Hämmar fosforylering av onkogena pax3-foxo1 minskar alveolära rabdomyosarkomfenotyper som identifierar nya terapimöjligheter | onkogenes

Hämmar fosforylering av onkogena pax3-foxo1 minskar alveolära rabdomyosarkomfenotyper som identifierar nya terapimöjligheter | onkogenes

Anonim

ämnen

  • Sarkom

Abstrakt

Patienter med translokationspositiv alveolär rhabdomyosarkom (ARMS), en aggressiv barndomtumör som främst kännetecknas av PAX3-FOXO1 onkogent fusionsprotein, har en dålig prognos på grund av brist på terapier som specifikt riktar sig till ARMS-tumörer. Detta faktum belyser behovet av nya läkemedelsinterventioner. Posttranslationsmodifieringar som fosforylering blir attraktiva biologiska mål för utvecklingen av sådana interventioner. Längs dessa linjer demonstrerade vi att PAX3-FOXO1 fosforyleras på tre specifika ställen och att dess fosforyleringsmönster förändras i förhållande till vildtyp Pax3 under tidig myogenes och i ARMS-tumörceller. Emellertid har lite arbete utförts för att undersöka effekten av direkt hämning av fosforylering på dessa platser på ARMS-utveckling. För att ta itu med detta kunskapsgap använde vi små molekylinhibitorer eller mutationsanalys för att specifikt hämma fosforylering av PAX3-FOXO1 för att undersöka hur förändring av fosforylering av det onkogena fusionsproteinet påverkar ARMS-fenotyper. Vi fann att hämning av fosforyleringen av PAX3-FOXO1 vid Ser201 signifikant minskade migration, invasion och proliferation i två oberoende ARMS tumörcellinjer. Vidare fann vi att hämning av fosforylering vid Ser205 också minskade spridningen och förankringsoberoende tillväxt. I överensstämmelse med dessa in vitro- resultat visar vi för första gången att PAX3-FOXO1 fosforyleras vid Ser201 och Ser205 i ett primärt tumörprov och i tumörceller som aktivt invaderar den omgivande normala vävnaden. Denna rapport är den första som visar att den direkta hämningen av PAX3-FOXO1-fosforylering minskar ARMS-tumörfenotyper in vitro och att dessa fosforyleringshändelser finns i primära humana ARMS-tumörer och invaderande tumörceller. Dessa resultat identifierar fosforylering av PAX3-FOXO1, särskilt vid Ser201, som ett nytt biologiskt mål som kan utforskas som en lovande väg för ARMS-terapier.

Introduktion

Rhabdomyosarcoma (RMS), en av de vanligaste fasta tumörerna hos barn, 1 består av två huvudhistologiska subtyper: embryonala och alveolära (ARMS). ARMS, den mer aggressiva subtypen, definieras primärt av t (2; 13) (q35; q14) -translokationen, som smälter den aminoterminala regionen av Pax3 till de karboxylterminala sekvenserna av FOXO1. 2, 3, 4 Det erhållna PAX3-FOXO1 onkogena fusionsproteinet har förändrat molekylära aktiviteter relativt vildtyp Pax3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 som tros bidra till ARMS tumörfenotyper. 11 patienter som diagnostiserats med PAX3-FOXO1-positiva ARMS har en 4-årig överlevnad på 8%; 12 som härrör från kemoresistensen av metastatiska tumörer i kombination med en aktuell brist på effektiva terapier specifika för att rikta ARMS. Denna information belyser nödvändigheten av att förstå de bakomliggande biologiska och biokemiska processerna som bidrar till uppkomsten av ARMS för att utveckla välbehövliga terapeutiska alternativ.

Posttranslationsmodifieringar såsom fosforylering är vanliga mekanismer för reglering av transkriptionsfaktorer. Som sådan ger hämning av dessa fosforyleringshändelser ett attraktivt mål för läkemedelsutveckling. 13, 14 Vi publicerade att vildtyp Pax3 fosforyleras vid Ser201 och Ser205 av kinaserna GSK3P respektive CK2. 15, 16 Efter induktion av differentiering kvarstår fosforylering vid Ser201. Fosforylering vid Ser205 förloras emellertid snabbt med en samtidig ökning av fosforylering på Ser209, återigen medierad av CK2. 16, 17 Däremot fann vi att PAX3-FOXO1 fosforyleras på Ser201 och Ser205 under spridning; denna status förblir oförändrad under hela myogenesen utan någon ökning av fosforylering vid Ser209. 15, 16 Därför kan den avvikande fosforyleringen av PAX3-FOXO1 påverka normal myogenes för att bidra till utvecklingen av ARMS.

Tidigare arbete visade att hämning av fosforylering av PAX3-FOXO1 i T-antigen-transformerade humana embryonala njurceller (293T-celler), en icke-fysiologiskt relevant in vitro cellulär modell, 18 förändrade dess transkriptionella aktivitet. Andra visade att små molekylinhibitorer av GSK3p påverkade livskraften och transformationsförmågan hos en ARMS-tumörcellinje. 19 Den första studien använde emellertid en allmän mutationsmetod som förändrade flera serinrester inom en region utan specifikt att rikta in sig på de kända ställena, medan den andra studien inte visade att de små molekylinhibitorerna direkt förändrade fosforylering av PAX3-FOXO1. Ingen av dessa studier visade vidare ett direkt beroende av biologiska resultat på förändringar av de specifika och identifierade PAX3-FOXO1-fosforyleringshändelserna. Slutligen har PAX3-FOXO1-fosforylering ännu inte studerats i humana primära ARMS-tumörprover. Därför ville vi bestämma hur inhiberande specifika platser för PAX3-FOXO1-fosforylering påverkar kända ARMS-tumörfenotyper och hur dessa biologiska effekter korrelerar med primära tumörprover för att identifiera potentiella ARMS-specifika biologiska mål för framtida terapibehandling.

I denna studie använder vi små molekylinhibitorer av GSK3β eller fosfokompetenta mutationer som individuellt riktar sig till de kända fosforyleringsställena för att bestämma hur hämning av dessa händelser på PAX3-FOXO1 påverkar ARMS tumörfenotyper. Våra resultat visar att hämmare av GSK3p reducerar fosforylering av PAX3-FOXO1 vid Ser201 och att hämning av denna händelse, antingen genom små molekylinhibitorer eller mutationsanalys minskar migration, invasion och proliferation i två oberoende ARMS tumörcellinjer. Vidare reducerar hämning av fosforylering vid Ser205 genom mutationsanalys ARMS tumörcellsproliferation och förankringsoberoende tillväxt. Slutligen visar vi att fosforylering av PAX3-FOXO1 vid Ser201 och Ser205 finns i humana primära ARMS-tumörer och i celler som infiltrerar den omgivande normala vävnaden. Sammantaget stöder våra resultat idén att fosforylering av PAX3-FOXO1 är en viktig bidragsgivare till ARMS-tumörfenotyper och som sådan kan vara ett viktigt biologiskt mål för ARMS-terapiutveckling.

Resultat

GSK3P-hämmare minskar fosforylering av endogen PAX3-FOXO1 vid Ser201

Andra visade att små molekylinhibitorer av GSK3P påverkar proliferationen och livskraften hos ARMS-tumörceller. 19 Vi bestämde att GSK3P fosforylerar PAX3-FOXO1 vid Ser201 i primära myoblaster och i ARMS-cellinjer. 16 Inga studier korrelerade emellertid hämningen av GSK3β med en minskning av fosforylering vid Ser201 eller hur dessa förändringar påverkar ARMS tumörfenotyper. Därför inkuberade vi ARMS-tumörcellinjerna RH30 eller RH4 med ökande koncentrationer av den vanligt använda GSK3P-hämmaren litiumklorid (LiCl; IC50 = 10 m M) 20 eller den mycket specifika hämmaren AR-A014418 (IC50 = 10 μM). 21 Vi använde koncentrationer som vanligtvis användes i publicerade rapporter och som visade sig vara effektiva för att hämma GSK3p in vivo. 21, 22, 23 Vi bestämde fosforyleringsnivån vid Ser201 på endogen PAX3-FOXO1 genom western blot-analys med användning av vår anti-Pax3 (pSer201) antikropp. 16 Efter normalisering för total PAX3-FOXO1 observerade vi en titrerbar minskning av fosforylering vid Ser201 med ökande koncentrationer av båda hämmare i båda cellinjerna (figur 1a och b).

Expression och fosforylering av endogena PAX3-FOXO1 eller PAX3-FOXO1 fosfomutanter. ( a ) Totala extrakt gjordes från RH30 (vänster panel) eller RH4 (högerpanel) ARMS tumörceller behandlade med ökande koncentrationer av LiCl eller AR-A014418. Närvaron av endogent PAX3-FOXO1 (bottenpanel) eller endogent PAX3-FOXO1 fosforylerat vid Ser201 (toppanelen) bestämdes genom western blot-analys på 25 | ig av totalt cellextrakt med användning av en antikropp specifik för PAX3 eller den Ser201 fosfospecifika antikroppen. ( b ) Fosfo-PAX3-FOXO1 och total PAX3-FOXO1 kvantifierades genom densitometri varefter fosfo-PAX3-FOXO1 normaliserades för total PAX3-FOXO1. Resultaten plottas som relativ fosforylering med icke-behandlade celler som får ett värde av 100. Felstänger representerar standardavvikelsen från tre oberoende bestämningar och P- värden beräknades med användning av icke-parametriska tvåvägsanalyser av varians, jämförande varje behandlingsvillkor med resultat med icke behandlade celler. (* P = 0, 03, ** P = 0, 004). ( c ) Totala cellextrakt gjordes från RH30 (toppaneler) eller RH4 (bottenpaneler) celler stabilt omvandlade endast med vektor (vektor), vildtyp PAX3-FOXO1 (WT) eller den angivna PAX3-FOXO1 fosfomutanten. Närvaron av ektopiskt uttryckt PAX3-FOXO1 bestämdes genom immunutfällning-western blot-analys, såsom beskrivs i material och metoder.

Bild i full storlek

Även om vi observerade titrerbar hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering vid Ser201, kan hämning av GSK3P-aktivitet påverka icke relaterade vägar, vilket tidigare visats i myogenes och embryonal rabdomyosarkom. 23, 24 Vidare resulterade hämning av CK2, ett allestädes närvarande och väsentligt multifunktionellt enzym, i icke-specifik celldöd (data visas inte) som förhindrade användning av dessa små molekylinhibitorer i dessa studier. För att bestämma hur specifikt hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering påverkar ARMS-tumörfenotyper använde vi mutanter i vilka varje enskilt ställe muterades till en fosfoinkompetent alanin (S201A, S205A eller S209A). De två ARMS-cellinjerna transducerades stabilt, valdes med puromycin och utvalda celler skördades från tre oberoende transduktioner och slogs samman vilket resulterade i en enda population för varje enskild mutant. Genom att använda en population av transducerade celler tar vi bort potentialen för variation som kan uppstå från klonala effekter. En immunutfällnings-Western blot-analys visade det ektopiska uttrycket för alla mutanter, varvid lägre expressionsnivåer sågs i RH4-tumörcellinjen (figur 1c). Oberoende Western blot-analyser bestämde att båda linjerna hade fysiologiskt relevanta nivåer av ektopiskt uttryck, vilket var ekvivalent med nivåerna av endogent PAX3-FOXO1 (data visas inte).

Hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering vid Ser201 minskar migrationsförmågan hos ARMS-tumörcellinjer

Cellulär migration är en viktig bidragsgivare till tumörutveckling. För att bestämma hur hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering påverkar ARMS-tumörcells migrationsförmåga utförde vi sårläkningsanalyser i närvaro av GSK3P-hämmare eller med celler som stabilt uttrycker PAX3-FOXO1-fosfomutanter. Vi observerade en titrerbar minskning av migrationsförmågan, bestämd av hastigheten för rörelse hos enskilda celler, med ökande koncentrationer av LiCl eller AR-A014418 i båda cellinjerna (figur 2a). Vidare korrelerar minskningarna av migrationsförmågan med våra observerade minskningar i fosforylering av PAX3-FOXO1 vid Ser201 (jämför resultat i figur 1b och figur 2a). Det ektopiska uttrycket av vildtyp PAX3-FOXO1, eller PAX3-FOXO1 fosfokompetent vid Ser205 eller Ser209, hade ingen effekt på migrationsförmågan hos RH30- eller RH4-celler. Däremot inhiberade det stabila uttrycket av PAX3-FOXO1 fosfokompetent vid Ser201 sårläkningskapaciteten för RH30- och RH4-celler nästan fyrfaldig respektive tvåfaldig (figur 2b). Dessa förändringar i migration resulterade inte från förändrade proliferationshastigheter eftersom analyserna genomfördes under 6 timmar, vilket är betydligt mindre än den registrerade fördubblingstiden på 35–50 timmar för dessa celler (figur 4), och vi observerade ingen celldelning medan du spårar enskilda celler.

Effekt av att hämma PAX3-FOXO1 fosforylering på ARMS tumörcellmigration. ( a ) ARMS-tumörceller RH30 eller RH4 behandlades med ökande koncentrationer av LiCl eller AR-A014418 eller ( b ) stabilt omvandlas med tom vektor (vektor), vildtyp PAX3-FOXO1 (WT) eller de angivna PAX3-FOXO1-fosfomutantema, som beskrivs i material och metoder. En repa infördes och migration in i såret övervakades genom mikroskopi av tidsfördröjning. Enskilda celler spårades och deras hastigheter bestämdes med användning av ImageJ-programvara. För båda panelerna presenteras resultaten som hastighet med felstänger som representerar standardavvikelsen från 60 till 80 oberoende bestämningar. P- värden beräknades med användning av icke-parametriska tvåvägsanalyser av varians där varje behandlingsvillkor jämfördes med resultat med icke-behandlade celler ( a ) eller med den tomma vektorn omvandlade negativ kontroll ( b ). (* P = 0, 07, ** P = 0, 003, *** P = 0, 0001 **** P <0, 0001).

Bild i full storlek

Hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering vid Ser201 reducerar signifikant den invasiva kapaciteten för ARMS-tumörceller

Ett av kännetecknen för metastas är en tumörcells förmåga att invadera källarmembranet för att initiera rörelse från det primära tumörstället. Därför undersökte vi hur hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering påverkade den invasiva kapaciteten för ARMS-tumörceller. RH4-celler invaderar inte genom Matrigel 25 (och data visas inte); därför kunde vi bara använda RH30-celler för dessa experiment. Vi observerade en titrerbar minskning av invasiv kapacitet med ökande koncentrationer av både LiCl och AR-A014418, vilket resulterade i en nästan 80% respektive 50% minskning (figur 3a), igen, i överensstämmelse med de observerade minskningarna av fosforylering vid Ser201. Det stabila uttrycket av vildtyp PAX3-FOXO1 eller PAX3-FOXO1 fosfokompetent vid Ser205 eller Ser209 hade ingen effekt på den invasiva kapaciteten för RH30-celler. Däremot minskade det stabila uttrycket av PAX3-FOXO1-fosfokompetent vid Ser201 invasionen med nästan 80%, liknande reduktioner sett i närvaro av LiCl (figur 3b).

Effekt av att hämma PAX3-FOXO1 fosforylering på ARMS tumörcellsinvasion. ( a ) ARMS-tumörceller RH30 behandlades med ökande koncentrationer av LiCl eller AR-A014418 eller ( b ) stabilt transducerade med tom vektor (vektor), vildtyp PAX3-FOXO1 (WT) eller de angivna PAX3-FOXO1-fosfomutanterna, såsom beskrivits i material och metoder. Invasionskapaciteten bestämdes med användning av BD Biocoat Tumor Invasion-systemet, en Matrigel-baserad invasionanalys, såsom beskrivs i metoderna. Resultaten presenteras som relativ invasion med icke-behandlade celler ( a ) eller tomma vektortransducerade celler ( b ) som ges ett relativt värde på 100. Felstänger representerar standardavvikelsen från tre oberoende bestämningar och P- värden beräknades med användning av icke- parametriska tvåvägsanalyser av varians som jämför varje behandlingsvillkor med resultat med icke-behandlade celler ( a ) eller med den tomma vektoromvandlade negativa kontrollen ( b ). (* P = 0, 02, *** P = 0, 0003).

Bild i full storlek

Hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering minskar proliferationen av ARMS-tumörceller

Det rapporterades att hämning av GSK3P minskade livskraften hos ARMS-tumörceller. 19 På liknande sätt fann vi att behandling av celler med GSK3p-hämmare under längre tidsperioder (> 72 timmar) resulterade i en celldödnivå som utesluter användningen av dessa hämmare i vår proliferationsanalys (data visas inte). För att bestämma effekten specifikt hämma PAX3-FOXO1-fosforylering har på proliferation, använde vi RH30- och RH4-celler stabilt transducerade med PAX3-FOXO1 eller de individuella PAX3-FOXO1-fosfomutanterna. Vi såg inga signifikanta förändringar i fördubblingstiden för RH30-celler stabilt omvandlade med vildtyp PAX3-FOXO1 relativt den tomma vektornegativa kontrollen. Emellertid resulterade det stabila uttrycket av fosfokompetent S201A, S205A eller S209A i en ökad fördubblingstid från 35 timmar till nästan 50 timmar (figur 4a). RH4-celler har i sig en långsammare fördubblingstid i förhållande till RH30-celler (45 timmar respektive 35 timmar). Det stabila uttrycket av PAX3-FOXO1 minskade fördubblingstiden från 45 till 35 timmar relativt den tomma vektorn, en minskning som förlorades efter det stabila uttrycket för någon av PAX3-FOXO1-fosfoinkompetenta mutanter (figur 4b).

Effekt av att hämma PAX3-FOXO1-fosforylering på ARMS-tumörcellsproliferation. ( a ) RH30 eller ( b ) RH4 ARMS-tumör var celler stabilt omvandlade med tom vektor (vektor), vildtyp PAX3-FOXO1 (WT) eller de angivna PAX3-FOXO1 fosfomutanterna, såsom beskrivs i materialen och metoderna. Cellerna pläterades och fick växa i upp till sju dagar. Varje dag bestämdes celltätheten med hjälp av CCK-8-cellräkningssatsen, densiteter ritades som en funktion av tiden, och fördubblingstider bestämdes med användning av GraphPad Prism 6-programvaran. Felstänger representerar standardavvikelsen från tre oberoende bestämningar och P- värden beräknades med användning av icke-parametriska tvåvägsanalyser av varians, där varje behandlingstillstånd jämfördes med resultat som ses med den tomma vektoromvandlade negativa kontrollen. (* P = 0, 01, ** P = 0, 003).

Bild i full storlek

Hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering minskar den förankringsoberoende tillväxten av ARMS-tumörceller

Förmågan hos celler att växa i frånvaro av ett fast stöd anses vara riktmärket för att bestämma transformeringskapaciteten för celler. Därför bestämde vi hur hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering påverkar ARMS-tumörcellförankringsoberoende tillväxt. Som beskrivits ovan för bestämning av proliferation kunde vi inte använda små molekylinhibitorer i dessa experiment och använde därför celler stabilt som uttrycker PAX3-FOXO1 fosfomutanter. Vidare är RH4-celler inte mottagliga för mjuka agaranalyser, 25 så vi bestämde den förankringsoberoende tillväxtförmågan hos dessa celler genom fokusbildningsanalyser. Vi observerade att det ektopiska uttrycket av vildtyp PAX3-FOXO1 ökade förmågan att bilda kolonier i mjuk agar och förmågan att bilda foci för RH30 respektive RH4-celler (figur 5). Vi fann att hämning av fosforylering vid Ser201 eller Ser209 avlägsnade denna PAX3-FOXO1-beroende ökade förankringsoberoende tillväxt med RH30 men inte RH4-celler (figur 5). Däremot hämmar fosforylering vid Ser205 signifikant förankringsoberoende tillväxt i båda cellinjerna (figur 5).

Effekt av att hämma PAX3-FOXO1 fosforylering på förankringsoberoende tillväxt. ( a och b ) RH30 eller ( c och d ) RH4 ARMS-tumörceller omvandlades stabilt med tom vektor (vektor), vildtyp PAX3-FOXO1 (WT) eller de angivna PAX3-FOXO1-fosfomutanterna. ( a ) RH30-celler pläterades i mjuk agar, inkuberades under 1 vecka och omvandlingsgraden bestämdes med en fluorescerande analys, såsom beskrivs i materialen och metoderna. Resultaten presenteras som relativ fluorescens, felfält representerar standardavvikelsen från tre oberoende bestämningar och P- värden beräknades med användning av icke-parametriska tvåvägsanalyser av varians som jämför varje behandlingsvillkor med resultat som ses med den tomma vektoromvandlade negativa kontrollen (* * P = 0, 002). ( b ) Representativa bilder av kolonibildningen. ( c ) Celler odlades till sammanflöde, varefter de fick växa ytterligare 5 dagar. Totalt antal kolonier räknades, resultaten presenteras som antal Foci, felstänger representerar standardavvikelsen från fyra oberoende bestämningar, och P- värden beräknades med användning av icke-parametriska tvåvägsanalyser av varians som jämförde varje behandlingsvillkor med resultat som sågs med den tomma vektorn omvandlade negativ kontroll (** P —0.0006, **** P <0, 0001). ( d ) Representativa faskontrastmikroskopibilder av kolonibildning togs.

Bild i full storlek

PAX3-FOXO1 fosforyleras vid Ser201 och Ser205 i humana primära ARMS-tumörer och celler som invaderar omgivande normal vävnad

Hittills har studier som undersöker den direkta rollen som fosforylering av PAX3-FOXO1 spelar i myogenes och ARMS-tumörutveckling övervägande begränsats till in vitro cellulära system 15, 16, 17, 19, 26 och har ännu inte undersökt närvaron och mönstret hos dessa fosforyleringshändelser i primära tumörprover. Därför bestämde vi närvaron av PAX3-FOXO1-fosforylering i primära tumörer hos humana patienter med användning av affinitetsrenade antikroppar specifika för fusionsproteinet när de fosforylerades vid Ser201 eller Ser205. Dessa antikroppar är mycket specifika för deras antigena mål, vilket demonstreras av närvaron av ett enda band på Western blot-analys av totala cellulära extrakt från flera ARMS-tumörceller, melanomcellinjer och primära myoblaster. 15, 16, 17, 27 Vi använde initialt tumörvävnad härrörande från en ARMS primär tumör erhållen från en höger lungtransbronchial biopsi från en 17 år gammal manlig patient med tumörtestet positivt för t (2:13) (q35) ; q14) kromosomal translokation (data visas inte). Även om närvaron av ARMS i lungvävnad är sällsynt, ger 28, 29 detta prov den perfekta interna negativa kontrollen eftersom den omgivande normala lungvävnaden inte uttrycker PAX3 eller PAX3-FOXO1.

Vi färgade vävnad med en Pax3-specifik antikropp, vilket visade uttrycket av PAX3-FOXO1 i ARMS primära tumörceller men inte den omgivande normala vävnaden (figur 6b). Med hjälp av våra Ser201-fosfospecifika antikroppar, fann vi att en majoritet av tumören färgades positivt för fosforylering vid Ser201 och att denna färgning är anrikad runt tumörens periferi (figur 6c). På liknande sätt visade användning av våra Ser205-fosfospecifika antikroppar 17 att ARMS-tumörer också fläckar positivt för fosforylering vid Ser205. Till skillnad från Ser201-färgningen är färgningen för fosforylering vid Ser205 emellertid relativt stark och mestadels enhetlig i hela tumörens kropp (figur 6e). Slutligen invaderar enskilda celler den omgivande normala vävnadsfärgen positiva för fosforylering vid både Ser201 och Ser205 (figur 6f – i). Resultaten som presenteras här är representativa för flera bestämningar (data visas inte).

Uttryck av fosforylerad Pax3-FOXO1 i human primär tumör. Tumorsektioner härstammade från en höger lungtransbronchial biopsi från en 17-årig patient med en primär ARMS-tumörtestning som var positiv för t (2:13) (q35; q14) kromosomal translokation med FISH-analys. Sektionerna färgades med hematoxylin och eosin ( a, d och f ) eller antikroppar som känner igen Pax3 ( b och g ), Pax3 fosforylerad vid Ser201 ( c och h ) eller Pax3 fosforylerad vid Ser205 ( e och i ) och förstoringar anges i varje panel.

Bild i full storlek

Diskussion

Nuvarande behandlingar för ARMS, som främst inkluderar kirurgi, strålning och generaliserad kemoterapi, möts med liten framgång, delvis beroende på en högre benägenhet för metastaser och resistens mot behandling. 2, 30, 31 Ett av hindren för att hitta bättre behandlingar är att belysa drogerbara molekylära mekanismer som är endemiska för ARMS. Även om flera studier fokuserade på att manipulera nedströmsvägar som utförs av det onkogena fusionsproteinet PAX3-FOXO1, visar 32 pågående kliniska studier att dessa behandlingar inte är så effektiva som ursprungligen hoppats. 33, 34 Även om inhibering av nedströmsvägar är logisk riktar sig dessa behandlingar inte till den definierande genetiska avvikelsen, PAX3-FOXO1, som visades direkt bidra till många ARMS-tumörfenotyper. 35 Därför är direktinriktning PAX3-FOXO1 logiskt för utvecklingen av nya farmaceutiska terapier för att behandla ARMS.

Inhibering av fosforylering genom användning av små molekyler är en intensiv eftersträvad undersökningslinje för potentiella cancerbehandlingar. 36 Även om andra beskrev effekterna av kinashämmare på PAX3-FOXO1 biologiska aktiviteter och ARMS-tumörfenotyper, gav 18, 19 ingen av dessa studier direkta bevis som korrelerade dessa effekter med förändringar i fosforylering av PAX3-FOXO1 på dess kända platser. 15, 16, 17 Därför undersökte vi hur den direkta hämningen av PAX3-FOXO1-fosforylering påverkar de kända ARMS-tumörfenotyperna av migration, invasion, spridning och förankringsoberoende tillväxt. I denna rapport är våra resultat de första som visar att fosforylering av PAX3-FOXO1, främst på Ser201, är en giltig molekylmekanism som bidrar till utvecklingen av ARMS.

Vi fann att behandling av två ARMS-cellinjer med antingen en allmän eller mycket specifik GSK3P-hämmare, som är inriktad på det kinas som är ansvarigt för fosforylering av PAX3-FOXO1 vid Ser201, 16 resulterade i titrerbara minskningar i fosforyleringen av endogen PAX3-FOXO1 på denna plats (figur 1), som direkt korrelerade med minskningar av migration och invasion (figur 2 och 3). Även om de är övertygande är dessa resultat enbart inte definitiva bevis, eftersom GSK3P kan påverka andra icke-PAX3-FOXO1-relaterade biologiska vägar, vilket visades för den translokationsnegativa embryonala rhabdomyosarkom. 24 Vi fann emellertid att direkt hämning av fosforylering vid Ser201 genom mutationsanalys, som avlägsnar fosforylering av fusionsproteinet oberoende av GSK3P-verkan, minskar migration, invasion och spridning (figur 2, 3 och 4) och hämmar fosforylering vid Ser205 minskar proliferation och förankringsoberoende tillväxt (figur 4 och 5). Därför, tillsammans med resultaten från små molekylinhibitorer, tillåter våra resultat oss att dra slutsatsen att fosforylering av PAX3-FOXO1, främst vid Ser201 men med bidrag från Ser205, är en viktig bidragsgivare till PAX3-FOXO1-beroende ARMS tumörfenotyper.

ARMS är en heterogen tumör 37 och som sådan visar cellinjer härrörande från patienter skillnader i hur de manifesterar tumörfenotyper. 38, 39 Våra resultat illustrerar detta faktum, vilket bevisas av våra observerade skillnader i spridning, förankringsoberoende tillväxt och invasion mellan RH30- och RH4-cellinjer (figur 3, 4 och 5). Vi observerade dock att hämningen av fosforylering av fusionsproteinet vid Ser201 och Ser205 konsekvent hämmade dessa PAX3-FOXO1-beroende effekter, oavsett de biologiska skillnaderna mellan celltyper eller deras svar på det ektopiska uttrycket av ekvivalenta nivåer av PAX3-FOXO1. Även om dessa celler uttrycker endogena PAX3-FOXO1 är det ekopiska uttrycket av fysiologiskt relevanta nivåer av fosfoinkompetenta mutanter tillräckligt för att hämma tumörfenotyper. Detta faktum antyder att icke-fosforylerad PAX3-FOXO1 kan agera på ett dominerande-negativt sätt med avseende på dess fosforylerade motsvarighet. Sammantaget stöder våra resultat idén att hämning av PAX3-FOXO1-fosforylering är en livskraftig väg för ny terapiutveckling som kan vara tillämplig på translokationspositiva ARMS-tumörer.

Förutom våra in vitro- bevis var det viktigt för oss att validera den kliniska relevansen av dessa studier i primära patientprover. Hittills har bristen på fosforyleringsspecifika antikroppar som var funktionella i immunohistocytokemi gjort detta svårt. Men den framgångsrika användningen av våra fosforyleringsspecifika antikroppar i immunohistocytokemi gjorde det möjligt för oss att visa förekomsten och mönstret av PAX3-FOXO1 fosforylering i primära tumörprover för första gången. Med användning av sällan förekommande primära translokationspositiva ARMS-tumörprover från en lungtransbronchial biopsi fann vi PAX3-FOXO1 fosforylerades vid Ser201 i primära ARMS-tumörprover (figur 6c och h). I överensstämmelse med våra in vitro-resultat , där fosforylering vid Ser201 är viktig för tumörcellmigration och invasion, fann vi att färgning för denna händelse var starkare runt periferin av tumören (figur 6c), där invaderande och migrerande celler härstammar, och i celler som aktivt infiltrerar den omgivande normala vävnaden (figur 6h).

Vi fann också att PAX3-FOXO1 fosforyleras vid Ser205 i samma tumörprov (figur 6e och i). I överensstämmelse med våra in vitro- resultat som visar att fosforylering vid Ser205 bidrar till spridning, är färgning för denna händelse även i hela tumören (figur 6e), i direkt kontrast till färgning för fosforylering vid Ser201. Ytterligare konsekvent med de bidrag som fosforylering vid Ser205 gör för att förankra oberoende tillväxt, en process som är nödvändig för celler för att etablera en tumör på ett avlägset ställe, fann vi intensiv färgning för denna händelse i celler som invaderar normal vävnad (figur 6i). Sammantaget visar dessa resultat för första gången att PAX3-FOXO1 fosforyleras vid Ser201 och Ser205 i primära ARMS-tumörer, att dessa fosforyleringshändelser berikas i celler som aktivt invaderar den omgivande normala vävnaden och att de ger klinisk validering för deras in vitro effekter på ARMS tumörfenotyper.

Resultaten som presenteras i detta arbete stöder idén att hämma fosforylering av PAX3-FOXO1, särskilt på Ser201, är en spännande möjlighet för framtida ARMS-terapier. Längs dessa linjer är GSK3P-hämmare effektiva för att minska tillväxten och kemoterapeutisk resistens hos flera icke-ARMS-cancerceller 40 och undertrycker tillväxt och förnyelse av embryonala RMS-tumörer. 24 Ännu viktigare för potentiell klinisk användbarhet visade sig att små molekylhämmare av GSK3P, såsom litiumklorid och Tideglusib, visade sig vara icke-toxiska i djurmodeller och människor, och är användbara för att behandla ett stort antal cancerformer, inklusive äggstockar, kolorektal, neuroblastom och prostata. 41, 42, 43, 44, 45

Sammanfattningsvis beskriver våra data en molekylmekanism genom vilken förändring av posttranslationsstatusen för PAX3-FOXO1, särskilt vid Ser201, dämpar kända ARMS-onkogena fenotyper. In vitro- resultaten stöds genom in vivo- studier som visar den kliniska relevansen av dessa fosforyleringshändelser. Sammantaget stöder dessa slutsatser idén att användning av små molekylinhibitorer riktade mot GSK3P, molekyler som har visat sig vara säkra och effektiva i andra icke-relaterade cancerformer, kan vara en livskraftig väg för utveckling av nya terapier för ARMS genom djurstudier och prekliniska studier.

Material och metoder

Cellinjer och cellkultur

ARMS-tumörcellinjen RH30 köptes från American Type Culture Collection. 293T- och ARMS-tumörcellinjen RH4 var generösa gåvor från Dr. Gerard Grosveld. Alla celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle Media (kompletterat med 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), penicillin G (200 U / ml) och streptomycin (200 μg / ml)) och odlades i en fuktig inkubationskammare vid 37 ° C i 5% CO2.

Konstruktion av PAX3-FOXO1 expressionsvektorer

PAX3-FOXO1 klonades in i den modifierade retrovirala expressionsvektorn med lågt kopieringsnummer MSCV-IRES-Puro, som innehåller ryggraden i den låga kopian pSMART GC LK-vektorn (Lucigen, Middleton, WI, USA). Vi introducerade en tyst mutation med en enda nukleotid, och skapade därigenom ett nytt BamHI-ställe i PAX3-FOXO1 som underlättade kloning av fosfoinkompetenta mutanter. Närvaron av IRES tillåter det dubbla uttrycket av PAX3-FOXO1 och puromycinresistensgenen som ett enda transkript, båda under kontroll av den konstitutivt aktiva Murine Stem Cell Virus-promotorn. 46 Phospho-specific point mutants in which the indicated serine was individually mutated to the phospho-incompetent alanine (S201A, S205A, S209A) were created by PCR amplification using previously created Pax3 point mutants as the template and primers containing a BamHI restriction sequence at the 3'-end. Alla konstruktioner bekräftades genom sekvensering.

Stable transduction of ARMS tumor cell lines

ARMS tumor cells were stably transduced with the empty vector, wild-type PAX3-FOXO1 or PAX3-FOXO1 phosphomutants (S201A, S205A or S209A) as previously described. 5, 17 Retroviral stocks were generated by the transient transfection of 293T cells with 3 μg each of retroviral packaging vectors pSRα-G and p-EQ-PAM-E and 3 μg of the above-described expression vectors using the TransIT -LT1 reagent (Mirus, Madison, WI, USA). Culture supernatants containing virus were collected between 36 and 72 h after transfection, filtered (0.45 μm) and subsequently used for a single transduction, as previously described. 16, 17 Two to 3 days post transduction, transduced cells were selected by incubation in media supplemented with puromycin (2.5 ng/ml) until complete cell death was observed in the non-transduced control cells.

Antikroppar och western blot-analys

Antibodies specific for PAX3-FOXO1 (anti-Pax3) or PAX3-FOXO1 phosphorylated at Ser201 (anti-Pax3[p201]) were produced as described previously. 17, 47 Western blot analysis of endogenous PAX3-FOXO1: non-transduced RH30 or RH4 cells were grown to approximately 80% confluency. Growth media was replaced with media containing increasing concentrations of the GSK3β inhibitors LiCl (10 m M, 20 m M, or 40 m M ) or AR-A014418 (2 μ M, 10 μ M, or 20 μ M ) and incubated for 24 h at 37 °C and 5% CO 2 . Alternatively, stably transduced cells were grown to 80% confluency in the absence of any inhibitors and harvested. Equal amounts of total cell lysates (25 μg) were separated by 8% SDS–PAGE and the analysis was performed as previously described. 15, 16

In vitro wound-healing assays

Non-transduced RH30 or RH4 cells were seeded onto a 24-well plate at 200 000 cells per well. Growth media was replaced with media containing increasing concentrations of LiCl (10 m M, 20 m M or 40 m M ) or AR-A014418 (2 μ M, 10 μ M or 20 μ M ) and incubated for 24 h at 37 °C and 5% CO 2 . Alternatively, stably transduced RH30 or RH4 cells were seeded onto a 24-well plate at 300 000 cells per well. A 100 μl gel-loading tip was used to generate a scratch in the monolayer, the cells were carefully washed twice with 1 × phosphate-buffered saline to remove floating cells, and subsequently incubated with fresh media containing the GSK3β inhibitors or non-supplemented media, respectively. Images were captured at exact spots every 15 min for 6 h using an Olympus time-lapse microscope (Olympus, Pittsburgh, PA, USA) with subsequent analysis using SlideBook software. Sixty to 80 individual cells from four independent images were tracked and the velocity was determined for each cell using ImageJ software.

Invasion assays

Non-transduced RH30 cells were grown on 100mm dishes until approximately 70% confluent, at which time they were incubated in the presence of GSK3β inhibitors at the concentrations described above. After 24 h, the cells were harvested and the invasive potential was determined using the BD Biocoat Tumor Invasion System (Becton Dickinson, East Rutherford, NJ, USA) as previously described 27 using 100 000 cells suspended in media containing the respective inhibitors in the apical plate and proliferation media supplemented with hepatocyte growth factor (hHGF, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) at 25 ng/ml and the respective inhibitors in the lower plate. The invasive potential of the stably transduced RH30 cells was determined as just described, except all incubations were performed in the absence of inhibitors. All samples were determined in triplicate and P -values were computed using non-parametric two-way analysis of variance.

Proliferationsanalys

The proliferation rate of stably transduced RH30 and RH4 cells was assessed using a CCK-8 colorimetric assay kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA). Cells were seeded at a density of 25 000 cells per well in a 24-well plate and allowed to grow for up to 7 days. The assay was conducted in triplicate, with an independent well being used for each replicate for each day of cellular growth. On each day of growth, 50 μl of CCK-8 solution was added to the individual well being tested and incubated for 2 h in a humidified chamber at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 . Color formation was detected by measuring the absorbance at 450 nm using a microplate reader, plotted as a function of time, and doubling times calculated using GraphPad Prism 6 software. P -values were computed using non-parametric two-way analysis of variance.

In separate experiments, once reaching 100% confluence, stably transduced RH4 cells were allowed to grow an additional 5 days to determine their foci forming capacity. Total numbers of foci formed were counted, all samples were determined in quadruplicate, and P -values were computed using non-parametric two-way analyss of variance.

Anchorage-independent growth in soft agar

Anchorage-independent growth assays were performed using a CytoSelect 96-well cell transformation assay kit (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA). Stably transduced RH30 cells were plated in 1.2% agar in a 96-well plate at 5000 cells/well and cultured for 8 days at 37 °C and 5% CO 2 . Transformation and colony formation was determined using the CyQuant GR fluorescent dye according to the protocol provided by the manufacturer.

Immunohistocytochemistry

Four micrometer-thick sections of human primary ARMS tumor were mounted on glass slides and incubated in an oven overnight at 65 °C to ensure tight adherence of tissue to the slides. Deparaffinization was carried out using xylene, graded alcohols and distilled H 2 O. The sections were loaded onto the Ventana Ultra IHC stainer (Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ, USA) and prepared according to the manufacturer's specifications. Briefly, slides (tissues) were treated with Cell Conditioner (antigen retrieval solution) at 95 °C for 92 min. After rinsing with reaction buffer, the slides were warmed to 36 °C. I-View Inhibitor was applied for 4 min; the slides were rinsed using reaction buffer. The sections were then incubated with antibodies specific for Pax3 or Pax3 phosphorylated at Ser201 or Ser205 for 2 h at 36 °C. After incubation, all slides were treated with Ventana's Blocker AB solution for 8 min. The slides were rinsed with reaction buffer; I-View Biotin Ig was applied for 8 min. After rinsing with reaction buffer, the slides were treated with I-View SA-HRP for 8 min, rinsed with reaction buffer. I-View DAB and I-View H202 was applied to the slides for 8 min after which the slides were rinsed in reaction buffer. The slides were treated with I-View Copper for 4 min, rinsed with reaction buffer, stained for 4 min with hematoxylin and toned with Bluing reagent for 4 min. Once the reactions were completed, the sections were washed in soapy distilled H 2 O, dehydrated (graded alcohols), cleared (xylene) and cover-slipped.