Hämning av p-glykoproteingenuttryck och funktion förbättrar triptolid-inducerad hepatotoxicitet hos möss | vetenskapliga rapporter

Hämning av p-glykoproteingenuttryck och funktion förbättrar triptolid-inducerad hepatotoxicitet hos möss | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Läkemedelssäkerhet
  • Toxikologi

Abstrakt

Triptolide (TP) är den viktigaste aktiva principen för Tripterygium wilfordii Hook f. och mycket effektiv vid behandling av autoimmuna sjukdomar. TP-inducerad hepatotoxicitet begränsade emellertid sina kliniska tillämpningar. Vår tidigare studie fann att TP var ett substrat av P-glykoprotein och dess leverns clearance påverkades markant av P-gp-modulering i sandwich-odlade råtta-hepatocyter. I denna studie användes små störande RNA (siRNA) och specifik hämmare tariquidar för att undersöka effekterna av P-gp-nedreglering på TP-inducerad hepatotoxicitet. Resultaten visade att när funktionen av P-gp hämmades av mdr1a-1 siRNA eller tariquidar, ökades den systemiska och lever exponeringen av TP signifikant. Den förvärrade hepatotoxiciteten visades med de anmärkningsvärt upphöjda nivåerna av serumbiomarkörer (ALT och AST) och patologiska förändringar i levern. De andra toxikologiska indikatorerna (MDA, SOD och Bcl-2 / Bax) ändrades också signifikant genom P-gp-hämning. Dataanalysen visade att ökningen av TP-exponering hos möss var kvantitativt korrelerad med den förbättrade hepatotoxiciteten, och exponeringen för lever var mer relevant för toxiciteten. P-gp-medierad clearance spelade en viktig roll vid TP-avgiftning. Risken för växter-läkemedelsinteraktion uppstår sannolikt när TP är samtidig med P-gp-hämmare eller underlag i kliniken.

Introduktion

Tripterygium wilfordii Hook f. (TWHF) har en lång historia av användning i traditionell kinesisk medicin för behandling av autoimmuna sjukdomar, såsom nefrit, lupus erythematosus och reumatoid artrit 1 . Triptolide (TP) är den huvudsakliga aktiva ingrediensen i TWHF och tillhör diterpenoid triepoxid. Det har visat flera farmakologiska aktiviteter, såsom immunsuppressiva aktiviteter, antiinflammatoriska, anti-cancer, anti-fertilitet och neurobeskyddande 2, 3, 4 . En relativt hög frekvens av biverkningar har dock begränsat dess kliniska tillämpning. Bland biverkningarna av TP ansågs hög förekomst av hepatotoxicitet i klinisk som en huvudsaklig dödsorsak och har väckt stor uppmärksamhet av läkare och toxikologer 5, 6, 7, 8 .

Metabolism och farmakokinetiska studier av TP indikerade att föreningen kunde koncentreras i levern med nivån signifikant högre än i andra vävnader 9, 10 . TP genomgick omfattande metabolism för att bilda flera oxidativa metaboliter 11, 12 . Cytochrome P450 3A (CYP3A) befanns vara det huvudsakliga enzymet som ansvarar för TP-metabolism 13, 14 . En in vitro- studie med användning av sandwich-odlad råttahepatocytmodell (SCRH) -modell visade att induktion och hämning av CYP3A betydligt kunde förändra TP-intracellulära koncentrationer och därefter hepatotoxicitet 15 . Inaktivering av lever-CYP: er i CYP-reduktas-knockout (KO) -möss resulterade i anmärkningsvärt ökad TP-systemisk exponering och toxicitet 11 . På liknande sätt kan förbehandling av djur med CYP3A-hämmare eller inducerare signifikant förändra TP-medierad hepatotoxicitet genom att påverka dess metaboliska profil 12, 16 . Dessa studier drog slutsatsen att CYP3A-medierad levermetabolism var en viktig clearance- och avgiftningsväg för TP.

Utöver den CYP-medierade metabolismen fann nyligen genomförda studier att gallvägsutsöndring också var en viktig clearanceväg för TP. I råttor med gallkanal-kanylerad (BDC) utsöndrades nästan 39% av TP-dosen via gallan under 24 timmar 17 . Genom att använda ATPas-analys med mdrl-membran från råtta identifierades TP som ett substrat av P-glykoprotein (P-gp) 18 . P-gp är en effluxtransportör som medierar ATP-beroende avflöde av läkemedel från celler. P-gp-proteinet uttrycks i de apikala membranen i utsöndringsceller, såsom hepatocyter, och spelar en roll i gallvägsutsöndring av läkemedel. Uttrycksnivån för P-gp såväl som dess funktion kan moduleras genom hämning och induktion, vilket därefter påverkar farmakokinetiken, effektiviteten, säkerheten eller vävnadsexponering av P-gp-substrat 19, 20 . Vår tidigare studie visade involvering av P-gp i TP gallvägsutsöndring in vitro 18 . Saminkubation av TP med P-gp-hämmare i SCRH kan förbättra TP-intracellulär exponering signifikant och leda till förvärrad hepatotoxicitet. Resultaten antydde att P-gp-medierat gallvägsutflöde också var en viktig avgiftningsväg för TP och modulering av effluxtransportmedierad TP-clearance kan orsaka läkemedels-läkemedelsinteraktion (DDI) relaterade säkerhetsproblem. Rollen för P-gp i TP in vivo- clearance och avgiftning förblir emellertid oklar. Ytterligare undersökning med användning av djurmodeller är nödvändig för att utvärdera det toxikologiska resultatet av TP genom P-gp-modulering och för att bedöma den potentiella DDI-risken förknippad med avloppstransportören.

Samspel mellan CYP och P-gp är ett allmänt rapporterat fenomen 21, 22, 23, 24 . En avsevärd överlappning observerades i substratspecificiteten och hämmare / inducerare, såsom ritonavir, ketokonazol och verapamil 25 . Det är svårt att använda dessa dubbla funktionella kemikalier för att skilja rollerna P-gp och CYP vid läkemedelsutrymme och DDI. I den aktuella studien användes RNA-interferens (RNAi) -teknik för att bedöma bidraget från P-gp i TP-clearance och toxicitet hos möss. RNAi är en process som orsakar genutsläpp på ett sekvensspecifikt sätt. Hög specificitet och effektivitet av RNAi gör det till ett föredraget verktyg för funktionell genomikforskning och genterapi 26 . Tekniken har också använts i läkemedels transporterrelaterade dispositionstudier 27, 28, 29 . I den aktuella studien användes ett kemiskt syntetiserat litet interfererande RNA (siRNA) för att specifikt slå ner P-gp-uttryck hos möss. Plasma- och levereksponeringen av TP bestämdes för att demonstrera effekten av P-gp-knockdown på TP-clearance och toxicitet. Serumbiokemi och histopatologi användes för att utvärdera den TP-inducerade leverskada. Och nivåerna av malondialdehyd (MDA), superoxiddismutas (SOD) och apoptosrelaterat protein (Bcl-2 och Bax) -uttryck mättes också som ytterligare toxikologiska slutpunkter för analys av toxikologisk mekanism av TP. Tariquidar, en specifik P-gp-hämmare, testades också parallellt med siRNA för jämförelse och för bedömning av effluxtransportörassocierad DDI.

Material och metoder

Kemikalier och reagenser

TP (fig. 1) erhölls från National Institute for Food and Drug Control (Peking, Kina) med renheten> 99%. Tariquidar köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA). SiRNA syntetiserades kemiskt av Ribobio Co., Ltd (Guangzhou, Kina). Kanin-anti-P-gp erhölls från Abcam (Cambridge, Storbritannien). Musen anti-Bcl-2 och anti-Bax köptes från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerade sekundära antikroppar var från Pierce Biotechnology (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Acetonitril och metanol var av HPLC-kvalitet (J&K Chemical LTD) och andra reagens var alla av analytisk kvalitet.

Bild i full storlek

djur

Manliga BALB / C-möss (vikt, 18–22 g) levererades av Beijing Experimental Animal Center (Peking Kina). Alla djur hölls på en 12-timmars ljus / mörk cykel med fri tillgång till vatten och lab chow. Alla förfaranden genomfördes i enlighet med de standarder som fastställts i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicerad av Institute of Laboratory Animal Resources i National Research Council (United States), och godkändes också av Animal Care och Använd kommittén för Pekinginstitutet för farmakologi och toxikologi. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet använda djur och deras lidande.

Design av siRNAs

Tre sekvenser för murint mdr1a siRNA valdes enligt Matsui et al. 30 och Patutina et al. 31 . Deras sekvenser gavs enligt följande: mdr1a-1 siRNA, känsla 5'-r (AAU GUU GUC UGG ACA AGCACU) d (TT) -3 'och antisense 5'-r (AGU GCU UGU CCAGAC AAC AUU) d (TT) -3; mdr1-2-sens 5'-r (AGA AGGAAC UAG AAG GUU CUG) d (TT) -3 'och antisense 5'-r (CAG AAC CUU CUA GUU CCU UCU) d (TT) -3'; mdr1a-3 siRNA, känsla 5'-GGCUGGACAAGCUGUGCAUGG-3 'och antisense 5'-AUGCACAGCUUGUCCAGCCAA-3'; negativ kontroll (NC) siRNA, känsla 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ′ och antisense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ′. 3'- och 5'-änden modifierades kemiskt med metylering och kolesterol för att höja stabiliteten.

Screening och funktionell utvärdering av mdr1a siRNA in vitro och in vivo

CT26.WT-celler, en muskolonkarcinomcellinje, erhölls från ATCC och hölls i RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum. Celler ympades till plattor med 6 brunnar med en densitet av 5 x 105 celler / brunn och odlades under 24 timmar. Transfektion utfördes i Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med syntetisk siRNA (80 pM) med användning av Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) under 6 timmar och mediet ersattes med färsk RPMI-1640. Detta tillstånd optimerades i våra preliminära experiment baserat på transfektionseffektiviteten och den cellulära livskraften. Efter inkubation under 48 timmar tvättades cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösningsbuffert (PBS) och totalt RNA och protein uppsamlades.

För validering av tystnadseffektivitet in vivo , injicerades mdr1a-1 siRNA via svansven från möss efter utspädning till 5, 10 och 15 nmol med saltlösning i 200 ul. Efter 48 timmar avlivades mössen och levern uppsamlades för mätning av P-gp-proteinuttrycket med användning av Western blot. P-gp-funktionen i gen knockdown-möss bedömdes med användning av digoxin, ett känt P-gp-substrat. NC-siRNA eller mdr1a-1 siRNA injicerades intravenöst 2 dagar före injektionen av digoxin (1 mg / kg). Blodprover uppsamlades vid 5, 15, 30, min och 1, 2, 4, 6, 8, 12 timmar efter digoxindosen (n = 5 / tidpunkt för varje grupp). Digoxinkoncentrationerna i prover analyserades kvantitativt med en publicerad LC-MS / MS-metod 32 .

RNA-extraktion, omvänd transkription (RT) och realtids-PCR

Totalt RNA från CT26. WT-celler extraherades med Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. RNA-prover (1 μg) omvänd transkriberades genom tillsats av oligo (dT) 18 (MBI Fermentas, USA), dNTP, RNas-hämmare och M-MLV-omvänt transkriptas (Takara, Japan), hölls vid rumstemperatur under 10 minuter och inkuberades vid 42 ° C under 60 minuter. Proverna upphettades vid 72 ° C för att inaktivera enzymer under 10 minuter och lagrades vid -20 ° C. PCR i realtid utfördes med användning av förnuft- och antisense-primrar. Grundparen var som följer: mdr1a, sens 5'-GGATGAAATTGATAATTTAGACATG-3 'och antisense 5'-TCCATTTATTATGGCACAGAATATA-3'; ß-aktin, sens 5′-TCT GTG TGGA TTG GTG GCT CTA-3 ′ och antisense 5′-CTG CTT GCT GAT CCA CAT CTG-3 ′. PCR-amplifiering utfördes med användning av SYBR Green PCR-reagens och ABI PRISM 7300-sekvensdetekteringssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA). Den relativa mängden mål-mRNA bestämdes med användning av den jämförande tröskelmetoden (Ct) -metoden genom att normalisera mål-mRNA-Ct-värden till de för p-aktin (ΔCt). Statistisk analys av PCR-data i realtid utfördes med användning av ΔCt-värden.

Western blot

För proteinekstraktion homogeniserades cellerna eller mösslevervävnaderna i RIPA-buffert och centrifugerades sedan vid 14 000 g vid 4 ° C under 30 minuter. Supernatanten uppsamlades och proteinkoncentrationen mättes med användning av BCA-analys. Provet (50 ug protein / prov) laddades sedan på 12% polyakrylamidgeler och överfördes till polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, USA). Efter blockering av 3% bovint serumalbumin inkuberades membranen med primära antikroppar och HRP-konjugerad sekundär antikropp, och detekterades sedan med användning av det förbättrade kemiluminescens plus detektionssystemet (Molecular Device, Lmax, USA). Densiteten för varje band kvantifierades med användning av bildanalysprogramvara (Science Lab 2005 Image Guage; Tokyo, Japan).

Toxikokinetisk studie

För TP-plasmakinetisk studie och toxikologisk utvärdering delades möss upp i fyra grupper (n = 5 vardera) för att samla blod- och vävnadsprover: (1) normal + saltlösningsgrupp; (2) 1, 0 mg / kg TP + 15 nmol NC-siRNA-grupp; (3) 1, 0 mg / kg TP + 15 nmol mdr1a-siRNA-grupp; (4) 1, 0 mg / kg TP + 10 mg / kg tariquidar-grupp. För att undvika komplikationen orsakad av läkemedelsabsorption eller möjlig tarm-första-pass-effekt administrerades TP och hämmaren intravenöst till möss. SiRNA-gruppen injicerades intravenöst med NC-siRNA eller mdr1a-siRNA 2 dagar före TP-dos. För TP + tariquidar-grupp fick mössen en intravenös tariquidardos 20 minuter före TP-injektionen. Blodprover uppsamlades vid 2, 5, 10, 15, 30, 60 och 120 min efter TP-dosering. För att bedöma lexponering av TP, samlades levervävnadsprover från en annan uppsättning möss vid 5, 30, 60 och 120 minuter efter dosering. Tre TP-grupper designades för detta experiment, inklusive TP + NC-siRNA-grupp, TP + mdr1a-siRNA-grupp och TP + tariquidar-grupp. Levervävnadsproven vägdes och homogeniserades sedan i 10 volym (w: v) iskall saltlösning. Koncentrationerna av TP i plasma och levervävnad mättes med en validerad LC-MS / MS-metod. Före ovanstående djurstudie utfördes ett preliminärt experiment för att utvärdera de möjliga skillnaderna i lever-P-gp-proteinuttryck (figur S1) och TP-plasmakinetik mellan NC-siRNA-behandlade möss och normala möss (med saltlösning) (figur S2 och kompletterande Bord 1). Inga signifikanta skillnader observerades i TP-plasmakoncentrationer och kinetiska parametrar. Därför användes NC-siRNA-gruppen som kontroll i följande djurstudie.

Full storlek bord

Toxikologisk utvärdering

Efter 24 timmar av TP-behandling samlades blod- och levervävnadsprover från mössen i plasmakinetisk studie. Serum-ALT- och AST-nivåer bestämdes med en CL8000 automatiserad biokemisk analysator (Shimadzu, Japan) efter att serum separerades genom centrifugering vid 900 g under 10 minuter. Levervävnadsprover delades upp i två delar, den första halvan hölls vid -80 ° C tills MDA- och SOD-mätningar användes MDA- och SOD-analyssatser (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Den andra halvan fixerades med 4% paraformaldehydlösning och dehydratiserades sedan, inbäddades i paraffin och sektionerades i en tjocklek av 5 um. Fyra paraffinsektioner från varje mus avvaxades, rehydratiserades och färgades med hematoxylin-eosin (HE) för total morfologisk utvärdering. Den totala proteinkoncentrationen kvantifierades genom BCA-analysen. Bcl-2- och Bax-proteiner mättes med western blot.

Kvantifiering av TP

TP i plasma- och vävnadsprover analyserades kvantitativt med en publicerad LC-MS / MS-metod 18 . Metoden modifierades något och validerades för analys av plasma- och levervävnadsprover. Plasma- och vävnadshomogenat förbehandlades med 3-faldig volym metanol-acetonitril (1: 1, volym / volym) innehållande 20 ng / ml propranolol för att fälla ut proteiner och centrifugerades sedan vid 4 ° C, 14 000 g under 10 minuter. Supernatanten (10 ul) injicerades i LC-MS / MS för analys. En Aglient 6410B trippel quadrupol-masspektrometer utrustad med Agilent1290 Infinity UHPLC-system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) användes. TP och propranolol (intern standard, IS) eluerades från en Agilent C18-kolonn (dp = 3, 5 um, 2, 1 x 50 mm, Agilent, MA) med användning av en mobil fasgradient (A: vatten med 0, 1% myrsyra och 2, 5 mM ammoniumformiat B, acetonitril med 0, 1% myrsyra). Gradienten kördes som: 0–2, 5 min håll vid 95% B; 2, 5–3 min, en linjär gradient till 10% B; 3–4 min. Håll vid 10% B. Flödeshastigheten var 0, 2 ml / min. TP och propranolol detekterades i positivt jonläge med användning av enstaka reaktionsövervakning: TP, m / z 378, 1 / 360, 1, IS, m / z 260, 0 / 116, 0. Under ovanstående optimerade tillstånd detekterades inga signifikanta endogena interferenser vid toppregionerna för TP och IS i alla biologiska prover. Kalibreringskurvorna för TP var linjära (r2> 0, 99) över koncentrationsområdet 1–1000 ng / ml. Den nedre kvantifieringsgränsen var vid 1 ng / ml. Intra- och interdagsprecisionerna (RSD) var alla under 11% och analysnoggrannheten (RE) låg i området från 87% till 113%. Återvinningen var över 80% för både plasma- och vävnadsprover.

Molekylär dockning

För att jämföra bindningssätten för TP och tariquidar på P-gp utfördes en molekylär dockningsanalys. Kristallstrukturen för mus-P-gp (PDB: 3G5U) valdes som receptorn för molekylanalys, eftersom mus var den djurmodell som användes i den aktuella studien och mus-P-gp bär en hög grad av homologi (cirka 87% amino sur identitet) med människan. De initiala ligandmolekylstrukturerna (TP och tariquidar) hämtades från NCBI-PubChem Compound Database. Dockningssimuleringen utfördes med AutoDock 4.2, ett molekylärt modelleringssimuleringsprogram som används allmänt för automatiserad dockning av ligander och deras makromolekylära receptorer. De fria energierna för bindning för protein / modulatorkomplexen uppskattades från de jämviktiga banorna med användning av SIETRAJ-algoritmen 33 . Konformationen motsvarande den lägsta energin valdes som den mest troliga bindningskonformationen 32 .

Dataanalys

Toxikokinetiska parametrar, inklusive arean under plasmakoncentration-tidskurvan (AUC), distributionsvolym (Vd), clearance (CL), genomsnittlig uppehållstid (MRT) och terminal eliminationshalveringstid (t 1/2 ), beräknades genom icke-avdelningsanalys med WinNonlin 5.2-programvara (Pharsight Corporation, CA, USA). Alla data uttrycktes som medelvärde ± SD. Skillnaderna mellan grupperna jämfördes med Students t-test för analys av oparade data eller envägs ANOVA. Statistisk signifikans accepterades vid P <0, 05.

Resultat

Screening och funktionell utvärdering av mdr1a siRNA

I denna studie transfekterades CT26.WT-celler med olika siRNA-sekvenser mot mdr1a. Den undertryckande effekten mättes 48 timmar efter transfektion för att utvärdera specificiteten av siRNA riktad mot mdr1a. Figur 2a visade tystnadseffektiviteten för tre siRNA-sekvenser på samma mRNA-mål. Alla de tre siRNA-sekvenserna inhiberade uttrycket av mdr1a-mRNA. Emellertid observerades signifikanta skillnader i tystnadseffektivitet med 63%, 51% och 46% för mdr1a-1, mdr1a-2 respektive mdr1a-3 siRNA. Western blot-analys indikerade vidare att P-gp-uttrycket i cellerna behandlade med dessa mdr1a-siRNA också minskades anmärkningsvärt (fig. 2b). Bland de tre sekvenserna var mdr1a-1 den mest effektiva för att reducera både expressionen av mdr1a mRNA och protein. Dessutom förändrades inte proteinuttryck för BCRP och MRP2, vilket bekräftade specificiteten för mdr1a-1 siRNA (fig. 2b). Därför valdes mdr1a-1 siRNA för in vivo- studien.

( a ) RNAi-medierad knockdown av mdr1a mRNA i CT26.WT-celler. ( b ) RNAi-medierad knockdown av P-gp-protein i CT26.WT-celler. CT26.WT-celler transfekterades med mdr1a-siRNA. Efter 48 timmar mättes mRNA för mdr1a-gen och P-gp-proteinuttryck med realtids-PCR och western blot. ( c ) RNAi-medierad knockdown av P-gp-proteinuttryck i mösslever. mdr1a-1 siRNA (i en dos av 5, 10, 15 nmol) injicerades via svansven från möss. Efter 48 timmar uppsamlades leveren av möss och P-gp-proteinuttrycket mättes för att validera effektiviteten av siRNA. ( d ) Utvärdering av P-gp-funktion efter förbehandling med mdr1a-1 siRNA i möss. NC-siRNA eller mdr1a-1 siRNA (15 nM) injicerades intravenöst 2 dagar före digoxininjektionen i en dos av 1 mg / kg. Blodproven uppsamlades vid schemalagda tidsintervall. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3 in vitro och n = 5 in vivo ). # P <0, 05, ## P <0, 01, ### P <0, 001 jämfört med NC-siRNA-grupp.

Bild i full storlek

Den undertryckande effekten på P-gp-expression i muslever levererades med western blot vid 48 timmar efter att mössen fick en intravenös injektion av mdr1a-1 siRNA. Figur 2c visade att, jämfört med kontrollgruppen, minskades uttrycket av P-gp-protein i levern från mdr1a-siRNA-gruppen signifikant. Tystnadseffektiviteten beräknades vara 62%, vilket var i överensstämmelse med in vitro- reduktion vid mRNA-nivå.

Med användning av det kända P-gp-substrat digoxinet bedömdes den in vivo undertryckande effekten av siRNA på P-gp-funktionen ytterligare. Plasmakoncentrationstiden för digoxin i möss efter P-gp-knockdown visades i fig. 2d, och de farmakokinetiska parametrarna anges i tabell 1. I förbehandlingsgruppen med mdr1a-1 siRNA var AUC 0-t digoxin ökade till cirka 2, 6 gånger den för NC-siRNA-gruppen. Under tiden minskade Vd och CL av digoxin till 39% respektive 30% av NC-siRNA-gruppen. Resultaten indikerade att den utvalda mdr1a-1 siRNA var specifik och effektiv för nedreglering av P-gp-funktion hos möss.

Effekterna av siRNA och tariquidar på TP-plasma och exponering i lever

Toxikokinetiska profiler av TP för kontroll (TP + NC-siRNA), TP + mdr1a-siRNA och TP + tariquidar-grupper visades i fig. 3. De toxikokinetiska parametrarna beräknades och listades i tabell 2. TP-plasmakoncentrationerna minskade snabbt i möss efter att ha fått en intravenös dos. Efter 2 timmar injektion tappades TP-koncentrationerna under den nedre kvantifieringsgränsen för alla tre grupperna. En jämförelse av parametrarna gjordes mellan kontrollen och de behandlade grupperna för att bedöma effekten av P-gp-hämning på TP-exponering och eliminering. Behandling med mdr1a-siRNA kan förbättra exponeringen för TP-plasman signifikant, med C max ökat från 413 ± 74 till 510 ± 94 ng / ml ( P <0, 05) och AUC från 103, 5 ± 9, 6 till 154, 3 ± 30, 2 ng · h / ml ( P <0, 05). I den samtidiga gruppen med tariquidar noterades också den signifikant ökade AUC, från 103, 5 ± 9, 6 av kontrollen till 145, 9 ± 24, 6 ng · h / ml av TP + tariquidar-gruppen ( P <0, 05). Följaktligen minskade den totala kroppsfriheten för TP hos möss anmärkningsvärt, från 9564, 0 ± 1024, 2 ml / min / kg av kontrollen till 6576, 4 ± 1438, 5 ( P <0, 05) och 5755, 4 ± 1200, 1 ml / min / kg ( P <0, 05) för TP + tariquidar respektive TP + mdr1a-siRNA-grupper. Även om de inte var signifikanta visade t 1/2 och MRT i de två behandlingsgrupperna en tendens till ökningar, i överensstämmelse med de minskade clearanceparametrarna för samma grupper.

NC-siRNA eller mdr1a-siRNA (15 nM) injicerades intravenöst 2 dagar och tariquidar (10 mg / kg) gavs intravenöst 20 minuter före injektionen av triptolid i en dos av 1 mg / kg. Blodproven samlades in vid planerade tidpunkter. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 5).

Bild i full storlek

Full storlek bord

TP-koncentrationer i levervävnaderna bestämdes också för att koppla exponeringen för lever och hepatotoxicitet. Som visas i tabell 3 ökade förbehandling med mdr1a-siRNA markant exponeringen för lever i TP och nivåerna var upp till 2, 2, 2, 4, 1, 9 och 2, 3 gånger kontrollgruppen vid 5, 30, 60 och 120 min. På liknande sätt förstärktes TP-exponeringen i levern också av tariquidar, med koncentrationerna cirka 1, 5 gånger kontrollen. Resultaten antydde att undertryckande av TP-kanalikulärt utflöde genom P-gp-gennedslag eller kemisk hämning avsevärt skulle kunna öka dess systemiska och leverutsättning. Detta kan leda till allvarlig hepatotoxicitet.

Full storlek bord

Effekterna av siRNA och tariquidar på TP-inducerad hepatotoxicitet hos möss

För att bestämma påverkan av nedsatt P-gp-funktion på TP-inducerad toxicitet genomfördes serumbiokemisk mätning och histopatologisk undersökning 24 timmar efter TP-behandling. Serum-ALT- och AST-nivåerna används vanligtvis som biokemiska markörer för leverskada. I TP + NC-siRNA-gruppen lyftade TP ALT- och AST-nivåerna upp till 4, 2 och 5, 4 veck av den normala gruppen, vilket indikerar den TP-inducerade toxiciteten (fig. 4a, b). Nedreglering av P-gp genom förbehandling av mdr1a-siRNA kan ytterligare anmärkningsvärt öka serumnivåerna av ALT och AST upp till 2, 3 respektive 2, 9 vikningar av TP + NC-siRNA-gruppen. I TP + tariquidar-gruppen var serumnivåerna för ALT och AST 1, 2 och 1, 9 gånger av TP + NC-siRNA-gruppen. Resultaten visade tydligt den allvarliga leverskada hos möss med P-gp-gennedslag eller funktionell hämning.

NC-siRNA eller mdr1a-siRNA (15 nM) injicerades intravenöst 2 dagar och tariquidar (10 mg / kg) gavs intravenöst 20 minuter före injektionen av triptolid i en dos av 1 mg / kg. Blodprov samlades in för mätning av ALT och AST 24 timmar efter dosering. Lever levererades för patologisk undersökning 24 timmar efter dosering. Sektionerna var H & E-färgade och skalfält = 50 mikrometer. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 5). # P <0, 05, ## P <0, 01, ### P <0, 001 jämfört med normal grupp, ** P <0, 01 jämfört med NC-siRNA-grupp. ( a ) nivån för ALT; ( b ) nivån på AST; ( c ) H & E-färgning.

Bild i full storlek

Histopatologisk undersökning av levern utfördes för att kontrollera leverskada orsakad av TP och den ytterligare behandlingen (Fig. 4c). Jämfört med den normala histologin hos hepatocyterna, visade leversektionerna från mössen i NC-siRNA-gruppen hepatocellulär hydropisk degeneration och vakuolisering och dessa patologiska förändringar var allvarligare i den samtidig tariquidära gruppen. I mdr1a-1 siRNA-förbehandlingsgruppen noterades, förutom de ovan observerade patologiska förändringarna, eosinofil nekros i hepatocyterna. Resultaten överensstämde med den förbättrade exponeringen för lever och TP såväl som serumnivåerna av ALT och AST.

Förändring i biomarkörer för oxidativ stress och apoptosrelaterade proteiner

De tidiga studierna antydde att överdriven apoptos av hepatocyter, lipidperoxidation och hämning av mitokondriell andningskedja var den möjliga mekanismen för TP-inducerad hepatotoxicitet 34, 35, 36 . För att undersöka förhållandet mellan exponeringen för leverfunktionen i TP och dessa toxikologiska vägar, mätte vi ytterligare MDA- och SOD-nivåerna och uttrycket av Bcl-2 och Bax-proteiner i mössliven. MDA och SOD är indikatorerna på oxidativ stress 37 . Resultaten visade att MDA-nivån i lever ökades i alla tre TP-behandlingsgrupper vid 24 timmar av TP-dosering (Fig. 5a). Den statistiskt signifikanta ökningen ( P <0, 05) observerades emellertid endast för TP + tariquidar-grupp (1, 3 gånger) och TP + mdr1a-siRNA-grupp (1, 6 gånger). Det liknande mönstret sågs i SOD-aktiviteten. Även om TP inducerade en minskning av SOD-aktivitet i alla tre TP-grupperna (Fig. 5b) noterades de statistiskt signifikanta skillnaderna endast i grupperna behandlade med tariquidar ( P <0, 05) och mdr1a-siRNA ( P <0, 01). Ökningen i MDA-nivå och minskningen av SOD-aktivitet var proportionell mot TP-exponeringen i levern, vilket tyder på att mössen med den nedreglerade P-gp-funktionen var mer känsliga för den TP-inducerade toxiciteten.

NC-siRNA eller mdr1a-siRNA (15 nM) injicerades intravenöst 2 dagar och tariquidar (10 mg / kg) gavs intravenöst 20 minuter före injektionen av triptolid i en dos av 1 mg / kg. Lever levererades 24 timmar efter dosering. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 5). # P <0, 05, ## P <0, 01, ### P <0, 001 jämfört med normal grupp, * P <0, 05 jämfört med NC-siRNA-grupp. ( a ) innehållet i MDA; ( b ) SOD: s verksamhet; ( c ) proteinbanden från Bcl-2 och Bax; ( d ) kvantitativ analys av Bcl-2 / Bax-förhållandet.

Bild i full storlek

Bcl-2-familjeproteinerna är nyckelregulatorer för apoptos, som inkluderar både anti-apoptotiska medlemmar såsom Bcl-2 och de pro-apoptotiska medlemmar såsom Bax. En liten förändring i den dynamiska balansen hos dessa proteiner kan resultera i antingen hämning eller främjande av celldöd 38, 39 . I denna studie mättes expressionsnivåerna för Bcl-2 och Bax med western blot för att bedöma graden av TP-inducerad apoptos. Resultaten i fig. 5c, d visade de signifikant reducerade Bcl-2 / Bax-förhållandena i tre TP-behandlade grupper, eftersom resultatet av den markant minskade Bcl-2-expressionsnivån och den ökade Bax-nivån. I överensstämmelse med förändringarna i TP-exponering för lever, visades den högsta hastigheten av apoptos i TP + mdr1a-siRNA-gruppen, som hade det lägsta Bcl-2 / Bax-förhållandet (fig. 5d) jämfört med det normala ( P <0, 001) och TP + NC-siRNA-grupp ( P <0, 05), respektive. Samtidigt med tariquidar minskade också markant förhållandet jämfört med den normala gruppen ( P <0, 01). Reduktionen av Bcl-2 / Bax-förhållandet var negativt korrelerat med exponeringen för lever (TP = r 2 = 0, 95), vilket indikerar att den TP-inducerade cellapoptosen var associerad med exponeringen för lever och förvärrades av den försämrade P-gp-funktionen.

Molekylär dockning av TP- och tariquidar-bindning på P-gp-protein

Ovanstående resultat indikerade att tariquidar, en känd P-gp-hämmare, anmärkningsvärt skulle kunna öka plasma- och levereksponeringen av TP genom att hämma utflödstransporten. För att ytterligare förstå bindningsegenskapen hos TP med P-gp-protein utfördes en molekylär dockningsanalys på de rapporterade tariquidar-bindningsställena på P-gp 33 . De molekylära bindningssätten jämfördes också mellan TP och tariquidar (fig. 6a, b). Det hydrofoba hålrummet kunde observeras på bindningsstället för både TP och tariquidar. I den inre håligheten i P-gp var ett antal aminosyrarester ansvariga för bindningen av tariquidar och TP (fig. 6c, d). Bland dessa rester var Phe299, Phe339, Ile302, Ala225, Ala338, Pro219, Val334 och Tyr303 vanliga för TP och tariquidar i hydrofob kavitet av P-gp, vilket antydde att tariquidar och TP delade några bindningsställen på P-gp-protein. De lägsta bindande energierna för protein / föreningskomplexen var −10, 1 respektive −8, 24 KJ / mol för tariquidar respektive TP. Lägre bindande energi från tariquidar över TP förklarade dess hämmande effekt på P-gp-medierad TP-transport.

Konformationen motsvarande den lägsta energin valdes som de mest troliga bindningspositionerna. ( a ) Den tredimensionella strukturen i bindningsställshåligheten hos P-gp bunden till tariquidar (cyan), triptolid (röd). ( b ) Förstorad vy av bindningsställets kavitet som visas i (A). ( c ) Stereovy av triptolid-interagerande rester inom den aktiva platsregionen i P-gp. ( d ) Stereovy av tariquidar-interagerande rester inom den aktiva platsregionen i P-gp.

Bild i full storlek

Diskussion

Som den huvudsakliga aktiva beståndsdelen i TWHF har TP visat sig vara mycket effektivt vid behandling av reumatoid artrit och system lupus erythematosus 40 . Emellertid har den TP-inducerade levertoxiciteten nyligen orsakat ökande säkerhetsproblem i klinik 7, 8 . Många undersökningar genomfördes för att undersöka sambandet mellan läkemedelsdisposition och toxicitet, med fokus främst på CYP-ämnesomsättningen. Moderformen av TP bekräftades vara ansvarig för toxiciteten och den CYP3A-medierade metabolismen var en avgiftningsväg. Förutom den CYP3A-medierade clearance avslöjade vår tidigare studie att effluxtransportörmedierad utsöndring i leveren också var en viktig clearanceväg för TP och den kanalikulära P-gp utgjorde en betydande roll för TP-inducerad hepatotoxicitet i SCRH 18 . In the present study, we further presented the in vivo evidence that P-gp contributed significantly to TP clearance and detoxification. The significantly increased TP exposure in liver and plasma in the P-gp down-regulated mice was clearly correlated to the enhanced hepatotoxicity.

In this study, RNAi technique was selected as the primal tool to assess the contribution of P-gp protein to the TP clearance, as TP was a dual substrate of CYP3A and P-gp. The silencing efficiency of 62% was obtained in this study for the synthetic siRNA at liver protein level of murine mdr1a in mice. It was slightly higher than the efficiency (50–60%) reported by Matsui's group 30 . Using a known P-gp substrate digoxin, the down-regulated P-gp function by the mdr1a-siRNA was further confirmed with 60% reduction noted in the total body clearance (CL) of the substrate. In this P-gp knockdown model, the contribution of P-gp in TP clearance and detoxification was clearly demonstrated. Comparing to the TP+NC-siRNA group, the increase of 1.5-fold in the plasma AUC and of 1.9 to 2.4-fold in liver exposure at different time points was observed for the TP+mdr1a-siRNA group (Table 3). The increase fold of TP hepatic exposure in P-gp knockdown mice (2.3 fold at 120 min) was comparable to that in CYP KO mice (about 2-fold at 120 min) reported by Xue and coworkers using CYP reductase KO mice 11 . As the result of higher exposure of TP in liver, the aggravated hepatotoxicity was observed. A 2.9-fold of increase in the AST level was determined in the P-gp knockdown mice in the present study and a nearly 2-fold increase was seen in CYP KO mice in Xue's study 11 . The above observations indicated that the P-gp mediated clearance played an important role in the detoxification of TP in vivo , with the contribution comparable to the CYP mediated metabolism. This was also in agreement with our in vitro result that CYP3A and P-gp likely contributed equally to the detoxification of TP in sandwich-cultured rat hepatocytes model 18 .

Drug interactions usually occur when one drug alters the pharmacokinetics of another drug by influencing its absorption, distribution and clearance. In assessment of the pharmacokinetics mediated DDI, a common approach is concomitant use of the substrate drug with inhibitors or inducers of drug metabolizing enzymes or drug transporter proteins 19, 24, 41 . In this study, tariquidar was selected to assess the potential DDI with TP. The previous studies have demonstrated that tariquidar was a potent and selective inhibitor of P-gp protein with much less enzyme based pharmacokinetic interaction than earlier used P-gp inhibitors, such as cyclosporin A and ritonavir 42, 43 . It could fully restore the antitumor activity of cytotoxic drug at a dose of 10 mg/kg, without displaying CYP mediated pharmacokinetic interactions 44 . In our study, concomitant with tariquidar (10 mg/kg) significantly altered both systemic and hepatic exposures of TP. The plasma AUC was lifted to 1.4-fold and CL decreased to 69% of the control group. Subsequently, the aggravated liver injury was observed with the significantly increased ALT and AST levels and pathological changes. To get the insights of the tariquidar inhibition on TP efflux and the molecular interaction between TP, tariquidar and P-gp protein, an in silico method was used to compare the binding property of TP and tariquidar on P-gp protein. Some published studies have demonstrated the success of using molecular docking technique to predict features of compounds for P-gp recognition and to model the interaction of substrates and modulators with P-gp 32, 45 . In our study, molecular docking analysis of TP and tariquidar was performed with AutoDock, a software system widely used to predict the optimal binding conformations of ligands to proteins 46, 47 . The result indicated that TP shared the same binding pocket with tariquidar (Fig. 6). They both bound to a number of amino acid residues, such as Phe299, Phe339 and Val334. And lower binding energy of tariquidar indicated that it could compete with TP on the P-gp binding sites and led to the efflux transporter mediated DDI. Although concomitant with tariquidar only cause 1.4-fold increase in plasma AUC, the toxicological consequence was more severe due to the narrow therapeutic window of TP. The potential risk of herb-drug interaction or herb-herb interaction likely occurs when TP is used in combination with P-gp inhibitors, such as tariquidar.

In this study, knockdown of P-gp by mdr1a-siRNA showed a higher effectiveness over tariquidar. Specific siRNA designed to target mdr1a or mdr1a/1b gene have been showed an excellent potential in down-regulation of P-gp expression and function in vitro and in vivo 48, 49, 50 . This is owed to high specificity and efficiency of siRNA and its inhibitory effect on gene expression at transcription level, which is usually more powerful than the inhibition at functional level. Tariquidar is a chemical inhibitor of P-gp and its modulating effect is derived from the competition with substrates at P-gp binding sites, inhibition of ATP hydrolysis or both 51 . The effect of tariquidar on canalicular P-gp is also relied on the exposure level at its targeted tissue/organ, which may be affected by the dose level, dosing route and also disposition fate in vivo . Therefore, siRNA is an appropriate technique to assess the role of transporters in disposition and toxicity of drugs or xenobiotics in vivo .

To analyze the relation between TP exposures and hepatotoxicity, we plotted serum ALT or AST level against TP exposure (AUC) for the TP treatment groups with or without modulators. As illustrated in Fig. 7, good quantitative correlations were observed between marker release (AST or ALT) and plasma ( r 2 of 0.8971 for AST and 0.8589 for ALT) or hepatic exposures ( r 2 of 0.9948 for AST and 0.9327 for ALT). Pretreatment with mdr1a-siRNA resulted in the highest TP exposure in plasma and liver, corresponding to more severe toxicity, with about 60% of the death rate within 30 h of TP treatment. The Fig. 7 also showed that the slope of plasma plot was much sharper (5.62 for ALT and 7.68 for AST) than that of the liver (0.47 for ALT and 0.70 for AST), indicating that a small change in plasma concentration corresponded to a high degree of liver damage. The narrow therapeutic window of TP in term of plasma concentration would make it difficult in clinical practice to predict TP induced hepatotoxicity through plasma concentration monitoring. Instead, serum biochemical markers would be more appropriate indicators for use in clinic to monitor the possible DDI mediated alteration in the hepatic TP exposure and subsequently the hepatotoxicity.

Mice were treated with or without triptolide (1 mg/kg) in the presence of siRNA and tariquidar. ( a ) the correlation of ALT with systemic and hepatic exposures; ( b ) the correlation of AST with systemic and hepatic exposures.

Bild i full storlek

Apart from the serum biomarkers, more toxicological evaluations were performed based on the known mechanism of TP toxicity. The levels of MDA and SOD, together with the expression of Bax and Bcl-2 proteins in the liver were measured to assess the impact of P-gp modulation on the TP-induced toxicity. The data showed in Fig. 5 clearly indicated that down-regulation of P-gp could significantly enhance TP-induced oxidative stress and cell apoptosis. The severity of the toxicological effects was correlated to the hepatic exposure of TP. The TP toxicity was largely relied on its hepatic clearance. Any factor that affects the metabolism or biliary excretion of TP might cause safety risk in clinic. Besides the modulation of metabolizing enzymes and efflux transporters by drug-drug and drug-herb interaction, some physiological and pathological condition may also have impacts on the TP-induced hepatotoxicity, for instance, hepatic impairment and bile duct blockage.

In summary, our results demonstrated that knockdown of hepatic P-gp significantly altered the systemic and hepatic exposures of TP in vivo , leading to severe hepatotoxicity. The hepatotoxicity was more relevant to the hepatic TP exposure. P-gp mediated clearance contributed significantly to the detoxification of TP. In clinical practice, the potential risk of herb-drug interaction or herb-herb interaction must be closely monitored when TP is concomitant with P-gp inhibitors or substrates.

ytterligare information

How to cite this article : Kong, L.-L. et al. Inhibition of P-glycoprotein Gene Expression and Function Enhances Triptolide-induced Hepatotoxicity in Mice. Sci. Rep. 5, 11747; doi: 10.1038/srep11747 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.