Induktion av IgG-antikroppar med hög titer mot multipla leukemi-associerade antigener hos cml-patienter med kliniska svar på immunterapi med k562 / gvax | blodcancer journal

Induktion av IgG-antikroppar med hög titer mot multipla leukemi-associerade antigener hos cml-patienter med kliniska svar på immunterapi med k562 / gvax | blodcancer journal

Anonim

ämnen

  • Immunterapi mot cancer
  • Kronisk myeloid leukemi

Abstrakt

Förmågan att rikta myeloid leukemi med immunterapi skulle representera ett betydande terapeutiskt framsteg. Vi rapporterar här immunologisk analys av kliniska studier av primär och sekundärvaccination med K562 / GM-CSF-immunterapi hos vuxna kroniska myeloida leukemipatienter (CML-CP) med suboptimala svar på imatinib mesylat. Med hjälp av serologisk analys av rekombinanta cDNA-expressionsbibliotek av K562 med autologt vaccinerat patientserum har vi identifierat 12 nya kroniska myeloida leukemiförenade antigener (LAAs). Vi visar att kliniska svar efter K562 / GM-CSF-vaccination är förknippade med induktion av antikroppssvar med hög titer mot flera LAA: er. Vi observerar markant diskordanta mönster av baslinje- och inducerade antikroppssvar hos dessa identiskt vaccinerade patienter. Inget enda antigen identifierades i alla svar på vaccination. Vi visar att en ytterligare "booster" -vaccinationsserie kan ges säkert till de med otillräckliga svar på initial vaccination, och är förknippade med mer frekvent induktion av IgG-svar på antigener överuttryckta i K562-vaccin jämfört med primär CML-CP. Slutligen delade de med inducerade immunsvar på samma LAAs ofta HLA-subtyper och patienter med kliniska svar efter vaccination kände igen ett delvis delat men icke-identiskt spektrum av antigener; båda resultaten har potentiellt betydande konsekvenser för immunterapi mot cancervaccin.

Introduktion

Cancerimmunoterapi, i form av allogen stamcellstransplantation, har framgångsrikt använts för att behandla hematologiska maligniteter i> 40 år. 1 Den betydande toxiciteten och de logistiska utmaningarna i samband med denna behandling har emellertid motiverat sökandet efter säkrare och mer praktiska immunterapimodaliteter (granskad av Hourigan och Levitsky 2 ). Målstyrd cellterapi mot cancer har potentialen att vara mycket effektiv men kräver antingen förmågan att utföra ex vivo- förstärkning av endogena antitumorsvar 3 eller förkunskaper om optimala antigenmål för cancer. 4, 5 Dessa begränsningar av målinriktad adoptiv cellulär terapi, tillsammans med andra faktorer, gör vaccination 6 och / eller immun kontrollpunkt hämning 7, 8, 9 potentiellt attraktiva metoder för cancerimmunoterapi; tyvärr är dessa behandlingar för närvarande läkande hos endast en minoritet av de behandlade patienterna. Vår förståelse av de immunologiska grunden för dessa få observerade kliniska svar är fortfarande i sin barndom. 10

CML har transformerats under det senaste decenniet genom införandet av rationellt utformade tyrosinkinasinhibitorer (TKI) till en nästan kronisk sjukdom med en uppskattad medianöverlevnad från diagnos på> 20 år. 11 Det finns emellertid fortfarande betydande kliniska utmaningar, inklusive svårigheter med att följa behandlingen, biverkningar, kontraindikation under graviditet, utveckling av resistensmutationer och de betydande kostnaderna för hälsovård för att tillhandahålla potentiellt livslång terapi vid en sjukdom där prevalensen i USA förutsäges öka sexfaldigt från nivåerna före TKI år 2035. 12 Innan TKI: s tillkomst kom involverade de bästa tillgängliga behandlingarna för CML immunterapi, 13 antingen interferon 14 eller stamcellstransplantation. 15 CML är känt för att vara särskilt mottagligt för immunkontrollen. 16, 17, 18, 19 Detaljerad information om specificiteten för detta immunsvar mot CML har kommit från den serologiska screeningen av cDNA-expressionsbibliotek (SEREX) 20 i CML-patienter, 21, 22 inklusive patienter med återfall av CML efter SCT som uppnådde en fullständig eftergivande efter behandling med donatorlymfocytinfusion. 23 Slutligen är CML en klonal stamcellstörning med en karakteristisk kromosomal translokation som möjliggör mycket känslig detektion av minimal restsjukdom. 24 Alla dessa faktorer gör CML till en utmärkt modell för att undersöka de mekanismer som ligger till grund för kliniska svar på immunterapi i hematologiska maligniteter.

Peptidvaccinationsmetoder vid cancer har upprepade gånger visats vara säkra och kunna inducera anticancer-antigenimmunsvar; 2, 25, 26 kvarstår emellertid frågor angående klinisk effektivitet och användbarhet av leukemi-klonspecifik antigenidentifiering och patient HLA-specifik epitopvalidering. 27, 28 I ett försök att övervinna dessa begränsningar har en mängd helcellvaccinationsmetoder undersökts, inklusive användningen av de bestrålade allogena cancercellinjerna genetiskt modifierade för att uttrycka höga nivåer av immunmodulerande cytokin GM-CSF ('GVAX') . 29, 30, 31 Kliniska studier har genomförts med användning av denna vaccinplattform vid akut myeloid leukemi 32 och pankreas, 33 bröst, 34 prostata, 35 njurceller 36 och icke-småcells lungcancer. 37 Vi har tidigare rapporterat kliniska svar efter K562 / GVAX-vaccination hos 19 patienter med CML-CP med suboptimala svar på TKI-terapi. 38 I denna studie rapporterar vi utvecklingen av en ny variation av SEREX-metodiken (Quan-SEREX) som vi använder för att identifiera inducerade IgG-svar på leukemi-associerade antigener (LAA) associerade med kliniska svar efter vaccination med K562 / GVAX och för att kvantifiera förändringar i serumantikroppstitrar av leukemi-antigen-specifik immunitet över tid.

Resultat

Patientens egenskaper

Vi rapporterade tidigare egenskaperna och de kliniska resultaten för 19 individer som deltog i en inledande studie (J0345) av K562 / GVAX-vaccinimmunoterapi för CML-CP-patienter med en beständig mätbar sjukdom trots minst ett års imatinib-terapi. 38 Ett efterföljande kliniskt protokoll (J0625) registrerade 11 av dessa personer med suboptimala svar på den ursprungliga vaccinserien för en andra "booster" -serie av K562 / GVAX-vaccinationer. Ett övergripande schema för de två försöken, inklusive de tidpunkter som användes i denna studie för bedömning av leukemi-specifik immunitet, visas i figur 1.

Att erbjuda en serie "booster" -vaccinationer till de patienter som efter den första vaccinationsserien inte hade ett molekylärt svar eller som hade en initial molekylär remission följt av återkomst av mätbar sjukdom är baserat på antagandet att dessa patienter inte har tillräckligt anti-leukemiskt immunsvar för att orsaka utrotning av deras sjukdom. Medianåldern för patienter i J0625-boosterstudien var 60. Medeltiden mellan den sista vaccinationen på J0345 och den initiala vaccinationen mot protokoll J0625 var 111 veckor. Den genomsnittliga tiden på imatinib före initiering av boostervaccinationer var 279 veckor. Patienter som fick boostervaccinationer upplevde liknande lokala platsreaktioner som de gjorde när de fick den primära uppsättningen vacciner i pilotstudien. Inga biverkningar av grad 3 eller 4 noterades. Alla patienter förblev medicinskt stabila och tolererade boostervaccinationerna väl. Det är viktigt att 8 av de 11 uppnådde sina lägsta registrerade BCR – ABL RQ-PCR-nivåer efter boostervaccinationsserien; mediantiden till detta värde var 24 veckor. Två patienter blev fullständigt molekylärt negativa för BCR – ABL-transkriptet efter boostervaccinationsserien (tabell 1).

Full storlek bord

SEREX för upptäckt av leukemi-antigen

Serologisk analys av rekombinanta cDNA-expressionsbibliotek av humana tumörer med autologt serum (SEREX) har varit en exceptionellt kraftfull teknik för att upptäcka cancerantigen. 20, 21, 22, 23 Vi använde en modifierad flerstegsversion av denna teknik för att identifiera specificiteten hos inducerade anti-leukemisvar hos patienter med kliniska svar på cancervaccinbehandling. Vecka 12 efter vaccinationsserum från fem patienter som visade tydliga kliniska svar på initial K562 / GVAX-vaccinationsserie (försökspersoner 2, 4, 6, 9 och 18) 38 användes för att screena ett K562-cDNA-expressionsbibliotek som beskrivits på annat håll (material och metoder 23 39 ). Efter tre omgångar med sekventiell screening testades renade monoklonala kandidatkloner med användning av pre- och vecka 12 efter vaccinationsserum för att identifiera svar som inducerats eller förstärkts efter vaccination (figur 2a) och sågs i <20% av 19 testade givarsera. Dessa kloner hade sina cDNA-insatser sekvenserade (tabell 2) och användes i efterföljande kvantitativ bedömning. Två (RHAMM, DNAJA1) hade identifierats tidigare med användning av SEREX, som CML-antigen 21, 22 medan vi tror att de återstående 12 representerar nya LAA: er.

Image

Utveckling av en kvantitativ infraröd immunskärmningsanalys, Quan-SEREX. ( a ) Närvaron av antikroppar från patientserumprover mot kandidatantigenerna bedömdes i patientserum vid pre-vaccin och vecka 12 efter vaccinetidpunkt med användning av traditionell SEREX-teknik. Svaret bedöms vara "ingen förändring" (A, överst) om det inte finns någon skillnad mellan pre- och postvaccinproven, "ökat" (A, mitten) om det finns i både pre- och postvaccin sampel, men signalintensiteten ökas i postprovet, eller 'induceras' (A, botten) om signalen endast observeras i postvaccinprovet. ( b ) Kvantitativ dot blot-analys: Vart och ett av de 14 antigenerna såväl som kontroller (kodade i fagklonlysat) prövades i triplikat på en bakteriegräsmatta och inkuberades med ett IPTG-indränkt nitrocellulosamembran. Detta membran inkuberas därefter med patientserum vid 1: 200. Fagbindning till serum-IgG detekterades med infrarött märkt anti-humant IgG, och intensiteten för varje fläck motsvarande en speciell fagklon bestämdes såsom beskrivs i material och metoder. ( c ) Tröskelinställning: Densitet av normaliserade intensiteter för kandidatantigener bland 19 normala givarindivider. Klockformkurvan i svart solid linje visade den empiriska densiteten för normaliserade intensiteter, och den ungefärliga normala fördelningen visades i röd strecklinje. Korta vertikala remsor i botten indikerar rådata om normaliserade intensiteter. Gränsen sattes till 85: e percentilen av ungefärlig normalfördelning och indikerades i blå vertikal strecklinje. ( d ) Normaliserad intensitet bestämd med Quan-SEREX är ett surrogat för antikroppstiter: Boxplot med normaliserade intensiteter vid 1: 200 titrering med maximala utspädningsnivåer. Fagklonlysatet prickades på en uppsättning av fyra olika nitrocellulosamembran som senare bearbetades med fyra olika utspädningar (1: 200, 1: 3000, 1:10 000 och 1:30 000) av patientserum. Maximal utspädningsnivå definierades som den maximala titreringen där en fag betraktades som erkänd. <1: 200-rutan indikerade de fager som inte kunde identifieras i några titreringar. Normaliserad intensitet vid 1: 200 titrering undersöktes med en ökande trend med maximala utspädningsnivåer (korrelationskoefficient = 0, 86 baserat på Spearmans strategi).

Bild i full storlek

Full storlek bord

Quan-SEREX tillåter kvantitativ bedömning av inducerad immunitet

Direkt infraröd fluorescensavbildningsteknik möjliggör nu kvantitativ detektionsbedömning över ett brett dynamiskt område med mindre bakgrund jämfört med konventionella synliga kemiluminescensmetoder. 41 Infraröd bildskanning (Material och metoder, figur 2b) användes för att kvantifiera nivån av serumreaktivitet mot de 14 antigenen som identifierats med traditionell SEREX-metod. Sera från 19 normala friska givare användes först för att bestämma baslinjens prestandaegenskaper för denna teknik. Vi ungefärliga uppskattade bakgrundsfördelning av normaliserade intensiteter med en normal Gauss-densitet centrerad vid provmedian, och med standardavvikelse en uppskattning av standardavvikelsen på 0, 75 gånger interkvartilområdet för de normaliserade intensiteterna för de 19 normala individerna (figur 2c, röd streckad linje). Experimentellt härledda normaliserade intensiteter uppvisade en liknande klockformad kurva (figur 2c, svart solid linje) som i stort sett överensstämmer med frånvaron av igenkänning av leukemi-antigenfager hos dessa ovaccinerade friska donatorer. En detektionströskel vid 85: e percentilen (figur 2c, vertikal prickad linje) för den ungefärliga normaliserade intensitetsfördelningen (det vill säga 0, 083) valdes för att maximera känsligheten. Tillfällig avvikelse från förväntad distribution observerades över denna tröskel hos normala friska ej vaccinerade givare i överensstämmelse med sällsynta cirkulerande autoantikroppar. I detta tillvägagångssätt fastställdes tröskeln för antigenigenkänning baserat på de sammanlagda data för friska givarsvar på alla antigen; baserat på vår preliminära dataförsök är denna estimator ganska robust mot bakgrundsljud, ger fördelen med beräkningsfördelar och verkar generera jämförbara resultat jämfört med att sätta individuella trösklar för igenkänningen av varje antigen. God korrelation (korrelationskoefficient = 0, 86) observerades mellan genomsnittlig normaliserad intensitet och traditionell spädningstiter för serumantikroppar (figur 2d).

Minskad återstående tumörbörda efter K562 / GVAX-immunterapi är associerad med induktion av IgG-antikroppar med hög titer mot flera LAA: er

Fem patienter valdes ut för en initial upptäcktskohort baserat på deras otvetydigt minskande BCR / ABL-mRNA-transkriptnivåer (figur 3a) efter initial K562 / GVAX-vaccination. 38 Fyra av dessa fem kliniskt svarande patienter visade sig ha induktion av nya leukemi-associerade IgG-svar efter primärvaccination (figur 3b), och två av dessa fyra visade sig också ha en förstärkning av leukemi-antigen-IgG-antikroppsnivåer (figur 3) 3c). Totalt identifierades endast fem unika antigener från vår panel före K562 / GVAX-vaccination och svar på samma antigen sågs också i 5–15% av 19 friska, ej vaccinerade givare som testades (tabell 2). Efter vaccination inducerades emellertid svar på ett antigen (DNAJA1) hos alla fyra patienter, två patienter (6, 18) utvecklade nya IgG-antikroppar mot samma tre antigener (DNAJA1, RPS23 och RHOX) och två patienter (6, 9) gjorde ett nytt svar på det väl beskrivna leukemi-antigenet RHAMM. 22, 42, 43 Totalt detekterades respons efter vaccination i 12 unika LAA hos de fyra patienterna (13 nya inducerade svar plus 3 förstärkta svar). Den högsta titern noterades vid veckan 6–12 tidpunkter i överensstämmelse med ett svar på vaccination. En större mångfald av antigener observerades erkännas av IgG vid tidig postvaccination (figur 3b), även om IgG-titrar mot vissa antigener var förhöjda i över ett år efter vaccination (figur 3c och 4).

Image

Kliniska svarare på K562 / GVAX-vaccination ger nya IgG-svar med hög titer på ett brett spektrum av LAA: er. ( a ) Restbelastning av CML-sjukdomen, bestämd med BCR – ABL-värden, bestämd med RQ-PCR från patientens PBMC-mRNA före och efter vaccination (vertikal streckad linje representerar primär J0345-vaccinationsserie). ( b ) Antal LAA som erkänts av serum IgG hos varje patient före ('pre') och efter primärvaccination (tid på x- axeln i dagar). ( c ) Kvantitativ mätning av LAA-specifikt serum IgG. Maximal "titer" av inducerade svar observerades mellan dag 42 och 84 tidpunkter (det vill säga 6–12 veckor). Normaliserad intensitet är färgkodad (nedre detektionsgräns, 0, 083 i mörkblått, maximalt i rött) enligt skalan i figur 4a.

Bild i full storlek

Image

Avvikande mönster av inducerad antikroppssvar hos identiskt vaccinerade patienter. ( a ) Färgkod för värmekartan med normaliserad intensitet (∼ titer) från mörkblå (minimi / tröskel för detektering) till ljusröd (maximal, lika eller högre än nivån sett för positiv kontroll). Antigener som inte är igenkända vid tidpunkten kodas i grått, saknade prover kodas i vitt. ( b ) Normal givarreaktivitet mot LAA: s kandidat. Tröskelvärden för detektion fastställdes till 85% av normal givardistribution för att begränsa falska positiva resultat i patientdatasatsen. Såsom förutses av detta, observerades experimentellt normal IgG-reaktivitet gentemot dessa 14 upptäckta LAA: s sällsynta, och när svar var närvarande var de låg titer. ( c ) Normaliserad intensitetsvärmekarta för CML-patientens LAA-specifika IgG-svar före och efter både primär och sekundär vaccination. Alla patienter fick identisk K562 / GVAX-helcellcellvaccinprodukt vid identiska tidpunkter men uppvisade markant divergerande svar.

Bild i full storlek

Mycket individualiserade mönster av inducerade serologiska svar observerade hos identiskt vaccinerade patienter

Denna analys utvidgades till de återstående 14 av 19 patienter i den ursprungliga ("primära") vaccinationsstudien och till de efterföljande tidpunktproverna i delmängden av 11 patienter som erbjöds en ytterligare serie vaccinationer ("boost") på grund av ett suboptimalt kliniskt svar på den ursprungliga vaccinationsserien (figur 1). Efter den första vaccinationsserien svarade var och en av de återstående 14 individuella patienterna till mellan 0 och 3 antigener (median: 1). Detta jämfört med en median av 4 antigener (intervall 0–7) erkänd i upptäcktskohorten som bestod av de fem patienterna som gjorde ett entydigt kliniskt svar efter vaccination (figur 3 och 4).

Det inducerade IgG-antikroppssvaret på vaccination hos dessa 19 identiskt vaccinerade patienter var extremt heterogent (figur 4). Två breda mönster av antigenspecifik IgG-induktion noterades; i det första mönstret sågs svar hos flera patienter även efter en primär vaccinserie och antalet patienter som svarade förändrades inte väsentligt efter en sekundär vaccinationsserie "boost" (till exempel DNAJA1). I det andra mönstret verkade den andra "boost" -vaccinationen öka antalet patienter som gjorde ett nytt IgG-svar på ett antigen (till exempel RHOXF2B, HBG2 och CDC25C). Vi ansåg att detta berodde på redan existerande immunologiskt minne mot den tidigare antigenklassen (från patientens egen tidigare exponering för autolog CML) och att uttrycket av den senare klassen av "sena" antigener skulle vara högre i K562-cellinjen, från vilken vaccinprodukten härleddes än i primär CML-CP. Vi noterar att mRNA-uttrycket av RHOXF2B (4/19 svar i primär vs 7/11 i boost), HBG (inga svarare efter 12 veckor efter primärvaccinationsserie, 2 svar vid senare tidpunkter) och CDC25C (1 responder post- primär, 3 svarare efter boost) var alla överuttryckta (5-40 gånger) i K562 jämfört med primära CML-CP-celler (figur 5). Slutligen, överraskande, trots användning av en helcellsvaccinationsmetod, kan en del av mångfalden som observeras i svar bero på HLA-begränsning. Patienter som gör IgG-svar på samma antigen (er) efter vaccination delade ofta flera HLA-alleler (figur 6).

Image

Förhållande mellan antigen-mRNA-expressionsnivåer i CML och K562 till tidpunkten för utveckling av IgG-antikroppssvar. Sekundär "booster" -vaccination kunde framkalla IgG LAA-svar hos patienter som inte svarade på det antigenet efter den första vaccinationsserien. Figuren visar procentandel av patienter som gör LAA-specifika IgG-svar före och efter antingen den första vaccinationsserien ( n = 19 patienter, ( a ) topppanelen) eller boostervaccinationsserien ( n = 11 patienter, ( b ) mellanpanelen). Antalet normala givare (ND; n = 19) som svarar på samma antigen visas för jämförelse i båda panelerna. Antigener som vanligtvis känns igen av patienter efter en sekundär "boost" -vaccinationsserie (CDC25C, RHOXF2, HBG2 och RHAMM) har högre nivåer av mRNA-uttryck i K562 (visat som vikuttryck över medeluttrycket i 8 normala givarprover) jämfört med nivåer i perifera blodnivåer från åtta ND eller åtta patienter med kronisk (CP) eller accelererad (AP) fas CML ( c ) nedre panel).

Bild i full storlek

Image

Roll av patientens HLA-typ vid definition av LAA IgG-svar på K562 / GVAX-helcellsvaccinimmoterapi. Molekylär HLA-typ erhölls från Clinical Immunogenetics Laboratory vid Johns Hopkins University School of Medicine. Variationen inom patienten i de inducerade IgG-responsen efter vaccination med en identisk K562 / GVAX-helcellvaccinprodukt verkar troligen inte bara på grund av tidigare antigenupplevelse och immunologiskt minne utan också på HLA-skillnader mellan patienter. Tre exempel belyses i figuren ovan; två kliniska svarare svarade på tre av samma antigen (DNAJA1, RPS23 och RHOX). Dessa patienter delade både klass I (HLA-A * 0301) och klass II-alleler (DRB * 1501) i sin HLA-haplotyp. Dessutom svarade 7 av de 19 patienterna i denna studie på RHAMM. Alla hade DRB15 och DQB * 0602-alleler i sin haplotyp; Faktum är att 7 av 8 patienter med DRB15 och 7 av 7 patienter med DQB * 0602 i denna studie svarade på RHAMM. Slutligen gav endast två patienter ett initialt svar på antigenet HN1L. De delade en nästan identisk HLA-haplotyp (HLA-A * 0101, HLA-C * 04KBG, HLA-B * 035, HLA-DRB * 0301 och HLA-DRQ * 0201). Ingen annan patient i studien hade denna haplotyp.

Bild i full storlek

Diskussion

Även om många LAA har rapporterats är 2, 44, 45, 46 mindre kända om sambandet mellan inducerad immunitet mot dessa antigener och framgångsrika kliniska svar på immunterapi. 23, 47 Med tanke på utmaningarna när det gäller att identifiera de optimala LAA som behövs för att inducera ett kliniskt svar, svårigheterna att definiera och validera individuella peptidepitoper, önskan att inte begränsa immunoterapitillgänglighet för individer med en viss HLA-typ och de betydande tid- och resurskostnaderna Patientanpassade autologa 48 eller matchade allogena 49 cellulära produkter, antog vi istället en helcellsvaccinationsstrategi i ett försök att leverera ett universellt CML-vaccin. Vi visar här att CML-patienter med sjunkande belastning av leukemissjukdomar efter vaccination med denna K562 / GVAX-immunterapi utvecklar nya leukemispecifika immunsvar som inte finns i dessa patienter före vaccination eller hos friska donatorer.

Det finns flera begränsningar för denna studie. Först undersökte vi endast en del av immunsvaret - inducerade eller förstärkta IgG-antikroppssvar mot LAA: er; framtida arbete kommer att koncentreras på andra antikroppsklasser och T-cell-svar. För det andra tillåter inte denna hypotesgenererande pilotstudie statistiska korrelationer mellan kliniska svar, inducerade immunsvar och / eller patientkarakteristika. För det tredje hade patienterna i denna studie endast låga nivåer av CML-sjukdomsbörda, vilket krävde att vårt SEREX cDNA-upptäcktsbibliotek härstammar från vaccinet K562-cellinjen snarare än autolog tumör och våra genuttrycksstudier använder CML-CP erhållet från tredje part. Planerade studier om upptäckt av myeloid leukemi antigen vid akut myeloid leukemi där sjukdomsbördan vid studieregistrering är högre kommer att adressera båda dessa begränsningar. Slutligen, i överensstämmelse med tidigare SEREX-arbete, användes ett bakteriesystem för antigenuttryck, vilket potentiellt resulterade i falska negativa resultat på grund av prokaryota glykosyleringsmönster. Framtida arbete (LQ, HIL) kommer att försöka utveckla en SEREX-variant som använder en eukaryotisk expressionsplattform.

Den höga mångfalden av inducerade svar som observerats i denna studie kan informera framtida vaccinationsstrategier vid cancerimmunoterapi. Noterbart var inget antigen universellt associerat med IgG-immunsvar hos alla CML-patienter antingen vid baslinjen eller efter vaccination med ett identiskt helcellvaccin. Efter den inledande vaccinationsserien svarade 13 av 19 patienter på ett enda antigen (DNAJA1), men detta var atypiskt med de flesta antigen som i genomsnitt erkändes av 2 av 19 patienter (11, 35%).

Hos de 11 patienterna som hade en andra serie boostervaccinationer framkallade två antigener (DNAJA1 och RHOX) IgG-immunsvar hos 7 av 11 patienter, varvid varje antigen testades erkändes av 3 eller 4 patienter (31%) i genomsnitt. Dessa antigener, tillsammans med RHAMM, stod för huvuddelen av nya inducerade IgG-svar sett efter primära (22 av 28 nya svar sett hos 19 patienter) och sekundära (19 av 28 nya svar sett hos 11 patienter) K562 / GVAX-vaccinationsserier.

DNAJA1 (även känd som HSJ 2, värmechock 40-kd protein 4 eller dnaJ homolog subfamily A-medlem 1) identifierades först 1993 50 och är nu känt för att ha en viktig och mycket bevarad roll i det molekylära chaperonsystemet för proteinfoldning, utbredning och nedbrytning, fungerar som den primära samkaparen för den konstitutivt uttryckta Hsp70-varianten, Hsc70. 51 Intressant nog har överuttryck av Hsp70 visat sig ha samband med resistens mot imatinib i CML. 52 autoantikroppar mot HSP: er och molekylära chaperoner har beskrivits både i friska och autoimmuna sjukdomstillstånd. 53 Anti-DNAJA1-antikroppssvar har hittats med användning av SEREX-screening av patientsera mot autologa tumör-cDNA-bibliotek hos patienter med hepatocellulärt karcinom, 54 skivepitelcancer i huvudet och halsen 55 och i opublicerat arbete deponerat i Cancer Immunome Database 56 från lunga, prostatacancer och koloncancerpatienter. Svar på DNAJA1 (och andra chaperonmolekyler) har också tidigare beskrivits i CML-patienter av Greiner et al. 22, med användning av SEREX och ett K562 cDNA-bibliotek, där 3 av 10 CML-patienter testade men ingen av 19 obehandlade AML-patienter och ingen av 20 friska frivilliga hade anti-DNAJA1 IgG-svar. Som jämförelse, i vår studie hade endast en enda frisk givare (av 19 testade) och inga CML-patienter före vaccination (av 18 testade) detekterbara IgG-svar på DNAJA1; emellertid utvecklade ungefär två tredjedelar av patienterna anti-DNAJA1 IgG-svar efter K562 / GVAX-vaccination (figur 5), inklusive alla fyra av de kliniska respondenterna med ett inducerat antikroppssvar efter vaccination.

RHOXF2B (även känd som RHOX homeobox familjemedlem 2B) är en del av familjen i det X-länkade RHOX homeobox genklusteret som är en viktig epigenetiskt reglerad komponent i transkriptionell reglering av normal utveckling och reproduktion. 57 RHOXF2B befanns uttryckas i normal mänsklig testisvävnad och en koloncancercellinje och kunde induceras genom decitabin demetyleringsterapi i en human bröstcancercellinje. 57 I vår studie var RHOXF2B ∼ 100-faldigt överuttryckt i K562-cellinjen jämfört med normala givare eller patienter med kronisk fas eller accelererad fas CML (figur 5). RHOXF2B känns inte igen av IgG-antikroppar från sera hos normala givare eller CML-patienter före vaccination men igenkändes efter primära (4 av 19 patienter) och sekundära vaccinationsserier (figur 4). RHOXF2B tycks därför representera ett nytt, immunogent och målinriktat cancer-testisantigen.

Slutligen är RHAMM (även känd som HMMR, Hyaluronan-medierad motilitetsreceptor, CD168; IHABP) ett väl karakteriserat CML-associerat leukemi-antigen. 21 Tidigare arbete visade serumspecificitet för detta antigen hos 5 av 16 testade CML-patienter. 21, 22 I denna studie av 19 behandlade CML-patienter med minimal restsjukdom visade ingen IgG-reaktivitet mot RHAMM vid baslinjen; emellertid svarade totalt 7 patienter efter vaccination (5 efter primärvaccination och ytterligare 2 efter sekundärvaccination).

Av de nio antigenen som igenkänts endast efter vaccination (tabell 1) är endast två membranbundna (RHAMM och DNAJA1), fem är övervägande cytoplasmisk (HBG2, EEF1G, RPS23, USP33 och MTHFD2) och två finns i kärnan (REPIN1 och RHOXF2B). När det gäller funktion är fyra involverade i transkriptionsreglering (RPS23, EEF1G och RHOXF2B) eller kontroll av replikering (REPIN1) och två är cytosoliska enzymer (MTHFD2 och USP33). Inget enda antigen framkallade inducerade eller förstärkta IgG-svar varken hos alla patienter eller i undergruppen av patienter som har ett kliniskt svar efter vaccination.

Vi har tidigare visat att helcellvaccination med en K562 / GVAX-produkt kan leda till kliniska svar hos patienter med kvarvarande CML efter suboptimala svar på TKI-terapi. 38 I denna studie demonstrerar vi att sådan vaccination är förknippad med ett mycket varierat mönster av inducerade IgG-svar på ett brett och överlappande, men icke-identiskt, spektrum av LAA, varav 12 beskrivs för första gången här. Kliniska svarare kunde generera svar med hög titer på flera antigener, och de inducerade svaren var ofta långvariga. Vi visade dessutom att en sekundär K562 / GM-CSF helcellvaccinationsserie, som ges i genomsnitt över 2 år efter den primära vaccinationsserien verkar säker, väl tolererad och var kliniskt associerad med de lägsta observerade BCR / ABL-transkriptnivåerna i 8 av 11 patienter inklusive två som blev molekylärt odetekterbara. Denna "booster" -serie kunde inte bara framkalla och förstärka antigenspecifika immunsvar hos tidigare svarare utan också inducera antigenspecifika IgG-svar hos de patienter som inte svarade på primärvaccination (figur 4), särskilt för de antigen med högre nivåer av uttryck i vaccin än primär tumör (figur 5). Slutligen delade patienter som gör IgG-svar på samma antigen ofta en del av eller hela sin HLA-haplotype (figur 6), en överraskande observation i denna helcellvaccinstrategi. Vi tror att detta är den första beskrivningen av detta fenomen i helcellvaccination och / eller cancervaccin. Det finns emellertid presedens för inducerade antikroppssvar som gynnas av patienter med vissa distinkta HLA-alleler, med bevis från studier av vaccination mot hepatit B, 58 rubella 59 och HIV. 60 Om detta observerade förhållande fastställs vara statistiskt meningsfullt i efterföljande arbete, bör framtida studier syfta till att belysa om detta representerar en direkt effekt av förändrad MHC-klass II-presentation och bristfälliga T-celler hjälper till att inducera humoral immunitet, en indirekt effekt genom koppling ojämvikt med tillhörande gener (såsom MHC-klass III-regionen) eller en annan mekanism som återstår att bestämma. Sammanfattningsvis kan dessa fynd ha konsekvenser för framtida tillvägagångssätt mot immunterapi mot cancer, särskilt de som försöker rikta in sig mot ett enda antigen eller leverera en form av universellt vaccin.

FÖRETAGSBIDRAG

LQ, NKY, PHN, MM, JF, YLK, MG utförde forskning; HLT och GLR utförde statistisk analys; GTP och BDS samlade in data; HIL designade forskning, analyserade och tolkade data; CSH utförde forskning, analyserade och tolkade uppgifterna och skrev manuskriptet.