Uppblåsta sporopollenin exina kapslar erhållna från tunnväggiga pollen | vetenskapliga rapporter

Uppblåsta sporopollenin exina kapslar erhållna från tunnväggiga pollen | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Bioinspirerade material
  • Organiska molekyler i materialvetenskap

Abstrakt

Sporopollenin är en fysiskt robust och kemiskt elastisk biopolymer som innefattar det yttersta lagret av pollenväggar och är den första försvarslinjen mot hårda miljöförhållanden. De unika fysisk-kemiska egenskaperna hos sporopollenin motiverar alltmer extraktionen av sporopollenin exina kapslar (SEC) från pollenväggar som en förnybar källa för organiska mikrokapslar för kapslingstillämpningar. Trots det stora utbudet av olika pollenarter med olika storlekar och väggtjocklekar har trogen extraktion av pollen-mimetiska SEC begränsats till tjockväggiga pollenkapslar med styva mekaniska egenskaper. Det finns ett omöjligt behov av att utveckla metoder för att producera SEC från tunnväggiga pollenkapslar som utgör en stor andel av alla pollenarter och har attraktiva materialegenskaper såsom större aerosoldispersion. Här rapporterar vi den första framgångsrika extraktionen av uppblåsta SEC-mikrokapslar från en tunnväggig pollenart ( Zea mays ) och därigenom övervinna traditionella utmaningar med mekanisk stabilitet och förlust av mikrostruktur. Morfologisk och sammansatt karaktärisering av SECs erhållna genom det nyutvecklade extraktionsprotokollet bekräftar framgångsrikt proteinavlägsnande tillsammans med bevarande av nanoskala arkitektoniska funktioner. Framöver finns det en utmärkt potential att tillämpa liknande strategier över ett brett spektrum av outforskade tunnväggiga pollenarter.

Introduktion

Den evolutionära anpassningen av pollenkapslar med sofistikerade väggfunktioner har varit en nyckelfaktor i bebyggelsen och förekomsten av växter 1, 2 . Pollenväggen består av ett tvåskiktsarrangemang med ett inre intinlager och yttre exinlager 3, 4, 5, 6 och utgör en mycket anpassningsbar och robust struktur som kan tåla hårda miljöförhållanden och kemiska behandlingar 7, 8 . Pollenväggens fysiska robusthet tillskrivs det styva tintlagret som består av cellulosa, hemicellulosa och lignin, medan det exinska lagret som består av en biopolymer som kallas sporopollenin bidrar till att förbättra väggens hållbarhet med sporopolleninspecifika egenskaper 2, 4 6, 8, 9, 10, 11 . De karakteristiska prydnaderna av sporopollenin som förekommer på pollenytor såväl som storleken på pollenkorn har divergerat med utvecklingen av växtarter 9, 12, men alla medlemmar i sporopolleninfamiljen har behållit viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper för att avvärja UV-ljus- inducerad skada, långvarig dessering, oxidativa fria radikaler och mikrobiell attack 4, 13, 14, 15 .

Pollenkorn är grundläggande mikroskala leveransfordon som innehåller känslig information som måste skyddas och upprätthållas tills de tas emot av kvinnliga reproduktionsstrukturer 4 . Som den första försvarslinjen är sporopollenin utrustat med olika evolutionsdrivna fjädrande egenskaper speciellt anpassade för skydd och uthållighet för att förbli livskraftiga under längre tid. På grund av dessa attraktiva egenskaper tillsammans med ett stort och förnybart utbud har pollenkorn fått uppmärksamheten hos det breda vetenskapliga samhället och visar sig vara utmärkta mikrokapslar för kapslingstillämpningar 3, 16, 17 . För att ta itu med möjliga problem med biokompatibilitet och allergiframkallande utvecklades ett proteinfritt mikrokapselderivat, känt som en sporopollenin exin kapsel (SEC) genom en extraktionsprocess som bara lämnar det ihåliga sporopollenin exinlagret, som själv fungerar som en mikrokapsel och kan vara används för inkapslingsapplikationer 15, 18, 19, 20, 21, 22 . Som en mikrokapsel har SECs visat stor mångsidighet för applikationer såsom bioimaging 23, smakmaskning 19 och till och med cellsåddställningar 20 .

Med utnyttjande av den fysisk-kemiska robustheten hos sporopollenin har flera exinextraktionsmetoder med hög temperatur och frätande kemikalier fastställts för att framställa SECs 21, 24, 25, 26, 27, samtidigt som de bibehåller naturliga morfologiska egenskaper inklusive den intrikata yttopografin 9, 25 . De nuvarande ansträngningarna har emellertid varit inriktade på pollen eller sporer från endast en liten del av växtarter inklusive Lycopodium clavatum 3, 15, 17, 19, 22, 23, 24 och Helianthus annus 16 . SEC-processutvecklingen har faktiskt varit begränsad till mikrometer tjockväggiga pollenarter med hög mekanisk stabilitet som underlättar framgångsrik bevarande av mikroarkitekturfunktioner genom de hårda bearbetningsstegen. Å andra sidan förblir SEC-utvecklingen från submikron tunnväggiga pollenarter svårfångade på grund av svagare mekaniska egenskaper som hindrar trogen bevaring av strukturella funktioner. Med tanke på att tunnväggiga pollenkorn har större aerosoldispersion 28 och olika mekanismer för matsmältning 29 än tjockväggiga pollenkorn, finns det en stark motivation att utveckla SEC från tunnväggiga pollenarter mot att realisera nya applikationer som tillförsel av aerosolläkemedel och utnyttja av SEC med olika nedbrytningsbeteenden.

Ett lovande exempel på submikron tunnväggiga pollenarter är Zea mays pollen, som presenterar attraktiva materialegenskaper som härrör från sin status som den vanligaste grödan som odlas i hela världen och dess unika strukturella egenskaper. Zea mays pollenkorn har en större storlek jämfört med andra arter, från 70 till 100 μm i diameter beroende på hydreringsförhållandena 30 . Den flerskiktade beläggningen av Zea mays pollen, bestående av en exine, intine och en lipidfraktion 31, 32, är tunn (~ 1 μm) 33 och elastisk, men ändå robust nog att stödja dess sfäriska form utan brott 12 . Hittills är framgångsrik utvinning av SEC från Zea mays pollenkorn fortfarande svårfångad. Det första försöket att extrahera Zea mays sporopollenin rapporterades av Dominguez et al. medan man utvärderar olika pollenkorn inklusive de från Betula alba , Ambrosia elatior, Zea mays och Pinus pinaster 25 . Efter uttömmande kemisk bearbetning visade alla typer av pollenpartiklar frånvaron av cellulosa med försumbara effekter på basstrukturen i sporopollenin. Emellertid visade morfologisk karakterisering av slutprodukten smuliga strukturella rester av Zea mays medan alla andra arter behöll sin naturliga form 25 . Även om pollenharmomegati (det naturliga viknings- eller knäckbeteendet hos pollenkorn som svar på uttorkning) tidigare har fastställts och allmänt erkänts som en naturlig försvarsmekanism mot uttorkning 7, 8, 11, 34, var fullständig kollaps av Zea mays SEC oåterkallelig vid det sista steget, vilket indikerar att förbättringar av behandlingsprotokollet skulle vara fördelaktiga för att producera tekniskt hållbara SEC.

Med hänsyn till dessa faktorer har vi utvecklat en förbättrad metod för att erhålla morfologiskt intakta, tunnväggiga SECs från Zea mays pollenkapslar med användning av en en-potts syrahydrolysprocess samtidigt som man kringgår fullständig dehydrering i mellansteget. Så vitt vi vet är detta den första rapporten av tunna väggar SEC med bevarade inre strukturella funktioner i både mikroskala och nanoskala. Skanningselektronmikroskopi (SEM), dynamisk bildpartikelanalys (DIPA), CHN-elementanalys och konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) användes för kapselkaraktärisering. SEM möjliggjorde avbildning med hög upplösning för att exakt jämföra morfologiska egenskaper hos resulterande SECs erhållna genom olika bearbetningsstrategier, och DIPA användes för mätningar med hög kapacitetsstorlek och sekundär morfologisk karakterisering. CSLM användes också för SEC-morfologisk karakterisering. Dessutom tillhandahöll CHN-elementaranalys sammansatt information avseende graden av återstående protein. Sammantaget indikerar resultaten att tunnväggiga SECs kan erhållas med 82% proteinborttagningseffektivitet med användning av en sur hydrolys-extraktionsmetod i 85 (vikt / volym)% fosforsyra (H3PO4) inom 2, 5 timmar.

Experimentellt avsnitt

Zea mays pollenmaterial

Avfettade Zea-mays pollenkorn erhölls från GREER ® källmaterial (USA) och det tillhandahållna pollen förbehandlades med etyleter av ACS-kvalitet för att avlägsna den vaxartade beläggningen och alla andra fettsyrabeståndsdelar i pollenkornen.

Extraktion av Zea mays Sporopollenin Exine Capsules (SECs)

Tre representativa tillvägagångssätt för SEC-extraktion, inklusive 6 M HCl-hydrolys, H3P04-hydrolys och etanol-ultraljudsundersökning, undersöktes. ( 1 ) Hydrolys med 6 M HCl; Två gram avfettade Zea-mays pollenkorn suspenderades i 6 M HCl i en perfluoroaloxi (PFA) rundbottnad kolv försedd med en glaskondensor. Under försiktig omrörning återloppskokades lösningen vid 70 ° C under 10 timmar. De erhållna SEC: erna uppsamlades med ett vakuumfilter och tvättades sedan med en serie organiska och vattenhaltiga lösningsmedel enligt följande: 5 x vatten (100 ml), 2 x aceton (100 ml), 1 x 2 M HCl (100 ml), 5 × vatten (100 ml), 2 x aceton (100 ml), 1 x etanol (100 ml). Mellan varje tvätt lämnades SEC i suspension i minst fem minuter och vakuumfiltrerades sedan för lösningsmedelsutbyte. Efter avslutad seriell tvättning av lösningsmedelsutbytet uppsamlades SEC och torkades vid 60 ° C under åtta timmar och lagrades för ytterligare karaktärisering. ( 2 ) Syrahydrolys med H3P04; Behandling av Zea mays pollen är identisk med ovanstående protokoll men med en annan syra för hydrolysen. ( 3 ) Ultraljud av etanol; Två gram avfettade Zea-mays pollenkorn suspenderades i 50 ml etanol och placerades i badbehandling under en timme. Efter 5 minuter med centrifug vid 3000 varv / minut avlägsnades supernatanten och ersattes med färsk etanol och placerades sedan i bad sonication under ytterligare 30 minuter. Etanolen ersattes igen med ett centrifugeringssteg och tvättades med 25 ml vatten och placerades sedan i 50 ml aceton under ytterligare 30 minuters sonikering av badet. Efter avlägsnande av acetonen tvättades provet med 25 ml vatten fem gånger, filtrerades och torkades vid 60 ° C under åtta timmar.

När det gäller det nya protokollet för att erhålla intakta Zea-mays SEC, gjordes modifiering av processerna efter extraktion enligt följande. De vakuumfiltrerade sekundärerna efter sur hydrolys sköljs med färskt Milli-Q-behandlat vatten över ett 20 cm × 20 cm förutskott nylonnät (ϕ: 30 μm) (Elko Filtering, USA) placerat i en ren bägare. SEC-suspensionen hålls nedsänkt i vatten med försiktig omrörning i 5 minuter, och sedan överförs nätet och dras i ett nytt bägare med färskt vatten förvärmt till 50 ° C under 5 minuter. Samma tvättmetod med stam-dialys upprepas med 50 ° C Milli-Q-vatten (4X), 50 ° C aceton (2X), 50 ° C 2M HCl (1X), 50 ° C vatten (tills det neutraliseras vid pH 7–8 ), 50 ° C aceton (2X), sedan 50 ° C etanol (2X). Efter den slutliga tvätten överförs nätet till färskt vatten, som sedan upphettas till 80 ° C under 30 minuter under rökluckan för att bli av med all återstående aceton och etanol. De resulterande SEC: erna avlägsnas från nätet och förvaras i ett 50 ml rör med 20 ml Milli-Q-vatten vid 4 ° C för ytterligare karakterisering.

Elementaranalys

Kompositionsanalys av Zea mays pollenkorn och extraherade SEC genomfördes med en kalibrerad VarioEL III CHN elementanalysator (Elementar, Tyskland). Cirka 5 mg av varje torkat prov placerades i en ugn vid 60 ° C under minst en timme före CHN-läsning. För våta prover torkades 5 ml av suspensionen i ugnen vid 60 ° C över natten före analys. Proteinkoncentrationerna för prover beräknades med användning av den detekterade kvävekoncentrationen och den totala konverteringsfaktorn för Kjeldahl kväve (TKN) av 6, 25 i enlighet med rekommendationer från Association of Analytical Communities (AOAC) 35 såsom visas nedan:

Skanning av elektronmikroskopi (SEM)

SEM-morfologisk karakterisering utfördes på obearbetade pollenkorn och bearbetade SEC genom användning av ett FESEM 7600F-instrument (JEOL, Japan). Bearbetade och obearbetade prover belades med platina vid en tjocklek av 10 nm med JFC-1600 (JEOL, Japan) (20 mA, 60 sek). Prover observerades med användning av en accelerationspotential på 5, 00 kV vid olika förstoringar. För att fånga tvärsnittsbilder av proverna utsattes pollenkorn för kryogen frysning i flytande kväve. De fixerade proverna tärdes sedan med ett kirurgiskt blad och belades med platina för observation.

Dynamisk bildpartikelanalys (DIPA)

FlowCam ® -instrumentet (Fluid Imaging Technologies, USA) var utrustat med en 200 μm flödescell (FC-200) och en 20 X-förstoringslins (Olympus, Japan) och kontrollerades av programvarupaketet VisualSpreadSheet version 3.4.11. För provberedning suspenderas 5 mg från varje torrt prov i 5 ml vatten före mätningarna, medan 1 ml från varje vått prov späds ut med 4 ml vatten för mätningar. Mätningar samlades in automatiskt med en fast hastighet på 10 bilder s −1 och bildsamling utfördes med ett internt filter för partiklar mellan 55–75 μm. Ett minimum av 100 000 partiklar uppsamlades för varje mätning och 1 000 mycket fokuserade partiklar från varje bildsats valdes med kantgradienten. Mikromeritisk analys av partikelmorfologi utvärderades baserat på diameter, aspektförhållande och cirkularitet genom cirkelpassning. Bildförhållandet mäter längden till breddförhållandet för varje partikel medan cirkelpassningsparametern räknar avvikelsen för partikelkanten från en ungefärlig cirkel med bästa passning tilldelad av programvaran.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Autofluorescens från pollenkorn och SEC observerades med konfokal laserscanningsmikroskopi (Carl Zeiss LSM700, Tyskland) utrustad med tre spektrala reflekterade / fluorescensdetekteringskanaler, sex laserlinjer (405/458/488/514/543/633 nm) och en Z1 inverterat mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland). Prover fixerades mellan två klibbiga objektglas (Ibidi, Tyskland) med en droppe Vecatashield ® monteringsmedium (Vector Laboratories, USA) och bilder fångades under en EC Plan-Neofluar 40 × / 1, 30 Oil DIC M27-objektiv (Carl Zeiss, Tyskland) med följande inställningar: laserexciteringsvåglängder vid 405 nm (10, 0%), 488 nm (11, 0%) och 561 nm (10, 0%) detekterade med emissionskopplare 410–516, 493–556 respektive 566–685 nm; Under planskanningsläge fixerades laserskanningshastigheten vid 67 sek per varje fas och pixel-dvelningstiden inställdes till 12, 6 miksek. Alla tagna bilder behandlades med ZEN 2008-programvaran (ZEISS, Tyskland).

Resultat och diskussion

Ett viktigt mål med detta arbete är att utveckla en metod där sur hydrolys av Zea mays pollenkorn kan ge transparenta sfäriska kapslar helt utan sporoplasmatisk innehåll, vilket i sin tur ger proteinfria kapslar (Fig. 1a). För att uppnå detta mål utfördes Zea SEC-extraktionen initialt med användning av en bearbetningsmetod med en kruka som följde ett tidigare publicerat protokoll 36, 37 . Den bestod av ett 85 (vikt / volym)% H3PO4-återflöde vid 70 ° C under 10 timmar följt av en serie tvättsteg. De erhållna kapslarna observerades sedan genom SEM-avbildning tillsammans med obearbetade pollenkorn för morfologisk jämförelse. SEM-bilderna avslöjade att de ursprungliga pollenkornen i deras ursprungliga form inte var helt sfäriska. Istället verkade de skrynkliga och saknade vanliga mönster eller strukturer. Slumpmässigt knäckning och fördjupning längs kornytan var uppenbar, även om de grova morfologiska kännetecknen var intakta (fig. 1b). Å andra sidan var alla behandlade kapslar allvarligt kollapsade eller spruckna, såsom ses i fig. 1c, vilket speglade resultaten från Dominguez et al. 25

(a) Tecknad schema över konventionellt protokoll bestående av ett surt hydrolyssteg följt av en omfattande tvätt som förväntas producera kapslar som bibehåller den naturliga formen. SEM-resultat erhållna från konventionellt protokoll visar obearbetad pollen (b) och bearbetade SECs (c) med allvarlig bristning (*) och knäckning (#) efter bearbetning.

Bild i full storlek

Med beaktande av den negativa effekten av H3PO4 på kapselmorfologin och den hårda behandlingen av SECs med syrahydrolys 10 infördes två ytterligare SEC-extraktionsmetoder. I en metod extraherades SEC med samma syrahydrolysmetod, men med HCl istället för H3PO4, som valdes baserat på dess cellulosadegraderbarhet 38 . Dessutom framställdes SEC genom en metanol med ljudbehandling som tidigare har föreslagits för känsliga pollenkorn 26 . I denna andra metod suspenderades pollenkorn i etanol och sonikerades två gånger med påfyllning av färsk etanol mellan sonikationsrundorna och tvättades sedan före ytterligare karakterisering. Morfologiska egenskaper hos de resulterande SEC: erna analyserades med SEM och CHN-elementanalys utfördes (fig. 2). SEM-bilder av SECs framställda med de två sura hydrolysmetoderna med användning av H3PO4 och HCl visade båda buckling och allmän strukturell instabilitet. En stor andel av kapslarna observerades skadas vid bearbetning med alla syratyper. Vid högre förstoringsbilder avslöjades det att ytskräp vidhäftade till SEC-ytan efter HCl-hydrolys trots omfattande tvätt, medan H3P04-behandlade SEC visade minimala skräp (fig. S1). CHN-resultat bekräftade överlägsenheten av H3P04-behandling och registrerade 0, 68% kväveinnehåll i SEC jämfört med 2, 64% kväveinnehåll för HCl-behandlade SEC.

(a) Obearbetad Zea bestämmer pollen efter dehydrering, (b) SECs från 10 timmar syrahydrolys i 85% H3PO4, (c) SECs från 10 timmar HCl-hydrolys, och (d) SECs erhållna från etanol med sonikering. (e) Kemisk sammansättning analyseras med CHN-analys och rapporteras som medelvärden med standardavvikelse (n = 3). ** Proteininnehållet beräknas med den specifika Jones Factor som beskrivs med Kjeldahl-metoden 33 .

Bild i full storlek

Däremot avslöjade SEC: erna som extraherats från etanolbehandlingsbehandling ett slående unikt utseende jämfört med de syrahydrolyserade SEC: erna. Framför allt behöll SECs från etanol-sonikationsbehandlingen sina sfäriska strukturer med litet brott, men ändå med en mycket förvrängd yttopografi som saknade jämnheten i obearbetad pollen. En kondenserad kärnstruktur var synlig inom SECs tillsammans med endast begränsad knäckning. CHN-analys visade emellertid ingen märkbar förändring i den kemiska sammansättningen, vilket indikerar låg proteinavlägsnande effektivitet. Medan etanol-sonikationsmetoden är otillräcklig för att minska proteininnehållet gav den också bevis för att en intern bärstruktur kan bidra till att minska graden av kapselbrott. Från dessa experiment drar vi slutsatsen att syrahydrolys med H3PO4 är den mest lämpliga metoden att vidare undersöka på basis av att producera proteinfria kapslar.

Motiverat av potentialen att strukturellt förstärka kapslarna genom att fylla i det tomma hålrummet, antog vi att bevara en flytande miljö inuti kapseln skulle vara tillräcklig för att upprätthålla den sfäriska morfologin. I korthet extraherades Zea mays SEC med samma 10 timmars återflöde i 85 (vikt / volym)% H3PO4 vid 70 ° C, men tvättning utfördes genom dialys för att minimera tiden i luft eller under vakuum. Som ett resultat skulle de tomma kapslarna alltid vara i uppblåst tillstånd (se metoder för en detaljerad beskrivning). Efter det sista tvättsteget med etanol dialyserades SEC med avjoniserat vatten och hölls i vatten för lagring. För att undvika dehydratiseringsbehovet implementerades DIPA-analys istället för SEM för jämförande analys av de två typerna av SEC erhållna från det ursprungliga protokollet och det modifierade protokollet. Jämförande resultat indikerar att den sfäriska morfologin till stor del bevarades för de flesta partiklar, om än med några skadade partiklar kvar (Fig. S2). För att förbättra utbytet av morfologiskt konserverade partiklar testades också SEC-extraktioner med reducerade H3P04-syrakoncentrationer av 63, 5 (vikt / volym) eller 42, 5 (vikt / volym)%. De extraherade SEC: erna hölls hydratiserade för att bibehålla den sfäriska strukturen och de slutliga produkterna utvärderades med DIPA och CHN-analys såsom visas i fig. 3. SEC erhållna från 63, 5 (vikt / volym)% H3PO4 visade lovande resultat jämförbara till kvaliteten på SEC erhållna från 85 (vikt / volym)% H3P04 med beräknade proteinavlägsningseffektiviteter av 80, 3% respektive 85, 2%, medan den procentuella defekten förbättrades från 51, 4% till 37, 5%. SECs erhållna från 42, 5 (vikt / volym)% H 3 PO4-behandling minskade ytterligare förekomsten av defekta SECs till 29, 7% men detta tillstånd var otillräckligt för effektivt proteinavlägsnande.

De testade H3P04-koncentrationerna var 85 (vikt / volym)%, 63, 5 (vikt / volym)% och 42, 5 (vikt / volym)%. Morfologisk karaktärisering med dynamisk bildpartikelanalys (DIPA) (skalfält = 40 μm) (vänster). Proteinborttagningseffektivitet beräknat från CHN-analys och procentuell defekt beräknad från partikelspårning uttrycks av medelvärdet och standardavvikelsen (n = 3).

Bild i full storlek

Intressant nog såg flera intakta SEC-sekvenser från satsen 42, 5 (vikt / volym)% H3P04-hydrolys med "äggula" -liknande strukturer med täta färgade gränser (ungefär 65% av hela partiet) antingen fästa vid det yttre skiktet eller flytande löst i kaviteten i vilket de ogenomskinliga spåren koncentrerades (fig. S3). Liknande artefakter observerades också i en liten population av skadade partiklar som förblir delvis fästa vid det missfärgade exinet (fig. S3). Baserat på den nära likheten vid skuggning av obearbetad pollen och baserad på CHN-analys som antydde en ungefärlig 69% retention av det ursprungliga proteininnehållet, verkade kärnan vara ett koncentrat för den återstående sporoplasman medan de täta gränserna spekulerades för att vara den intin som skyddar kärna. Enligt Zhang et al. fullständig upplösning av cellulosa i H3P04 uppnås endast när syrakoncentrationen överstiger 81, 7 (vikt / volym)% medan reversibel svullnad förväntas i koncentrationer under 80 (vikt / volym)% 39 . Denna trend överensstämmer väl med vår observation av intakta intinlager i 42, 5 (vikt / volym)% H 3 PO 4- bearbetade SEC, medan det fanns fullständig upplösning vid högre syrakoncentrationer.

Genom att erkänna behovet av att ta bort tarmarna behandlades den allmänna mekanismen för SEC-extraktion som en tvåstegsprocess: först behandlades fullständig upplösning av tarmarna som det hastighetsbegränsande steget (Fig. S4), följt av avlägsnande av resten av sporoplasma för att erhålla en isolerad exinkapsel. För att tillgodose behoven för båda stegen bestämdes 85 (vikt / volym)% H 3 PO 4 som det mest lämpliga alternativet trots dess korrosivitet. För att förbättra behandlingsresultatet varierade vi därefter exponeringstiden för det sura hydrolyssteget. SECs framställdes med 85 (vikt / volym)% H3PO4 i 70 ° C och SEC-prover uppsamlades efter 1, 2, 5 och 5 timmars inkubation för DIPA och CHN-analys tillsammans med 10 timmars bearbetade SECs (fig 4). En progressiv ökning i procent defekt observerades med utökad exponeringstid, med en kraftig ökning, särskilt mellan 2, 5 och 5 timmar, från 9, 0% till 37, 3%. Under tiden verkade proteinavlägsnande effektiviteten av H3PO4 nå sin topp mellan 1 till 2, 5 timmar med ett ökat avlägsnande av det totala proteinet som steg från 19, 5% till 82, 1%. Noterbart uppvisade de 1 timme-behandlade SEC-värdena en liknande opaquitet som de 42, 5 (vikt / volym)% H3PO4-bearbetade SEC-enheterna, förutom de förstnämnda innehöll också en intakt intinring (fig 3 och 4). Att sätta observationerna i perspektiv, det hastighetsbegränsande steget för borttagning av tint krävde ungefär en timme, vilket framgår av frånvaron av intine i DIPA-bilderna och den plötsliga förbättringen av proteinavlägsnande effektiviteten efter den första timmen. De kommande 1, 5 timmarna tycktes vara tillräckliga för att avlägsna sporoplasma-bulk som indikeras av graden av proteinavlägsnande effektivitet. Vidare verkade den plötsliga ökningen av de defekta kapslarna sammanfalla med utarmningen av bulkinnehållet, vilket återigen betonar vikten av ett strukturellt stöd för att upprätthålla den intakta sfäriska morfologin hos Zea mays . Sammantaget stöder uppgifterna att 2, 5 timmars behandling i 85 (vikt / volym)% H3PO4 är optimal bland de testade förhållandena med endast 9% defekt och 82% proteinborttagningseffektivitet.

Proteinavlägsnande effektivitet erhållen från CHN-analys och procentuell defektmätning från partikelspårning uttrycks av medelvärdet och standardavvikelsen (n = 3). Det markerade avsnittet i diagrammet motsvarar det prickade SEC-behandlingsprotokollet som fastställs vara det optimala tillståndet för Zea mays SEC-beredning.

Bild i full storlek

För att ytterligare karakterisera denna optimala SEC-beredning genomfördes CSLM-avbildning och detekterade förändringen i autofluorescensintensitet i pollenresterna. Naturliga pollenpartiklar har tidigare rapporterats ge ut autofluorescens med våglängder som är organellspecifika enligt Pöhlker et al. 40 . De bearbetade SECs och obearbetade pollenkorn observerades under CLSM för att jämföra förändringen i sammansättning, som registrerats av skillnader i autofluorescensen. I CLSM-bilder av det obearbetade Zea- pollen, observerades en ljus fluorescens i de blå och gröna kanalerna i hela pollenkaviteten med ett litet utseende även i den röda kanalen (fig. 5a). När alla fluorescenskanaler slogs samman ovanpå mikroskopbilden för differentiell interferenskontrast (DIC), visualiserades en homogen blågrön fluorescerande pollenpartikel med relativt låg fluorescens runt gränserna. Tvärtom, CLSM-bilden av det optimerade SEC presenterade en intensiv fluorescens i de gröna och röda kanalerna medan den blå kanalen var svagt synlig (fig. 5b). Den sammanslagna bilden av kanalerna resulterade i en ljusgul eller orange fluorescens lokaliserad specifikt på pollenväggen. Sammantaget indikerar dessa resultat framgångsrikt godkännande av sporoplasmatiska material. Mikromeritisk analys med DIPA-mätningar utfördes också för att utvärdera morfologiska egenskaper inklusive diameter, aspektförhållande respektive cirkularitet (Fig. 5c). Som förväntat observerades en skillnad i diameter mellan obearbetade korn och bearbetade SECs, med en betydande ~ 20% storleksminskning från 80 μm till 64 μm i genomsnitt. Under tiden delade både obearbetad pollen och SECs samma fördelningsprofiler i aspektförhållande och cirkularitet koncentrerad vid spetsens höga ände vilket indikerar bevarandet av den ursprungliga sfäriska konformationen. Sammanfattningsvis var SEC-extraherade med 85 (vikt / volym)% H3PO4 under 2, 5 timmar tillräckligt fria från sporoplasmiska rester och i stort sett intakta medan de karakteristiska strukturella utseendet för de obearbetade kornen bibehölls. Dessutom kunde SEC: erna laddas med bovint serumalbumin som en modellförening och, viktigare, indikerade SEM-karakterisering att läkemedelsbelastning ger strukturellt stöd för att bevara den uppblåsta morfologin hos mikrokapslar även i uttorkat tillstånd (fig. S5).

(a) CLSM-detekterad autofluorescens av obearbetad Zea mays- pollen presenteras för de blå, gröna respektive röda kanalerna och slås sedan samman med motsvarande DIC-bild. (b) Autofluorescensdetektering av SEC uttrycks också i samma ordning för jämförelse. (c) Mikromeritik av både obearbetad pollen och SEC analyserade i tre kategorier för morfologi: diameter, bildförhållande och cirkularitet.

Bild i full storlek

För att ytterligare karakterisera de obearbetade och bearbetade proverna jämfördes högupplösta SEM-bilder av SEC: er med de obearbetade pollenkornen, särskilt med fokus på pollenväggens nyckelfunktioner (fig. 6). Efter schemat för det modifierade sura hydrolys-SEC-extraktionsprotokollet samlades för- och efterbehandlade prover, frystes fryst och sprickades för att erhålla tvärsnittsbilder av pollenväggarna (Fig. 6a). Det obearbetade pollenprovet avslöjade ett vaxartat överlag på utsidan och inre sidor av väggen, vilket gav ett övergripande smidigt utseende (fig 6b och S6). Efter att ha blivit utsatt för H3PO4-behandling avlägsnades innehållet som blockerar grobarhetsporen, vilket lämnade bakom huvudöppningen tillsammans med nanoporer över ytan (fig 6c och S6). Tvärsnittsvyen av den ~ 500 nm tjocka exinväggen visade högt definierade exina substrukturer inklusive det yttre tektumskiktet som pryddes av spinuler och det basala fotskiktet fäst vid tektum av pelare med ~ 50 nm diameter kollumeller. Nano-kanaler sågs också genom hela tektumskiktet, vilket gav det ett streckigt utseende (Fig. 6c). Sammantaget visar SEM-mikrografer effektiviteten av den optimala H 3 PO4-behandlingen för att avlägsna exogent skräp från väggytan samtidigt som alla viktiga strukturella egenskaper hos pollenväggen bevaras.

( a ) Schematisk illustration av SEC-extraktionsprocessen från pollen (vänster). Förändring i nyckelfunktioner från den obearbetade pollenpartikeln (I) till slutlig SEC (IV) observeras av SEM. (b) Spirande por och sektionsvy av Zea mays pollenvägg. (c) Spirningspor och snittvy av Zea mays SEC-väggen presenteras med märkta exinrum.

Bild i full storlek

Baserat på resultaten som erhållits i denna studie presenteras en omfattande översikt över steg involverade i extraktion av SEC från pollenkorn i fig. 7. Det hastighetsbegränsande steget, som medför fullständig upplösning av tarmarna, bestäms av H 3 PO4 syrakoncentration. Vid syrakoncentrationer under 80 (vikt / volym)% H3P04 förblir intinen intakt och skyddar en stor andel av sporoplasman från syran vilket resulterar i SECs med hög proteinretention. När syrahydrolys genomförs med 85 (vikt / volym)% H3PO4, är en timme tillräcklig för att uppnå fullständig upplösning av tennet. Nedbrytningen av sporoplasmen följer kort efter avlägsnandet av tarmarna, bulkinnehållet i det förra avlägsnas inom 2, 5 timmar. Ytterligare återloppskokning upp till tio timmar, vilket tidigare krävdes i det ursprungliga protokollet 36, 37, hade försumbar effekt för att förbättra renheten för SEC: erna och ökade andelen defekter negativt. Överlappningen i den kritiska punkten för ökningen av SEC-brytningshastigheter gentemot platån i proteinavlägsnande effektivitet (jfr Fig. 4) antyder att bulk-sporoplasmainnehållet hjälpte till att stabilisera SEC-strukturen före dess borttagning. Effekten av BSA-belastning på att bevara mikrokapselns strukturella integritet vid uttorkning stöder ytterligare denna uppfattning. Efter att ha förlorat detta strukturella stöd blir en progressiv förlust av intakta SECs oundvikliga. En fullständig kollaps i morfologin åtföljs av uttorkning som ytterligare bidrar till bristen på strukturellt stöd. Följaktligen fastställs 2, 5 timmars behandling med 85 (vikt / volym)% H3PO4 för att vara det optimala behandlingsschemat för Zea mays SEC-produktion baserat på de testade förhållandena. Vi vill också kommentera effektiviteten för proteinavlägsnande. While ~85% protein was removed from the SECs, there was a small remaining fraction based on the CHN analysis that should be considered in the context of in vivo applications and potential risk of allergenicity. In principle, the residual protein could affect the quality of drug loading although the preliminary BSA encapsulation data obtained in this study supports that the drug loading in the thin-walled pollen microcapsules is feasible and, in fact, beneficial. Looking forward, the addition of a benign surfactant treatment step may be considered among the possibilities to fully remove protein depending on the application need.

Intine dissolution is the rate-limiting step to obtain SECs but the use of corrosive acid increases the chance of rupture with increasing time. Dehydration causes the flattening of capsules, and in some cases, causes rupturing of the capsules. The dotted box (*) is recommended as the optimal condition for Zea mays extraction.

Bild i full storlek

Conclusions

To date, SEC extraction from pollen grains has been limited to thick-walled, rigid pollen grains. The fundamental problem limiting the use of thin-walled pollen has been the lack of rigid structure in the exine wall and, in turn, reliance on the intine and sporoplasm for structural support. With the disintegration of its internal counterpart and corrosive effects of the treatment conditions, the exine sheath becomes susceptible to extrinsic forces and fragile from the chemical treatment eventually leading to structural failure. The required dehydration step in the conventional protocol further destabilizes the structure, resulting in complete morphological loss.

Through the systematic approaches taken here, various factors involved in acid hydrolysis of natural Zea mays pollen grains were evaluated. Based on our findings, we have outlined a two-step model whereby SECs are produced starting with intine removal followed by sporoplasm removal, and the protocol was optimized to maintain particle morphology. The required dehydration step was also avoided in order to bypass the natural tendency of pollen walls to buckle when exposed to drying and to address the need for structural support to maintain the original shape of Zea mays pollen. Taking all matters into consideration, a reconstructed protocol is proposed for the extraction of Zea mays SECs which consists of a 2.5 hour reflux in 85 (w/v)% H 3 PO 4 followed by dialysis with a series of solvents for washing, and finally, storage in an aqueous suspension. Based on this approach, successful Zea mays SEC production is reported for the first time with an optimized SEC extraction protocol. This new protocol opens the door to investigating a wide range of previously unexplored pollen species, especially those with thin and fragile walls which are attractive candidates for aerosol drug delivery and possess more sensitive degradation behaviors that could be exploited for controlled release. Also, the identified effects of pollen folding during SEC production will be useful in significantly improving product quality regardless of the pollen species and can even be exploited for applications that require controlled cycling of dehydration-rehydration. Lastly, the prodigious and renewable abundance of Zea mays pollen worldwide brings great promise towards scaling up the methodologies reported in this work towards generating renewable supplies of natural microcapsules.

ytterligare information

How to cite this article : Park, JH et al. Inflated Sporopollenin Exine Capsules Obtained from Thin-Walled Pollen. Sci. Rep. 6, 28017; doi: 10.1038/srep28017 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.