Ifn-inducerbara p47 gtpaser visar differentiella svar på schistosoma japonicum akut infektion | cellulär & molekylär immunologi

Ifn-inducerbara p47 gtpaser visar differentiella svar på schistosoma japonicum akut infektion | cellulär & molekylär immunologi

Anonim

Abstrakt

Interferon gamma inducerat GTPas (IGTP) (även benämnt Irgm3) och interferon gamma inducerbart protein 47 (IRG-47) (även benämnt Irgd) är interferon (IFN) -inducerbara p47 GTPaser som har visats reglera värdmotstånd mot intracellulära patogener. Lite kunskaper har varit kända om rollen för p47 GTPaser i värdsvar mot extracellulära patogener. För att undersöka möjliga roller för IGTP och IRG-47 under loppet av Schistosoma japonicum- infektion utmanades IGTP och IRG-47 knockout och vildtyp (WT) -möss med cercariae av S. japonicum , och värdsvar analyserades. I det akuta stadiet av S. japonicum- infektion uppvisade möss som saknade IGTP liknande parasitbelastningar och patologiska skador på WT-möss. Det är viktigt att S. japonicum- infekterade möss med IRG-47-brist, i motsats till möss med IGTP-brist, och WT-möss, signifikant minskade maskar och lägre äggbelastning, men intensiv granulomatös reaktion som framkallades av schistosomägg i perifera delar av leverlober. Dessutom observerades uppreglering av inflammationsrelaterat genuttryck i mjälten hos IRG-47-bristande möss med användning av oligonukleotid-mikroarrayer, i vilka flera vägar för cytokin-cytokinreceptorinteraktion, T-cellreceptorsignalering, komplement, koaguleringskaskader och celladhesion molekyler lyfts fram. Sammantaget antyder dessa data att IGTP och IRG-47 kan ha distinkta särdrag som var differentierade för resistens mot S. japonicum .

Introduktion

Schistosomer är extracellulära maskar som är ett utmärkt exempel på en komplex multicellulär patogen som blomstrar i många däggdjursvärdar inklusive människor. I Kina orsakar Schistosoma japonicum allvarligare sjukdomar längs floden Yangtze än någon annan Schistosoma- art. Även om stora ansträngningar har gjorts för att bestämma naturen av immunsvaret mot schistosomer, är det fortfarande osäkert hur man ska hantera sådana komplexa organismer under övervakning av värdens immunsystem.

Det är välkänt att det starkaste och mest långvariga vaccinskyddet inducerat av de strålningsdämpade cercariaerna implicerade T-cellmedierade immunitet som involverar interferon (IFN) -y-beroende mekanismer. 1 IFN-y reglerar uttrycket av mer än 1200 gener, vars produkter förmodligen involverar flera biologiska funktioner av IFN-y-medierade effekter. 2, 3 Dessa IFN-y-reglerade proteiner verkar tillsammans för att bilda en barriär för att kontrollera patogener effektivt. En ny familj av IFN-y-inducerade gener har identifierats som IFN-inducerbara p47 GTPaser som har en markant påverkan på värdkontrollen av infektion både på organismenivå och cellnivå. 4, 5 Dessa gener kodar för en serie av 47- till 48-kDa guanosin-trifosfatbindande proteiner. 6, 7 Funktionella studier har koncentrerats på sex mus-p47-GTPas-proteiner som kan klassificeras i två grupper baserat på sekvenshomologi: grupp I inkluderande LRG-47 (Irgm1), 8 interferon gamma-inducerat GTPas (IGTP) (Irgm3) 6, 7 och GTPI (Irgm2), 9 och grupp II inkluderande IRG-47 (Irgd), 10 TGTP / Mg21 (Irgb6) 11, 12, 13 och IIGP (Irga6). 9 För närvarande har studier på denna GTPas-familj huvudsakligen varit inriktade på intracellulära patogener. Den enskilda medlemmen har olika funktioner: möss med IGTP-brist uppvisar hög känslighet för en liten grupp av protozoer 14 men är resistenta mot alla intracellulära bakterier undersökta hittills; LRG-47-bristfälliga möss uppvisar minskad resistens mot alla protozoer och intracellulära bakterier som har testats; IRG-47-bristfälliga möss visar något minskad eller normal resistens mot alla testade protozoer och bakterier. GTPas-familjemedlemmar verkar ha väsentliga, patogenspecifika roller i resistens mot infektioner. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 GTPas-familjen representerar också en ny IFN-y-beroende kväveoxidsyntas 2 (NOS2) -beroende väg i kontrollen av patogeninvasion. 16, 17

Det finns dock lite information om den här familjens potentiella funktioner vid infektion av extracellulära patogener. Vår tidigare forskning, med mikroarray och realtidspolymeraskedjereaktion (PCR) för att analysera IFN-responsiva vägar i musmodell infekterad med S. japonicum , fann att de flesta IFN-inducerbara p47 GTPaser uppreglerades i den tidiga infektionen och nedreglerades sedan mer snabbt såväl som signifikant än IFN-y per se med utvecklingen av denna sjukdom. Uttrycket av vissa p47-GTPaser tycktes också vara negativt korrelerat med schistosombelastningen i våra andra studier (data visas inte). Dessutom hade varje GTPas-gen helt olika intensiteter. Dessa resultat antydde att GTPas-familjen kan vara involverad i IFN-medierade effekter på S. japonicum- infektion, och varje medlem kan fungera tydligt i immunförsvar. 22 I den här studien använde vi gen-knockout-möss som saknade uttryck för IGTP eller IRG-47, företrädare för de två grupperna av GTPas-familjen, för att undersöka den potentiella involveringen av p47 GTPaser i den skyddande immuniteten mot S. japonicum- infektion.

Resultat

Differentialparasitbörda hos IGTP - / - och IRG-47 - / - möss infekterade med S. japonicum

För att undersöka skillnader mellan parasitparametrar mellan grupper, mätte vi antalet ägg i levern och den totala mängden maskar och par som återvunnits från 6-veckors S. Japonicum-infekterade IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT möss i två oberoende experiment. Ingen relevant skillnad i antalet vuxna maskar och leverägg hittades mellan infekterade IGTP - / - och WT-möss. Men det fanns en signifikant minskning av vuxna maskar och äggantal i levern från infekterade IRG-47 - / - möss jämfört med de andra två grupperna. Under tiden minskade också äggproduktionen hos varje parasitpar i IRG-47 - / - möss. Tabell 2 sammanfattar ovanstående resultat.

Full storlek bord

Differensfördelning av ägg och granulomatös reaktion i levern hos S. japonicum- infekterade IGTP - / - och IRG-47 - / - möss

S. japonicum frigör, till skillnad från Schistosoma mansoni , ägg i konglomeration i stor mängd. Äggmassa runt portalområdet, vilket leder till presinusoid obstruktion och central deponering av flera ägg i granulomas. Figur 1 visar en representativ bild av leverpatologin i de tre grupperna. HE-färgning avslöjade att ett större antal ägg koncentrerades runt portalområdet i 6-veckors S. japonicum- infekterade IGTP - / - och WT-möss (figur 1a och c), medan relativt mindre ägg i infekterade IRG-47 - / - möss (figur 1b). Det fanns ingen signifikant skillnad i antalet granulom som innehöll olika antal ägg i alla leversektioner av tre musfärger (data visas inte). Det är viktigt att celluläriteterna hos granulom med ett ägg bland de tre grupperna var signifikant olika. Det genomsnittliga antalet eosinofiler och det totala antalet celler i varje granulom med en ägg i IRG-47 - / - möss var mycket högre än i IGTP - / - och WT-möss (figur 2). Således observerades en mer intensiv cellreaktion framkallad av schistosomägg hos infekterade IRG-47 - / - möss (figur 1e) än de i de andra två grupperna (figur 1d och f).

Leverpatologi med HE-färgning i 6-veckors S. japonicum- infekterade IGTP - / -, IRG-47 - / - respektive WT-möss. ( a - c ) Ett representativt porträtt av leverportalområdet från IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT-möss med en förstoring av × 100 (skalstång = 400 μm). ( d - f ) En representativ bild av granulom med ett enda ägg från IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT-möss vid en förstoring av × 400 (skalstång = 100 μm).

Bild i full storlek

Cellulariteten i levergranulom med ett enda ägg i 6 veckors S. japonicum- infekterade IGTP- / -, IRG-47 - / - respektive WT-möss. Eosinofiler, lymfocyter, plasmaceller och de totala cellerna räknades i varje granulom. Minst 10 granulom räknades i varje sektion av möss. Stjärnor indikerar signifikanta skillnader (* P <0, 05, ** P <0, 01, jämfört med WT-möss).

Bild i full storlek

Differential Th1 / Th2-cytokinnivåer i serum av IGTP - / - och IRG-47 - / - möss som svar på S. japonicum- infektion

För att bedöma påverkan av IGTP- eller IRG-47-brist på Th1 / Th2-immunsvaret mättes vi Th1 och Th2-cytokiner i 6-veckors S. japonicum- infekterade musserum med Bio-Plex-teknik. För serumdetektering var de flesta cytokinnivåer i oinfekterade möss för låga och utan signifikant skillnad mellan grupper (data visas inte). Figur 3 visar Th1 / Th2-cytokinprofilering i sera från tre grupper 6 veckor efter infektion. Jämfört med IRG-47 - / - möss producerade S. japonicum- infekterade IGTP - / - möss en hög mängd IL-12p70, TNF-a, IL-4, IL-5 och IL-10 samt WT-möss ; GM-CSF- och IL-2-produktioner i IGTP - / - möss var signifikant högre än de i WT-möss ( P <0, 05 respektive P <0, 01). Intressant nog visade IRG-47 - / - möss de lägsta cytokinnivåerna i sera, oavsett om Thl eller Th2-typ, såsom IL-12p70, IFN-y, IL-10, IL-4 och IL-2, bland tre grupper.

Mängderna Th1 / Th2-cytokiner i sera från 6-veckors S. japonicum- infekterade IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT-möss analyserades med Bio-Plex-teknik. Symbolen '▴' visar den absoluta mängden för varje prov. Stjärnor indikerar signifikanta skillnader (* P <0, 05, ** P <0, 01).

Bild i full storlek

Uppreglering av inflammationsrelaterad genuttrycksprofil observerad i funktionell klassificering av mikroarray i IRG-47 - / - möss

Vi använde oligonukleotid-mikroarrayer med hög densitet för att jämföra förändringarna i funktionella generuttryck i IGTP- eller IRG-47-bristande möss med S. japonicum akut infektion. För att ytterligare dissekera de underliggande molekylära händelserna i samband med specifik geninriktning utförde vi en funktionell klassificering av de differentiellt uttryckta generna som är relaterade till immunsvaret. De mest representativa familjerna visade sig vara den som omfattade de inflammatoriska responsgenerna, inklusive cytokiner, kemokiner, celladhesionsmolekyler, costimuleringsmolekyler och så vidare. Figur 4 sammanfattar de signifikant förändrade generna i dessa fyra familjer. Intressant nog var de flesta gener uttryckta i IRG-47 - / - möss uppreglerade markant jämfört med IGTP - / - och WT-möss. Dessa gener föll in i följande klassiska kategorier: cytokiner, inklusive il4 , il6 , il10 , fasl , ifng , csf1 , och så vidare; kemokiner, inklusive ccl2 , ccl3 , ccl4 , cxcl9 , cxcl10 , och så vidare; costimulatorer, inklusive cd28 , cd 80 , cd 86 , icos , och så vidare; vidhäftningsmolekyler, inklusive vaskulär celladhesionsmolekyl-1 ( vcam-1 ), aktiverad leukocytcelladhesionsmolekyl ( alcam ), och så vidare. Annars uttrycktes den viktiga cytokinet TNF-a på en lägre nivå i möss med IRG-47-brist, vilket kan vara relaterat till minskad äggbörda och mild skada i levern. Betydande kandidatgener, valda från fyra representerade funktionella familjer, validerades med qRT-PCR. Dessutom visade NOS2, såsom uttryckt som svar på proinflammatoriska cytokiner och inducerande NO-produktion, liten skillnad mellan tre grupper.

Funktionell klassificering av 26 utvalda, differentiellt uttryckta gener från mikroarray-data för mjältceller. Gener delades in i immunologiskt relevanta funktionella familjer. Varje färgad ruta representerar den normaliserade expressionsnivån för en given gen i ett speciellt experimentellt tillstånd och färgas enligt förhållandet (log 2 (signalintensitet för IGTP - / - eller IRG-47 - / - ) / signalintensitet för WT) av en specifik genuttrycksnivå i IGTP - / - eller IRG-47 - / - möss till den i WT-möss.

Bild i full storlek

Dessutom påverkade differentiell genuttryck av cytokiner, kemokiner, celladhesionsmolekyler och costimuleringsmolekyler i IRG-47-bristfälliga möss signifikant vägarna för cytokin-cytokinreceptorinteraktion, T-cellreceptorsignalering, komplement- och koaguleringskaskader och celladhesionsmolekyler, som visas i figur 5. Bana för naturlig mördande cellmedierad cytotoxicitet tycktes spela en viss roll i IGTP - / - möss. Därför spekulerades det att högt uttryck av inflammatoriska responsgener i IRG-47 - / - möss kunde relateras till den minskade parasitbördan.

Betydande vägar med differentiellt förändrade gener i IGTP - / - och IRG-47 - / - möss jämfört med WT-möss. Bioinformatikanalysen utfördes med användning av GeneSpring version 7.0 programvara. Differentiellt förändrade gener placerades i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways database för att söka i de relevanta vägarna. Betydande vägar förknippade med immun- och inflammatoriskt svar i IRG-47 - / - möss fokuserade på cellvidhäftning, cytokin-cytokinreceptorinteraktion, T-cellreceptorsignalering, komplement och koagulering.

Bild i full storlek

qRT-PCR-validerad mikroarray-data

För att studera påverkan av IGTP- eller IRG - 47-genbrist på uttrycket av andra familjemedlemmar för p47 GTPaser och även bekräfta giltigheten av mikroarray-data utförde vi qRT-PCR för att identifiera mRNA-nivåerna för p47 GTPaser inklusive igtp , lrg47 och irg47- gener, och några differentiellt uttryckta funktionella gener inklusive ccl2 , il12 och il10 , i mjältceller från 6-veckors S. japonicum- infekterade IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT-möss. Det relativa genuttrycket för lrg47 uppreglerades signifikant i både IGTP - / - och IRG-47 - / - möss, jämfört med WT-gruppen, medan igtp och irg47 var något förhöjda när irg47 eller igtp var bristfälligt, men det finns ingen signifikant skillnad motsvarande (Figur 6b). Dessa antydde att en viss p47-GTPas-brist kan leda till ökat uttryck för andra medlemmar bland samma familj. qRT-PCR-resultat visade också att uttryck av ccl2 , il12 och il10 i IRG-47 - / - möss var högre än i IGTP - / - och WT-möss. Speciellt visade ccl2- uttryck i IRG-47 - / - möss en signifikant ökning (figur 6a).

De relativa mRNA-nivåerna av ccl2 , il12 , il10 och tre medlemmar av p47 GTPas-familjen, igtp , lrg47 och irg47 , vid 6-veckors S. Japonicum-infekterade IGTP - / -, IRG-47 - / - och WT-möss, var analyseras med kvantitativ PCR i realtid. Förhållandet mellan målgen och intern kontroll beräknades för att representera den relativa expressionsnivån. ( a ) De relativa mRNA-nivåerna för ccl2 , il12 och il10 indikerade att uttryck av ccl2 , il12 och il10 i IRG-47 - / - möss var högre än de i IGTP - / - och WT-möss. Speciellt gav ccl2- uttryck i IRG-47 - / - möss en signifikant ökning (* P <0, 05). ( b ) lrg47- genen uppreglerades signifikant i både IGTP - / - och IRG-47 - / - möss, jämfört med WT-gruppen (* P <0, 05).

Bild i full storlek

Diskussion

Som nedströmsförmedlare av IFN-responsiv väg, spelar p47 GTPaserna omfattande och djupa roller när det gäller att medla medfödd resistens mot intracellulära patogener. 23, 24 Hittills har inga data publicerats som visar en roll för något p47-GTPas i värdförsvaret mot extracellulära patogener. I denna studie använde vi S. japonicum som en multicellulär patogenmodell och undersökte de olika infektiösa resultaten i möss med IGTP- och IRG-47-brist. IGTP-bristfälliga möss uppvisade jämförbar parasitbelastning, inflammatorisk reaktion i lever och T-cellrespons på WT-möss under S. japonicum- infektion. Däremot visade IRG-47-bristande möss partiell resistens mot parasiten och lindrade systemiska immunsvar, uppvisade reducerad parasitbörda och undertryckte Th1 / Th2-cytokinuttryck i sera jämfört med IGTP-bristfälliga och WT-möss. Det är emellertid värt att notera att en mer intensiv granulomatös reaktion framkallad av schistosomägg i leverns periferi observerades hos IRG-47-bristfälliga möss. Dessa data indikerar att p47 GTPaser kan spela en mycket bredare roll i immunsvar än tidigare erkänt. De är involverade i extracellulära infektioner såväl som i intracellulära infektioner.

Olika p47 GTPaser kan ge olika bidrag till upprättandet av och / eller värdmotstånd mot specifikt smittämne, även kallad "patogenspecifik resistens". IGTP kunde medla värdens fullständiga resistens mot Toxoplasma gondii , men det förändrade inte signifikant förloppet för Trypanosoma cruzi- infektion. Under T. gondii- infektion dödades IGTP- och LRG-47-bristande möss enhetligt och snabbt under den akuta fasen av infektionen; däremot visade IRG-47-bristande möss endast delvis minskad resistens som inte manifesterades förrän den kroniska fasen. Vår studie på denna extracelluära maskinfektion antydde också att IGTP och IRG-47 kan spela olika roller i resistens mot S. japonicum , och IRG-47 skulle kunna äventyra den skyddande immuniteten . Till skillnad från intracellulär infektion där vissa p47 GTPaser hjälper till att reglera behandlingen av parasitoforiska vakuoler och i slutändan driva eliminering av patogenen, vid S. japonicum- infektion, kan dessa p47 GTPaser placeras för att uppvisa olika förmågor att bortskaffa eller regurgitera exogena antigen från schistosomer, och involverat i hantering av exocytotisk frisättning av lösliga lymfocyt-kofaktorer, såsom cytokiner eller kemokiner. Som leverpatologi visade, mer inflammatoriska celler, inklusive eosinofiler och lymfocyter, kemotaxades och ackumulerades runt schistosomägg för att konstruera relativt större granulom i periferin av levern i IRG-47 - / - möss.

Följaktligen noterades signifikant uppreglering av inflammatoriska responsgener från mikroarray-data i IRG-47-bristfälliga möss, som bildade karakteristisk miljö mot schistosomer. Dessa endogena signaler kan grupperas i följande tre kategorier: signaler som förmedlade det inflammatoriska svaret, inklusive tnf , il6, ifn och olika kemokiner; signaler som fungerade som costimulatorer för T-cellaktivering, inklusive cd80 , cd86 , icos , cd28 , cd40 , och så vidare; signaler som kontrollerade induktionen av effektorfunktioner och hålls i jämvikt, inklusive il4 , il10 , il12 , transformerande tillväxtfaktor-p ( tgfb ) och ifng . Kemokiner här, såsom ccl2 , ccl3 , ccl4 , cxcl9 och cxcl10 , riktade migrationen av antigenspecifika celler, huvudsakligen inklusive T-celler, monocyter, neutrofiler och eosinofiler, tillsammans med andra effektorceller till platsen för invaderande patogen antingen genom att inducera uttrycket av vidhäftningsmolekyler på endotelceller eller genom att stimulera kemotaxi.

Bristen på IRG-47 tycktes resultera i mer intensiv kemotoxicitet riktad mot specifikt schistosomantigen. Om detta fenomen inträffade i schistosomulumstadiet av tidig infektion, kunde ett antal inflammatoriska celler som samlats leda till förstörelse av fler schistosomula genom skada på tegument eller andra dödsmekanismer, vilket resulterade i ett minskat antal vuxna maskar och parasitägg. Således kan den möjliga mekanismen som ligger bakom det partiella motståndet för IRG-47-brist vara associerad med att bilda en ogynnsam överlevnadsmiljö och cytokinfält för S. japonicum .

Dessutom bör NO som en viktig effektor av makrofagbaserat dödande betraktas här. NOS2 uttrycks som svar på proinflammatoriska cytokiner (såsom IFN-y och TNF-a) och / eller mikrobiella produkter (såsom lipopolysackarid) och resulterar i en långvarig produktion av en stor mängd NO. 25, 26 Funktionen av NO i immunsvaret varierar beroende på den biologiska miljön. 26, 27, 28, 29 NO kan vara värdskyddande och fungera som en effektormolekyl av makrofagcytotoxicitet mot tumörceller och invaderande patogener och som en regulator av inflammatoriska svar. 27, 30 NO: s roll under schistosomiasis har undersökts tidigare och befanns fungera i tidiga stadier av akut schistosomiasis. 31 Vi försökte bestämma om parasitbelastning orsakad av frånvaron av IGTP eller IRG-47 var associerad med NO-medierad mekanism. Våra mikroarray-data visade att det inte fanns någon signifikant skillnad i uttrycket av NOS2 bland IGTP-brist, IRG-47-brist och WT-möss. Kombinerat med våra tidigare observationer att det inte fanns någon skillnad i koncentrationen av NO i kultursupernatanten av aktiverad IGTP - / -, IRG-47 - / - eller WT-makrofager, indikerades det att NOS2-aktivitet och NO-produktion var ojämn i frånvaro av IGTP och IRG-47. En liknande slutsats drogs från studier av rollen för LRG-47 i den mikrobicida aktiviteten hos makrofager för Mycobacterium tuberculosis . 5, 32 Därför antyder dessa fynd att p47 GTPas och NO fungerar oberoende vid medling av parasitkontroll.

Resultaten i denna studie stödjer tidigare studier som indikerar att IFN-y-inducerbar signalering har pleiotropiska effekter på immunförsvar och avslöjar att p47 GTPaser fungerar olika beroende på invaderande patogenarter. Funktionerna hos IGTP och IRG-47 tycktes vara annorlunda mot S. japonicum. Ännu viktigare argumenterar den för den skyddande rollen för p47 GTPas-familjen i denna delade IFN-y-medierade väg. Framtida studier bör definiera naturen och relevanta molekylära mekanismerna för IGTP och IRG-47 som svar på S. japonicum- infektion.