Nedsatt antiviralt cytokinrespons av nk-celler mot influensavirus hos nyfödda nyfödda barn under graviditet | cellulär & molekylär immunologi

Nedsatt antiviralt cytokinrespons av nk-celler mot influensavirus hos nyfödda nyfödda barn under graviditet | cellulär & molekylär immunologi

Anonim

Abstrakt

De nyfödda, särskilt små för graviditetsåldern (SGA), är mottagliga för olika mikrobiella infektioner. Naturliga mördare (NK) -celler är kritiska komponenter i värdets medfödda immunitetssystem och huvudkällan för de inflammatoriska cytokinerna, som ger kritiskt skydd under den tidiga fasen av virusinfektioner innan utvecklingen av ett lämpligt adaptivt immunsvar. Emellertid är lite känt om de antivirala effekterna av NK-celler hos nyfödda, särskilt SGA-populationen. Nedan genomfördes en prospektiv beskrivande studie för att bestämma skillnaderna i NK-cellimmunitet bland vuxna, lämplig för graviditetsålder (AGA) och SGA-nyfödda. Vuxna har mycket högre NK-cellantal i perifert blod än det i navelsträngsblod från nyfödda. Som svar på stimulans av influensavirus uttryckte neonatala N-celler, speciellt SGA-babyceller, signifikant lägre antivirala cytokiner inklusive perforin-, interferon- (IFN) -y- och tumörnekrosfaktorrespons (TNF) -a-svar än vuxna NK-celler. Dessutom korrelerades de antivirala cytokinsvaren från NK-celler positivt med neonatal födelsevikt. Våra data antydde att den deprimerade antivirala aktiviteten och mindre frekvens av NK-celler troligen kommer att vara ansvarig för den höga känsligheten för mikrobiell infektion hos nyfödda, åtminstone delvis. Att förbättra medfödd immunitet kan ge ett nytt sätt att försvara virusinfektion.

Introduktion

Infektion har stort bidrag till perinatal dödlighet och morbiditet hos nyfödda, särskilt små-för-graviditetsålder (SGA). 1 Känsligheten för olika infektioner tros orsakas av den medfödda immuniteten som är beroende av graviditetsålder och födelsevikt. 2, 3 Det medfödda immunsystemet har ett effektivt antiviralt svar i det tidiga livet, vilket inkluderar monocyter, fagocyter, naturliga mördare (NK) -celler, Vy9Vδ2-T-celler och andra igenkännings- och effektorelement. 4 NK-celler är viktiga effektorceller i den medfödda immuniteten, som spelar en kritisk roll i den första raden för värdförsvar mot akuta virusinfektioner genom att direkt döda infekterade celler och hämma virusreplikation genom utsöndring av antivirala cytokiner. 5, 6

NK-celler är i stort sett reaktiva mot olika slags virus, såsom influensavirus, herpesvirus, hepatit B-virus och Marburg-virus, vilket indikerar en generell roll för cellerna i antiviralt immunsvar. 6, 7, 8 Antiviralt cytokinuttryck är en huvudmekanism för att hämma virusreplikation och eliminera virus. Tidigare studier har visat att NK-celler från perifert blod hade uppenbar utsöndring av interferon (IFN) -y och tumörnekrosfaktor (TNF) -a mot virus men låg respons i nyfödda nyfödda barn med lämplig för graviditet (AGA). 9, 10, 11, 12, 13 Det är emellertid lite känt om den antivirala funktionen hos NK-celler i SGA-nyfödda, varken om förhållandet mellan NK-cellfunktion och neonatal födelsevikt.

I denna studie undersökte vi antiviralt svar från NK-celler i navelsträngsblod. Det visade sig att som svar på stimulans av influensavirus uttryckte NK-celler av SGA-nyfödda mycket lägre antivirala cytokiner än vuxna NK-celler. En positiv korrelation mellan neonatal födelsevikt och antiviral cytokinuttryck av NK-celler indikerades.

Material och metoder

ämnen

Ledarblodet samlades in vid avdelningen för neonatologi, avdelningen för pediatrik, andra sjukhuset vid Sichuan University, från januari 2010 till mars 2012. Det informerade medgivandet erhölls från föräldrarna till de nyfödda. Det perifera blodet samlades upp från friska vuxna frivilliga samtidigt. Forskningsprotokollet godkändes av Institutional Review Board vid University of Sichuan University. Detaljerad information och kliniska särdrag hos de rekryterade försökspersonerna erhölls om allmänna sociodemografiska vanor (utbildning, äktenskaplig status, moders ålder), personliga egenskaper (vikt, huvudomkrets, intag av vitamin A / D), gynekologisk och obstetrisk historia och rökförbrukning i graviditet. Inget tecken på nöd, infektion under intrauterint liv eller uppenbara medfödda avvikelser visades. Alla blodprover samlades in i natriumheparinrör.

Cellberedning och influensavirusstimulering

Mononukleära celler i perifera blod (PBMC) och mononukleära celler i navelsträngsblod isolerades med Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Sverige) gradientcentrifugering som vi beskrev tidigare. 14 Mänskligt influensa A-virus, A / PR / 8/34 tillhandahöll vänligt av Institutionen för mikrobiologi, West China School of Prelinical and Forensic Medicine, Sichuan University, och odlades i njurcellerna Madin – Darby. Virustitern bestämdes genom daglig observation av cytopatisk effekt, och den mediana vävnadskulturinfektionsdosen (TCID50) beräknades enligt Reed – Muench-formeln. PBMC: er eller CBMC: er av samma antal infekterades med influensa A-virus vid ett infektionsmångfald (MOI) av 2 och odlades i RPMI-1640-media kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) sattes till en slutkoncentration av 10 | ig / ml 4 timmar före slutet av kulturen. Celler och supernatanter uppsamlades sedan efter 24 timmars kultur, och perforin-, IFN-y- och TNF-a-utsöndrande celler undersöktes genom intracellulär cytokinfärgning som vi beskrev tidigare. 15

Cytometrisk pärlgruppsanalys

PBMC: er eller CBMC: er infekterades med influensa A-virus vid ett infektionsmångfald (MOI) av 2 och odlades i RPMI-1640-media kompletterat med 10% fetalt bovint serum under 24 timmar. Odlingssupernatanterna uppsamlades och koncentrationer av cytokin (TNF-a och IFN-y) mättes med användning av cytometrisk pärlgrupp (Becton & Dickinson, New Jersey, USA), såsom vi beskrev tidigare. 16 Data erhölls genom flödescytometri och analyserades med cytometrisk pärluppsättningsprogramvara. Standardkurvor för varje cytokin genererades för att beräkna deras koncentration i de testade proverna.

Flödescytometrisk analys

Celler färgades för cellytemarkörer med följande antikroppar: mus anti-human CD56-PE för att identifiera NK-celler. I vissa experiment fixerades cellerna ytterligare med lysbuffert (eBioscience, Kalifornien, USA) under 30 minuter, permeabiliserades med permeabiliseringsbuffert (eBioscience, Kalifornien, USA) under 30 minuter och färgades sedan med anti-human Perforin-FITC, anti- human TNF-a-APC och anti-human IFN-y-PE-Cy7 (BD Biosciences, New Jersey, USA) som vi gjorde tidigare. 17 Alla prover förvärvades på en Gallios (Beckman Coulter, Kalifornien, USA) och analyserades av FlowJo-programvaran (version 7.6.5; Tree Star, Kalifornien, USA). Framåt spridning och sidospridning användes för att indentifiera lymfocyter, som vidare användes för att definiera NK-celler och intracellulära uttryck av perforin, TNF-a och INF-y.

Statistisk analys

Data uttrycktes som medel ± standardfel. Skillnader mellan de normala och stimulerade cellerna analyserades med parade t- tester. ANOVA-test användes för att jämföra de olika vikskillnaderna mellan grupperna. Pearson r- test användes för att uppskatta sambandet mellan födelsevikt och NK-svar. P <0, 05 ansågs vara signifikant.

Resultat

De kliniska proverna

Totalt 41 nyfödda och 17 friska vuxna (PB) registrerades i denna studie. Det fanns 20 SGA-barn (term och nära sikt> 35-veckors graviditet, födelsevikt i den lägsta 10-procentiga) spädbarn och 21 AGA-barn. Tabell 1 presenterar beskrivande statistik över mödrar och faderliga variabler beaktade i denna undersökning. Baserat på urvalskriterierna var medel för födelsevikt och huvudomkrets signifikant lägre i SGA-nyfödda, jämfört med AGA-nyfödda. Mellan de två grupperna var det en markant skillnad i mödrarnas ålder. Mödrarna till AGA-nyfödda uppvisade mer adekvat prenatal vård och tillräcklig applicering av vitamin A / D. Rökningsstatus och graviditetsinducerad hypertoni var mer frekvent i SGA gravid grupp än dessa i AGA gravid grupp ( P <0, 05). Könsfördelningen, Apgar-poängen och föräldrarnas utbildningsnivåer mellan SGA och AGA-nyfödda var jämförbara (tabell 1).

Full storlek bord

Nedsatt antiviral cytokinproduktion av CBMC från SGA-nyfödda

Efter det att PBMC och CBMC stimulerades med influensavirus under 24 timmar, samlades supernatanterna och undersöktes med avseende på antiviralt cytokinuttryck. Som visas i figur la, i SGA-nyfödda, var IFN-y-koncentrationen (121, 63 ± 5, 56 pg / ml) signifikant lägre än i AGA (276, 66 ± 10, 97 pg / ml) och vuxen (542, 91 ± 40, 19 pg / ml). TNF-a-produktionen i SGA 192, 37 ± 8, 81 pg / ml och AGA (215, 05 ± 12, 33 pg / ml) nyfödda var jämförbar, men båda var mycket lägre än den som producerades hos vuxna (375, 58 ± 17, 95 pg / ml) (figur 1b ).

Nedsatt antiviral cytokinproduktion av CBMC från SGA-nyfödda. Vuxna PBMC och neonatal CBMC infekterades med influensa A-virus vid en MOI på 2 i 24 timmar. Kultursupernatanterna uppsamlades och undersöktes med avseende på uttryck av IFN-y ( a ) och TNF-a ( b ). Data som visas är enstaka värde för varje punkt i scatter-plot. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 0001. CBMC, mononukleär cell i navelsträngsblod; IFN, interferon; PBMC, peronal blodmononukleär cell; MOI, infektionsmångfald; SGA, liten för graviditetsålder; AGA, lämplig för graviditetsålder; TNF, tumornekrosfaktor.

Bild i full storlek

Lägre procentandel vilande NK-celler och mindre frekvens av perforinuttryck i SGA-nyfödda

För att bestämma den möjliga orsaken till den lägre koncentrationen av de antivirala cytokinerna i supernatanter undersökte vi först mängden vilande NK-celler i de totala lymfocyterna i olika grupper genom flödescytometri. De nyfödda hade lägre andel NK-celler i blodet än vuxna. Perforinuttrycket i vilande NK-celler var också signifikant högre hos vuxna än hos AGA- eller SGA-nyfödda. Det fanns inga skillnader mellan AGA- och SGA-nyfödda i termer av procentandelarna av vilande NK-celler och deras perforinuttryck (figur 2a och b). Vidare var uttryck av antivirala cytokiner IFN-y och TNF-a i vilande NK-celler jämförbara bland dessa tre grupper (figur 2c och d).

Mindre frekvens och perforinuttryck av vilande NK-celler i SGA-nyfödda. ( a ) Procentandelen NK-celler inom lymfocyter bestämdes med flödescytometri. ( b - d ) De intracellulära uttrycka av perforin, IFN-y och TNF-a i vilande NK-celler av AGA ( n = 13), SGA ( n = 13) nyfödda och vuxna ( n = 17) undersöktes med flödescytometri. Data uttrycks som medelvärde ± sem * P <0, 05; *** P <0, 0001. AGA, lämplig för graviditetsålder; IFN, interferon; NK, naturlig mördare; SGA, liten för graviditetsålder; TNF, tumornekrosfaktor.

Bild i full storlek

Minskat cytolytiskt granuluttryck i NK-celler från SGA-nyfödda vid stimulans av influensavirus

För att bestämma det cytolytiska granuluttrycket av NK-celler vid influensavirusstimulering stimulerades CBMC och PBMC med influensa H1N1-virus, och perforinuttrycket i NK-celler analyserades med FACS. Såsom visas i figur 3a och c ökade influensaviruset signifikant perforinuttryck i NK-celler från alla vuxna, AGA- och SGA-nyfödda. Den ökade vikningen av perforin i SGA-nyfödda var emellertid signifikant lägre än hos både vuxna och AGA-nyfödda efter stimulans av influensavirus (figur 3b).

Minskat cytolytiskt granuluttryck i NK-celler från SGA-nyfödda vid stimulans av influensavirus. Individuella CBMC: er från AGA ( n = 20), SGA ( n = 18) nyfödda eller vuxna ( n = 17) inkuberades med influensa H1N1 PR / 8virus vid en MOI på 2 i 24 timmar. Det intracellulära uttrycket av perforin i NK-celler undersöktes med flödescytometri ( a ). Vikningsökning relativt håna beräknades också ( b ). ( c ) Ett representativt flödesdiagram för perforinuttryckning inom NK-celler visades. Data uttrycks som medelvärde ± sem * P <0, 05; *** P <0, 0001. AGA, lämplig för graviditetsålder; CBMC, mononukleär cell i navelsträngsblod; IFN, interferon; MOI, infektionsmångfald; NK, naturlig mördare; SGA, liten för graviditetsålder; TNF, tumornekrosfaktor.

Bild i full storlek

Minskat antiviralt cytokinrespons i NK-celler från SGA-nyfödda vid stimulans av influensavirus

Vi bestämde vidare IFN-y- och TNF-a-svar från NK-celler inducerade av influensavirusstimulering. Efter 24 timmars stimulering förbättrades uttryck av IFN-y och TNF-a signifikant i NK-celler hos alla vuxna, AGA- och SGA-nyfödda (figur 4a c och e). Vikningen av antingen IFN-y eller TNF-a hos vuxna var mycket högre än hos nyfödda. Dessutom, bland nyfödda, uppvisade AGA-nyfödda signifikant högre gånger ökningen av dessa två antivirala cytokiner än SGA-nyfödda (figur 4b och d).

Minskat antiviralt cytokinrespons i NK-celler från SGA-nyfödda vid stimulans av influensavirus. Individuella CBMC: er från AGA ( n = 20), SGA ( n = 18) nyfödda eller PBMC: er ( n = 17) inkuberades med influensa H1N1 PR / 8virus vid en MOI på 2 i 24 timmar. De intracellulära uttryckena av IFN-y och TNF-a i NK-celler undersöktes med flödescytometri ( a, c ). Vikningsökning relativt håna beräknades också ( b, d ). ( e ) Representativa flödesdiagram för IFN-y- och TNF-a-expression i NK-celler visades. Data uttrycks som medelvärde ± sem * P <0, 05; *** P <0, 0001. AGA, lämplig för graviditetsålder; CBMC, mononukleär cell i navelsträngsblod; IFN, interferon; MOI, infektionsmångfald; NK, naturlig mördare; PBMC, peronal blodmononukleär cell; SGA, liten för graviditetsålder; TNF, tumornekrosfaktor.

Bild i full storlek

Korrelation mellan antivirala cytokiner utsöndrade av NK-celler med födelsevikt

Förhållandet mellan neonatal födelsevikt och NK-cellfunktion undersöktes vidare. CBMC för nyfödda med distinkt födelsevikt stimulerades med influensavirus. Uttryck av perforin, IFN-y och TNF-a undersöktes med flödescytometri. Såsom visas i figur 5 ökades också med ökningen av neonatala födelsevikt ökningar av perforin-, IFN-y- och TNF-a-uttryck i NK-celler, vilket indikerade en positiv korrelation av influensavirusinducerat NK-cellrespons med neonatal födelsevikt.

Korrelation mellan antivirala cytokiner utsöndrade av NK-celler med födelsevikt. CBMC från nyfödda med olika födelsevikt (20 AGA och 18 SGA) inkuberades med influensa H1N1 PR / 8virus vid en MOI på 2 under 24 timmar. Vikförhöjningarna av perforin-, IFN-y- och TNF-a-uttryck beräknades. Korrelationen mellan deras vikningsökning med födelsevikt bestämdes med Pearson r- test. AGA, lämplig för graviditetsålder; CBMC, mononukleär cell i navelsträngsblod; IFN, interferon; MOI, infektionsmångfald; NK, naturlig mördare; SGA, liten för graviditetsålder; TNF, tumornekrosfaktor.

Bild i full storlek

Diskussion

SGA-nyfödda, definierade som de med födelsevikt under den 10: e percentilen för graviditetsålder, orsakas huvudsakligen av intrauterin tillväxtfördröjning. 2 Intrauterin tillväxtfördröjning skapar en negativ intrauterin miljö för fostret, vilket leder till fördröjd utveckling i organ inklusive immunsystemet. 18, 19 SGA-nyfödda barn är mycket mottagliga för livshotande infektioner med en hög frekvens av perinatal morbiditet och dödlighet på grund av deras juvenilitet av adaptivt och medfødt immunsystem. 2, 3 En serie studier har redan visat den försämrade adaptiva immuniteten hos SGA-nyfödda. 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Det medfödda immunsystemet spelar en viktig roll under den första månaden efter födseln. 18 Tidigare studier visar att det medfödda immunsystemet hos nyfödda är omogna. 12, 13, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30 Dessa försämrade immunfunktioner kan tillskrivas förändring av de medfödda immunitetsgenerna som är relaterade till graviditets- och livmodermiljön. 23, 29, 30

NK-celler är viktiga effektorceller eftersom de spelar en kritisk roll i den första raden för värdförsvar mot virusinfektioner genom att döda infekterade celler utan föregående antigenstimulering. 31, 32 Cytotoxiciteten och antiviralt cytokinuttryck av NK-celler är huvudhistokompatibilitetskomplex-obegränsat och är oberoende av de typer av invaderande virus. 33, 34 Influensavirus är en viktig orsakande patogen för akuta luftvägssjukdomar över hela världen och står för betydande sjuklighet och dödlighet hos nyfödda, särskilt hos SGA-spädbarn. 35 Tidigare studier visade att vuxna NK-celler har kraftfulla antiinfluensaeffekter 6, 35 och också har högt uttryck för NKG2D. 36 I denna studie undersöktes den antivirala funktionen hos neonatala NK-celler.

Vi visade först att som svar på stimulans av influensavirus stimulerade nyfödda celler, särskilt de från SGA-barn, mycket mindre antivirala cytokiner inklusive TNF-a och IFN-y än vuxna. Den lägre sekretionen av cytokiner kan bero på det omogna antivirala svaret från NK-celler i navelsträngsblod från nyfödda. Därför undersökte vi nästa NK-cellfunktion och fann att andelen NK-celler i navelsträngsblod är lägre än hos vuxna, i överensstämmelse med resultaten från Juretic. 37 Dessutom var perforinuttryck i neonatal vilande NK-celler också signifikant lägre än hos vuxna NK-celler. Perforin är en porbildande molekyl, och den tillåter apoptotiska molekyler såsom granulysin att komma in i celler och orsaka osmotisk lysering av målceller. 26 Det visades att cytotoxiciteten hos människors navelsträngsblodceller är signifikant låg. 38 Det deprimerade perforinuttrycket som detekteras här kan förklara den låga cytotoxiciteten hos NK-celler i navelsträngsblod. Förutom att döda virusinfekterade celler genom cytolytiska granuler producerar NK-celler också cytokiner såsom IFN-y och TNF-a för att utöva direkta och indirekta antivirala effekter. I denna studie visade vi att neonatala NK-celler uttryckte signifikant mindre antivirala cytokiner än vuxna celler vid stimulans av influensavirus. Dessutom, hos nyfödda, visade SGA-spädbarn ännu mycket mindre IFN-y- och TNF-a-uttryck av NK-celler än AGA-barn, vilket antyder att den funktionella mognaden för NK-celler i nyfödda kan vara relaterad till barnets födelsevikt. Detta stöds också av våra ytterligare fynd att uttrycket av cytolytiska granuler och antivirala cytokiner i NK-celler förbättrades signifikant tillsammans med ökningen av neonatal födelsevikt.

Sammanfattningsvis demonstrerade vi här att nyfödda, särskilt de med låg födelsevikt, föddes med funktionellt omogna och lågt antal NK-celler. Som svar på influensavirusutmaning hade neonatala NK-celler svagare antivirala svar jämfört med vuxna celler. Deprimerad antiviral aktivitet och en lägre frekvens av NK-celler bidrar sannolikt till den höga känsligheten för mikrobiell infektion hos nyfödda, särskilt SGA-barn. Denna rapport är, så vitt vi vet, den första som beskriver den nedsatta antivirala aktiviteten hos NK-celler mot influensavirus hos SGA-nyfödda. Avkryptering av nyfödda NK-immunitet kan ge kliniker en ny vinkel för bättre förståelse och hantering av den ökade känsligheten för livshotande infektioner och sepsis hos SGA-spädbarn.