Hämning av vemurafenib-resistent melanom genom interferens med pre-mrna-skarvning | naturkommunikation

Hämning av vemurafenib-resistent melanom genom interferens med pre-mrna-skarvning | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Cancergenetik
  • Terapeutisk resistens mot cancer
  • Melanom
  • RNA-skarvning

Abstrakt

Mutationer i serin / treoninkinas BRAF finns i mer än 60% av melanom. Den vanligaste melanommutationen är BRAF (V600E), som konstitutivt aktiverar nedströms MAPK-signalering. Vemurafenib är en potent RAF-kinasinhibitor med anmärkningsvärd klinisk aktivitet i BRAF (V600E) -positiv melanomtumörer. Patienter utvecklar dock snabbt resistens mot vemurafenib-behandling. En motståndsmekanism är uppkomsten av BRAF-alternativa skarvningsisoformer som leder till eliminering av den RAS-bindande domänen. Här identifierar vi störningar med pre-mRNA-skarvning som en mekanism för att bekämpa vemurafenib-resistens. Vi upptäcker att småmolekyler före-mRNA-splitsningsmodulatorer reducerar produktionen av BRAF3–9 och begränsar in vitro- celltillväxt av vemurafenib-resistenta celler. I xenograftmodeller förhindrar störning med pre-mRNA-skarvning tumörbildning och bromsar tillväxten av vemurafenib-resistenta tumörer. Våra resultat identifierar en intronisk mutation som den molekylära basen för en RNA-skarvningsmedierad RAF-hämmares resistensmekanism och vi identifierar pre-mRNA-skarvningsstörningar som en potentiell terapeutisk strategi för läkemedelsresistens vid BRAF-melanom.

Introduktion

Serinet / treoninkinaset BRAF är en prototo-onkogen som verkar i MAP-kinasvägen och förbinder mitogensignaler till transkriptionella regulatoriska nätverk för cellproliferation. Mutationer i BRAF är mycket utbredda och finns i mer än 60% av melanom 1, 2, 3 . Den vanligaste melanommutationen är BRAF (V600E), som konstitutivt aktiverar nedströms MAPK-signalering 4 .

Vemurafenib är ett potentiellt kortvarigt terapeutiskt medel för behandling av BRAF (V600E) -positivt melanom 5 . Patienter utvecklar emellertid alltid resistens mot läkemedlet 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 . Resistens kan uppstå genom re-aktivering av mitogen-aktiverat protein (MAP) / extracellulär signalreglerade kinaser (ERK) signalvägar 7, 11, inklusive uppströms råttasarkom (RAS) aktivering genom RAS-mutation, uppreglering av receptortyrosinkinaser 6, 14, amplifiering av BRAF (V600E) 12, aktivering av mutationer i MAPK / ERK-kinas (MEK) 8 och epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) 15, 16 . I ∼ 30% av resistenta tumörer beviljas resistens mot RAF-hämmaren vemurafenib genom alternativ skarvning via generering av BRAF-isoformer som saknar den RAS-bindande domänen (RBD) kodad av exonerna 3–5 (ref. 17, 18, 19; Fig. 1a ). I frånvaro av RBD dimeriseras dessa BRAF-isoformer även i närvaro av låga nivåer av RAS och ger läkemedelsresistens 13 .

( a ) Schematisk representation av AS-händelser upptäckta hos vemurafenib-resistenta melanompatienter. Endast introner dras i skala, intron 1 = 63 kbp. ( b ) Kvantitativ qPCR-analys av föräldrar och resistenta C3-celler. Indikerade värden representerar isoformvärden normaliserade till totalt BRAF-mRNA. Isoformnivåer i resistens C3-cellinjen sattes till 1, # Signal under detektionsgränsen. ( c ) U2OS-celler transfekterades med wt eller mutant BRAF-reporter. mRNA-nivåer utvärderades efter 48 timmar med användning av qPCR, indikerade värden representerar isoformvärden normaliserade till den totala mängden grönt fluorescerande protein (GFP) mRNA. Isoformnivåer i wtBRAF sattes till 1. ( d ) Sekundär struktur av 3'S för intron 8. Färgkodad parningssannolikhet för individuella nukleotider indikeras. ( e ) U2OS-celler transfekterades med den angivna BRAF-reportern. mRNA-nivåer utvärderades efter 48 timmar med användning av qPCR, BRAF3–9 isoformvärden normaliseras till den totala mängden GFP-mRNA. Isoformnivåer i wtBRAF sattes till 1. ( b, c och e ) Värden representerar medlen för tre oberoende experiment ± sd (* P <0, 05, ** P <0, 01, t- test).

Bild i full storlek

Här har vi undersökt användningen av skarvmodulering som ett medel för att övervinna vemurafenib-resistens. Vi visar att en punktmutation i intron 8 i BRAF- genen förmedlar resistensen mot vemurafenib i en läkemedelsresistent cellinje. Skarvningsmodulering vänder avvikande BRAF-skarvning och bromsar tillväxten av vemurafenib-resistenta celler in vitro och in vivo med användning av en xenograftmodell. Våra resultat skapar bevis för principen för skarvning av modulering som en terapi för cancer med ett molekylärt beroende till en svagt skarvad onkogenisoform.

Resultat

Identifiering av en intronisk BRAF vemurafenib-resistensmutation

För att utforska den molekylära basen för den pre-mRNA-skarvningsmedierade resistensen mot vemurafenib, utnyttjade vi tillgängligheten av vemurafenib-resistenta C3 humana melanomceller 13 . Dessa celler genererades genom förlängd BRAF-hämmarbehandling av SKMEL-239-celler, en patient-härledd melanomcellinje som uttrycker BRAF (V600E) 13 . I likhet med situationen hos vemurafenib-resistenta patienter medieras resistens i C3-celler genom uttryck av den alternativt skarvade BRAF3–9-isoformen, som saknar exon 4–8 (Fig. 1a) 13 . I överensstämmelse med den heterozygota naturen hos BRAF (V600E) -mutationen upptäckte vi både BRAF3–9 och helt skarvad BRAF (BRAF8–9) i de resistenta C3-cellerna. Ingen BRAF3–9 detekterades i föräldracellinjen (Fig. 1b och Kompletterande Fig. 1a). Förhöjda nivåer av BRAF3–9 i C3-celler berodde inte på nonsensmedierad nedbrytning av andra BRAF-isoformer sedan tystnad av UPF1, en komponent i det nonsensmedierade mRNA-förfallkomplexet, påverkade inte BRAF3–9 eller 7–9 isoformer (kompletterande Fig. Ib, c; P- värde <0, 01). Jämförande sekvensering av genomisk BRAF i C3 och deras föräldra SKMEL-239-celler identifierade en C-till-G-mutation vid position 51nt uppströms om 3 ′ skarvplatsen (SS) för intron 8 i BRAF (V600E) allelen i C3-celler (kompletterande Fig. 1d). Mutationen −51 kartlägger till en förutsedd grenpunkt (BP) i intron 8 (ref. 20).

BRAF3–9 isoformbildning genom en intronisk mutation

BRAF- mutationen −51 var tillräcklig för att främja bildningen av BRAF3–9. I en BRAF-minigen innehållande exonerna 3, 4, 8, 9 och delar av intronerna 3 och 8 (kompletterande fig. 1e) gynnade mutationen produktion av BRAF3–9-isoformen ungefär tvåfaldigt och ömsesidigt reducerat BRAF8–9 enligt bedömning av kvantitativ PCR (qPCR) och semi-qPCR jämfört med vildtyp (wt) -kontrollen (fig. 1c och kompletterande fig. 1g; P- värde <0, 01). Dessa effekter observerades oavsett om reportrar introducerades i föräldriga eller resistenta C3-celler, exklusive möjligheten till cellintresseffekter på BRAF- skarvning (kompletterande figur 1h).

Förutom den förutsagda intron 8 BP indikerar sekvensanalys 20 och sekundärstrukturanalys 21 närvaron av två kryptiska BP (cBP: er) belägna vid positionerna 88 och −109 nt i intron 8, uppströms om 3 ′ SS (Fig 1d). För att testa om dessa cBP: er är ansvariga för BRAF3–9 skarvning i närvaro av −51-mutationen i vemurafenib-resistenta celler, muterade vi cBP: erna i samband med antingen wt eller mutant BRAF (fig. 1e). Mutation av båda förmodade cBP: erna i wtBRAF-bakgrunden hade bara en försumbar effekt på BRAF3–9-skarvning (fig. 1e). Däremot resulterade mutation av dessa platser i samband med den −51 vemurafenib-resistenta BRAF-mutanten i en 40% minskning av BRAF3–9-användningen (Fig. 1e; P- värde <0, 05). Dessutom reducerade mutation av ett SRSF6-bindande ställe vid −129, men inte av SRSF6-ställen vid exon 8, samt knockdown av SRSF6, men inte SRSF1 eller 3, i resistenta C3-celler endogena BRAF3–9 med ∼ 30% (Kompletterande Fig. Li och j; P- värde <0, 05) och i U2OS-celler som uttrycker stabilt BRAF-minigen (kompletterande figur 1k och l; P- värde <0, 01). Inga skillnader i SRSF6-mRNA-nivåer hittades i föräldrar och resistenta cellinjer före RNA-interferens (RNAi) -behandling (kompletterande fig. 1 m).

Skarvningsmodulatorer reducerar produktionen och aktiviteten för BRAF3–9

Med tanke på förändringen i alternativ skarvning mot BRAF3–9-isoformen i vemurafenib-resistenta celler, testade vi huruvida behandling av resistenta celler med skarvningsmodulatorn spliceostatin A (SSA) 22 eller dess analoga meayamycin B (MAMB) 23, 24, som riktar sig till skarvning faktor SF3B1, hämmar bildning av BRAF3–9. Behandling av C3-resistenta celler med SSA (100 ng; 9 h) minskade mängden BRAF3–9 i resistenta C3-celler (Fig. 2a; P- värde <0, 05). Som kontroll påverkades inte skarvning av BRAF8–9 av SSA-behandling i varken föräldriga eller resistenta cellinjer (fig. 2a och kompletterande fig. 2a). Effekten av SSA var specifik eftersom ∼ 60% reduktion av dess omedelbara mål SF3B1 med RNAi (kompletterande fig. 2b; P- värde <0, 01) efterliknade dessa effekter (kompletterande fig. 2c, d; P- värde <0, 05). Behandling med MAMB (10 nM; 9 h) hade liknande effekter (fig. 2b; kompletterande fig. 2e). Som en ytterligare specificitetskontroll övervakade vi AS för MAPK-genen Erk-1 (ref. 25) och fann ingen förändring i varken föräldriga eller resistenta cellinjer (kompletterande figur 2f). Som förväntat resulterade reduktion av BRAF3–9-skarvning i reduktion av BRAF3–9-proteinisoform i den resistenta cellinjen (Fig. 2c) och åtföljdes av en minskning av ERK-signalering (Fig. 2d och kompletterande Fig. 2g, h; P värde <0, 05). Som visat före 13 är de totala BRAF-nivåerna lägre i den resistenta C3-cellinjen jämfört med föräldrarna (fig. 2c), men ERK-aktiviteten är förhöjd i resistenta celler (fig. 2d och kompletterande fig. 2g, h). Vi drar slutsatsen att skarvningsstörningar motverkar produktionen av BRAF3–9.

( a ) Vemurafenib-resistenta C3-celler behandlades med 100 ng ml-1 SSA under 9 timmar. mRNA-nivåer utvärderades med användning av qPCR. Indikerade isoformvärden normaliseras till totalt BRAF-mRNA. Isoformnivåerna i kontrollen sattes till 1. ( b ) Vemurafenib-resistenta C3-celler behandlades med 10 nM MAMB under 9 timmar. mRNA-nivåer utvärderades med användning av qPCR. Indikerade isoformvärden normaliseras till totalt BRAF-mRNA. Isoformnivåerna i kontrollen sattes till 1. ( c och d ) Föräldrar och resistenta C3-celler behandlades med 10 nM MAMB under 9 timmar. ( c ) Immunoblotting genomfördes med de indikerade antikropparna, ( d ) BRAF-aktivitet bestämdes genom att mäta pERK1 / 2-nivåer med användning av en Meso Scale Discovery (MSD) -teknologi. För SSA behandlades MAMB-experimentkontrollceller med antingen metanol eller dimetylsulfoxid, föreningslösningsmedlet. ( a, b och d ) Värden representerar medel för tre oberoende experiment ± sd (* P <0, 05, ** P <0, 01, t- test). GAPDH, glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas.

Bild i full storlek

Skarvningsmodulatorer hämmar vemurafenibresistent cellproliferation

Som tidigare visats är vemurafenib-resistenta C3-celler beroende av BRAF3–9 för deras spridning 13 . För att testa huruvida skarvningsstörningar blockerar spridning av läkemedelsresistenta celler behandlade vi föräldra SKMEL-239 eller resistenta C3-celler under 3 dagar med MAMB. För att säkerställa cellöverlevnad under 3 dagar av behandlingen var det använda dosintervallet (0, 05–0, 5 nM) ∼ 50 gånger lägre än den rutinmässiga dosen (10 nM) som användes för kortvariga skarvningsanalyser 26 . Resistenta C3-celler var signifikant mer känsliga för MAMB jämfört med kontrollförälderceller i frånvaro av vemurafenib (fig. 3a; P- värde <0, 0001). Den minskade proliferationsgraden i resistenta C3-celler i en dos av 0, 2 nM åtföljdes av en minskning av BRAF3–9-isoformen (kompletterande fig. 3a, b). Det är viktigt att skarvning av interferens återkänsliggjorde resistenta C3-celler till vemurafenib och reducerade deras proliferationspotential till den för de läkemedelsresponsiva föräldercellerna (Fig. 3b; P- värde <0, 001). Re-sensibilisering av C3-celler till vemurafenib åtföljdes av en reduktion av BRAF3–9 och följaktligen ERK-signalering (kompletterande fig. 3c, d; P- värde <0, 05). Skarvningsmodulering hade ingen effekt på proliferation eller ERK-signalering i föräldracellinjen (kompletterande fig. 3d, e). Dessa resultat visar att SSA och MAMB minskar BRAF3–9-skarvning och följaktligen ERK-signalering.

( a ) Föräldrar och resistenta C3-celler behandlades med den angivna koncentrationen av MAMB och cellviabilitet bestämdes efter 3 dagar. ( b ) Vemurafenib-känslighetskurvor vid 3 dagar för föräldriga och resistenta C3-celler i närvaro eller frånvaro av 1 ng ml −1 SSA. ( c ) Föräldra M397 och resistenta M397AR-celler behandlades med den angivna koncentrationen av MAMB och cellviabilitet bestämdes efter 3 dagar. Värden representerar medel för tre oberoende experiment ± sd ( P <0, 001, tvåvägsanalys av varians).

Bild i full storlek

Uppskattningsvis 30% av vemurafenib-resistenta tumörer innehåller olika BRAF-skarvningsisoformer 13, 19 (fig. 1a). För att testa om skarvningsstörningar är specifika för BRAF3–9 eller också är tillämpliga på andra BRAF-isoformer, behandlade vi den vemurafenib-resistenta M397AR-cellinjen, som uttrycker BRAF1–11, med MAMB (10 nM, 9 h) 12, 27 . BRAF1–11 reducerades med 50% i de resistenta M397AR-cellerna (kompletterande fig. 3f; P- värde <0, 05). Denna effekt berodde inte på generellt skarvhävande undertryck eftersom BRAF10–11 skarvning endast minskades måttligt med MAMB-behandling i antingen M397- eller M397AR-cellinjer (kompletterande fig. 3f, g). Som observerats för C3-celler var resistenta M397AR-celler mer känsliga för MAMB jämfört med M397-kontrollceller (fig. 3c; P- värde <0, 0001). Vidare hade skarvningsmodulering ingen effekt på proliferation i två uppsättningar av cellinjer som var resistenta mot vemurafenib av icke-RNA-skarvningsmedierad mekanism 14, 28 (kompletterande figur 3h, i).

Skarvningsmodulering hämmar tillväxt av vemurafenib-resistenta tumörer in vivo

För att undersöka den potentiella användningen av skarvningsmodulering i tumörer in vivo utförde vi xenograft-experiment. Föräldrar SKMEL-239 eller vemurafenib-resistenta C3-celler (1 x 10 6 ) injicerades subkutant i immunkomprometterade NSG-möss och djur behandlades med en låg dos SSA (0, 28 μg kg-1; injicerades ip var tredje dag). Även om SSA inte hade någon effekt på tumörbildning av förälderceller, blockerades bildningen av tumörer av vemurafenib-resistenta celler effektivt i närvaro av SSA (fig. 4a och kompletterande fig. 4a; P- värde <0, 05). Vemurafenibresistenta tumörer växte inte alls (3/4) eller var minst tio gånger mindre i vikt än den genomsnittliga föräldra tumören (1/4). För att undersöka om skarvningsmodulering hade någon gynnsam effekt på redan etablerade vemurafenibkänsliga eller -resistenta tumörer, behandlades NSG-möss med tydligt påvisbara 6 dagar gamla SKMEL-239 eller C3-tumörer med vemurafenib enbart eller i kombination med SSA (0, 28 μg kg −1 ; intraperitoneal (ip) injicerad var tredje dag). Som förväntat reducerade vemurafenib storleken på SKMEL-293, men inte av C3-tumörer (fig. 4b; kompletterande fig. 4b). SSA ensam hade ingen hämmande effekt och hindrade inte vemurafenib i läkemedelskänsliga SKMEL-293-tumörer (fig. 4b). Däremot inhiberade SSA effektivt tumörtillväxt av vemurafenib-resistenta C3-celler antingen ensamma eller i kombination med vemurafenib (fig. 4b och kompletterande fig. 4c; P- värde <0, 05). Det är viktigt att minskningen av tumörstorlek som observerades i de resistenta C3-tumörerna åtföljdes av en minskning av BRAF3–9, men inte BRAF8–9 (fig. 4c och kompletterande fig. 4d; P- värde <0, 001). Vi drar slutsatsen att eliminering av den resistens-orsakande BRAF3–9-isoformen genom störning av pre-mRNA-skarvning är ett effektivt sätt att övervinna vemurafenib-resistens in vivo .

( a ) Värden på tumörvikten vid experimentets slutpunkt (dag 20) representerar medel ± SEM från fyra möss (* P <0, 05, t- test). ( b ) Tumörer bildades under 6 dagar genom injektion av föräldriga eller resistenta C3-celler och NSG-möss behandlades sedan med vemurafenib-analog PLX4720 blandad i chow (417 mg läkemedel per kg chow; 67 mg kg −1 i möss) och / eller 0, 28 μg kg −1 SSA. Värden för tumörvikt vid experimentets slutpunkt (dag 35) representerar medel ± SEM från 6 möss (* P <0, 05, t- test). ( c ) Kvantitativ PCR-analys av resistenta C3-tumörer med eller utan SSA. mRNA-värden normaliseras till totalt BRAF-mRNA. Kontrollen sattes till 1. Värden representerar medel för 6 möss ± sd (*** P <0, 001, t- test).

Bild i full storlek

Diskussion

Vi identifierar här en punktmutation i BRAF , vilket gör melanomceller resistenta mot den kliniskt använda BRAF-hämmaren vemurafenib. Mutationen är belägen i en förmodad skarvningsgrenpunkt och främjar genereringen av BRAF3–9-skarvningsisoformen, vilket ger vemurafenib-resistens. Vi finner också att flera pre-mRNA-skarvningsmodulatorer, inklusive SSA och MAMB, kan motverka produktion av BRAF3–9 och övervinna skarvmedierad vemurafenib-resistens. Den observerade hämmande effekten av SSA på tumörbildning av vemurafenib-resistenta celler, även i frånvaro av BRAF (V600E) -hämmaren, indikerar att eliminering av BRAF3–9-isoformen är tillräcklig för en gynnsam effekt. Denna tolkning överensstämmer med en dominerande förstärkning-av-funktion mekanism av BRAF3–9, som har konstitutiv BRAF-aktivitet på grund av förlust av dess RAS-bindande domän (RBD) 13 . Även om prevalensen av −51-mutationen för närvarande är okänd, har målinriktning av RNA-skarvmedierad resistens mot vemurafenib möjligen att vara av allmän klinisk relevans eftersom ∼ 30% av resistenta tumörer hos patienter som behandlats med vemurafenib har rapporterats uttrycka resistensmedierande BRAF-skarvning isoformer 9, 13, 19 . Eftersom alla pre-mRNA-skarvmedierade resistenta tumörer delar vanliga skarvningsisoformer som avlägsnar RBD i BRAF 13, förväntas det att skarvningsinterferens kan vara effektiv oavsett den exakta resistensmutationen. Denna uppfattning stöds av vårt konstaterande att skarvningsstörningar också förhindrar produktion av den vemurafenib-resistenta BRAF1–11-isoformen. Dosen med skarvningsmodulatorer som användes i våra experiment är betydligt lägre än den som användes i tidigare kliniska studier av SSA / MAMB-analogen E7107-relaterade (ref 29, 30), vilket minskar risken för toxicitet och antyder dess genomförbarhet i en klinisk miljö. Som stöd hade låga doser av SSA ingen effekt på tillväxten av förälderceller eller tumörer och visade ingen märkbar toxicitet hos möss. Våra resultat antyder att hämning av skarvning kan vara en kompletterande metod för för närvarande använda kombinationsterapier av vemurafenib med MEK- eller histondeacetylaser (HDAC) -hämmare 14, 15, 31, 32, 33 . Med tanke på den höga prevalensen av pre-mRNA-splitsningsmedierad läkemedelsresistens kan inriktning på pre-mRNA-skarvning vara ett användbart tillvägagångssätt för att övervinna läkemedelsresistens hos melanompatienter.

metoder

Celllinjer

SKMEL-239 föräldrar och vemurafenib-resistenta C3-cellinjer (en snäll gåva från David Solit, MSKC) samt M397 / M397AR (en snäll gåva från Antoni Ribas, UCLA), WM938B / WM983B BR och 451 Lu / 451 Lu BR-cell linjer (en snäll gåva från Meenhard Herlyn, Wistar Institute) odlades i RPMI kompletterat med 10% fetalt bovint serum. U2OS (ATCC-nummer: HTB-96) celler odlades i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum; alla cellinjer hölls vid 37 ° C och 5% CO2-atmosfär.

Sequencing

Sekvensbestämning utfördes på renade PCR-produkter av 5 'SS för intron 3 och 3' SS från intron 8 av GENEWIZ, Inc.

BRAF-reportergen och transfektion

Reportergenen konstruerades genom syning av PCR-produkter med användning av GeneArt Seamless Cloning Technology (Life Technologies) och produkten klonades in i pEGFP-N1-vektorn (Clontech). PCR-reaktioner som användes för att skapa wtBRAF- och mutBRAF-reportrar konstruerades med användning av genomiskt DNA från föräldra- eller resistenta C3-cellinjer som mall. Mutagenes utfördes med användning av QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies). Celler transfekterades med användning av Nucleofector Technology (Lonza). Primers som används i denna studie finns i tilläggstabell 1.

RNAi

OnTarget Plus SMARTpool mot SF3B1, UPF1, SRSF1, SRSF3 och SRSF6 erhölls från Dharmacon (Lafayette). Celler odlades till 20–50% sammanflytning och transfekterades med siRNA med användning av DharmaFECT 1-reagenset (Lafayette).

qPCR

RNA isolerades från celler med användning av RNeasy plus mini-kit (QIAGEN). cDNA-syntes genomfördes med High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). qPCR utfördes med SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) på Biorad iCycler. Den jämförande Ct-metoden användes för att kvantifiera transkript, och delta Ct uppmättes rutinmässigt i tre exemplar. Primers som användes i denna studie återfinns i tilläggstabell 1. Erk1 och cErk1-primrar designades på annat håll 25 .

Sekundär struktur, BP och SRSF6-bindande platsförutsägelse

Den fullständiga minigenesekvensen (2 684 nt) veckades med användning av Wien RNAfold-servern (//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) 21 för att erhålla den minsta fria energistrukturen, partitionsfunktionen och basparningssannolikheter. Resultaten korskontrollerades med mfold-servern (//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold) 34, 35, 36 . 3'-SS för intron 8 (1 000 nt) analyserades med användning av ESEfinder 3.0 (ref. 20) för att lokalisera BP och de två cBP: erna. Den fullständiga minigen-sekvensen (2 684 nt) analyserades med användning av ESEfinder 3.0_ENREF_19 (ref. 20 för att identifiera möjliga bindningsställen för SRSF6.

Imaging

Celler fixerades genom att tillsätta 4% paraformaldehyd i PBS direkt i odlingsmediet i ett par: 1/1-förhållande 1: 1 och inkuberades under 15 minuter vid rumstemperatur. Celler tvättades sedan 3 x i PBS och färgades med DRAQ5 (Biostatus Limited) 1: 5 000 i PBS. Automatiserade avbildningssteg utfördes med ett operasystem (Perkin-Elmer). Bilder togs med användning av en 488/640 nm exciteringslaser (första förvärv) och en 568 nm exciteringslaser (andra förvärv). Bilder analyserades med Acapella-programvarupaketet (Perkin-Elmer). Grönt / rött-förhållandet beräknades som förhållandet mellan den genomsnittliga kärnkraftsintensitetssignalen i kanalen 488-nm och den genomsnittliga kärnkraftsignalen i 568-nm-kanalen. Minst 1 000 kärnor analyserades i varje experimenttillstånd.

Transplantationsanalyser

Sex veckor gamla manliga NOD / SCID / interleukin 2-receptor-y-nollmöss (NSG; Jackson Laboratory) hölls under patogenfria förhållanden. För generering av tumörer blandades celler (1 x 106 per injektion) i 35 ul PBS med 15 pl Matrigel (BD BioScience) och injicerades subkutant i mössens flanker. Möss rakades lokalt med en hårbottenkräm 1 dag före injektion. SSA (0, 28 μg kg -1 ) injicerades ip (100 μl) var tredje dag från den angivna dagen. Kontrollmöss injicerades med PBS kompletterat med metanol (SSA-lösningsmedel). Vemurafenib-analog PLX4720 blandad i chow (417 mg läkemedel per kg chow; 67 mg kg-1 i möss) tillhandahölls från dag 6 under experimentets längd. Tumörtillväxt bedömdes två gånger i veckan med användning av en digital bromsok. Tumörvolym beräknades enligt formeln dxD , där d och D är den kortaste respektive den längsta diametern. Vid slutpunkten avlägsnades tumörer, vägdes och RNA extraherades. Alla förfaranden godkändes av National Institute of Health Animal Use and Care Committee.

Proliferationsanalys

Två tusen celler utsädes per brunn i en platta med 96 brunnar; cellerna behandlades nästa dag. SSA, MAMB eller vemurafenib (PLX4032, Selleck) blandades till den angivna dosen. Kontrollceller behandlades med både dimetylsulfoxid och metanol eller dimetylsulfoxid enbart, lösningsmedlen från PLX4032, SSA respektive MAMB. Proliferation bedömdes efter 3 dagar av CellTiter 96 (Promega) enligt tillverkningens instruktioner.

pERK1 / 2-analys

Meso Scale Discovery-plattor användes för detektering av pERK1 / 2 och total ERK1 / 2, enligt tillverkarens protokoll. Plattor analyserades på SECTOR Imager.

immunoblotting

Celler skördades och lyserades med RIPA-lysbuffert kompletterat med proteas- och fosfatasinhibitorer, och extrakten kördes på 4–12% Bis-Tris-gel och överfördes till ett polyvinylidendifluoridmembran. BRAF-antikropp (F-7): sc-5284 (1: 1 000), Anti-Hsc70-antikropp [1B5] (ab19136, 1: 25 000).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande figurer 1-4 och kompletterande tabell 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.