de fyra proteinerna mellan infekterade och oinfekterade celler överensstämde med de erhållna från iTRAQ-metoden.

Image

Immunoblottinganalys av proteiner (beta-catenin, STAT1, GRB2 och PCNA) i PRV-infekterade eller mock-infekterade PK15-celler. WB-förhållanden och iTRAQ-förhållanden (infektion / håna) visades på höger sida. P-aktinproteinet användes som kontroll.

Bild i full storlek

Diskussion

Från perspektivet av värdcellproteiner är virus- och värdcellinteraktioner mycket komplexa processer som ofta orsakar många förändringar i uttrycket av proteiner involverade i signalvägar 26 . För närvarande används olika proteomiska metoder för att studera virala och värdcellulära interaktioner 23, 24, 27 . PRV kan infektera PK15-celler med uppenbara CPE: er; därför är PK15-celler en lämplig modell för studien av PRV-infektion, med många studier på värd-PRV-interaktioner som har genomförts på PK15-celler 28, 29, 30 . Hittills har ingen forskning fokuserat på proteinprofilen för PK15-celler infekterade med PRV. I denna studie användes iTRAQ i kombination med LC-MS / MS för att identifiera de differentiellt reglerade proteinerna i PK-15-celler under PRV-infektion. Totalt 4333 proteiner detekterades och kvantifierades i PRV- och mock-infekterade PK15-celler, varav 234 signifikant uppreglerades och 232 nedreglerades baserat på en vikförändring> 1, 5 eller <0, 67 med p- värde <0, 05 för de differentiellt uttryckta proteinerna. Fyra representativa proteiner verifierades genom Western blot-analys och förhållandet mellan infektion och hålig infektion i enlighet med iTRAQ-resultat. Dessa differentiellt uttryckta proteiner var involverade i en mängd biologiska processer inklusive metabola vägar, proteinbearbetning i endoplasmatisk retikulum, ECM-receptorinteraktion och reglering av aktincytoskelet. Dessa data kan ge ledtrådar som är användbara för ytterligare analys av PRV-patogenes.

Spredningen av virus i celler kräver energi och små molekylmetaboliter, inklusive ATP, NADH, NADPH och kolet som används för syntes av nukleotider, lipider, aminosyror och kolhydrater 31 . I denna studie klassificerades 83 differentiellt uttryckta proteiner (17, 8%) i metaboliska vägar. Dessa proteiner var huvudsakligen involverade i citratcykeln (TCA) såväl som glykolys och pyruvatmetabolism. Femton av 17 proteiner i TCA-cykeln, alla 9 proteiner i pyruvatmetabolism och 8 av 13 proteiner i glykolys uppreglerades (kompletterande figur). Dessa data visar att PRV använde energi från värdcellen för att spridas genom kapning av värdcellsmetaboliska processer. På samma sätt, som en medlem av herpesvirusfamiljen, kan HCMV aktivera TCA-cykeln och glykolys samtidigt som tillåter att kolhydraterna från glukos levereras till TCA-cykeln för att producera fettsyror. Däremot aktiverar HSV-1 pyruvat-karboxylas för att inducera pyrimidinbiosyntes 32. Mekanismerna för metabolism med värdvärde-metabolism berättigar till ytterligare studier, särskilt i hur nyckelgen som är involverade i metaboliska vägar kan reglera virusinfektion, eftersom dessa studier ger nya mål för antiviral läkemedelsupptäckt genom metaboliska väghämmare. De viktigaste enzymerna i metabola vägar som uppreglerades efter PRV-infektion är involverade i genuttrycksregleringssystemet; därför kan införande av systemanalys, inklusive transkriptomisk 33, proteomic 8 och metabolomisk data, bidra till att få en bättre förståelse av denna specifika mekanism.

Endoplasmatisk retikulum (ER) är avgörande för proteinsyntes och mognad. ER är bosatt på många molekylära chaperoner som hjälper proteinveckning och montering 34 . Många studier visar att virala infektioner kan förändra endoplasmatisk retikulum (ER) och aktivera det outfoldade proteinsvaret (UPR) och därigenom underlätta viral replikation 35, 36, 37, 38 . I den aktuella studien var 21 av de differentiellt uttryckta proteinerna involverade i proteinbearbetning i endoplasmatisk retikulum. Intressant nog var alla de 21 proteinerna uppreglerade (kompletterande figur). Bland dessa var värmechockproteinerna hsp 90-beta (hsp90ab1), 90 kDa beta-medlem 1 (hsp90b1), 70 kDa protein 5 (hspa5) och 105 kDa (hsph1). På liknande sätt förändrades hsp27 också signifikant vid 4 timmar av PRV-infektion i Madin-Darby-nötceller från nötkreatur med användning av SILAC-masspektrometri-metoder, eftersom endast ett litet antal värdcellproteiner förändrades under tidiga stadier av PRV-infektion, andra stressrelaterade proteiner inte visa betydande variationer 7, 8 . Värmechockproteiner kan underlätta vikning av proteiner, aktivering av värmechockrespons kan vara en virusspecifik funktion som säkerställer korrekt proteinsyntes och; därför kan ER-stressproteiner också vara viktiga för virusreplikation 37, 39, 40 . Hsp90 är involverad i montering och kärntransport av virala RNA-polymeras-subenheter och underlättar viral replikation i HIV-1, ebolavirus, hepatit B-virus, hepatit C-virus och Rotavirus 41, 42, 43, 44, 45, 46 . Tidigare forskning har visat att hsp90 kan interagera med acetylerat a-tubulin för att främja kärntransport av HSV-1 kapsidprotein och interagera med HBV-omvänt transkriptas för att underlätta bildningen av ett ribonukleoprotein (RNP) -komplex som krävs tidigt i replikering 47, 48 . Således kan hsp90 riktas med hjälp av hämmare för att motstå virusinfektioner 49, 50 . På liknande sätt är hspa5 ett viktigt mål för en virusinfektion, såsom ebolavirus 51 . Vissa andra uppreglerade ER-stressproteiner, såsom calreticulin och calnexin, som är viktiga för kalciumlagring och proteinvikning 52, spelar också en viktig roll vid virusinfektioner. Calreticulin induceras under HBV-infektion och kan förbättra HBV-replikation genom att antagonisera IFN-vägen 53 . Calnexin kan binda direkt till moget S-protein och resultera i en infektivitet av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 54 . Således kan dessa uppreglerade proteiner också spela en viktig roll i PRV-replikering, och ytterligare forskning krävs för att undersöka funktionen hos dessa proteiner under PRV-infektion.

Många ribosomala proteiner och förlängningsförlängningsfaktorer uppreglerades under PRV-infektion (kompletterande fil 2). Vi spekulerar i att PRV skulle använda värdcellproteinsyntesystemet för att producera ett stort antal virala proteiner efter inträde i cellen. Bland dessa proteiner detekterades 60 S surt ribosomalt protein P0 (RPLP0) och visade signifikanta förändringar i de tidiga stadierna av infektion med PRV i Madin-Darby nötceller från nötkreatur 8 . Flera DNA-helikaskomplex som krävs för processen för DNA-replikation inklusive minikromosomunderhållsproteinet (MCM2, MCM4 och MCM6) nedreglerades i de PRV-infekterade cellerna. På liknande sätt reducerades kärnkraftsansamling av MCM4 och MCM6 i HSV-1-infekterade humana epitelialynxcarcinom HEp-2-celler 55 . MCM4-, MCM6- och MCM7-underenheter binds tätt med MCM2, vilket orsakar en reducerad affinitet för att bilda MCM-kärnkomplexet som fungerar som ett DNA-helikas i avlindningen av cellulärt dsDNA 56, 57 . Herpesvirus inklusive PRV innehåller sina egna helikaser väsentliga för bildning och förlängning av replikationsgaffeln i viral replikation 1, 58, 59, 60 . Därför spekulerar vi att PRV kapar cellulära komponenter som är involverade i värdcellreplikation och främjar viral genomreplikation. Emellertid uppreglerades en annan kritisk värdreplikationsfaktor som prolifererande cellkärnantigen (PCNA) i PRV-infekterade celler. PCNA är en klämma som fungerar som en processivitetsfaktor i DNA-replikering och krävs för HSV-1-replikering och histondeposition 61, 62 . Sammantaget indikerar dessa data att PRV riktar sig till flera proteiner involverade i värdcellreplikation och translation, och funktionen för dessa proteiner vid PRV-infektion måste undersökas ytterligare.

Heterogena nukleära ribonukleoproteiner (hnRNP) är en familj av RNA-bindande proteiner närvarande i cellkärnan som är kända för sin roll i pre-mRNA-skarvning 63 . Alphaherpesvirus kan leda till drastiska förändringar i RNA-metabolism genom deras herpesvirala avstängningsmekanismer inklusive modulering av hnRNP. Värdutstängningsproteinet pUL41 av HSV-1 kan företrädesvis bryta ned mRNA innehållande AU-rika element 8, 64 . Till skillnad från de många cellulära pre-mRNA var HSV-1-gener i stor utsträckning oplicerade och utvecklade ett antal strategier för att hämma värdcellsklyvningen 55, 65 . Tidigare studier har visat att expressionsnivåerna för hnRNP påverkades av HSV-1 eller PRV-infektion med användning av SILAC och 2-DE masspektrometri närmar sig 8, 17, 55 . Här identifierades också åtta hnRNP: s familjemedlemmar (A2B1, A3, C, K, M, R, U och UL2) och visade sig vara nedreglerade efter PRV-infektion (kompletterande fil 2). Vissa av dessa proteiner har kända roller i andra virala infektioner. Till exempel är hnRNPU en potentiell HIV-begränsningsfaktor 66 . hnRNPA2 / B1 interagerar med influensa A-virusprotein NS1 och hämmar viral replikation 67 . Därför antog vi att det minskade uttrycket av dessa proteiner kan spela en viktig roll i replikationen av PRV.

Cytoskeletproteiner spelar en avgörande roll i upprätthållandet av cellmorfologi, cellrörelse och cell-till-cell-fästning. Många virusinfektioner orsakar cytoskeletalt störning eller desorganisering av värdceller 68, 69, 70 . I vår studie ändrades många proteiner involverade i cytoskelettnät och cellkommunikation efter PRV-infektion. Bland dem är actin alfa 4 (ACTN4), fungerar som en aktinbindande och tvärbindande faktor, väsentlig för ett antal viktiga cellfunktioner inklusive cellvidhäftning och signaltransduktion och kan interagera med nukleoprotein för att underlätta influensa A viral infektion 71 . Andra transmembranreceptorer involverade i cell-cell- och cell-extracellular matrix (ECM) -interaktioner är integrin beta 1 och integrin beta 4. 12 av 13 proteiner involverade i ECM-receptorinteraktionsvägen nedreglerades efter PRV-infektion. Efter PRV-infektion, vid 24 hpi, observerade vi betydande cellpatologiska förändringar med hög viraltiter. Därför sluts vi att värdcellens cytoskeletala och ECM-receptorinteraktionstörningar kan bidra till PRV-spridning och frisättning.

Virus kan tillämpa olika strategier för att undertrycka värdens immunsystem efter infektion. STAT1 spelar en kritisk roll i JAK / STAT-vägen som är involverad i att förmedla det cellulära interferonsvaret 72 . Som svar på IFN-y-stimulering binder STAT1- och STAT3-homo- och heterodimerer till IFN-y-aktiverad sekvens (GAS) -element 73 . Våra proteomiska data visar att STAT1 och STAT3 minskas med PRV-infektion. Dessa data antyder att PRV undertrycker kanonisk interferonsignalering genom JAK-STAT1-vägen. Ett annat signalprotein, ß-catenin, involverat i Wnt / ß-catenin-signalering, en kanonisk väg som är känd för att spela en viktig roll i många cellulära aktiviteter minskades också efter PRV-infektion. Tidigare forskning har visat att ß-katenin kan fungera som en värdbegränsningsfaktor för att undertrycka basal HIV-transkription i astrocyter 74, 75 . Dessa proteiner måste emellertid studeras ytterligare för att se om de spelar en viktig roll vid PRV-infektion.

Sammanfattningsvis ger denna studie en omfattande analys av proteomikprofilen för PRV-infekterade PK-15-celler genom ITRAQ-baserad kvantitativ proteomik. Totalt identifierades 466 signifikant förändrade proteiner; funktionen för dessa differentiellt uttryckta proteiner förblir emellertid mest beskrivande. Dessa proteomiska resultat är preliminära data som kräver ytterligare undersökning för att förstå rollerna för dessa proteiner vid PRV-infektion, vilket möjliggör nya antivirala terapeutiska mål för PRV-infektion.

metoder

Cellodling och virusinfektion

Den virulenta PRV-stammen av vildtyp PRV ZJ (Zhejiang) användes i denna studie 76 . PK15-celler (erhållna från American Type Culture Collection, Manassas, VA) odlades i modifierat Eagle's medium (MEM, Gibco, Life Technologies, Austin, TX) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Gibco, Life Technologies, Austin, TX) och hölls i en fuktig inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.

Enskiktet av sammanflytande PK15-celler dispergerades med 0, 25% trypsin och 0, 02% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och ympades i 6 cm cellkulturflaskor. PK15-celler odlades under nästan 24 timmar för 80% sammanflöde och tvättades två gånger med PBS. Därefter infekterades cellerna med PRV med 70 ul av 10 5, 67 / ml 50% vävnadskultur infektionsdos (TCID50) per brunn. Efter 1 timmes adsorption hölls infekterade celler i MEM kompletterat med 2% FBS. Oinfekterade PK15-celler användes som den håravfallsmittade gruppen. De PRV-eller håninfekterade cellerna uppsamlades 24 timmar efter infektion (hpi). Varje grupp behandlades med tre oberoende biologiska replikat. Viral förökning bekräftades med cytopatisk effekt (CPE) under ett ljusmikroskop och enstegs tillväxtkurva för PRV vid 12, 24, 36 och 48 hpi.

Immunofluorescensanalyser

Cellerna infekterade med PRV vid olika tidpunkter och hånainfekterade celler vid 24 timmar tvättades två gånger med PBS och fixerades sedan med 4% paraformaldehyd under 20 minuter vid rumstemperatur (RT) och permeabiliserades med 0, 2% Triton X-100 (T8200, Solarbio life science) i 15 min. Cellerna inkuberades sedan med en blockerande buffert (PBS innehållande 5% bovint serumalbumin [BSA]) vid RT under 30 minuter. Efter tre tvättar med PBS färgades cellerna med anti-PRV kaninantikropp (PA1–081, Thermo Fisher Scientific) vid RT under 1 timme. Efter att ha tvättats med PBS inkuberades cellerna med Alexa Fluor 488 konjugerad getantikropp för get (A-11008, Thermo Fisher Scientific). Kärnorna färgades med DAPI (C0060, Solarbio life science).

Proteinisolering, matsmältning och märkning med iTRAQ-reagens

Infekterade och mock-infekterade PK15-celler tvättades två gånger med PBS och uppsamlades sedan med användning av cellskrapor efter tillsats av 200 pl TEAB (0, 5 M trietylammoniumbikarbonat) upplösningsbuffert. Proverna bröts av ultraljudsvågen under 15 minuter, och sedan efter centrifugering vid 12000 r / min under 20 min, avsattes supernatanten genom att tillsätta 4-faldig volym kall aceton innehållande 10 mM DTT under cirka 2 timmar. Efter centrifugering vid 12000 r / min under 20 minuter vid 4 ° C uppsamlades fällningen och blandades med 800 ul kall aceton vid 56 ° C för att bryta proteinernas disulfidbindningar. Efter centrifugering vid 12000 r / min under 20 min vid 4 ° C uppsamlades den torkade fällningen och löstes med 100 pl TEAB-upplösningsbuffert. Proteinkoncentrationen bestämdes med användning av Bradford-proteinanalysen.

En alikvot av totalt protein (100 μg) löstes till 100 μl i en upplösningsbuffert och späddes sedan med 500 ul 50 mM NH4HCO3. 2 ug trypsin tillsattes och inkuberades sedan över natten vid 37 ° C. Efter proteindjälvning tillsattes lika stor volym av 0, 1% myrsyra för surgöring. Peptider renades på pelaren Strata -XC18, som först aktiverades med metanol, balanserades sedan genom tillsats av 1 ml 0, 1% myrsyra tre gånger, tvättades med 0, 1% myrsyra + 5% acetonitril två gånger och eluerades med 1 ml 0, 1% myrsyra syra + 80% acetonitril. Peptiderna torkades genom vakuumcentrifugering. Det torkade peptidpulvret återupplöstes med 20 ul 0, 5 M TEAB för märkning av peptider.

Peptiderna märktes med iTRAQ Reagent-8 plex Multiplex Kit (AB Sciex UK Limited) enligt tillverkarens instruktioner. Proverna och märkta markören var som följer: PRV-infekterade prover märktes med iTRAQ-taggen 115, iTRAQ-taggen 116 eller iTRAQ-taggen 117, och mock-infekterade prover märktes med iTRAQ-taggen 118, iTRAQ-taggen 119 eller iTRAQ-taggen 117. Alla märkta prover blandades med en lika stor mängd. De märkta proverna fraktionerades med användning av högpresterande vätskekromatografisystem (HPLC) (Thermo DINOEX Ultimate 3000 BioRS) med användning av en Durashell C18 (5 um, 100 Å, 4, 6 × 250 mm). Slutligen samlades 12 fraktioner.

LC-MS / MS-analys

Datainsamling utfördes med ett Triple TOF 5600-system (AB SCIEX, Concord, ON). Prover kromatograferades med användning av en 90 min gradient från 2–30% (mobil fas A 0, 1% (volym / volym) myrsyra, 5% (volym / volym) acetonitril; mobil fas B 0, 1% (volym / volym) myrsyra, 95 % (v / v) acetonitril) efter direkt injektion på en 20 mikrometer PicoFrit-emitter (New Objekt) packad till 12 cm med Magic C18 AQ 3 mikrometer 120 Å stationär fas. MS1-spektra samlades i intervallet 350–1 500 m / z under 250 ms. De 20 mest intensiva prekursorerna med laddningstillstånd 2–5 valdes för fragmentering, och MS2-spektra samlades i intervallet 50–2 000 m / z under 100 ms; föregångsjoner utesluts från omval under 15 sek.

Dataanalys

De ursprungliga MS / MS-fildata skickades till ProteinPilot Software (version 4.5, AB Sciex) för dataanalys. MS / MS-data sökte mot Sus scrofa UniProt-databasen (9 mars 2016, innehållande 35 303 sekvenser, //www.uniprot.org/proteomes/UP000008227). Följande sökparametrar användes: instrumentet var TripleTOF 5600, iTRAQ-kvantifiering, cystein modifierad med jodacetamid; biologiska modifieringar valdes som ID-fokus, kvantitatet, trypsin-matsmältningen, förspänningskorrigering och bakgrundskorrigering kontrollerades med avseende på proteinkvantifiering och normalisering. För beräkning av falsk upptäcktsfrekvens (FDR) användes en automatisk strategi för sökkritningsdatabas 77 för att uppskatta FDR med PSPEP-algoritmen (Proteomics System Performance Evaluation Pipeline Software). Endast proteiner med minst en unik peptid och oanvänt värde mer än 1, 3 övervägs för vidare analys. Bland de identifierade peptiderna var några uteslutna från den kvantitativa analysen av ett av följande skäl. (1) Topparna som motsvarade iTRAQ-etiketterna upptäcktes inte. (2) Peptiderna identifierades med låg identifieringsförtroende. (3) Peptiderna hävdades av mer än ett protein. (4) S / N (signal-till-brusförhållande) för vilket peptidförhållande som helst var för lågt. (5) Peptider hade en kombinerad funktionssannolikhet <30% på grund av semitryptiska peptider, peptider saknade en iTRAQ-reagensetikett, peptider med låg sannolikhetsmodifiering och peptider med stora delta-massor. För proteinkvittelförhållanden uppmätta med användning av iTRAQ efter normalisering, ansågs vi specifikt förhållanden med p- värde 1, 5 eller <0, 667.

Bioinformatikanalys

De identifierade och differentiellt uttryckta proteinsekvenserna kartlades med Gene Ontology-termer (//geneontology.org/). En homologisökning utfördes först för alla identifierade sekvenser med ett lokaliserat NCBI BLASTP-program mot NCBInr djurdatabas. E-värdet inställdes på mindre än 1e-5, och det bästa träffet för varje frågesekvens togs med i beräkningen för GO-termmatchning. GO-termmatchningen utfördes med blast2go v4.5-rörledningen 78 . Clusters of Orthologous Groups of Proteins System (COG, //www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) användes för funktionell kommentering av gener från nya genom och för forskning i genomutveckling. Pathway-analyser genomfördes med Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -plattform. Statistik för anrikning av vägar utfördes med Fishers exakta test, och de med ett korrigerat p- värde <0, 05 ansågs vara de viktigaste vägarna.

Western blot-analys

De infekterade och håravfallsmittade cellerna uppsamlades med 24 hpi. Ekvivalenta mängder celllysat från varje prov blandades med 5 × provbelastningsbuffert och kokades under 10 minuter, separerades med 12% SDS-polyakrylamidgeler och överfördes till PVDF-membran (Millipore). Membranen blockerades med 5% nonfat-mjölk i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0, 1% Tween-20 (TBST) och inkuberades sedan över natten vid 4 ° C med primära antikroppar specifika för p-Actin (4967, Cell Signaling Technology), beta-catenin (51067-2-AP), STAT1 (10144-2-AP), GRB2 (10254-2-AP) och PCNA (60097-1-Ig) köpt från Proteintech Group. Membran tvättades sedan med TBST tre gånger och inkuberades med en pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundär antikropp (Proteintech Group) under 1 timme vid omgivningstemperatur. Slutligen visualiserades proteinband genom tillsats av SuperSignal West Pico kemiluminescerande substrat (Thermo, Rockford, IL) reagens.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Yang, S. et al . iTRAQ-baserad proteinanalys av porcine njure-epiteliala PK15-celler infekterade med Pseudorabies-virus. Sci. Rep. 7, 45922; doi: 10.1038 / srep45922 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande fil 1

  2. 2.

    Kompletterande fil 2

  3. 3.

    Tilläggsfil 3

  4. 4.

    Kompletterande fil 4

  5. 5.

    Kompletterande fil 5

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.