Intracellulär kvantitativ detektion av humant tymidylatsyntasengagemang med en okonventionell hämmare med användning av tetracstein-diarsenisk-sondteknologi | vetenskapliga rapporter

Intracellulär kvantitativ detektion av humant tymidylatsyntasengagemang med en okonventionell hämmare med användning av tetracstein-diarsenisk-sondteknologi | vetenskapliga rapporter

Anonim

Abstrakt

Att visa ett kandidatläkemedels interaktion med dess målprotein i levande celler är av avgörande betydelse för det framgångsrika resultatet av läkemedelsupptäcktprocessen. Även om tymidylatsyntas (hTS) är ett viktigt målprotein mot cancer, är effekten av de få anti-hTS-läkemedel som för närvarande används i klinisk praxis begränsad av utvecklingen av resistens. Därför finns det en intensiv sökning efter nya, okonventionella anti-hTS-läkemedel; det finns cirka 1600 pågående kliniska studier som involverar hTS-inriktade läkemedel, både ensamma och i kombinationsprotokoll. Vi har nyligen upptäckt nya, okonventionella peptidhämmare av hTS som är aktiva mot cancerceller och inte resulterar i överuttryck av hTS, som är en känd molekylär resistenskälla. Här föreslår vi en anpassning av den nyligen föreslagna tekniken för tetracstein-arsenikbindande-motiv för att detektera och kvantitativt karakterisera engagemanget av hTS med en sådan peptidinhibitor i celllysat. Denna nya modell kan utvecklas till ett test för screeningstudier med hög genomströmning av intracellulärt målprotein / småmolekylbindning.

Introduktion

Inom anticancerforskning har kemiska och kliniska observationer lett till utvecklingen av nya translationella medicinska koncept med tillämpningar i de tidiga faserna av ett stort antal kliniska prövningar. De hittills identifierade cancerläkemedlen visar fortfarande en hög grad av kliniskt fel, ofta i de sena stadierna av försöken 1 . Således har mer effektiva strategier genomförts aktivt. Läkemedelsupptäckt har flyttats från det konventionella begreppet cytotoxisk kemoterapi till riktad terapi; det vill säga utvecklingen av medel som riktar sig mot molekyler och signaltransduktionsvägar som är avvikande i cancerceller 2, 3, 4 . I detta sammanhang är det mycket viktigt att bevisa att kandidatläkemedlets interaktion med dess målprotein i levande celler, vilket är en förutsättning för effektiviteten av terapeutiska läkemedel, är ett viktigt resultat för det framgångsrika resultatet av läkemedelsupptäcktledningen 5, 6, 7 Dessutom skulle tillgängligheten av verktyg för att mäta läkemedelsmål engagemang i en biologisk miljö ge användbar information för att förbättra förståelsen för de fysisk-kemiska aspekterna av läkemedelsmålinteraktioner. För detta syfte föreslår vi en metod baserad på celler som ektopiskt uttrycker ett humant tymidylatsyntas (hTS) enzym konstruerat för att upprätthålla den FRET-baserade övervakningen av hTS-hämmare-bindning vid celllysatnivån.

Mer än 1600 kliniska studier pågår för närvarande för att utforska olika tillämpningar av folatinriktade enzymer i cancer mot terapi. I många av dessa studier är hTS-inriktade kemoterapeutika i framkant som enskilda medel eller i kombinationer 8, 9, 10, 11 . I den dimera formen katalyserar TS-enzymet den reduktiva metyleringen av deoxyuridinmonofosfat (dUMP) till dTMP och tillhandahåller den enda de novo-vägen till tymidinproduktion för DNA-syntes 12 . Således förorsakar dess hämning utarmningen av celltillväxt genom att försämra DNA-replikering och reparation. Bristen på hTS-monomerer att reglera hTS-mRNA med efterföljande hTS-överuttryck är en mekanism för uppkomsten av resistens mot TS-riktade läkemedel 13, 14, 15 . Efter identifiering av hotspot-rester vid intermonomergränssnittet som är avgörande för stabiliteten hos den dimera enheten 16 upptäckte vi flera oktapeptidinhibitorer som, annorlunda än klassiska hTS-hämmare, binder proteindimeren vid gränssnittet monomer / monomer och stabiliserar dess inaktiva konformation 17, 18 . Bland dessa hämmare visade sig peptid LSCQLYQR (LR) ackumuleras i celler till stabila koncentrationer av flera tiotals mikromol / liter 19 och kunde hämma hTS och cancercellstillväxt utan att orsaka överuttrycket av enzymet 17, 20 .

Enligt en strategi som utarbetats av Tsien och medarbetare kan vissa fluorogena biarsenicaler kovalent binda proteiner som innehåller ett tetracsteinmotiv, CCXXCC, och därigenom stärka deras utsläppskvantautbyte och göra sådana tetracsteininnehållande proteiner observerbara i cellerna 21, 22 . CCPGCC-sekvensen har en hårnålkonformation som optimerar den kovalenta bindningen av varje As-atom i sonden till S-atomerna i två cysteinenheter. Tydliga dissociationskonstanter så låga som 4 pM har uppmättts för komplex bildade mellan den fluorescein-diarseniska sonden FlAsH och vissa dodekapeptider som inkluderar denna sekvens 23 . Denna strategi har visat stort värde vid utredning av protein-protein-interaktioner och proteinstrukturmodifieringar 24, 25 . Men dess potential för att detektera den intracellulära bindningen av ett målprotein med ett kandidatläkemedel har uppenbarligen förbises.

I det aktuella arbetet demonstrerar vi denna potential genom ett testfall som involverar hTS och dess peptidinhibitor LR. Vi anpassade tekniken tetracystein-arsenikbindande-motiv för att möjliggöra kvantitativ karaktärisering av bindningen av hTS med LR-peptiden i en celllysatmiljö (se Fig. 1 för en översikt). Vi modifierade hTS genom att introducera en CCPGCC-hexapeptid (TC-motiv) som kan binda kovalent den grönemitterande fluoresceinbaserade diarseniska sonden (FlAsH-EDT 2 ) 21, 22, och LR-peptiden konjugerades till en blåemitterande sond ( hilyte405, h). På grund av en gynnsam spektral överlappning kan hilyte405 effektivt sensibilisera FlAsH-emissionen genom icke-strålande energiöverföring (FRET) i hTS-TC-FlAsH / LR-h-komplexet och därmed avslöja hTS / LR-ingrepp i en cellulär miljö.

Image

( a ) Schematisk representation av introduktionen av TC-motivet (CCPGCC) nära N-terminalen av hTS och den efterföljande bindningen av en grönemitterande fluoresceinbaserad diarsenisk sond (FlAsH-EDT2) för att bilda FlAsH-TC-hTS-komplexet. ( b ) Efter hTS / LR-igenkänning inducerar excitering av LR-hilyte405 energiöverföring till grönemitterande FlAsH i FlAsH-TC-hTS / LR-hilyte405-komplexet. Denna vy representerar en horisontell sektion av dimern.

Bild i full storlek

Resultat

Transfekterade HEK293-celler uttrycker enzymatiskt aktiv tetracstein-hTS

TS-aktiviteten beror på den strukturella integriteten i den C-terminala regionen, och den proteasomala nedbrytningen av humant TS är ubiquitinoberoende och medieras av en intrinsiskt störd region vid molekylens 26 N-ände. För att undvika störningar i dessa processer satte vi därför in den CCPGCC-arsenikbindande domänkonstruktionen vid N-terminalen vid position aa 20–21 från den förutsagda starten. Det konstruerade hTS förväntades uttryckas ektopiskt och bevara sin aktivitet inuti celler. I själva verket är det lilla CCPGCC-motivet mindre benägna att störa hTS-strukturen och biologiska funktioner än andra vanliga taggar (CFP, YFP, eGFP) 27 . En översikt över kloningsstrategin ges i det kompletterande materialet.

HEK293T-celler transfekterades transient med antingen pcDNA3.1-tom vektor eller pcDNA3.1-hTS eller pcDNA3.1-tetracstein-hTS. Efter behandling med FlAsH-EDT 2 observerade vi den förväntade förbättringen av grön fluorescens endast i TC-hTS-transfekterade celler (fig. 2a). Vi bekräftade den specifika bindningen av FlAsH-EDT 2 till den rekombinanta TC-hTS genom att ladda polyakrylamidgelen med proteinerna extraherade från HEK293T-celler transient transient med de tre vektorerna som beskrivs ovan och behandlats med FlAsH-EDT2. Fluorescensemissionen från den TC-bundna FlAsH fångades och det ektopiska uttrycket av hTS utvärderades genom immunblotanalys (fig. 2b, kompletterande fig. 2). Det ektopiskt uttryckta TC-hTS-proteinet bevarade sin enzymatiska aktivitet. Såsom visas i fig. 2c visade HEK293T-celler transfekterade med pcDNA3.1-tom vektor basal hTS-aktivitet. HTS ektopiskt uttryck (pcDNA3.1-hTS) ökade enzymaktiviteten med 2, 3 gånger. En dosberoende induktion av aktivitet observerades också i celler som ektopiskt uttryckte ökade mängder av konstruerad TC-hTS (pcDNA3.1-tetracstein-hTS), vilket således visade att enzymaktiviteten ökade tillsammans med mängden internaliserad plasmid. Under samma förhållanden ökade hTS-proteinnivåerna, som bedömdes genom western blot-analys, parallellt med hTS-aktiviteten.

Image

( a ) Konfokal fluorescensmikroskopibilder av HEK293T-celler transfekterade med tom vektor, pcDNA-TS eller pcDNA-tetracstein-hTS (pcDNA-TC-TS) som visar den gröna fluorescensen av FlAsH bunden till det rekombinanta TC-hTS-proteinet; ( b ) En representativ beskuren polyakrylamidgel för hTC-TC-FlAsH (fullängdsgelén presenteras i kompletterande figur 2). Gelén kördes med användning av olika provberedningar: 10 mM TCEP (tris (2 karboxietyl) fosfin) som reduktionsmedel istället för BME (p-merkaptoetanol) sattes till lysatet innan FlAsH-EDT2-märkning. Den nedre panelen visar Western blot för hTS-proteinuttryck med samma prover, men med BME används som reduktionsmedel; ( c ) utvärdering av hTS-aktivitet i HEK293T-celler som ektopiskt uttrycker hTS och TC-hTS; överst: TS-aktivitet, botten: TS-proteinnivåer. Felfält representerar sd (n = 3).

Bild i full storlek

FRET-experiment möjliggör kvantitativ karakterisering av LR-peptidbindning till rekombinant hTS

Den fluorometriska analysen av LR / hTS-interaktionen fortsatte i tre steg. Vi undersökte först bindningen av peptiden till det rekombinanta proteinet i buffert. Sedan jämförde vi dessa resultat med beteendet som visas av oktapeptiden kontra hTS i två cellmiljöer med ökande komplexitet. För det första experimentet titrerades ett rekombinant hTS märkt med fluorescein (detaljer tillhandahålls i ref. 28 och i metodavsnittet) med LR-h-konjugatet. Den märkta LR-peptiden testades gentemot rekombinant hTS och visade hämning med en IC50 av 7 ± 1 mikrometer (kompletterande figur 3), i överensstämmelse med de resultat som observerades för hämning av LR 17 . De UV-synliga absorptionsresultaten presenterade i fig. 3a visar den progressiva tillsatsen av LR-h (maximalt vid 404 nm) till en lösning av 4, 2 μM hTS märkt med fluorescein (hTS-F, maximalt vid 495 nm, 3, 8 μM) i fosfat buffert vid pH 7, 5. Under titreringsförloppet orsakade excitation av hilyte405 (h) utsläpp från h själv, med ett maximum vid 420 nm, och från fluorescein (F), med ett maximum vid 522 nm. Det senare resulterade från både direkt excitation och energiöverföring från h (fig. 3a).

Image

( a ) topp: UV-synligt absorptionsspektra av en 4, 2 μM hTS-lösning märkt med fluorescein (F, 3, 8 μM) med efterföljande tillsatser av LR-hilyte405 (h); botten: emissionsspektra för hilyte405 (h) och fluorescein (F) vid excitering vid 370 nm lösningar i fosfatbuffert innehållande en fast hTS-F-koncentration och ökande koncentrationer av LR-h. Insats: Scatchard-plot för hTS-F / LR-h fluorometrisk titrering (r = fraktion av ockuperade bindningsställen, L = koncentration av fri LR-h-ligand). ( b ) FlAsH-emission vid hilyte405-excitation vid 380 nm för lysater av hTS-uttryckande celler (topp, hTS) och hTS-tetracys-transfekterade celler (botten, TC-hTS). Insatser: korrigerad FlAsH-utsläppsintensitet vid 522 nm som funktion av tillsatt LR-h-volym och motsvarande Scatchard-plot.

Bild i full storlek

För en given LR-h-koncentration var emissionskvoten I 420 / I 522 oberoende av kyvettorienteringen 4 × 10 mm 2 och därför av den genomsnittliga banlängden för utsänt ljus genom lösningen. Detta resultat indikerar att strålande energiöverföring, dvs reabsorptionen av h-emission med F, är försumbar och att den observerade FRET härstammar från icke-strålande energiöverföring mellan h-givaren och F-acceptorn inom LR-h / hTS-F-komplex. H-emissionen ökade linjärt med mängden LR-h tillsatt, vilket förväntas om LR-h inträffar i överskott med avseende på komplexet. Däremot visade F-emissionen en mättande trend, typisk för titreringar, och övervakades LR-h / hTS-F-komplexbildning. Scatchard-analys av fluorescensdata (inskjutet i fig. 3a) gav en bra linjär passning motsvarande en 1: 1-bindning (-avlyssning / lutning = 1, 03) och en jämviktskonstant för hTS-F / LR-h-komplexa dissociation, K d = 3, 6 um (± 10%). Vi erhöll den bästa passningen med ett mättnadsvärde för protein / peptidkomplexkoncentrationen på 3 μM, vilket var 29% lägre än den totala proteinkoncentrationen. Detta resultat innebär att endast en del av proteinet kan binda peptiden, ett resultat som överensstämmer med de kalorimetriska resultaten som rapporterats i ref. 17 och tolkas genom att postulera att endast den di-inaktiva formen av proteinet (ungefär 25% av det totala hTS-proteinet) kan binda LR-peptiden (experimentellt arbete som syftar till att noggrant testa detta antagande pågår för närvarande).

LR-h / hTS-TC-FlAsH FRET bevisar bindning av enzym / hämmare i celllysat och möjliggör kvantitativ karakterisering

I en steg-för-steg ökning av matriskomplexiteten utförde vi liknande experiment i HEK293T-celllysat till vilka hTS-F hade tillsatts upp till en koncentration av 2, 5 μM. Återigen ökade h-emissionen linjärt med LR-h-koncentrationen, medan F-emissionens intensitet visade mättande beteende (kompletterande fig. 4). Skillnaden här var att den senare emissionen visade en försenad initial ökning, i överensstämmelse med initial bindning av en fraktion av LR-h till en art som skiljer sig från hTS. I själva verket visade Scatchard-plottet att de två första punkterna avvikde från den linjära trenden (kompletterande figur 4). Men om jämviktsmodellen korrigerades för att inkludera ett tätt LR-peptidbindemedel (K = 5 × 10 7 M −1 ) vid en 150 nM koncentration (se Metoderna för detaljer), återvanns en bra linjär plot med en Kd och ett protein / peptidbindningsförhållande som inte kan skiljas från de erhållna i fosfatbuffert. Återigen var mättnadsprotein / peptidkomplexkoncentrationen ungefär 20% lägre än den spektrofotometriska proteinkoncentrationen.

Vi karaktäriserade slutligen LR / hTS-bindningen direkt i lysat av HEK293T-celler som ektopiskt uttrycker TC-hTS. Vi övervakade bildningen av protein / peptidkomplexet genom att observera FRET från hilyte405, bundet till LR-peptiden, till den diarseniska sonden FlAsH tillsatt till celllysat för att märka hTS-proteinet smält med TC-motivet. Vi utförde fyra efterföljande tillsatser av en koncentrerad FlAsH-lösning, var och en motsvarande en slutkoncentration 0, 15 μM, till lysaten av hTS- och TC-hTS som uttrycker HEK293T-celler. FlAsH-emissionen (excitation vid 480 nm) ökade med den tillsatta mängden FlAsH och, i fallet med de hTS-uttryckande cellerna, fortsatte att öka i ungefär fyrtio minuter efter tillsatsen av sonden. I själva verket kan bindning av de två arsenikatomerna till de fyra cysteinerna i motivet kräva flera tiotals minuter 29 . Efter den fjärde tillsatsen, vid en total FlAsH-koncentration på 0, 6 μM, erhöll vi en emission från TC-hTS-celllysatet som var 2, 5 gånger högre än den från hTS-celllysatet (kompletterande fig. 5). Vi utförde sedan fem tillsatser av LR-h till dessa lösningar upp till en slutlig koncentration av 2, 6 μM. Vi observerade FRET från h-givaren till FlAsH-acceptorn i TC-hTS-lysater, men inte i hTS-lysater (fig. 3b). Efter en enkel korrigering av FlAsH-utsläppsintensiteten för h-utsläppsvansen analyserade vi data enligt Scatchard-metoden. Vi erhöll en bra linjär kurva (inskjuten i fig. 3b) med användning av en mättnadsprotein / peptidkomplexkoncentration 2, 5 mikrometer och en Kd på 3, 4 mikrometer, vilket var i utmärkt överensstämmelse med Kd- värdet erhållet med den förenklade modellen i fosfatbuffert med de inhiberingsdata som ges ovan för LR-h-konjugatet och publicerades för LR-peptiden 17 . I detta fall kan den punkt som motsvarar det första LR-h-tillsatsen justeras med följande punkter genom att inkludera ett 30 nM tätt LR-bindemedel, som var närvarande i TC-hTS-celllysatet, till den totala jämviktsmodellen.

Sammanfattningsvis utvecklade vi HEK293T-transformerade celler som ektopiskt uttryckte en konstruerad hTS med bevarad aktivitet och stabilitet. TC-motivet smält i detta protein kan binda en diarsenisk fluorofor, som är i stånd att fungera som en elektronisk energiacceptor inom komplex som involverar det konstruerade proteinet och en liten peptidinhibitor som är märkt med en energidonator, vilket ger en signal som kan användas för att känna igen och karakteriserar kvantitativt protein / hämmareinteraktion i celllysat. Även om TC-diarsenisk sondteknologi har använts i problem som involverar protein-proteininteraktioner och proteinstrukturmodifieringar 24, så är det enligt vår kunskap dess första tillämpning på FRET-baserad övervakning och kvantitativ karakterisering av interaktionen mellan ett målprotein med en liten -molekylläkemedelskandidat i celllysat. Denna rekombinanta modell är lätt att applicera och erbjuder en enastående möjlighet att utföra en förskjutningsanalys för screening av specifika hämmare av hTS-monomer / monomerinteraktion i celler. Arbetet i denna riktning pågår. Av mer allmänt intresse kan det tillvägagångssätt som beskrivs här anpassas för att utveckla analyser för kvantitativt screening av drogbart protein / småmolekylinteraktioner i celler. Slutligen, enkel sekventiell applicering på ett cellprov av två olika diarseniska prober, t.ex. grönemitterande FlAsH-EDT 2 och rödemitterande ReAsH-EDT 2, och detekteringen av deras utsläpp över tid kommer att ge ett enkelt sätt att följa omsättningen och handel med hTS eller något annat lämpligt konstruerat protein.

metoder

Syntes av LR-hilyte405

Konjugeringen av LR till hilyte405 uppnåddes med användning av den klassiska tiol-Michael-reaktionen. En lösning av fluorescerande sond (1 mg, 1 ekv.) I CH3CN (250 mikroliter) sattes till en omrörd lösning av LR-peptiden (1, 1 ekv.) I 250 mikroliter H20, följt av tillsats av 25 mikroliter NaHCO 3 5%. Blandningen omrördes i mörkret under en kväveatmosfär vid omgivningstemperatur under 15 minuter. Reaktionen övervakades genom HPLC och MS-analys. Efter avslutad reaktion gav HPLC-rening det fluorescerande konjugatet i kvantitativt utbyte.

Proteinrening

Det humana tymidylatsyntas- proteinet (hTS) -proteinet erhölls från en kultur av E. coli (DH5a) som uppbär plasmidvektorn pQE80L_hTS klonande proteinkodande gen i EcoRI / BamHI-restriktionsställena för plasmidvektorn pQE80L ( Addgene ) 16 . Positivt transformerade celler selekterades genom ampicillinresistens (100 ug / ml) och odlades genom att skakas i 1 1 LB-tillväxtmedium vid 37 ° C och 120 rpm under 6 timmar. Isopropyl-P-D-1-tiogalaktopyranosid ( IPTG , 1 mM) sattes till bakteriekulturen vid 37 ° C och 120 varv / minut under 14 timmar. Efter induktion av proteinuttryck centrifugerades hela cellkulturen under 20 minuter vid 4 ° C och 4500 rpm. Den cellulära pelleten återsuspenderades med buffert-A (NaCl 30 mM, NaH2PO4 20 mM, pH 7, 0). Proteasinhibitor ( Roche ) sattes till den cellulära suspensionen och bakterieceller lyserades genom sonikering ( Melsungen Labsonic ). Suspensionen centrifugerades vid 12000 varv / min, vid 4 ° C, under 20 minuter och lysatet filtrerades genom 0, 45 / 0, 2 um sprutfilter. Det filtrerade lysatprovet inkuberades med nickelharts under 1 timme på is vid 120 rpm. Två tvättsteg utfördes: tre volymer buffert-A och sedan tre volymer buffert-B (NaCl 30 mM, NaH2PO4 20 mM, imidazol 100 mM, pH 7, 0). Målproteinet eluerades med buffert-C (NaCl 30 mM, NaH2P04 20 mM, imidazol 1 M, pH 7, 0) med användning av en flödeshastighet av 1 ml / min. Ett avsaltningssteg med en HiTRAP-avsaltningskolonn (5 ml, GE Healthcare ) i buffert-A behövdes för att avlägsna imidazol. Enzymets kinetiska aktivitet detekterades med den spektrofotometriska metoden i varje uppsamlad elueringsfraktion. Renhetsnivån för den renade proteinpoolen kontrollerades med SDS-PAGE (≫ 95%). Enzymets kinetiska profil kännetecknades (se nedan).

Kinetisk karaktärisering av enzymet

kcat- och Km-värden bestämdes med användning av en spektrofotometrisk metod (Spectramax 190, Molecular Devices) baserat på den tidsberoende ökningen av absorbansen vid 340 nm på grund av dihydrofolat (DHF) bildning härrörande från 5, 10-metylen-tetrahydrofolat (mTHF) enzymkatalyserad oxidation reaktion. Reaktionsblandningen innehöll 600 ul kinetisk buffert (NaCl 30 mM, NaH2PO4 20 mM, pH 7, 0), 50% (volym / volym) TES-buffert (N- [tris (hydroximetyl) metyl] -2-aminoetansulfonsyra 100 mM, MgCl2 50 mM, Formalin 13 mM, EDTA 2 mM, p-merkaptoetanol 150 mM, pH 7, 4), hTS-proteinenzym, mTHF och deoxyuridin-monofosfat (dUMP) -substrat. Enzymreaktionen startades när dUMP sattes till reaktionsblandningen. Sex enzymkoncentrationsintervall (0, 08–0, 16–0, 25–0, 30–0, 38–0, 46 μM) och fasta mTHF- och dUMP-substratkoncentrationer på 55 μM respektive 120 μM. Den resulterande kcat var lika med 0, 9544 (s −1 ), i överensstämmelse med data rapporterade i litteratur 17 . MTHF Km-värdet bestämdes med hänsyn till ett intervall av värden på 3, 50–6, 90–8, 65–20, 70–41, 50–69, 20 μM och fasta enzym- och dUMP-koncentrationer, nämligen 0, 30 μM respektive 120 μM. DUMP Km-värdet bestämdes med tanke på substratkoncentrationer på 5, 15–10, 29–20, 58–41, 16–80, 61–161, 21 μM och fasta enzym- och mTHF-koncentrationer av 0, 30 μM respektive 55 μM. De resulterande km-värdena för mTHF och dUMP var lika med 5, 87 μM respektive 9, 74 μM i överensstämmelse med data rapporterade i litteraturen 17 . kcat- och Km-värden bestämdes genom att analysera rådata med Michaelis-Menten-kinetik med stabil tillstånd. För varje enstaka bestämningsanalys analyserades experimentdata i tre exemplar med ett p-värde <0, 005 som representerade statistisk signifikans.

Enzyminhibitionsanalys

Förmågan hos LR-hilyte405 att hämma den kinetiska aktiviteten hos hTS utvärderades. En spektrofotometrisk analys på en 96-brunnars platta med användning av en Spectramax-190 multiplikatorläsare ( Molecular Device ) utfördes. Analysen bestod av övervakning, i närvaro och frånvaro av hämmaren, av absorbanssignalvariationen vid DHF-specifik våglängd av 340 nm, under en total kinetisk tid av 180 sek vid RT i en slutvolym av 100 ul per brunn. Inhiberingsreaktionsblandningen inkluderade följande komponenter: kinetisk buffert (NaCl 30 mM, NaH2PO4 20 mM, pH 7, 0), 100 ul; hTS-enzym, i ett koncentrationsvärde för att uppnå ett enzymkinetiskt värde i området 0, 07–0, 08 ΔOD / min; inhibitorföreningen vid flera olika koncentrationsvärden; 50% (v / v) TES-buffert-, mTHF- och dUMP-substrat vid koncentrationer motsvarande 10 gånger km-värdet (mättningsbetingelser). För att mäta koncentrationen av hämmare som reducerar aktiviteten för hTS med 50% (IC50) utfördes analysen enligt följande. Liganden löstes i DMSO för att erhålla en initial koncentration av 10 mM. En första hämningsanalys vid två koncentrationer med enstaka punkter utfördes för att identifiera de optimala ligandvärdena att beakta i ICso-analysen. LR-hilyte405 testades i två koncentrationer (50 och 100 mikrometer) i duplikat, med ett statistiskt signifikant p-värde <0, 005, för att utvärdera den hämmande aktiviteten både vid tidpunkten noll och efter en inkubation av 1 timme med hTS-enzymprotein vid RT och 50 varv / min. LR-hilyte405-peptid-sondkonjugatet testades vid 50 och 100 mikrometer både vid tiden noll och efter 1 timmars inkubation, vilket uppvisade en hämmande aktivitet lika med 80% respektive 88%. Baserat på de erhållna hämningsdata mättes liganden IC50 med användning av en enzymkoncentration lika med 0, 30 umM och substratkoncentrationer på 55 respektive 100 mikrometer för mTHF respektive dUMP. Tio koncentrationer av LR-Hilyte 405 (0–2–5–10–15–25–50–75–100–125 μM) testades i duplikat, med ett statistiskt signifikant p-värde <0, 005. Uppgifterna analyserades i ett plottformat av Dixon-typ (v −1 / [LR-h]) med användning av en linjär minsta kvadratisk passning (inbyggd i tilläggsfiguren 3). IC50, dvs LR-Hilyte 405-koncentrationen vid vilken reaktionshastigheten var halva hastigheten i frånvaro av hämmare, och det tillhörande felet erhölls från anpassningsparametrarna och deras fel.

cDNA-manipulationer och mutagenes

hTS cDNA amplifierades med PCR från omvänt transkriberat cDNA från en cellcellinje från livmoderhalscancer 2008 med användning av KAPA HiFi DNA-polymeras (KAPABIOSYSTEMS) och följande primrar. Primer1: 5′-GCGGAAGGGGTCCTG-3 ′ och Primer 2b Kpn1: 5′-CTCGGTACCGACGAATGCAGAACACTTCTTTATTATAGC-3 ′. Det resulterande fragmentet på 1, 559 bp bestående av den sista 115 bp uppströms ATG-kodonet, hela cd-skivorna och 3UTR klonades in i pTargeT ™ däggdjursuttryckningsvektorn (Promega) som genererade hTS-pTargeT-plasmiden. CCPGCC-aminosyrasekvensen (tetracysteinmotiv) infördes mellan den 20 och 21: e aminosyran via PCR-medierad kloning från 2008 cDNA-biblioteket. Fragmentet (a) från 115 bp uppströms ATG till 60 bp nedströms erhölls med användning av Primer1: 5'-GCGGAAGGGGTCCTG-3 'och primer 2a XmaI: 5'-ACAACAGCCCGGGCAACACCGCTCCTGTGCGGC-3', innehållande XmaI-stället insatt i nukleot .

Primer1b XmaI: 5′-TGTTGCCCGGGCTGTTGTGACGCCGAGCCGCG-3 ′ inklusive samma tetracstein-nukleotidsekvens och primer2b KpnI:

5'-CTCGGTACCGACGAATGCAGAACACTTCTTTATTATAGC-3 'användes för att generera ett 1400 bp fragment (b) bestående av den återstående proteinkodande nukleotidsekvensen och hela 3UTR. Båda fragmenten klonades in i pTargeT ™ Mammalian Expression Vector. Fragment (b) subklonades till XmaI- och Kpnl-stället för det vektorinnehållande fragmentet (a) för att generera hTS-TC pTargeT-konstruktionen. Sedan subklonades hTS och hTS-TC till NheI- och KpnI-stället för pcDNA3.1 (+) -vektorn för att generera hTS-pcDNA3.1- och hTS-TC-pcDNA3.1-konstruktionerna.

Cellodling och transfektioner

HEK293T-celler bibehölls i DMEM kompletterat med 10% FCS, 1 mM glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 U / ml streptomycin (Life Technologies) i en fuktad inkubator med 5% CO2. För expression av proteiner odlades celler på kammarglas och transfekterades med lämpligt plasmid-DNA med användning av Lipofectamine ™ LTX Transfection Reagent (Life Technologies) enligt tillverkarens instruktioner.

FlAsH-färgning och avbildning

HEK293T-celler (3 x 104) pläterades in i 6-brunnars mikroslider förbelagda med 0, 01% (vikt / volym) poly-L-lysin och transfekterades följande dag med 2, 5 ug DNA med användning av Lipofectamine ™ LTX Transfection Reagent. Efter 24 timmar märktes cellerna under 30 minuter med 12, 5 μM 1, 2-etanditiol (EDT) och 0, 5 μM FlAsH (Life Technologies) i HBSS och tvättades sedan två gånger under 15 minuter i 150 μM 2, 3-dimercaptropanol (BAL) i HBSS. Celler fixerades med 4% (vikt / volym) paraformaldehyd under 15 minuter vid RT och avbildades sedan med användning av ett inverterat Leica TCS SP2-konfokalt mikroskop kopplat till en Ar-laser (488 nm / 20 mW), utrustad med AOBS och drivs med en förstoring av 63x (HCX PL APO 63x / 1.40 - olja - Lambda blå korrigering). Bilder bearbetades med hjälp av LCS Lite (Leica Microsystems, Heidelberg).

SDS-PAGE av protein-FlAsH-komplex

HEK293T-celler (8, 5 x 105) pläterades i 35-mm skålar och transfekterades dagen efter med 2, 5 ug tom vektor, pcDNA-TS eller pcDNA-TS-TC med användning av Lipofectamine ™ LTX Transfection Reagent. Efter 24 timmar skördades cellerna och lyserades med RIPA-buffert (15 μg totalt protein belastat per linje). Laemmli provbuffert med SDS, glycerol, Tris-HCl pH 6, 8 och bromofenolblått, men innehållande 10 mM TCEP som reduktionsmedel istället för BME eller DTT, tillsattes till de prover som tidigare lyserats med RIPA-buffert. Prover kokades vid 100 ° C under 5 minuter och kyldes. Därefter tillsattes 10 mikrometer FlAsH-EDT 2 till proteinet och provbufferten, inkuberades vid rumstemperatur under 15–30 minuter, laddades på en 12% polyakrylamidgel och kördes som vanligt. Protein-FlAsH-komplexen visualiserades genom att placera gelén på en UV-transilluminator utrustad med en standardkamera med etidiumbromidfiltret valt på kameran.

Western blotting

HEK293T-celler skördades från substratet genom skrapning och pelletering innan de lyserades. Lysering utfördes på is under 15 minuter i RIPA-buffert (1% natriumdeoxikolat, 20 mM Tris-HCl (pH 7, 6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EGTA, 1 mM Na2 EDTA, 1 mM Na) 3 VO4, Na2 MoO4, 1 mM PMSF och proteasinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich Corporation)). Supernatanterna kokades med Laemmli-buffert och p-merkaptoetanol vid 95 ° C under 5–10 minuter. Prover separerades sedan på en SDS-PAGE, följt av överföring till PVDF-membran. Efter överföringen blockerades membran med 5% skummjölk vid rumstemperatur under en timme. Membran färgades med de angivna primära antikropparna (den monoklonala TS106-primära antikroppen från musen (Abnova) och vinculin musantikropp (Millipore, Inc.) i TBS-T med 5% torrmjölk över natten vid 4 ° C på en skakare. Pepparrotsperoxidas) ) -konjugerade anti-mus (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) sekundära IgG-antikroppar användes, och signalen visualiserades med användning av ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare Biosciences).

TS-katalytisk analys i celler

HEK293T-celler (2, 5 x 106) pläterades på 100 mm skålar och transfekterades följande dag med tom vektor, pcDNA-TS (15 μg) eller pcDNA-TS-TC (7, 13 eller 20 μg) med användning av Lipofectamine ™ LTX-transfektion Reagens. Efter 24 timmar skördades cellerna och delades upp för att analysera proteinnivåerna av TS (med användning av Western blotting) och för att utvärdera TS-aktiviteten. Cellpellets tinades genom tillsats av iskall lysbuffert (200 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 20 mM 2-merkaptoetanol, 100 mM NaF och 1% Triton X-100), sonikerad (tre x 5 s) och centrifugerades därefter vid 14 000 × g under 15 minuter vid 4 ° C. Supernatanten användes för enzymanalyser. TS-katalytisk analys utfördes enligt en tidigare rapporterad metod. Analysen bestämde den katalytiska aktiviteten av TS genom att mäta mängderna av 3H frisatt under den TS-katalyserade omvandlingen av [5-3H] dUMP till dTMP. I korthet utfördes analysen på enzymerna i analysbufferten (lysbuffert utan Triton X-100) och 650 μM 5, 10-metylentetrahydrofolat i en slutvolym av 50 μL. Reaktionen startades genom tillsats av [5-3H] dUMP ( 1 μM slutkoncentration, specifik aktivitet 5 mCi / mol), följt av inkubation vid 37 ° C under 60 minuter, och stoppades genom tillsats av 50 μl iskall 35% triklorättiksyra. Återstående [5- 3 H] dUMP avlägsnades genom tillsats av 250 ul av 10% neutralt aktiverat kol. Kolet avlägsnades genom centrifugering vid 14 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C, och ett 150 ul prov av supernatanten analyserades med avseende på tritiumradioaktivitet genom vätskescintillationsräkning i vätskescintillationsanalysatorn Tri-Carb 2100 (Packard). För varje cellinje fastställdes lineariteten för [5-3 H] dUMP-omvandling med avseende på mängden protein och tid.

Lysatberedning för spektrofluorometrisk analys

HEK293T-celler (10 x 106) pläterades i 150 mm skålar (6 skålar användes för varje tillstånd) och transfekterades följande dag med 25 | ig pcDNA-TS eller pcDNA-TS-TC med användning av Lipofectamine ™ LTX Transfection Reagent; celler samlades 48 timmar efter transfektion i 15 ml rör och tvättades två gånger med 4 ° C kall PBS för spektrofluorometrisk analys. För att undvika kärnbrott och följaktligen frisättning av kromatin för att erhålla lysat så optiskt tydligt som möjligt suspenderades cellulära pellets i 1, 5 ml hypotonisk lysbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7, 5, 20 mM Na2HP04, 30 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 mM HEPES pH 7, 9, 0, 01% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM Na3 VO4, 1 mM Na2 MoO4-proteasinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich Corporation) och inkuberades under 45 minuter på en rotator vid 4 ° C för att möjliggöra hypotonisk svullnad av celler och lysering genom mekanisk skjuvning. Efter centrifugering vid 16 000 g under 30 min samlades supernatanter för varje provlager och lagrades vid -80 ° C för ytterligare spektrofotometrisk analys.

FRET-baserad detektion av hTS-LR-interaktioner in vitro

UV-synliga absorptionsmätningar utfördes med en Cary 100 Varian-spektrofotometer. Fluorescensmätningar utfördes med en Horiba Fluoromax-3-spektrofluorometer. Prover hölls i 4 x 10 mm 2 kvarts-kyvetter. För experiment i fosfatbuffert märktes hTS med fluorescein med användning av förfarandet beskrivet i ref. 27. 800 ul av en lösning av fluorescein-märkt hTS (hTS-F) i fosfatbuffert vid pH 7, 5 3, 8 mikrometer i fluorescein och 4, 2 mikrometer i hTS-dimerer titrerades med LR-märkt med hilyte405 (LR-h), varvid varje tillsats motsvarar en slutkoncentration mellan 0, 15 och 0, 2 μM. Fluorescein-, hTS-dimer- och LR-h-koncentrationerna bestämdes spektrofotometriskt med användning av följande utdödningskoefficienter: ε max (fluorescein) = 79000 M −1 cm −1, 280 (hTS) = 89000 M −1 cm −1, 280 fluorescein) = 30000 M −1 cm −1, 28 och ε 404 (LR-h) = 35000 M −1 cm −1, bestämd ad hoc för detta arbete. H (420 nm) och F (522 nm) utsläpp mättes genom excitation vid 370 eller 380 nm. F-emissionsvärden analyserades enligt Scatchard-metoden som funktioner för LR-h-koncentrationen. Mängden uppmätt före tillsats av LR-h och på grund av den direkta excitationen av F vid 370 nm subtraherades från intensiteten uppmätt vid 522 nm. Eftersom tillsatsen av LR-h orsakar en ökning av absorbansen vid 370 nm, A370, minskades emellertid den subtraherade mängden för att ta hänsyn till effekten av det inre filteret LR-h genom att multiplicera värdet vid [LR-h] = 0 med 10 −A370 / 2 . Bidraget vid 522 nm av h-utsläppets svans subtraherades också. För varje LR-h-tillägg beroddes således den korrigerade intensiteten vid 522 nm, I 522, endast på FRET och var därför proportionell mot koncentrationen av hTS-F / LR-h-komplex. Det användes för att beräkna fraktionen av ockuperade hTS-bindningsställen, r, och koncentrationen av den fria peptidliganden L med användning av det extrapolerade värdet vid mättnad, I 522 ', som r = I 522 / I 522', L = Lt - r [hTS] t, där [hTS] t är den totala koncentrationen av protein som kan binda peptiden. Värdet på denna parameter som gav den bästa passningen var vanligtvis något mindre än den spektrofotometriska totala proteinkoncentrationen. För TS / LR-komplexet erhölls Kd-värdet som Kd = −1 / s, där s är lutningen för den linjära minsta kvadratiska beslag av Scatchard-plottet, r / L vs. r, och proteinet / peptiden bindningsförhållandet var -i / s, där i är fånget och s lutningen. Liknande experiment utfördes i 800 ul av lysatet av 60 × 10 6 HEK-celler till vilka hTS-F sattes till en koncentration av 2, 5 mikrometer (bestämd spektrofotometriskt). För att få en linjär Scatchard-plot komplicerade vi bindningsmodellen genom att lägga till en jämvikt som beskriver komplexionen av LR med ett bindemedel med hög affinitet närvarande i lysatet. Målet var att förhindra att en del av peptiden binds till hTS, vilket gav en försenad ökning av I 522- signalen på grund av FRET inom hTS-F / LR-h-komplexen. Slutligen användes LR-h för att titrera hTS-proteinet närvarande i lysaten av 60 × 106 HEK-vildtypsceller och 60 × 106 HEK-celler transfekterade för att uttrycka tetracsteinmodifierad hTS. Båda lysaterna, 800 ul vardera, tillsattes först med den diarseniska sonden FlAsH. Fyra 2-ul tillsatser gjordes till en slutlig koncentration av 0, 6 mikrometer. FlAsH-emission mättes över tiden efter varje tillsats för att tillåta sonden att binda till tetracysmotiven. Därefter titrerades lysaten med LR-h och h-till-FlAsH FRET övervakades vid h-excitation vid 370 nm. De resulterande intensiteterna vid 530 nm, korrigerade som tidigare beskrivits för fluoresceinemissionen vid 522 nm, användes i en Scatchard-analys av de två datasätten parallellt med det som beskrivits ovan. I samtliga fall erhölls de fel som är förknippade med Kd- värdena från de fel som är förknippade med tomternas sluttningar i de linjära analyserna med de minsta kvadraterna och standardöverväganden.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.