Involvering av autofagi i antitumoraktivitet av folat-bifogat metyl-p-cyklodextrin | vetenskapliga rapporter

Involvering av autofagi i antitumoraktivitet av folat-bifogat metyl-p-cyklodextrin | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Immunterapi mot cancer
  • Kemoterapi
  • Läkemedelsutveckling
  • Riktade terapier

Abstrakt

Autophagy, den viktigaste lysosomala vägen för återvinning av intracellulära komponenter inklusive organeller, framträder som en nyckelprocess som reglerar tumörgenes och cancerterapi. Senast syntetiserade vi nyligen folat-bifogad metyl-p-cyklodextrin (FA-M-p-CyD) och demonstrerade potentialen hos FA-M-p-CyD som ett nytt antitumörläkemedel. I denna studie undersökte vi om anticanceraktivitet av FA-M-p-CyD i folatreceptor-a (FR-α) -positiva tumörceller är involverad i autofagi. I motsats till metyl-p-cyklodextrin (M-p-CyD), FA-M-p-CyD in i KB-celler (FR-a (+)) genom CLIC / GEEC endocytos. Ingen signifikant depression i DNA-innehållet observerades i KB-celler efter behandling med FA-M-p-CyD. Dessutom höjdes transmembranpotentialen hos mitokondrier efter behandling med FA-M-p-CyD drastiskt. Under tiden inducerade FA-M-p-CyD bildningen av autofagiska vakuoler, som delvis kolokaliserades med mitokondrier, i KB-celler. Sammantaget antyder dessa resultat att FR-a-uttryckande cellselektiv cytotoxisk aktivitet av FA-M-p-CyD kan förmedlas genom regleringen av autofagi, snarare än induktion av apoptos.

Introduktion

Vid cancercemoterapi är läkemedelsförsörjningstekniken oerhört viktig för att uppnå maximal behandlingseffekt av anticancermedel. För att tillhandahålla en aktiv målförmåga är den kemiska modifieringen av tumörspecifika ligander känd till en läkemedelsbärare. Av olika tumörspecifika ligander har folinsyra (FA) 1, 2, 3, 4, 5 framkommit som en anmärkningsvärd målriktad ligand med förmåga till kraftfull interaktion med cancerceller som uttrycker folatreceptorn (FR) med hög affinitet ( Kd : 10 −9 ~ 10 −10 M) 6, 7 . FR ingriper cellytan genom ett glykosylfosfatidylinositol-ankare och uttrycks starkt i olika tumörceller inklusive maligniteter i hjärnan, äggstocken, bröst, njuren och lungan och har försumbart uttryck i normala vävnader 8 . I takt med att cancer fortskrider, ökar uttrycksnivån för FR anmärkningsvärt 9 . Därför är FR en av de potenta kandidaterna för inte bara en lovande markör utan också ett målprotein för behandling av cancer.

Cyklodextriner (CyDs) är cykliska oligosackarider som bildar inklusionskomplex med ett brett spektrum av hydrofoba molekyler och används i stor utsträckning i farmaceutisk region 10, 11 . CyD: er har rapporterats interagera med cellmembrankomponenter av kolesterol och fosfolipider, vilket resulterar i induktion av hemolys av röda blodkroppar vid höga koncentrationer av CyD: er 12, 13, 14 . Dessutom används metyl-p-cyklodextrin (M-p-CyD) ofta för att störa lipidflotten på grund av dess förmåga att minska kolesterollagren på cellmembran 15 . Ett antal studier har också visat att störningen av lipidflotten av M-ß-CyD kan skada cancerceller och orsaka celldöd. Grosse et al . avslöjade att M-p-CyD signifikant minskade tumörtillväxt hos tumörbärande möss efter intraperitoneal administration 16 . Emellertid har den cytotoxiska reaktionen av M-p-CyD brist på tumörcellselektivitet.

Senast, för att göra ett försök att ge en tumörspecifik cytotoxisk reaktion på M-p-CyD, beredde vi tidigare FA-konjugerad M-p-CyD (FA-M-p-CyD) 17 och utvärderade dess antitumoraktivitet 18 . FA-M-p-CyD gav stor antitumoraktivitet jämfört med M-p-CyD i KB-celler, vilket mycket uttrycker folatreceptor-a (FR-a). Den enda intravenösa administrationen av FA-M-p-CyD undertryckte signifikant tumörtillväxten i Colon-26-celler (FR-a (+)) -bärande möss. Dessutom var antitumoraktiviteten för FA-M-p-CyD överlägsen den för doxorubicin efter en intravenös administrering, i samma dos. Dessa resultat indikerar att FA-M-p-CyD har potentialen som ett lovande medel mot cancer. Emellertid är mekanismen för antitumoraktivitet för FA-M-p-CyD fortfarande oklar.

Autophagy, den viktigaste lysosomala vägen för återvinning av intracellulära komponenter inklusive organeller, framträder som en nyckelprocess som reglerar tumörgenes och cancerterapi 19, 20, 21, 22, 23 . De dynamiska rollerna för autofagi vid cancer är tumörundertryckande effekt i ett tidigt stadium av cancerutvecklingen, men är tillväxteffekten hos etablerade tumörer. På samma sätt kan stimulering av autofagi som svar på terapeutiska ämnen kontextuellt gynna eller försvaga kemoresistens och antitumörimmunitet. Därför är förståelsen för och hur autofagi kan utnyttjas för att döda cancerceller avgörande för cancercemoterapi. I denna studie undersökte vi om antitumoraktivitet av FA-M-p-CyD i FR-α (+) -celler är involverad i autofagi. Som ett resultat befanns FA-M-p-CyD inducera autofagosombildning i FR-a (+) -celler, vilket indikerar involvering av autofagi i antitumoraktivitet. Med beaktande av våra tidigare resultat att FA-M-p-CyD drastiskt undertryckte tumörtillväxten hos möss inokulerade FR-α (+) tumörceller 18, kan FA-M-p-CyD appliceras som ett nytt läkemedel mot cancer reglering av autofagi för cancercemoterapi mot FR-a-överuttryckande tumör.

Resultat

Antitumoreffekt av FA-M-p-CyD

För att belysa antitumoreffekten av FA-M-p-CyD i FR-a (+) -celler undersökte vi antitumoreffekten av FA-M-p-CyD i FR-α (+) och FR-α (-) celler. FA-M-p-CyD hade stor antitumoreffekt i FR-a (+) -celler, såsom KB- och M213-celler, jämfört med kontroll, efter behandling under 2 timmar (fig. 1A, B). Det fanns emellertid ingen signifikant antitumoraktivitet i FR-a-negativa A549-celler (fig. 1C). Dessa resultat indikerar att FA-M-p-CyD hade FR-a (+) cellselektiv antitumoreffekt.

(A) KB-celler, (B) M213-celler och (C) A549-celler. Koncentrationen av FA-M-p-CyD var 10 mM. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM (n = 3–4 per grupp). * p <0, 05 kontra kontroll.

Bild i full storlek

Cellulär förening och intracellulär distribution av FA-M-p-CyD

Tidigare rapporterade vi att FA-M-p-CyD har FR-α (+) cellspecifik antitumoreffekt 18 . För att erhålla detaljerna i mekanismen för den FR-a-medierade antitumoreffekten av FA-M-p-CyD studerade vi om TRITC-FA-M-p-CyD associerar med KB-celler (fig. 2). Påfallande är TRITC-FA-M-p-CyD starkt associerad med KB-celler (fig. 2A), trots att CyD: er är kända för att vara biomembranogenomträngliga. Vidare inhiberades föreningen av TRITC-FA-M-p-CyD genom tillsatsen av FA som en konkurrent till FR (Fig. 2A). Liknande resultat observerades i M213-celler (fig. 2B). Dessutom sänktes cellförening av FA-M-p-CyD signifikant i FR-a nedreglerade KB-celler, jämfört med KB-celler (Fig. 2C). Dessa data indikerar att FA-M-p-CyD kunde associeras med celler genom FR-a.

(A) KB-celler, (B) M213-celler och (C) FR-a-knockdown-celler. Fluorescensintensiteten härledd från TRITC bestämdes 1 timme efter inkubation vid 37 ° C med en flödescytometer.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi den intracellulära fördelningen av TRITC-FA-M-p-CyD i KB-celler efter 1 timme-behandling (Fig. 3). Det bör noteras att cellupptag av TRITC-FA-M-p-CyD i KB-celler observerades. Dessutom lokaliserades TRITC-FA-M-ß-CyD huvudsakligen i cytoplasma snarare än i kärna efter 1 timmars behandling. Sammantaget indikerar dessa resultat att FA-M-p-CyD distribuerades i cytoplasma efter det cellulära upptaget i KB-celler och gav kraftiga antitumoreffekter.

KB-celler behandlades med TRITC-FA-M-p-CyD (10 um) under 1 timme.

Bild i full storlek

FA-M-ß-CyD orsakade cytotoxisk aktivitet via apoptosoberoende väg

För att undersöka om FA-M-ß-CyD inducerar apoptos eller inte, undersökte vi DNA-innehållet i kärnan, transmembranpotentialen i mitokondrier, TUNEL-analys och kaspasanalys i KB-celler. Här använde vi 2, 6-di- O- metyl-p-CyD (DM-p-CyD) som en positiv kontroll av apoptosinducerare, eftersom vi tidigare visade att DM-p-CyD framkallade apoptos genom undertryckandet av PI3K -Aktiv aktivitet, genom kolesterolekstraktion från plasmamembran i NR8383-celler 24 . DNA-innehållet i KB-celler efter behandling med 10 mM DM-p-CyD under 2 timmar sänktes signifikant, jämfört med det med kontroll (Fig. 4A). Under tiden observerades ingen signifikant minskning av DNA-innehållet i 10 mM FA-M-p-CyD i KB-celler (fig. 4A).

DNA-innehåll (A) och mitokondriell transmembranpotential (B) efter behandling med FA-M-p-CyD. KB-celler behandlades med FA-M-p-CyD (10 mM) under 2 timmar. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM (n = 3–4 per grupp). * p <0, 05 kontra kontroll. † p <0, 05 vs. KB-celler utan behandling av FA. (C) TUNEL-analys efter behandling med FA-M-p-CyD i KB-celler. (D) Klyvd caspase 3-analys efter behandling med FA-M-p-CyD i KB-celler. De beskurna fläckarna indikerades. (E) Bandintensiteten för förhållandet klyvt kaspas 3 / pro-kaspas 3. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM (n = 3 per grupp). * p <0, 05 kontra kontroll.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi effekterna av CyD: er på transmembranpotential i mitokondrier med användning av rodamin 123 i KB-celler (fig. 4B). Transmembranpotentialen i mitokondrier hos KB-celler behandlade med DM-p-CyD minskade drastiskt jämfört med kontroll. I skarp kontrast höjdes potentialen hos KB-celler behandlade med FA-M-p-CyD drastiskt. Dessutom minskade denna ökning av potentialen genom tillsats av FA-M-p-CyD till kontrollnivå i närvaro av FA, en konkurrent till FR (fig. 4B).

Därefter utförde vi TUNEL-analys. Såsom visas i fig. 4C färgades KB-celler behandlade med DM-p-CyD, jämfört med kontroll, vilket antyder induktion av apoptos. Under tiden färgades inte cellerna som behandlades med FA-M-p-CyD.

Vidare, i den klyvda kaspas 3-analysen (fig. 4D, 4E), producerade DM-p-CyD kraftigt aktiverat kaspas 3 genom en klyvning av pro-kaspas 3, vilket indikerar induktion av apoptos. FA-M-p-CyD visade emellertid endast liten klyvningsaktivitet för pro-kaspas 3. Sammantaget indikerar dessa data att celldöd orsakad av FA-M-p-CyD var apoptosoberoende.

Involvering av autofagi i celldöd orsakad av FA-M-p-CyD

Autofagi är en normal fysiologisk process i kroppen som hanterar förstörelse av celler i kroppen och kan döda cellerna under vissa förhållanden. Det finns flera rapporter om autofagi eller autofagisk celldöd aktiverad i cancerceller efter behandling med olika läkemedel mot cancer. Därefter undersökte vi om autofagosombildning i KB-celler framkallas av FA-M-p-CyD med Cyto-ID® Autophagy Detection Kit, som upptäcker autofagiska vakuoler i celler. Såsom visas i fig. 5A och 5B observerades de autofagiska vakuolerna i KB-celler efter behandling med FA-M-p-CyD under 2 timmar. Dessutom minskade de autofagiska vakuolerna som framkallades genom behandlingen med FA-M-p-CyD överväldigande genom förbehandlingen av LY294002, en autofagihämmare. Dessa resultat antyder att FA-M-p-CyD inducerade bildningen av autofagiska vakuoler i KB-celler.

(A, B) Effekter av FA-M-p-CyD på autofagosombildningen i KB-celler. (C, D) Effekter av FA-M-p-CyD på clearance av proteinaggregering via autofagi. (E) Effekter av kloroquin, bafilomycin Al, 3-MA och LY294002 på antitumoraktivitet av FA-M-p-CyD för KB-celler. Resultaten representeras som medelvärde ± SEM (n = 3–6 per grupp). * p <0, 05 kontra kontroll. p <0, 05 vs. FA-M-p-CyD utan hämmare.

Bild i full storlek

Därefter utförde vi autofagianalys med användning av ett kit med Premo ™ Autophagysensorer, som kan övervaka en clearance av proteinaggregat via autofagi med GFP-märkt p62 i fig. 5C och 5D. Här kan p62-proteinet binda till både ubiquitin 26 och LC3 27 och därigenom underlätta clearance av ubiquitinerade proteiner via autofagi. Fluorescensen av GFP-p62 i kontroll sänktes drastiskt genom tillsats av FA-M-p-CyD. Under tiden visade inte M-p-CyD någon signifikant förändring i fluorescensen av GFP-p62, jämfört med kontroll. Dessa resultat antyder att de ackumulerade autofagosomerna i KB-celler nedbrytades av FA-M-p-CyD via autofagi.

Därefter undersökte vi effekterna av autofagihämmare såsom kloroquin, bafilomycin Al, 3-metyladenin (3-MA) ​​och LY294002 på cellvärdigheten för KB-celler efter behandling med FA-M-ß-CyD. Här förhindrar klorokin och bafilomycin Al endosomal försurning, vilket leder till hämning av både fusion av autofagosom med nedbrytning av lysosom och lysosomalt protein. 3-MA och LY294002 användes som PI3K-hämmare. Såsom visas i fig. 5E var cellviabiliteten för KB-celler behandlade med FA-M-p-CyD i närvaro av autofagihämmare högre än med FA-M-p-CyD enbart. Sammantaget indikerar dessa data att FA-M-p-CyD sannolikt orsakar autofagisk celldöd.

De dysfunktionella mitokondrierna känns igen och försämras inom celler av både icke-selektiv autofagi och mitofagi, en selektiv typ av autofagi 28, 29 . Såsom visas i fig. 4B fann vi att FA-M-p-CyD signifikant förstärkte mitokondriell membranpotential i KB-celler, vilket indikerar induktion av mitokondriell stress. Därför undersökte vi involveringen av mitofagi i celldöd orsakad av mitokondriell stress efter behandling med FA-M-ß-CyD (Fig. 6). De autofagiska vakuolerna och mitokondrierna, färgade av Cyto-ID® Autophagy Detection Kit respektive rodamin 123, kolokaliserades delvis i KB-celler efter behandling med FA-M-p-CyD (fig. 6A). Liknande resultat erhölls i M213-celler (fig. 6B). Därför antyder dessa resultat att den autofagiska celldöden inducerad av FA-M-p-CyD kan associeras med mitofagi framkallad av en mitokondriell stress.

(A) KB-celler och (B) M213-celler behandlades med FA-M-P-CyD under 2 timmar, och sedan behandlades cellerna med Cyto-ID ™ och rodamin 123 för att färga autofagosomer respektive mitokondrier.

Bild i full storlek

Diskussion

Att ha en inriktningsförmåga för antitumörmedel spelar en nyckelroll för att inte bara tillhandahålla stark antitumöraktivitet utan också minska risken för biverkningar vid cancercemoterapi. Tidigare visade vi att FA-M-ß-CyD visade en FR-α (+) cell-selektiv antitumoreffekt 17 . Dessutom avslöjade vi att antitumoreffekten av FA-M-p-CyD signifikant undertrycktes i närvaro av FA, vilket indikerar att FR-medierad endocytos är avgörande för att förbättra antitumoreffekten med FA-M-p-CyD 18 . I allmänhet antas det att graden av cellupptag av CyD: er är försumbar förmodligen på grund av deras hydrofilicitet och hög molekylvikt, FA-M-p-CyD faktiskt internaliserades i KB-celler (fig. 3). Samtidigt troddes FR att endocytoseras via clathrinoberoende bärare / GPI-förankrade proteiner anrikade tidigt endosomalt fack (CLIC / GEEC) 30 . Därför kunde FA-M-p-CyD komma in i cellerna via CLIC / GEEC efter igenkänningen av FR-a. Faktiskt är FA-M-p-CyD starkt associerad med KB-celler snarare än med FR-α-knockdown KB-celler (fig. 2C), vilket indikerar potentialen för FA-M-p-CyD som en FR-a (+) cellselektivt läkemedel mot cancer.

Nyligen har en alternativ process för att kontrollera celldöd och nya läkemedel som framkallar cancercelldöd upptäckts 31 . Bland celldödsmaskiner spelar apoptos avgörande roller i cellöverlevnad och tumörtillväxt. M-ß-CyD används ofta för att försämra lipidflotten på grund av extraktion av kolesterol från plasmamembranen 15, 32 . Ett antal studier har visat att M-ß-CyD kan skada cancerceller genom försämring av lipidflotten. Exempelvis framkallade minskningen av kolesterolnivån med M-p-CyD apoptos i humana epidermoidcancerceller 33 . Dessutom rapporterade vi tidigare att DM-ß-CyD framkallade apoptos genom försämring av PI3K-Akt-aktiviteten, genom utarmning av kolesterol från lipidflåtar i alveolära makrofager 24 . Vi verifierade också att DM-ß-CyD gav apoptos i KB-celler genom kolesterolutarmning (Fig. 4). Dessutom framkallade M-ß-CyD också apoptos i KB-celler, på grund av kolesterolekstraktionen, vilket ledde till sänkning av DNA-innehåll i kärnan och transmembranpotentialen i mitokondrier 34 . Intressant nog släppte FA-M-ß-CyD signifikant kolesterol från både KB-celler (FR-α (+)) och A549-celler (FR-α (-)) till odlingsmedium, jämfört med det för M-ß-CyD och DM -p-CyD i vår tidigare studie 18 . FA-M-p-CyD visade emellertid kraftig cytotoxisk aktivitet utan att minska DNA-innehållet i kärnan och transmembranpotentialen i mitokondrier (fig. 4), vilket antyder att celldödmekanismen i FA-M-p-CyD-systemet kan vara annorlunda från apoptos. Sammantaget förändrade modifieringen av FA till M-p-CyD drastiskt celldödmekanismen, förmodligen på grund av inträde i FR-a-överuttryckande celler medierade av CLIC / GEEC endocytos.

Viktigast av allt avslöjade vi att involvering av autofagi i celldöd orsakad av FA-M-p-CyD i FR-a-uttryckande celler såsom KB-celler. Det vill säga FA-M-p-CyD förbättrade uttrycket av LC3-II, en autofagosommarkör, i autofagiska membran i KB-celler (fig. 5A). Nyligen tros autofagi dyka upp som en nyckelprocess som reglerar tumörgenes och cancerterapi. I det tidiga stadiet av tumörutveckling fungerar autofagi som en tumörhämmare. Under tiden, vid avancerade stadier av tumörutveckling, främjar autofagi tumörprogression. Tumörcellerna som finns i det centrala området av tumörmassan genomgår autofagi för att överleva under förhållanden med låg syre och näringsämnen. Autophagy skyddar vissa cancerceller mot behandling av cancer mot cancer genom att blockera den apoptotiska vägen ("skyddande autophagy"). I den aktuella studien befanns FA-M-p-CyD inducera autofagosombildning i FR-a-positiva celler, vilket antyder att autofagy involverades i antitumoraktivitet. Med beaktande av våra tidigare resultat att FA-M-p-CyD drastiskt undertryckte tumörtillväxten hos möss inokulerade FR-α (+) tumörceller 18, kan FA-M-p-CyD appliceras som ett nytt läkemedel mot cancer reglering av autofagi för cancercemoterapi mot FR-a-överuttryckande tumör. Det är emellertid fortfarande oklart om FA-M-p-CyD inducerar avfosforylering och inaktivering av mTOR, som framkallar autofagi, och aktiverar klass III PI3K, som involverar i autofagosombildningen. Därför krävs ytterligare studier av inte bara mekanismen för autofagi orsakad av FA-M-p-CyD, utan också bidraget från endocytosvägen till celldödmekanismen.

Aktivering av mitokondriell permeabilitetspor (mPTP) är associerad med mitokondriell depolalisering, frikoppling av oxidativ defosforylering, svullnad av mitokondrier och frisättning av dödsfrämjande faktorer såsom cytokrom c 35 Nyligen har Ziolkowski et al . visade att M-p-CyD minskar funktionen hos råttlever-mitokondrier och undertrycker den kalciumkloridinducerade svullnaden 36 . I den aktuella studien kan FA-M-ß-CyD som är internaliserade i KB-celler interagera med mitokondriella flotte-liknande mikrodomäner, vilket leder till undertryckande av mPTP-aktivitet, vilket resulterar i reglering av autofagosombildning. Ytterligare detaljerade studier avseende effekterna av FA-M-ß-CyD på mitokondriell funktion pågår.

Sammanfattningsvis avslöjade vi i den aktuella studien deltagandet av autofagi i FR-a-uttryckande cell-selektiv antitumoreffekt av FA-M-p-CyD. Dessa upptäckter kommer att ge bra information om FA-M-ß-CyD som en ny autofagiinducerare för cancercytoterapi.

metoder

material

RPMI-1640 (FA-fri) erhölls från GIBCO (Tokyo, Japan). Tetrametylrhodaminisotiocyanat (TRITC) och FR-a siRNA (sc-39969) köptes från Funakoshi (Tokyo, Japan) respektive Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Lipofectamine ™ 2000-reagens och Premo ™ Autophagysensorer erhölls från Invitrogen (Tokyo, Japan). Cyto-ID® Autophagy Detection Kit köptes från Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY).

Cellodling och in vitro antitumoraktivitet

KB-celler, en human oral squamous carcinomcellinje, A549-celler, ett humant lungcarcinom och M213-celler, en human kolangiocarcinomcellinje, odlades som rapporterats tidigare 17 . Antitumoraktiviteten in vitro utfördes med WST-1-metoden, såsom tidigare rapporterats 18 . I korthet behandlades KB-celler, M213-celler och A549-celler (5 × 10 4 /96-brunns mikroplatta) med 150 ul odlingsmedium innehållande 10 mM FA-M-p-CyD under 2 timmar vid 37 ° C. I den autofagihämmande studien förbehandlades KB-celler med odlingsmedium RPMI-1640 innehållande 20 mikrometer klorokin, 1 nM bafilomycin Al, 5 mM 3-metyladenin (3-MA) ​​och 50 mikrometer LY294002 under 24 timmar. Efter tvättning med PBS (pH 7, 4) kompletterades 100 pl färskt HBSS (pH 7, 4). Därefter inkuberades plattorna och inkuberades med WST-1-reagens under 30 minuter. Absorptionsvåglängden och referensvåglängden var 450 nm respektive 630 nm.

Cellulär förening av FA-M-p-CyD

KB-celler och M213-celler (1 x 10 6/35 mm skål) inkuberades med 1 ml odlingsmedium (FA-fritt) innehållande 10 mikrometer tetrametylrhodaminisotiocyanat (TRITC) -märkt FA-M-p-CyD (TRITC-FA- M-p-CyD) vid 37 ° C under 1 timme. Efter tvättning med PBS (pH 7, 4) skrapades cellerna med 1 ml PBS (pH 7, 4). Data erhölls för 1 x 104 celler på en FACS Calibur-flödescytometer med användning av CellQuest-programvaran (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Intracellulär distribution av FA-M-p-CyD

KB-celler (1 x 10 6/35 mm glasskål) behandlades med 10 um TRITC-FA-M-p-CyD vid 37 ° C under 1 timme. Hoechst 33342 (10 ug / ml) inkuberades vid 37 ° C under 10 minuter. Efter tvättning med PBS (pH 7, 4) tillsattes RPMI-1640 (FA-fri). KEYENCE Biozero BZ-8000, ett fluorescensmikroskop, användes för detektering av TRITC och Hoechest33342.

DNA-innehåll och mitokondriell transmembranpotential

DNA-innehållet och transmembranpotentialen i mitokondrier i KB-celler bestämdes såsom rapporterats tidigare 34 . I korthet behandlades KB-celler (1 x 10 6/35 mm skål) med RPMI-1640 (FA-fri) innehållande 10 mM DM-p-CyD eller FA-M-p-CyD under 2 timmar. Propidiumjodid (PI, 20 μg / ml) och rodamin 123, indikatorerna för DNA-innehåll och transmembranpotential i mitokondrier, kvantifierades med användning av en FACS Calibur-flödescytometer med CellQuest-mjukvara.

TUNEL-analys

Detektion av apoptos utfördes med TUNEL-analys. Kort sagt inkuberades KB-celler (1 x 10 6/35 mm glasskål) med 5 mM DM-p-CyD eller FA-M-p-CyD vid 37 ° C under 1 timme. Cellerna tvättades med PBS och fixerades genom inkubation i 4% paraformaldehyd i PBS under 1 timme vid rumstemperatur. Terminala deoxynukleotidyltransferas (TdT) -medierade dUTP nick och märkning (TUNEL) analyser utfördes med användning av TACS® 2 TdT-DAB in situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD) enligt tillverkarens instruktioner.

Klyvad caspase 3-analys

Caspase 3-klyvningsanalys utfördes genom western blotting. I korthet inkuberades KB-celler (1 x 10 6/35 mm skål) med RPMI-1640 odlingsmedium (FA-fritt) innehållande 10 mM DM-p-CyD eller FA-M-p-CyD under 2 timmar. Efter tvättning med PBS lyserades cellerna med 4 x provbuffert (8% SDS, 40% glycerol, 24% p-merkaptoetanol i Tris-HCl-buffert (pH 6, 8)) och kokades under 5 minuter. Efter bestämning av proteinkoncentrationer med användning av bicinchoninsyrareagenset från Pierce Chemical (Rockford, IL) separerades prover (20 ug som proteiner) med 12% SDS-PAGE och överfördes till Immobilon P-membran (Nihon Millipore, Tokyo, Japan). Membranen blockerades med 5% skummjölk i PBS innehållande 0, 1% Tween 20 (PBS-T) och inkuberades med caspase 3-antikropp (Santa Cruz, Delaware, CA) vid 4 ° C under natten. Efter tvättning med PBS-T inkuberades membranen med sekundär antikropp av peroxidas-konjugerat får (Amersham-farmakia Biotech, Buckinghamshire, UK). Specifika band detekterades med användning av ett ECL Western blotting-analyspaket (Amersham Bioscience, Tokyo, Japan). Banden detekterades med användning av Lumino-bildanalysatorn LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo, Japan). Bandintensitetsförhållandet för klyvt caspase 3 / pro-caspase 3 analyserades med Image-J-programvaran.

Autofagosombildning

I korthet inkuberades KB-celler (1 x 10 6/35 mm skål) med FA-M-p-CyD (5 mM) under 2 timmar, i närvaro och frånvaro av förbehandling med 1 mikrometer LY294002, en autofagisk hämmare, under 4 timmar. h och därefter behandlades cellerna med Cyto-ID® Autophagy Detection Kit. Ett fluorescensmikroskop av Biozero BZ-8000 (KEYENCE) användes för cellobservation.

Clearance av proteinaggregat via autofagi

Clearingen av proteinaggregat via autofagi utvärderades av Premo ™ Autophagysensorer. I korthet inkuberades cellerna (5 x 10 5/35 mm glasbotten) med RPMI-1640 odlingsmedium (FA-fritt) under 24 timmar. Efter tvättning med PBS tillsattes 25 ul GFP-p62 till odlingsmediet. Efter inkubation under 16 timmar tvättades cellerna med PBS och inkuberades med 50 mikrometer klorokin under 10 timmar. Därefter inkuberades cellerna med 5 mM FA-M-p-CyD i närvaro av 50 umM kloroquin under 2 timmar. Efter tvättning med RPMI-1640 odlingsmedium (FA-fritt) användes ett fluorescensmikroskop av Biozero BZ-8000 (KEYENCE) för cellobservation.

Statistik

Alla experiment genomfördes i tre exemplar i varje mätserie, och varje serie upprepades mer än tre gånger. De experimentella resultaten visas som medel ± SEM Signifikansnivåer för jämförelser mellan prover bestämdes med Scheffes test. Nivån för statistisk signifikans sattes till P <0, 05.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande figur 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.