Ifi16 krävs för DNA-avkänning i mänskliga makrofager genom att främja produktion och funktion av cgamp | naturkommunikation

Ifi16 krävs för DNA-avkänning i mänskliga makrofager genom att främja produktion och funktion av cgamp | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Monocyter och makrofager
  • Mönsterigenkänningsreceptorer
  • Virusinfektion

Abstrakt

Medfödd aktivering av makrofager är en viktig del av värdförsvaret mot infektion. Cytosoliskt igenkänning av mikrobiellt DNA i makrofager leder till induktion av interferoner och cytokiner genom aktivering av cykliskt GMP-AMP-syntas (cGAS) och stimulator av interferongener (STING). Andra värdfaktorer, inklusive interferon-gamma-inducerbar faktor 16 (IFI16), har föreslagits bidra till immunaktivering med DNA. Men deras förhållande till cGAS-STING-vägen är inte klar. Här visar vi att IFI16 fungerar i cGAS-STING-vägen på två olika nivåer. Utarmning av IFI16 i makrofager försvårar cGAMP-produktion på DNA-stimulering, medan överuttryck av IFI16 förstärker funktionen av cGAS. Vidare är IFI16 avgörande för signalering nedströms stimulerad av cGAMP, vilket underlättar rekrytering och aktivering av TANK-bindande kinas 1 i STING-komplexet. Sammantaget antyder våra resultat att IFI16 är avgörande för effektiv avkänning och signalering vid DNA-utmaning i makrofager för att främja interferoner och antivirala svar.

Introduktion

Medfödd immunaktivering av cytosoliskt DNA från mikrobiella patogener är en potent trigger av typ I-interferon (IFN) och proinflammatoriska cytokiner 1 . Interferonaktivering har studerats omfattande både vad gäller proteiner som binder cytosoliskt DNA och de som behövs för efterföljande signalering nedströms och immunaktivering. Även om många kandidatsensorer av cytosoliskt DNA har föreslagits 2, har två proteiner visats av separata laboratorier att spela en roll i DNA-driven typ 1-interferonsvar. Dessa proteiner är cykliskt GMP-AMP-syntetas (cGAS) och interferon gamma-inducerbar faktor 16 (IFI16) (ref. 3). IFI16, ett cytosoliskt och kärnprotein, är associerat med induktion av IFN-a och IFN-p vid stimulering med enkelsträngat och dubbelsträngat DNA 4, 5, 6 och genom infektion med olika herpesvirus 7, 8, 9, human immunbrist virustyp 1 (HIV-1) 5 och bakterieinfektioner såsom Listeria och Francisella 10, 11 . Det cytosoliska proteinet cGAS är viktigt för att avkänna alla former av strukturerat DNA och är en ledande sensor för mikrobiellt DNA 12, 13, 14, 15 . cGAS har den enzymatiska kapaciteten att producera den andra messengercykliska GMP-AMP (cGAMP) 13, 16, 17, 18, som dockar till den endoplasmiska retikulumbundna proteinstimulatorn av interferongener (STING). Denna interaktion inducerar konformationella förändringar som gör att STING kan homodimerisera, migrera från ER (ref. 19) och rekrytera TANK-bindande kinas 1 (TBK1) 20 . Hur TBK1 aktivt rekryteras till STING är för närvarande okänt, men frånvaron av TBK1-bindning till STING resulterar i försämrad immunaktivering 21 . En ny rapport visade att TBK1-bindning till STING initierar en komplex kaskad av händelser inklusive fosforylering av STING samt rekrytering och aktivering av interferon regulatorisk faktor 3 (IRF3) 21 . Brist på fosforylering av STING vid Ser 366 avskaffar nedströms signalering och immunaktivering, vilket visar vikten av exakt och direkt aktivering av STING.

Studier av möss med cGAS-brist visar en tydlig fenotyp i medfödda immunsvar 13, 22, 23 . Eftersom möss inte har en direkt ortolog till mänsklig IFI16, finns data från IFI16-bristfälliga musmodeller inte tillgängliga. Många p200 familjemedlemmar har föreslagits ha funktioner som delvis överlappar mänsklig IFI16 (refs 24, 25). På grund av bristen på en definitiv murin IFI16-ortolog är musmodeller emellertid inte lämpliga för att lösa den potentiella sammankopplingen mellan cGAS och IFI16 i det medfödda immunsvaret mot främmande DNA.

Till skillnad från den väl beskrivna verkningsmekanismen för cGAS vid DNA-avkänning finns det begränsad kunskap om interaktionen mellan IFI16 och STING-beroende signalering och även om IFI16 är redundant för cGAS-STING-TBK1-vägen. Tidigare fynd har visat att affiniteten för cGAS för DNA varierar mellan relativt svag (Kd i 20 mikrometerområdet) 26, 27 till stark (≈80 nM) 28 och att specifika storlekar eller strukturer av dsDNA krävs för att cGAS ska engagera bindning 29, 30 . Vidare är cGAS-bindning till ssDNA ineffektivt 28 . Således verkar det troligt att cGAS reagerar effektivt på cytosoliskt DNA med hjälp av en eller flera samfaktorer. Eftersom IFI16 kan binda starkt till enstaka och dubbelsträngat DNA genom dess HIN-domäner och modulera protein-proteininteraktioner via dess PYRIN-domän 5, 31, 32 undersökte vi här mekanismen genom vilken IFI16 främjar DNA-driven STING-beroende signalering.

Vi presenterar två funktioner av mänsklig IFI16 i cGAS-STING-vägen. Med användning av humana phorbol-myristatacetat (PMA) -behandlade THP1-celler och humana monocyt-härledda makrofager (MDM) som tömts av IFI16, finner vi att tidigt interferonuttryck som svar på virusinfektioner eller DNA-transfektion kräver IFI16. Det är viktigt att i IFI16-bristfälliga celler stimulerade med DNA komprimeras nivån av STING-dimerisering, fosforylering och signalering nedströms. Dessutom är IFI16 nödvändig för effektiv cGAMP-produktion genom cGAS som svar på DNA. Slutligen rekryterar IFI16 aktivt TBK1 till det cGAMP-stimulerade STING-komplexet och främjar således fosforylering av STING. Sammantaget tyder våra resultat på att IFI16 reglerar STING-aktivering och är en integrerad del av DNA-avkänningsvägen i mänskliga makrofager.

Resultat

IFI16 kontrollerar medfödda immunsvar på virusinfektioner

Nyligen rapporterade har visat att HIV-omvänd transkriptionsintermediärer (RTI) kan detekteras med cGAS och initiera den kanoniska STING-interferonvägen i myeloida dendritiska celler behandlade med den virala SAMHD1-antagonisten Vpx (refs 12, 30, 33, 34). I makrofager kan SAMHD1 reglera både poolen av dNTP: er, liksom direkt nedbrytning av HIV-RNA 35, 36 . Således möjliggör nedbrytning av SAMHD1 med Vpx högre produktion av HIV RTI i cytosolen och därmed fler PAMP för potentiell avkänning. Vi försökte därför bestämma om IFI16 är involverad i medfödd immunaktivering i primära humana MDM-infekterade med replikeringskompetent HIV i kombination med lentivirala partiklar packade med Vpx-proteiner (nedan HIV + vpx ) Med användning av RNAi-utarmning av IFI16 i MDM från fyra olika givare, uppnådde vi variabla knockdown-effektiviteter som sträckte sig från 15 till 85% (fig. 1a). Mest effektiv knockdown uppnåddes hos de två givarna som visade de högsta basala nivåerna av IFI16-uttryck (Fig. 1a). Intressant nog korrelerade basnivån hos IFI16 med induktion av ISG54 efter infektion med HIV + vpx . Donatorerna 1 och 2 visade robust ISG54- induktion i förvrängda siRNA-behandlade MDM: er (fig. 1b; intervall 150–300 gånger). Däremot gav givarna 3 och 4 en blygsam ökning av ISG54- uttrycket (Fig. 1b: ökning 2-3 gånger) när de infekterats med HIV + vpx . Vpx enbart hade ingen signifikant effekt. Liknande observationer gjordes för IFN-p- uttryck (Fig. 1c). Men här upptäckte vi bara en signal över bakgrund för givare 1 och 2, i vilket fall infektion med HIV + vpx visade tydlig IFN-p- induktion. Observera att det dåliga svaret på HIV-infektion som observerades för givare 3 inte berodde på reducerat basaluttryck av cGAS eller STING (kompletterande figur 1a). Ännu viktigare visade MDM: er behandlade med IFI16-specifika siRNA inte en induktion av ISG54 och IFN-p- uttryck efter HIV-infektion (fig. 1b, c). För att bekräfta att dessa resultat inte berodde på ospecifika effekter av siRNA-behandlingen applicerades ytterligare en IFI16 siRNA-pool på ytterligare tre givare (kompletterande figur Ib, c). Observera att hos en av givarna kunde vi inte uppnå tillräcklig knockdown med siRNA som riktade sig till IFI16 och observerade därför inga skillnader i interferonsvar, vilket ytterligare argumenterade mot möjligheten till ospecifika effekter av siRNA-behandlingen. Således förbättrar IFI16 kapaciteten hos makrofager att känna HIV och att initiera ett immunologiskt svar.

Image

( a ) IFI16-uttryck mättes genom western blotting i fyra primära humana makrofagdonatorer behandlade med förvrängd (Sc.) och IFI16-specifik (IFI16) siRNA. ( b, c ) ISG54- uttryck ( b ) och IFN-p- uttryck ( c ) mättes i de fyra givarna som visas i ( a ) utmanade med antingen Vpx-partiklar ensamma eller HIV vpx + under 18 timmar. Data representerar mRNA-expression av varje gen normaliserad till mRNA-expression av RNaseP från två biologiska replikat av varje donator. ( d ) IFI16-uttryck mätt med WB i fyra primära humana makrofager behandlade med scramble eller IFI16-specifikt siRNA vid tidpunkten för utmaning med HIV-Bal-infektion (vänster panel). Produktion av replikerande kompetenta HIV-partiklar mättes 6 dagar pi med användning av HIV-tillåtna TzmBL Luciferas-reportercellinje (höger panel). ( e, f ) Typ I-interferonuttryck utvärderades i kontroll, IFI16 KO, cGAS KO och STING KO THP-1-celler utmanade med HSV1 ( e ) eller hCMV ( f ) 18 timmar efter infektion med användning av en MOI av 3. ( g ) Interferonuttryck av typ I utvärderades i kontroll och IFI16 KO-celler vid 2, 4 och 8 timmar efter HSV1-infektion med användning av en MOI av 10. Data i ( e - g ) representerar medelvärdet ± sd för biologiska triplikat, representerande för två oberoende experiment. Oparad t- test korrigerad för flera jämförelser med Holm – Sidak utfördes för att utvärdera betydelsen. * P < 0, 05; ** P < 0, 01.

Bild i full storlek

Vi ansåg att bristen på medfödd immunaktivering riktad av IFI16 kan leda till nedsatt viral kontroll i makrofager. För att testa detta slog vi ned IFI16 i MDM och undersökte nivåerna av HIV-produktion 6 dagar efter infektion. Vi fann att en genomsnittlig IFI16-reduktion på 70% ökade produktionen av den makrofag-tropiska HIV Bal-stammen med ungefär två storleksordningar (fig. 1d). Liknande fynd observerades med användning av en annan uppsättning IFI16-specifika siRNA där en 3-faldig förbättring uppnåddes (kompletterande figur 1d, e).

För att bättre förstå hur IFI16 reglerar de medfödda immunsvaren mot virusinfektion, använde vi CRISPR-Cas9-tekniken för att generera knockout-genvarianter i humana THP-1-celler, en monocytisk cellinje som antar en makrofagliknande fenotyp vid PMA-differentiering. Enkelcellskloner som bär IFI16-mutationer genererades baserat på tre olika styr-RNA: er (kompletterande fig. 2a, b). Verifiering av genetisk KO utfördes med Western blot på PMA-behandlade THP1-celler (kompletterande fig. 2c, d) och med enkel klonsekvensering (kompletterande fig. 2e). THP-1-klonerna som har KO-mutationer i gener som kodar för STING och cGAS har beskrivits tidigare 37 .

Till skillnad från hiv utlöser medlemmar av herpesviridae robusta medfödda immunsvar i makrofager 6, 7, 9 . Vi har tidigare rapporterat viktiga roller för IFI16 när det gäller att stimulera interferonrespons på herpesvirusinfektioner med användning av shRNA-riktad knock-down 7 . Vi försökte därför validera huruvida KO-cellinjerna uppvisar ett liknande beroende av IFI16 för herpesvirusinducerad typ I-interferonproduktion. Vid PMA-behandlade THP1-celler kontroller observerade vi förhöjd typ I-interferonsekretion 18 timmar efter infektion med båda herpes simplex-virus 1 (HSV-1; Fig. 1e) och humant cytomegalovirus (hCMV; Fig. 1f). Detta svar avskaffades fullständigt i THP1-celler som saknade cGAS och STING, och endast mindre återstående induktion av typ I-interferoner i IFI16 KO-celler observerades (Fig. 1e, f). Med hjälp av en högre MOI av HSV1 kunde vi undersöka interferonsekretion vid tidigare tidpunkter (2–8 timmar). Resultaten bekräftade att IFI16 krävs för potent tidig immunaktivering efter HSV-1-infektion (fig. 1g).

För att utesluta potentiella effekter utanför målet av IFI16-riktad CRISPR-knockout, utvärderade vi medfödda immunsvar mot paramyxovirus Newcastlesjukdomsviruset (NDV), ett RNA-virus känt för att utlösa RIG-I-aktivering 38, 39 . I detta fall påverkades inte interferon av typ I och TNF-a genom att slå ut IFI16 (kompletterande figur 3a, b). För att utesluta mättande effekter av höga NDV-titrar bekräftade vi våra resultat med användning av sekventiella spädningar av virala ympningar (kompletterande figur 3c). Således ökade IFI16 specifikt makrofagernas kapacitet att känna av infektion genom DNA-innehållande eller producerande virus.

Tidig och robust aktivering av STING regleras av IFI16

En pålitlig strategi för att utlösa immunaktivering med cGAS och STING är liposomal transfektion av syntetiskt DNA från olika strukturer. Vi transfekterade därför kontroll- och IFI16 KO-celler med olika typer och koncentrationer av syntetiskt DNA och utvärderade tidig interferonsekretion av typ I. Både HSV-1 60mer (dsDNA) och sill-testis-DNA (HT-DNA) inducerade robusta interferonsvar i kontroll-THP1-celler. Som jämförelse visade THP1-celler som saknade IFI16 ett signifikant svagare interferonsvar (fig. 2a; kompletterande fig. 4a). Strukturerat enkelsträngat HIV-DNA, som tidigare visats trigga interferonsignalering 5, resulterade i ett liknande interferonsvar som observerats för HT-DNA och dsDNA (kompletterande fig. 4b). Lipofektamintransfektion ensam inducerade inte en väsentlig mängd av typ I-interferon (kompletterande fig. 4c).

Image

( a ) Kontroll- och IFI16 CRISPR KO THP-1-celler transfekterades med dsDNA vid olika koncentrationer och interferoninduktion mättes efter 6 timmar. ( b, c ) Kontroll- och IFI16 KO-celler transfekterades med dsDNA (4 μg ml −1 ) vid angivna tidpunkter ( b ) eller poly (I: C) (1 μg ml −1 eller 5 μg ml −1 ) för 20 h ( c ), nedanstående supernatanter utvärderades med avseende på typ I-interferonuttryck. ( d ) Hela celllysat från kontroll eller IFI16 KO-celler stimulerade med dsDNA (4 μg ml −1 ) vid indikerade tidpunkter utsattes för immunblotting med användning av antikroppar mot STING, pIRF3, pTBK1, total TBK, total IRF3 och vinculin (VCL) som lastkontroll. ( e ) Kontroll- eller IFI16 KO-celler transfekterades med dsDNA (4 ug ml −1 ) under två och fyra timmar. Cellerna fixerades och färgades med anti-IFI16 (grön) och anti-STING (röda) specifika antikroppar. DNA visualiserades med DAPI (blått). Data representerar medelvärde ± sd för biologiska triplikat, representerande för tre oberoende experiment. Oparad t- test korrigerad för flera jämförelser med Holm – Sidak utfördes för att utvärdera betydelsen. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Bild i full storlek

För att ytterligare validera dessa observationer transfekterade vi kontroll- och IFI16 KO THP1-celler med dsDNA och bedömde typ I-interferonsekretion under en 12 timmars kurs. I kontrollceller observerade vi en kontinuerlig ökning av interferonsvar, medan IFI16 KO-celler avbildade ett signifikant dämpat och försenat interferonsvar (Fig. 2b). Denna försämring i THP1-celler som saknade IFI16 var ännu mer uttalad när vi utvärderade expression av den IRF3-beroende målgen CXCL10, som var fullständigt frånvarande i IFI16 KO-celler (kompletterande figur 4d). Däremot inducerade transfektion med polyI: C, som aktiverar RIG-I-vägen, normalt interferon (fig. 2c) och TNF-a-svar (kompletterande fig. 4e) i både kontroll- och IFI16 KO-celler. Det minimala interferonsvaret som observerats i IFI16 KO THP1-celler kan bero på effekter på andra medfödda signalvägar. Men när vi förbehandlade kontroll- och IFI16 KO-celler med TBK1 / IKKɛ-kinasinhibitorn BX-795 före DNA-transfektion såg vi ett komplett block av interferonrespons av typ I (kompletterande figur 4f). För att bekräfta att DNA-transfektion inte påverkade andra kinaser än TBK1 i interferoninduktionsvägen, utvärderade vi också interferonsvar i TBK1 KO THP1-celler (kompletterande fig. 4g). TBK1 KO-celler producerade inte typ I-interferon vid transfektion med dsDNA, i konstrast för att kontrollera THP1-celler (kompletterande fig. 4h). För att validera dessa fynd i primära celler slog vi ned IFI16 i MDM med hjälp av siRNA (kompletterande figur 5a) och transfekterades med dsDNA 48 timmar efter den slutliga siRNA-behandlingen. Effektiv IFI16-utarmning förknippades med signifikant reducerade interferonsvar efter transfektion med dsDNA men inte polyI: C (kompletterande figur 5b, c).

Dessa observationer bekräftades i ytterligare THP1 IFI16 KO-kloner från totalt tre olika gRNA-sekvenser (kompletterande figur 2b). Alla kloner svarade normalt på polyI: C-transfektion eller NDV-infektion men visade starkt försämrad interferonrespons av typ I på dsDNA (kompletterande figur 6a – e). Interferonsvar av typ I var också frånvarande vid dsDNA-behandling i THP1-celler som saknade cGAS eller STING (kompletterande fig. 6f). Slutligen rekonstituerade vi IFI16-expression genom lentiviral genleverans och demonstrerade ett delvis återställt IFI16-uttryck 48 timmar efter transduktion (kompletterande figur 6g). Dessa celler fick kapacitet att svara på dsDNA-transfektion observerad genom ökad produktion av typ I-interferon, medan svaret på poly (I: C) -transfektion var oförändrat (kompletterande figur 6h). Vi observerade att lentiviral genleverans av eGFP inte inducerade interferonproduktion i IFI16 KO-celler, men det ökade något interferonrespons efter DNA-stimulering i kontrollceller (kompletterande figur 6h).

Vi spekulerade i att de dämpade interferonsvaren som observerades i IFI16 KO THP1-celler kan bero på försämrad reglering av STING-signaleringskaskaden. För att utvärdera detta utförde vi immunblotting för STING, fosfo-TBK1 och fosfo-IRF3. Vi observerade att transfektion av celler med dsDNA resulterade i uppkomsten av en långsam migrerande form av STING (kompletterande fig. 7a, vänster sida), möjligen på grund av fosforylering 40 . För att bekräfta detta behandlade vi prover med alkaliskt fosfatas före elektrofores med SDS – PAGE. Detta resulterade i att den långsammare migrationssignalen försvann (tilläggsfiguren 7a, höger panel). Därefter transfekterades kontroll- och IFI16 KO THP1-celler med dsDNA och utvärderades med avseende på uppkomsten av det fosforylerade STING-bandet. I kontrollceller visade sig denna signal efter en timme och toppade mellan 4 och 6 h pt (fig. 2d, övre vänstra panelen). Däremot producerade celler som saknade IFI16 en mycket svag och övergående signal efter 4–6 timmar (Fig. 2d, övre högra panelen). Utvärdering av TBK1-fosforylering indikerade vidare att kontrollceller svarade snabbt på dsDNA, medan celler som saknade IFI16 hade ett försenat och övergående fosforyleringsmönster (Fig. 2d). Detta dämpade svar var också uppenbart IRF3-fosforylering där kontroll-THP1-celler inducerade fosfo-IRF3 efter 1 timme och nådde en topp på 8 timmar, medan IFI16 KO-celler visade minst en 4 timmars fördröjning och en svagare signal för fosfo-IRF3 (fig. 2d, spår 2–4 kontra spår 10–12).

Vi använde sedan konfokal mikroskopi för att visualisera kinetiken för STING-aktivering, bedömd genom STING puncta-bildning efter dsDNA-transfektion i både kontroll- och IFI16 KO-celler. I kontroll THP1-celler kolokaliserades IFI16 och STING i distinkta fläckar med mättad DAPI-färgning, vilket indikerar transfekterat dsDNA, vilket var helt frånvarande i celler som saknade IFI16 (fig. 2e). Vidare observerades STING-fläckar tydligt i kontrollcellerna 2 timmar, som ytterligare ökade vid 4 timmar (fig. 2e). Däremot bildade THP1-celler som saknade IFI16 inga detekterbara fläckar vid 2 timmar och mycket få vid 4 timmar (Fig. 2e). Denna skillnad var signifikant när STING puncta räknades i flera celler (kompletterande figur 7b, c). Sammantaget visar dessa data att makrofager, som uttrycker cGAS och STING men saknar IFI16, inte har förmågan att initiera tidig och robust STING-signal aktivering som svar på cytosoliskt dsDNA.

STING-dimerisering och fosforylering styrs av IFI16

Nyligen har det visats att dimerisering av STING genom cGAMP-interaktion föregår aktiv TBK1-fosforylering av STING och IRF3 (ref. 21). Således antog vi att IFI16 deltar i att reglera STING-dimerisering och därefter TBK1 / IRF3-aktivering. För att testa detta använde vi ett internt STING-dimeriseringsprotokoll 37 som möjliggör utredning av STING-dimerisering och fosforylering efter dsDNA-transfektion. För att fastställa STING-dimerisering genomfördes alla experiment under semi-nativa förhållanden, eftersom reducerande förhållanden skulle störa dimeriseringen men inte fosforyleringssignalen från STING (kompletterande fig. 7d). När kontroll-THP1-celler stimulerades med dsDNA observerades en omedelbar dimeriseringssignal som nådde sin topp i intensitet efter 4 timmar (Fig. 3a, spår 2-4). Denna signal var både försenad och mindre intensiv i THP1-celler som saknade IFI16 (Fig. 3a, spår 10-14). På basis av tre individuella experiment beräknade vi att STING-dimeriseringsbildningen toppade 4 timmar efter dsDNA-transfektion i kontroll-THP1-celler, medan celler som saknade IFI16 visade en fördröjning på minst 4 timmar (fig. 3b). Dessa observationer bekräftades i en IFI16 knockout-klon genererad med ett annat gRNA (kompletterande figur 7e).

Image

( a, b ) Kontroll och IFI16 KO THP-1-celler stimulerades med dsDNA (4 ug ml −1 ) vid indikerade tidpunkter och hela celllysat utsattes för immunoblotting av STING-dimerisering genom semi-nativ gelelektrofores. Vinculin (VCL) användes som belastningskontroll. ( b ) Kvantifieringen av bandintensiteten för STING Dimer kontra STING Monomor gjordes med användning av ImageJ-programvara från tre oberoende experimentella inställningar. ( c, d ) Kontroll, cGAS KO- och IFI16 KO-celler stimulerades med dsDNA (4 μg ml −1 ) vid angivna tidpunkter och hela celllysat utsattes för både semi-nativ gelelektrofores och standard SDS-sida. Membraner testades med antikroppar mot STING, p-TBK1 och VCL ( c ) eller fosfospecifik STING Ser 366 och Histone3 som belastningskontroll ( d ). Data som presenteras i ( a, c ) är representativa för minst tre oberoende experiment, medan data i ( d ) är representativa för två oberoende experiment.

Bild i full storlek

Därefter försökte vi bestämma om förseningen i STING-aktivering och fosforylering var jämförbar i IFI16- och cGAS KO THP1-celler. Som förväntat producerade kontrollceller snabb STING-dimerisering efter 1 timme. Intensiteten hos dimeriseringssignalen ökade ytterligare 4 timmar efter en blekningssignal för STING-monomer och ökad signal för fosfo-TBK1 (fig. 3c, spår 2-4). Som väntat genererade cGAS KO THP1-celler en mycket svag STING-dimeriseringssignal (fig. 3c, spår 6–8), såväl som en svag signal om fosforylerad TBK1 (fig. 3c, spår 7). I celler som saknade IFI16 observerades inte STING-dimerisering och fosforylering förrän 4 timmar efter transfektion, i vilket fall signalintensiteten var underordnad de signaler som observerades för kontrollcellerna (fig. 3c; spår 2-3 mot 10–11). Parallellt med den försenade och reducerade dimeriseringen av STING observerade vi också att THP1-celler som saknade IFI16 inte inducerade TBK1-fosforylering före 4 timmar (Fig. 3c, spår 11).

Specifik fosforylering vid STING Ser 366 är avgörande för signalering nedströms till IRF3 och dess aktivering 21, 40, 41 . Således utvärderade vi STING-fosforylering med användning av en fosfospecifik antikropp 21 riktad mot Ser 366 . Vi bekräftade att kontrollceller stimulerade med dsDNA inducerade en tydlig signal efter 1 timme, som förblev förhöjd tills 8 timmar (Fig. 3d, spår 2-4). Denna signal var frånvarande i cGAS KO-celler (fig. 3d, spår 7) och dämpades starkt i IFI16 KO-celler (fig. 3d, spår 11). Dämpningen och förseningen av STING-aktivering som observerats i IFI16 KO-celler skulle påverka makrofagernas kapacitet att montera ett tidigt antiviralt svar, såsom indikeras i fig. 1. För att komplettera detta utvärderade vi också RNAseq-genuttrycksprofiler i kontroll och IFI16 KO THP1-celler stimulerad med dsDNA under 6 timmar. Vi fann att totalt 117 immungener inducerades minst 10 gånger i kontrollceller efter stimulering; mer än hälften av dessa gener uppreglerades emellertid inte i IFI16 KO-celler (fig. 4a). Närmare undersökning av sex klassiska typ I-interferonstimulatoriska gener (ISG) visade en homogen ökning av RNA-avläsningar i varje biologiskt prov av kontrollmakrofager stimulerade med dsDNA, medan IFI16 KO-celler visade små eller några skillnader (Fig. 4b). Sammanfattningsvis stöder dessa data att IFI16 kontrollerar STING-aktivering vid eller uppströms om STING-fosforylering.

Image

( a ) Kontroll- och IFI16 KO-celler stimulerades med dsDNA (4 μg ml −1 ) under 6 timmar innan extraktion av totalt RNA och analysering av differentiellt uttryckta gener på ProtonIon med Partek Genspecifik analysalgoritm. ( b ) Totalt genuttryck (antal läs normaliserade till total läs) presenteras för de 6 rödmarkerade generna: IFI44L, VIPERIN, IFNB1, MX1, APOBEC3F och GBP5. Rutan representerar interquartile intervall, med linjen i mitten som representerar median medan whiskers symboliserar 90–10% intervall.

Bild i full storlek

IFI16 rekryterar TBK1 till STING för att initiera IRF3-aktivering

På grundval av resultaten ovan undersökte vi sedan om IFI16 direkt interagerar med faktorer som är involverade i STING-signalvägen efter dsDNA-stimulering. Vi gjorde detta genom att utföra immunutfällning (IP) av STING eller IFI16 på cytosoliska extrakt från THP1-celler och MDM stimulerade med dsDNA (fig. 5). I STING-IP-prover observerade vi en robust signal för IFI16 2 h pt som minskade vid 4 h pt (Fig. 5a, spår 2-3), medan vi inte kunde dra IFI16 i STING KO-celler (kompletterande fig. 8) . Vi observerade också en stark samband mellan STING och TBK1, såväl som fosfo-TBK1, efter DNA-stimulering (Fig. 5a, spår 2). I överensstämmelse med dessa resultat resulterade IP med IFI16-antikroppar på cytosoliska extrakt i en robust signal för STING 2 h pt, vilket inte längre var synligt vid 4 timmar (Fig. 5a, spår 5-6). Dessutom observerade vi att IFI16 starkt associerade med TBK1 även i frånvaro av stimulering (Fig. 5a, spår 4). Denna interaktion var specifik, eftersom TBK1 inte fälldes ut med anti-IFI16 i THP1 IFI16 KO-celler (kompletterande figur 8). På dsDNA-transfektion fälldes också den fosforylerade formen av TBK1 tillsammans med IFI16 (fig. 5a, spår 5-6). Dessa resultat sammanfördes i celllysat från primära MDM med användning av STING-IP-protokollet (fig. 5b).

Image

( a ) Schematisk illustration av arbetsflödet för co-immunutfällningsförsök. Rensade celllysat (CCL) av THP-1-celler stimulerade med dsDNA (4 μg ml −1 ) under 2 och 4 timmar utsattes för övernattande samimmunutfällning över natten med antikroppar indikerade i varje panel. Lysat från kontrollceller sam-IP med STING (spår 1-3) eller IFI16 (spår 4–6). Inmatning och eluer analyserades genom gelelektrofores följt av immunblotting (IB) med de indikerade antikropparna. ( b ) STING sam-IP-prover från primära humana MDM efter IB med de indikerade antikropparna. ( c ) STING sam-IP-prover från kontroll (spår 1-3) och IFI16 KO (spår 4–6) THP-1-celler efter IB med de angivna antikropparna. ( d ) IFI16 sam-IP-prover från STING KO THP-1-celler efter IB med de indikerade antikropparna. Varje fläck representerar tre oberoende experiment. ( e ) Kontroll- eller IFI16 KO-celler stimulerades med dsDNA (4 μg ml −1 ) under 2 timmar, fixerade och färgades för DAPI (blå), anti-IFI16 (grön) eller anti-IRF3 (röd) och utsattes för konfokal avbildning vid × 63 oljelins. ( f ) Kvantifiering av IRF3-lokalisering av minst 50 individuella celler behandlade såsom beskrivs i e .

Bild i full storlek

Dessa data antydde att IFI16 potentiellt fungerar som en bro mellan STING och TBK1. För att testa denna hypotese genomförde vi därefter en STING IP av kontroll och IFI16 KO THP1-celler stimulerade med dsDNA. Anmärkningsvärt var rekrytering av TBK1 till STING frånvarande i celler som saknade IFI16 och dessa celler misslyckades med att fosforylera STING vid Ser 366 (Fig. 5c, spår 5-6). Däremot visade kontroll-THP1-celler både TBK1-rekrytering till STING och stark fosforylering av STING vid position Ser 366 (Fig. 5c, spår 2-3). Därefter utförde vi IP av IFI16 i STING KO THP1-celler och rekapitulerade den konstitutiva föreningen mellan TBK1 och IFI16 (fig. 5d). Sammantaget tyder dessa data på att IFI16 är viktig för rekrytering av TBK1 till STING efter dsDNA-stimulering.

Nedsatt STING- och TBK1-interaktion bör resultera i minskad IRF3-aktivering och translokation till kärnan. Faktiskt bekräftade konfokal mikroskopi IRF3-ackumulering i kontrollkärnan men inte i IFI16 KO-celler (fig. 5e, f). Sammantaget antyder dessa resultat att IFI16 konstitutionellt interagerar med TBK1 och kan rekrytera TBK1 till STING efter DNA-stimulering, vilket således stödjer fosforylering av STING och efterföljande IRF3-aktivering.

Nedsatt cGAMP-produktion i celler med IFI16-brist

En förutsättning för DNA-stimulerad STING-aktivering och rekrytering av TBK1 är aktivering av cGAS för att producera cGAMP (ref. 16). I dendritiska celler har denna process föreslagits kontrolleras av en cellulär kofaktor PQBP1 under avkänning av retroviralt DNA (ref. 33). Således antagde vi att bristen på interferoninduktion observerad i IFI16 KO THP1-celler berodde på frånvaron av IFI16 som stödjer cGAS-aktivitet efter DNA-bindning. För att utvärdera detta, mätte vi däggdjur 2′5′-3′5-cGAMP (nedan cGAMP) genom LC-MS / MS-analys (fig. 6a). Intressant nog hade IFI16 KO THP1-celler lägre cGAMP-produktion än kontrollceller efter DNA-transfektion (fig. 6b). Med användning av den externa kalibreringskurvan för syntetisk cGAMP (fig. 6a) kunde vi kvantifiera cGAMP-produktion över flera experiment, vilket bekräftade att kontrollen av THP1-celler producerade signifikant mer cGAMP efter DNA-utmaning än IFI16 KO-kloner (fig. 6c).

Image

( a ) Extern kalibreringskurva för spetsad (2′3′-3′5 ′) - cGAMP i cellextrakt före kolonnrening användes för att kvantifiera cGAMP-produktion i stimulerade celler. Kalibreringskurvan var linjär upp till en koncentration av minst 400 nM med en R2 på 0, 991. Kromatogrammet visar toppen detekterad med användning av syntetisk cGAMP. ( b ) LC-MS / MS-kromatogram av hela celllysat från kontroll och IFI16 KO THP-1-celler stimulerade med dsDNA under 2, 4 eller 8 timmar. ( c ) Kvantitativ LC – MS / MS-analys av kontroll och IFI16 KO THP-1 av tre enskilda enskilda kloner. ( d ) Immunoblotting av HEK29T med eller utan stabil transduktion av humant IFI16 (CE, cytoplasmiskt extrakt; ME, membranekstrakt; NE, nukleärt extrakt; PE, pelletsextrakt). ( e ) Kvantitativ LC – MS / MS-analys av HEK293T med eller utan stabil transduktion av human IFI16 24 timmar efter transfektion med ökande doser av cGAS-uttryckande plasmid. ( f ) Immunoblotting av HEK293T med eller utan stabil transduktion av humant STING. ( g ) HEK293T STING- celler transfekterades med cGAS-uttryckande plasmid (25 ng brunn -1 ) och ökande doser av IFI16-uttryckande plasmid (0, 250, 500, 750 och 1 000 ng brunn-1). STING-aktivering utvärderades 24 timmar senare genom att mäta expression av en IFN-p-promotor Firefly-gen normaliserad till en beta-aktinpromotor Renilla-gen. ( h ) Diagram of IFI16 domains and the two different IFI16-mutants used to transient express IFI16 protein in HEK293T stable expressing human STING. An eGFP expressing plasmid was used as negative control. Transfection efficiencies were evaluated by measuring eGFP or BFP by Flow cytometry. ( i ) HEK293T STING cells were transfected with cGAS expressing plasmid (25 ng well −1 ) and increasing doses of plasmids expressing wt, Pyrin or Hin IFI16 mutant. ( j ) HEK293T STING cells were transfected with cGAS expressing plasmid (25 ng well −1 ) and increasing doses of plasmids expressing Pyrin containing proteins; MNDA, IFIX or IFI16. Data in ( c, e, g, i, j ) represent mean±sd of biological triplicates from three independent experimental setups. Unpaired t -test corrected for multiple comparisons using Holm–Sidak was performed to evaluate the significance. For data in ( i ) one-way ANOVA was performed to evaluate significance. * P< 0.05; ** P< 0.01, *** P< 0.001.

Bild i full storlek

These data indicated that IFI16 directly supports the capacity of cGAS to sense DNA and activates the signalling complex. To confirm this in another system, we used HEK293T cells, which do not express IFI16, cGAS or STING, but do activate the IFN-β promoter in responsive to plasmid DNA transfection upon overexpression of STING and cGAS (ref. 42). Using Sleeping Beauty DNA transposon technology, we generated a HEK293T cell model stably expressing human IFI16. These cells demonstrated a subcellular distribution of IFI16 reminiscent of macrophages (Fig. 6d), with the majority of IFI16 accumulating in the nucleus, but a significant portion in the cytoplasm (Fig. 6d, CE and NE lanes). We titrated cGAS into these cells to examine whether IFI16 supported cGAMP production by cGAS in response to sensing of the transfected plasmids. Indeed, HEK293T IFI16 cells generated significantly more cGAMP measured by LC-MS/MS than normal HEK293T cells (Fig. 6e).

We examined next whether overexpression of IFI16 in combination with cGAS had any synergistic effect in the HEK293T stable expressing human STING (Fig. 6f). Overexpression of IFI16 alone did not render cells responsive to plasmid DNA, whereas co-expression of cGAS alone resulted in robust IFN-β promoter-stimulated luciferase activity (Fig. 6g). When we titrated increasing doses of IFI16 in HEK293T STING expressing cGAS we observed prominent dose-response effects of IFI16, indicating that IFI16 enhances cGAS activation (Fig. 6g).

To identify the domain responsible for triggering cGAS activation, we transiently transfected HEK293T STING cells with two different IFI16 mutants: a PYRIN-domain mutant and a DNA-binding mutant, in which we deleted the HIN-a domain and made specific HIN-b site-directed mutagenesis 31 in residues essential for DNA binding (Fig. 6h). All IFI16 plasmids contained an IRES-BFP cassette to control for gene expression by flow cytometry (Fig. 6h). When we overexpressed any of the IFI16 constructs in a HEK293T STING background no IFN-β promoter activity was detected. However, expression of cGAS in combination with wildtype IFI16 significantly elevated IFN-β promoter activity above control plasmid expression (Fig. 6i). Additionally, when each of the IFI16 mutants were co-expressed together with cGAS, we observed significantly reduced IFN-β promotor activity compared with IFI16 wildtype. To examine whether this was a specific function by the IFI16 PYRIN domain, we overexpressed two other PYRIN-domain containing proteins also reported as sensors of DNA (MNDA and IFIX) 43 in HEK293T STING cells. However, increasing doses of MNDA and IFIX did not increase IFN-β promoter activity (Fig. 6j). To further confirm specificity of IFI16 for the STING pathway, we activated the IFN-β promoter by overexpression of the phospho-mimic IRF3 mutant IRF3-5D, or the adaptor protein MAVS (Supplementary Fig. 9). Co-expression of IFI16 did not elevate IFN-β promotor activity supporting that the function of IFI16 is specific to the STING pathway. In conclusion, IFI16 augments cGAS-dependent responsiveness to DNA, and this is dependent on the PYRIN and HIN domains of IFI16.

IFI16-deficient cells are unaffected by cGAMP stimulation

Based on the results above, we hypothesized that limited cGAMP production might not be the only factor contributing to impaired STING activation. We therefore sought to determine whether the immune response in IFI16 KO THP1 cells was normalized when bypassing the cGAS-DNA sensing mechanism. We explored this by stimulating cells directly with cGAMP. As expected, control cells and cGAS KO THP1 cells demonstrated a clear type I interferon response 4 and 8 h after infusion with cGAMP, whereas STING KO cells were insensitive to cGAMP stimulation (Fig. 7a). Interestingly, IFI16 KO cells behaved in a similar manner as STING KO cells (Fig. 7a). In MDMs, cGAMP infusion resulted in strong type I interferon responses in cells treated with scrambled siRNA whereas the response was significantly lower in MDMs treated with IFI16-specific siRNA (Fig. 7b). Using confocal microscopy we observed that control cells stimulated with cGAMP generated specific STING patterns, including multiple small cytoplasmic puncta and larger aggregations, in ER-like formations (Supplementary Fig. 10). In contrast, IFI16 KO cells generated small aggregates in ER but no cytoplasmic spots (Supplementary Fig. 10), indicating that IFI16 participates in regulating the function of STING downstream of cGAMP activation.

Image

( a ) Control, IFI16, cGAS, STING KO THP-1 cells or ( b ) MDMs with IFI16 siRNA knockdown, were infused with cGAMP (50 nM) at indicated time-points and subsequently evaluated for type I interferon secretion. ( c ) STING dimerization analysis by semi-native western blotting. Upper lane represents an overexposure of the dimer STING band. Total STING was run on a separate SDS–Page gel. ( d ) Control and IFI16 KO cells were infused with cGAMP (50 nM) for 2 h, fixed and stained for DAPI (blue), IFI16 (green) and IRF3 (red). ( e ) IRF3 translocation from cytoplasm to nuclear saturation were quantified by counting >50 separate images of control or IFI16 KO cells 2 h post cGAMP infusion. ( f ) Subcellular fractions of control and IFI16 KO cells stimulated with 50 nM cGAMP for 1 h were immunoblotted for phosphorylated IRF3 and total IRF3 in cytosolic (cyto) and nuclear (nucl) fractions. Data in ( a, b ) represent mean±sd of biological triplicates from ( a ) three independent experimental setups or ( b ) one donor; ( cf ) data is representative of one of three independent experiments.

Bild i full storlek

Next, we evaluated the kinetics of STING dimerization and phosphorylation in cells stimulated with cGAMP infusion. Digitonin alone did not result in STING dimerization (Fig. 7c). However, on stimulation with cGAMP, control THP1 cells demonstrated effective shift in STING dimerization after just 30 min (Fig. 7c). Unexpectedly, IFI16 KO THP1 cells produced a strong STING dimerization signal. However, this was not phosphorylated as observed for the control cells (Fig. 7c, high-exposure plot; lane 2–3 versus 7–8), suggesting a lack of TBK1 recruitment to the STING dimerization complex in absence of IFI16, which support our earlier findings (Fig. 5). This reduced STING phosphorylation would propose impaired IRF3 activation. This was confirmed by confocal microscopy visualizing IRF3 nuclear translocation one hour after cGAMP infusion (Fig. 7d). When multiple cells were evaluated, we found notably increased nuclear accumulation of IRF3 in control versus IFI16 KO cells (Fig. 7e). These results are supported by immunoblotting for phospho-IFR3 in lysates from control and IFI16 KO cells stimulated with cGAMP demonstrating strong signals for IRF3 phosphorylation in cytoplasmic fractions of control cells and a very faint signal in IFI16 KO cells (Fig. 7f). In nuclear fractions we observed an about 50% reduction of the signal for phospho-IRF3 in IFI16 KO cells (Fig. 7f), recapitulating the observations from the confocal microscopy.

Altogether, these results indicate that IFI16 not only cooperates with cGAS to promote cGAMP production but also has a key function downstream of cGAMP-STING interaction involving its recruitment of TBK1 to STING for phosphorylation.

PYRIN domain is essential for cGAMP-mediated STING signalling

The data presented suggested that IFI16 and TBK1 cooperate for effective activation of STING. To determine at which step IFI16 acts in the cGAMP-activated pathway, we measured STING dimerization and phosphorylation in control, IFI16 KO, and TBK1 KO THP1 cells. First, we confirmed that TBK1 KO cells stimulated with cGAMP did not produce type I interferon (Supplementary Fig. 11a). Multiple THP1 IFI16 KO clones were also evaluated for their response to low (50 nM) and high (400 nM) cGAMP infusion, demonstrating minimal type I interferon production (Supplementary Fig. 11b, c). Furthermore, reconstitution with IFI16 by lentiviral transduction before cGAMP infusion, demonstrated a partly restored interferon respond to cGAMP, which was not observed using a lentiviral transduction with eGFP (Supplementary Fig. 11d, e). The degree of interferon induction in the reconstituted cells did; however, not reach similar levels as control cells, probably due to a lower overall expression of IFI16 in the reconstituted KO cells (Supplementary Fig. 11d).

It is known that STING can also be activated by bacterial cyclic-di-nucleotides such as cyclic-di-AMP (refs 10, 44, 45). We found that THP1 cells infused with high and low doses of cyclic-di-AMP responded to high doses of c-di-AMP in an IFI16 dependent manner (Supplementary Fig. 11f).

We next investigated STING dimerization and observed that TBK1 KO cells produced STING-dimers at levels similar to control cells at early time points pi (Fig. 8a), as well as to IFI16 KO cells (Fig. 8b). However, in both cases we did not detect the slower migrating phosphorylated band seen in the control cells. We further, evaluated the degree of direct STING phosphorylation at Ser 366 and observed control THP1 cells mounting a robust phospho-signal 30 min to 1 h after cGAMP infusion (Fig. 8a, b) but as expected, no signal was detected in TBK1 KO cells (Fig. 8a). Moreover, in IFI16 KO cells we merely observed a very weak STING Ser 366 phospho-signal 1 h after stimulation (Fig. 8b).

Image

( a ) Control and TBK1 KO or ( b ) Control and IFI16 KO THP-1 cells were infused with cGAMP (50 nM) for 30 min, 1, 4 and 8 h and whole cell lysates was used to evaluate STING dimerization (upper panel) and specific STING phosphorylation at Ser 366 (lower panel). Black arrows represent the phosphorylated form of the STING dimer. ( c ) HEK293T STING -IFI16 expressing cells were infused with cGAMP (range from 50 to 250 nM) for 16 h and the degree of STING activation was evaluated by measuring expression of an IFN-β promoter Firefly gene normalized to a beta-actin promotor Renilla gene. ( d ) HEK293T- cGAS expressing cells were co-cultured with HEK293T STING that had been transfected with eGFP or one of the three IFI16 variants. Twenty-four hours after culturing cGAMP transfer and STING activation was evaluated by measuring expression of IFN-β promoter Firefly gene normalized to beta-actin promotor Renilla gene. Data represent mean±sd of biological triplicates, representative of three independent experiments. Unpaired t -test corrected for multiple comparisons using Holm–Sidak was performed to evaluate the significance. * P <0, 05; ** P <0, 01.

Bild i full storlek

The IFI16 PYRIN domain engages in protein–protein interactions, while the HINb domain is central for DNA binding 3, 31 . To identify the domain(s) responsible for triggering STING activation after cGAMP stimulation, we next evaluated IFN-β promoter activity in HEK293T STING cells overexpressing the various IFI16 constructs (Fig. 6i). In cells expressing wildtype IFI16, we observed a significant increase in the IFN-β promoter-stimulated luciferase activity response to cGAMP compared with cells expressing eGFP only, which was saturated between 500 and 1, 000 nM cGAMP (Supplementary Fig. 12). Interestingly, the ΔHin-IFI16 mutant augmented reporter gene expression to the same extent as wildtype IFI16, whereas the ΔPyrin-IFI16 mutant was impaired in enhancing cGAMP-stimulated STING-dependent IFN-β promoter activation (Fig. 8c). To exclude the possibility that we oversaturated cell activation levels by infusing high doses of recombinant cGAMP, we also investigated the response of cGAMP production in HEK293T cells and the possible transfer to other cells through gap-junctions 42 . We transfected HEK293T cells with cGAS-expressing plasmid and subsequently co-cultured them with HEK293T STING co-expressing one of the three IFI16 variants. Co-culturing cGAS-expressing cells with HEK293T STING resulted in minor IFN-β promoter-stimulated luciferase activity (Fig. 8d). Co-expressing eGFP from control plasmid resulted in low IFN-β activity possible due to a direct STING activation 46, but when these cells were co-cultured with cGAS-expressing cells the IFN-β promoter-stimulated luciferase activity significantly increased above background levels (Fig. 8d). When HEK293T STING -IFI16 cells were co-cultured with cGAS-expressing cells, the IFN-β promoter-stimulated luciferase activity significantly increased, once again indicating that IFI16 expression supports cGAMP-transferred activation of STING. A similar response was observed when we investigated the ΔHin-IFI16 mutant (Fig. 8d). Finally, overexpression of the ΔPyrin-IFI16 did not increase IFN-β promoter-stimulated luciferase activity (Fig. 8d), indicating that the protein–protein interaction domain of IFI16 is necessary for efficient activation and signalling of STING following cGAMP production.

Diskussion

DNA potently stimulates innate immune responses through a pathway dependent on the DNA sensor cGAS and signalling via STING, TBK1 and IRF3 to induce type I interferon expression 1 . Previously, several other DNA sensors have been proposed 2 . Here, we demonstrate a central role for IFI16 in innate DNA sensing in macrophages, and unveil a 'two-step' interconnected process where IFI16 enhances both cGAS-mediated cGAMP production, and cGAMP-mediated activation of the STING signalsome (Supplementary Fig. 13).

The function of IFI16 as a DNA sensor was demonstrated more than five years ago 6, and work by us and others suggested important roles for IFI16 in pathogen recognition 5, 9, 10 . However, after the discovery of cGAS as a DNA sensor and demonstration of a clear role of this protein in both men and mice 13, 16, 47 less attention has been given to other proposed DNA sensors, including potential interactions with the cGAS-STING pathway. However, a recent report highlights that cGAS may need cofactors to achieve optimal binding to cytosolic DNA 33 . Contrary, a recent report observes unaltered DNA sensing in mice depleted for the locus containing PYHIN-encoding genes 48 . These results argue against a role for murine PYHIN proteins in the cGAS-STING pathway. However, since mice do not have a clear ortholog of IFI16, it is difficult to extrapolate the murine data to human cells.

Our present results reiterate the necessity of cGAS and IFI16 to drive interferon responses in the human macrophage-like cell line THP-1 during infection with HIV, HSV-1 and CMV or by stimulation with synthetic DNA. More interestingly, we demonstrated that IFI16 is also necessary for initiating an early and robust interferon response to cytosolic DNA, HIV and herpes infections, and cGAMP stimulation in primary human macrophages. Our results suggest that IFI16 and cGAS cooperate in macrophages to enable optimal production of cGAMP that allows STING dimerization and downstream signalling events. We speculate that IFI16 has a function as co-factor for cGAS, through its capacity to bind double-stranded DNA (Supplementary Fig. 13). This model is similar to what has been suggested for PQBP1 in human dendritic cells 33 . However, PQBP1 appears to be more specific as a co-factor for retroviral infections than IFI16, although the precise PAMP has not been identified.

We have previously demonstrated that monocytic undifferentiated THP-1 cells have very low basal expression of IFI16 but show high expression levels of cGAS. These cells do respond immunologically to cytosolic DNA (ref. 10). However, when differentiated into macrophage-like cells over a two-day period they drastically change morphology, and also display strong elevation of IFI16 expression and decreased cGAS expression, which correlates with elevated interferon and cytokine responsiveness compared to undifferentiated cells 10 . Nonetheless, DNA-driven IFN-β expression is independent of IFI16 in undifferentiated THP-1 cells 10 . This suggests that the core cGAS-STING pathway may use a panel of co-factors, including IFI16 and PQBP1, depending on the cellular context. Notably, the physiological relevance of the IFI16-dependent phenotype observed in PMA differentiated THP-1 cells is supported by the demonstration of a role for IFI16 in primary human monocyte-derived macrophages for both DNA stimulation and cGAMP infusion. It is also interesting to notice that in the study by Almine et al . 49 an analogous function of IFI16 in human keratinocytes was observed. Primary keratinocytes treated with siRNA and HaCaT cells with IFI16-deficience lacked the capacity to produce interferon in respond to exogenous DNA and cGAMP. In comparison to our study, Almine et al . did however not observe that IFI16-deficiency affected production of cGAMP. These variances indicate cell-type specific differences for the fine-tuning of IFI16 function in respond to DNA.

The experimental design used here aimed to address a potential role for IFI16 in the cytosolic compartment. It is known that IFI16 is a multifunctional protein involved in nuclear as well as cytosolic processes, including sensing of foreign DNA in the nucleus 3, 50 . Others have reported a role for IFI16 in transcriptional regulation of the IFN-β promoter 51 . Our results based on measurement of cGAMP production, STING dimerization and phosphorylation clearly demonstrate that human macrophages deficient of IFI16 have impaired capacity to initiate these processes and hence to stimulate IRF3 activation. Thus, in the PMA-THP-1 macrophage model, IFI16 has a function as co-factor for cGAS, most likely through its ability to bind DNA. Of note, based on other recent publications 9, 11 we cannot exclude that IFI16 may also act by stabilizing cGAMP and inhibiting its turnover. Further studies are warranted to address this possibility. In addition, when macrophages were stimulated with cGAMP directly, we identified a hitherto unknown function of IFI16, independent of its cooperative function for cGAS activity. Specifically, IFI16 was not necessary for STING to initiate dimer formation, but was important for recruitment of TBK1 to STING and phosphorylation of STING. A recent study shows that STING can be phosphorylated at numerous positions, where phosphorylation at Ser 366 is important for downstream signalling to IRF3 (ref. 21). In addition, it has been proposed that activation of STING is associated with its trafficking from the ER to the ER-Golgi intermediate compartment 19 . In light of these data, it is interesting to note that even though STING dimerization occurred in IFI16-deficient cells with a delayed response, we observed less STING degradation in combination with reduced TBK1-directed phosphorylation. This could indicate that STING dimerization occurred in the ER, but did not traffic to the ER-Golgi intermediate compartment, where it is assumed to associate with TBK1 and leading to subsequent degradation of STING by the autophagy pathway 19 . However, further studies are warranted to determine whether STING translocation from the ER occurs in the absence of IFI16.

On the basis of our immunoprecipitation results, we propose that IFI16 constitutively binds TBK1. Upon cGAMP-triggered STING dimerization, IFI16 may then form a signalling complex with STING and TBK1 that allows TBK1 to phosphorylate STING. Furthermore, based on the results obtained using IFI16 mutants we propose that IFI16 promotes activation of the cGAMP-activated STING-TBK1 pathway by a process relying on PYRIN domain-dependent protein-protein interactions.

In conclusion, our data reveal that IFI16 is important for the DNA-activated cGAS-cGAMP-STING-TBK1 pathway in human macrophages, and that it acts at two levels in the upstream part of the pathway. IFI16 (i) augments cGAS-mediated production of cGAMP and (ii) enables cGAMP-mediated recruitment of TBK1 to STING. Our work thus identifies IFI16 as an important cofactor for cGAS in the initial steps of DNA sensing upstream of cGAMP production, and provides evidence for a novel appliance of a known PRR needed for downstream events in the STING signalling pathway. Finally, the results reveal that the activity of the cGAS-cGAMP-STING-TBK1 pathway can be fine-tuned by the cell-type and context-specific expression of the cellular factor IFI16.

metoder

Reagens

Cyclic [G(2′, 5′)pA(3′, 5′)p] (cGAMP) was obtained from BioLog. The dsDNA (HSV-1 60mer) was synthesize and annealed by DNA technology; sense strand 5′- CCA TCA GA AAG AG GTT TAA TA TTT TTG TGA GAC CAT CGA AGA GAG AAA GAG ATA AAA CTT; antisense 5′- AAG TTT TAT CTC TTT CTC TCT TCG ATG GTC TCA CAA AAA TAT TAA ACC TCT TTC TGA TGG. For more information see 6 . The ssDNA1 sequences was 5′-GTC TCT CTG GTT AGA CCA GAT CTG AGC CTG GGA GCT CTC TGG CTA ACT AGG GAA CCC ACT GCT TAA GCC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT GCT TCA AGT AGT G-3′. For more information see 5 . Herring testis DNA was from Sigma Aldrich (D6898); BX795 (tlrl-bx7) and poly I:C (tlrl-pic) were both acquired from InvivoGen.

plasmider

IFI16 mutant plasmid constructs were originated from a pCDNA3 human IFI16-HA tagged expression construct kindly provided by Professor Andrew Bowie, Trinity College Dublin. Overlap extension PCR was used to construct a ΔPyrin domain (consisting of amino acids 87–729 of IFI16) or a ΔHIN-A domain+HIN-B domain specific mutations (consisting of amino acids 1–191 and 460–729 of IFI16 and the point mutations K572A, K607A, R611A, S614A, K618A, N654A, K676A, K678A, K703A). Each PCR product was then recloned into a BamHI –and XhoI-digested pCCL-PGK-eGFP (ref. 52) together with a PCR-amplified IRES-BFP fragment by NEBuilder HiFi DNA Assembly according to manufactures instructions. For illustration see Fig. 6h.

The mBanana-cGAS fusion construct was engineered by PCR amplification of mBanana and cGAS and subsequent cloning into a NotI-digested pT2/CMV-eGFP.SV40-neo 53 by NEBuilder HiFi DNA assembly according to manufactures instructions.

Cell kultur

Human acute monocytic leukaemia cell line (THP-1) was cultured in RPMI 1640 (Lonza) supplemented with 10% heat inactivated fetal calf serum, 200 IU ml −1 Penicillin, 100 μg ml −1 Streptomycin and 600 μg ml −1 glutamine (hereafter termed RPMI complete). Mycoplasma infection was tested and ruled on a monthly basis using Lonza MycoAlert kit (LT07–703). To differentiate THP-1 cells into adherent phenotypically macrophages, cells were stimulated with 100 nM Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma Aldrich 79346 5MG) in RPMI complete for 24 h before medium was refreshed with normal RPMI complete and allowed to further differentiate an additional day (hereafter defined as macrophages). Of note, the haplotype of STING in the THP-1 parental cell type has been identified to be HAQ (ref. 17).

Peripheral Blood Mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy donors (blood donors gave written consent as accordingly to the ethical guidelines at Aarhus University Hospital) by Ficoll Paque gradient centrifugation (GE Healthcare). Monocytes were separated from PBMCs by adherence to plastic in RPMI 1640 supplemented with 10% AB-positive human serum. Differentiation of monocytes to macrophages was achieved by culturing in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% heat inactivated AB-positive human serum; 200 I IU ml −1 Penicillin; 100 μg ml −1 Streptomycin and 600 μg ml −1 glutamine for 10 days in the presence of 10 ng ml −1 M-CSF (R&D Systems).

HEK293T cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% heat inactivated FCS; 200 I IU ml −1 Penicillin; 100 μg ml −1 Streptomycin and 600 μg ml −1 glutamine. HEK-Blue IFN-α/β (InvivoGen) cells were cultured in DMEM supplemented with 10% heat inactivated FCS; 200 IU ml −1 Penicillin, 100 μg ml −1 Streptomycin, 600 μg ml −1 glutamine, 100 μg ml −1 normocin (InvivoGen), 30 μg ml −1 blasticidin (InvivoGen) and 100 μg ml −1 zeocin (InvivoGen).

TZM- bl indicator cells (kindly provided by Drs Kappes and Wu and Tranzyme Inc. through the NIH AIDS Reagent Program) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% heat inactivated FCS; 200 I IU ml −1 Penicillin; 100 μg ml −1 Streptomycin and 600 μg ml −1 glutamine.

Virus

Newcastle Disease Virus (NDV) was kindly provided by professor Peter Palese (The mount Sinai Hospital, USA); HSV1+17 and hCMV (AD169) viral strains were propagated in-house.

Replication competent HIV macrophage tropic strain Bal was generated in-house.

VSVg-pseudotyped Vpx-packed particles were generated by transfecting HEK293T cells with the plasmid pMD.2G and SIV3+ (containing all SIVmac proteins except Env, kindly provided by professor Gregory Towers, UCL). Supernatants were harvested after 48 h, concentrated through a 20% sucrose cushion. Viral pellets were resuspended in PBS, DNase treated and stored at −80 °C. Each Vpx prep was concentration determined by p24 ELISA and used at 125 pg p24 setup.

Transduction of THP-1 cells with lentiviral CRISPR/Cas9

We employed the CRISPR/Cas9 system to generate a set of THP-1 single clones with specific gene knockouts. Specifically, we used a lentiviral CRISPR/Cas9 vector 54 that encodes a codon-optimized nuclear-localized Cas9 gene N-terminally fused to the puromycin resistance gene via a T2A ribosome-skipping sequence. Additionally, the vector contains a human U6 promoter driving expression of a guideRNA (gRNA) consisting of a gene-specific CRISPR RNA (crRNA) fused to the trans -activating crRNA (tracrRNA) and a terminator sequence.

The gene-specific crRNA sequences cloned were: For Control KO cells we used the gene of beta-2-microglobulin (5′-GAGTAGCGCGAGCACAGCTA-3′); for IFI16 KO (#1; 5′-GTACCAACGCTTGAAGACC-3′), (#2; 5′-GTTCCGAGGTGATGCTGGTT-3′) or (#3; 5′- GACCAGCCCTATCAAGAAAG-3′); for cGAS KO (5′-GACTCGGTGGGATCCATCG-3′); for STING KO (5′-GAGCACACTCTCCGGTACC-3′); and for TBK1 KO (5′-GTCAGATTCTGGTAGTCCAT-3′).

VSVg-pseudotyped lenti-CRISPR virions were produced by transfecting HEK293T cells with the following plasmids: CRISPR/Cas9 vector, pMD.2G, pRSV-REV, and pMDlg/p-RRE. Viral supernatants were harvested after 72 h and used to transduce THP-1 cells by infection in the presence of 4 μg ml −1 polybrene. Transduced cells were selected with 2 μg ml −1 puromycin at 2 days post transduction. After two weeks a single cell suspension culture was established using limiting dilution. After three weeks individual clones were subjected to western blotting to confirm absence of the targeted gene products (see also Supplementary Fig. 1a). At least 15 clones were then assessed for proper cell proliferation and expansion, and dismissed if they were slow growing or increased cell death.

Reconstitution of IFI16 by lentiviral transduction

For the IFI16 reconstitution, the lentiviral vector pCCL/PGK-IFI16 was generated by inserting a PCR amplified IFI16 fragment from pCCL/CMV-DH287-IRES-BFP into BamHI –and XhoI-digested pCCL-PGK-eGFP 49 by NEBuilder HiFi DNA assembly.

Packaging plasmids pMD2.G, pRSV-Rev and pMDIg/pRRE were calcium phosphate-transfected together with pCCL/PGK-IFI16 into HEK293T cells. Vector-containing supernatants were harvested by filtration through a 0.45 μm filter (Sarstedt) and ultracentrifuged at RPM 25, 000 at 4 °C for 2 h on a 20% sucrose cushion. Pellets were re-suspended in PBS and stored at −80 °C. Two hundred and fifty ng p24 of LV-IFI16 or LV-eGFP (control) inoculums were then used to infect PMA-undifferentiated THP1 IFI16 KO cells using 6 μg ml −1 polybrene. After 6 h, PMA was added and cells were allowed to differentiate into macrophages. After 48 h, cells were stimulated with DNA or cGAMP. Supernatant was harvest after 8 or 20 h for type I interferon bioassay and cells were lysed for verification of IFI16 expression by immunoblotting.

Transfection of HEK293T cells

Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) cells were stably transfected with wild type human STING using the sleeping beauty-mediated transposition system. Human STING and SB100X encoding vectors were mixed with Polyethyleneimine in a 1:3 relationship and administered to the cells, which were allowed to incubate for 48-h. Cells were subsequently selected with 1 μg ml −1 puromycin for two weeks and allowed to expand before analysing stable expression of STING via western blotting.

DNA/RNA stimulation of cells

Standard stimulation of primary macrophages and two-days PMA-differentiated THP-1 with dsDNA, ssDNA and poly (I:C) was conducted on 2 × 10 5 cells in a 24-well format with 500 μl medium using lipofectamine 2000 (Life Technologies 11668-019) as carrier. Transfection protocols were as according to the manufacturer's instructions using a ratio of lipo-DNA/RNA of 1:1. For experimental details regarding concentration of DNA/RNA and time points before supernatant harvest and lyses of cells see figure legends.

cGAMP stimulation of cells

Two-hundred thousand PMA-differentiated THP-1 cells in 24-well plates were permeabilized with digitonin permeabilization buffer (50 nM HEPES, 100 mM KCl, 3 mM MgCl 2, 0.1 mM DTT, 85 mM sucrose, 0.2% BSA, 1 mM ATP, 1 mM GTP, pH 7) containing 5 μg ml −1 digitonin in the presence or absence of cGAMP. After incubation at 37 °C for 10 min, the permeabilization buffer was removed and replaced with warm RPMI medium with 10% FCS and 600 μg ml −1 glutamine. For experimental details regarding concentration of cGAMP and time points before supernatant harvest and lyses of cells see figure legends.

Functional type I interferon assay

To quantify functional type I interferon the reporter cell line HEK-Blue IFN-α/β (InvivoGen) was utilized according to the manufacturer's instructions. Thirty thousand HEK-Blue cells were seeded in a 96-well plates with 150 μl medium devoid of Blasticidin and Zeocin and given 50 μl supernatant the next day. This cell line expresses secreted embryonic alkaline phosphatase under the control of the IFN- α/β inducible ISG54 promotor. SEAP activity was assessed by measuring optical density (OD) at 620 nm on a micro plate reader (ELx808, BioTEK). The standard range was made with IFN-α (A2) (PBL Assay Science).

Enzymbunden immunosorbentanalys

Protein levels of the cytokines CXCL10 and TNF-α in supernatants, were measured using ELISA kits from PeproTech (CXCL10; 900-T39) and BioLegend (TNF-α; 430201) following the manufacturerŕs instructions.

RNA-analys

Gene expression was determined by real-time PCR, using TaqMan detection systems (Applied Biosciences). Genomic RNA from cells was collected using the High Pure RNA Isolation kit (Applied Bioscience) and RNA was quality controlled by Nanodrop spectrometry. RNA for human ISG54 (HS00533665), IFNβ (Hs01077958_s1), RNaseP (ThermoFisher #4316844) and DAG1 (HS00189308_M1) were analysed with premade TaqMan assays and the RNA-to-C t -1 kit following manufactures procedures (Applied Biosciences). The MX3005 (Stratagene) was used for PCR quantification.

Western blot

Two hundred thousand cells were lysed in 150 ul Pierce RIPA buffer (Thermo Scientific) supplemented with 10 mM NaF, 1 × complete protease cocktail inhibitor (Roche), 0.2% SDS, 1 × XT Sample Buffer (Bio-Rad) and 1x XT Reducing Agent (Bio-Rad). Whole cell lysates were sonicated using a Biorupture (Diagenode) 5 min at high intensity and denatured at 95 °C for 5 min before loading on gel. Separation was done on 10% or 4–20% SDS–PAGE gel electrophoresis (Criterion TGX gels, Bio-Rad). Transfer onto poly-vinylidene difluoride membranes (Bio-Rad) was done using a Trans-Blot-Turbo transfer system. All western blots were incubated and washed with TBS supplemented with 0.05% Tween-20. The following specific antibodies were used with PVDF membranes blocked in 5% skim-milk (Sigma Aldrich 70166-500G) and 1% skim-milk in antibody solutions (all 1:1, 000 dilution): anti-IFI16 (Santa Cruz sc-6050), anti-cGAS (Sigma HPA031700), anti-STING (Cell Signaling #13647) and anti-vinculin (Sigma Aldrich v9131). The following specific antibodies were used with PVDF membranes blocked in 5% BSA (Roche 10 739 086 001) and 1% BSA in antibody solutions (all 1:1, 000 dilution): anti-STING Ser 366 (a gift from Zhijian James Chen, UT southwestern Medical school, Texas), anti-phospho-TBK1 (Cell Signaling #4947s), anti-TBK1 (Cell Signaling cat not), anti-IRF-3 (Cell Signaling #3013), and anti-phospho-IRF3 (Cell Signaling #5483s). Secondary antibodies (dilution 1:15, 000), peroxidase-conjugated F(abŕ)2 donkey anti-mouse IgG (H+L), peroxidase-conjugated Affinipure F(abŕ)2 donkey anti-rabbit IgG (H+L) and peroxidase conjugated F(abŕ)2 donkey anti-goat IgG (H+L), were purchased from Jackson Immuno Research. IRF3 western blotting was conducted on nuclear fractions according to the manufacturer's instructions (Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells, Thermo Scientific) using anti-IRF3 (Santa Cruz sc-9082). All membranes were exposed using Clarity Western ECL Blotting Substrate. The levels of proteins were for some experiments quantified by densitometry (ImageJ) as specified in the figure. To verify phosphorylation events on proteins, whole cell lysates were pre-treated with 10 units of FastAP Thermosensitive Alkaline phosphatase according to manufaturer's protocol (Thermo Scientific).

Semi-native WB STING dimerization assay

STING dimerization was assayed under semi-native conditions. Two hundred thousand cells were lysed in 150 μl Pierce RIPA buffer (Thermo Scientific) supplemented with 10 mM NaF, 1 × complete protease cocktail inhibitor (Roche), 1 × XT Sample Buffer (Bio-Rad). Whole cell lysates were sonicated using a Biorupture (Diagenode) 5 min at high intensity before loading on gel without heating. Separation was done on 4–20% SDS–PAGE gel electrophoresis (Criterion TGX gels, Bio-Rad) where each gel was run initially for 10 min at 70 V and subsequently for 45 min at 120 V. Transfer onto poly-vinylidene difluoride membranes (Bio-Rad) was done using a Trans-Blot-Turbo transfer system. The blots were incubated and washed with TBS supplemented with 0.05% Tween-20. The following specific antibodies (used in 1:1, 000 dilution) were used on membranes blocked in 5% skim-milk (Sigma Aldrich 70166-500G) and 1% skim-milk antibody solutions: anti-STING (Cell Signaling #13647) and anti-vinculin (Sigma Aldrich v9131). Secondary antibodies, peroxidase-conjugated F(abŕ)2 donkey anti-mouse IgG (H+L) and peroxidase-conjugated Affinipure F(abŕ)2 donkey anti-rabbit IgG (H+L). Membranes were exposed using Clarity Western ECL Blotting Substrate.

Confocal microscopy

For visualization of IFI16 following transfection with DNA or cGAMP infusion, 50, 000 cells on 1.2 mm coverslips were fixed with 2% PFA for 15 min and permeabilized with 0.2% Triton X-100. Coverslips were stained with antibodies directed against IFI16 (C-18, Santa Cruz sc-6050), STING (R&D Systems, AF6516) or IRF3 (Cell Signaling 4302, s). Secondary antibodies included Alexa Fluor 488 Donkey-anti-rabbit, Alexa Fluor 568 Donkey-anti-sheep, and Alexa Fluor 488 Donkey-anti-goat (Molecular probes, A11002, A21099 and A11055, resp). Images were acquired using a Zeiss LSM 710 or LSM 780 confocal microscope using a 63 × 1.2 water lens. Images were handled using Zen 2011 (Zeiss) and ImageJ.

RNAseq analysis

Total RNA was extracted from 3 × 10^6 Control or IFI16 KO macrophages using the High Pure RNA Isolation kit (Applied Bioscience) kit. Library preparation and RNAseq was performed at BGI (Shenzhen, China). In short, the 12 RNA samples (each condition in triplicate) were DNase I treated, enriched for mRNA using the oligo(dT) magnetic beads, and fragmented into 130 bp fragments. First strand cDNA was performed using random hexamers followed by second strand cDNA synthesis. After purification, end-reparation, adaptor ligation, and size-selected using TAE-agarose gel, the fragments were enriched by PCR amplification, and sequenced on an Ion Proton platform. A minimum of 10 M clean reads was obtained from each sample. Using Partek Flow, the reads were aligned to human hg38 (whole genome) using STAR 2.4.1d. The mapped reads were annotated using RefSeq transcripts 2015-08-04. Differential expressed genes were analysed with Partek Gene Specific Analysis Algoritm. A list of induced genes after stimulation was obtained by filtering the gene list using the following thresholds (1) fold-change >10, (2) P< 0.01 and (3) total reads >30.

Co-immunoprecipitation

Ten million THP-1 macrophages grown in T75 flask with 15 ml medium were transfected with 4 μg ml −1 dsDNA using lipofectamine. Cells were harvested and resuspended in 500 ul Pierce Co-IP lysis buffer (Thermo Scientific) supplemented with 1x Complete Ultra (Roche) and NaF 10 mM. Cells were allowed to lyse at 4C for 90 min under rotation and cytosolic supernatants were cleared by centrifugation at 2, 000 g for 10 min. These lysates were then incubated at 4 °C overnight with 6 ug anti-IFI16 (Santa Cruz sc-6050) or 6 μg anti-STING (Cell Signaling 13647) primary antibodies. On the following day, each lysate was incubated with pre-washed Dynabeads magnetic protein G (Invitrogen), washed four times in Pierce Co-IP lysis buffer and proteins were detached from beads by incubating samples in a pH 2 elution buffer for 10 min on ice. Samples were subsequently neutralized, mixed with SDS-loading buffer and reducing agent, heated and loaded on SDS–Page.

Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

Three million THP-1 cells were seeded in 6-well plates with 3 ml medium and allowed to PMA-differentiate for two days before transfecting with 2 μg ml −1 dsDNA. Cells were subsequently lyzed in (80% methanol, 2% acetic acid, 18% deionized water). Lysates were spun at 10.000 × g for five minutes before collecting supernatant A. The pellet was resuspended in 2% acetic acid and incubated for five minutes on ice before being spun at 10.000 × g. Supernatant B was collected and pooled with supernatant A. The previous step was repeated generating supernatant C which was pooled with A+B. Supernatants were added to HyperSep aminopropyl solid phase extraction (SPE) cartridges (Thermo Scientific) for cGAMP purification. The SPE cartridges were conditioned with methanol following deionized water before applying supernatants. After supernatant run-through columns were washed in deionized water followed by methanol. cGAMP was eluted in 1.5 ml alkaline methanol (80% methanol+20% concentrated aqueous ammonia (25% NH 4 OH)). Eluates were evaporated using a vacuum centrifuge and redissolved in 50 μl mobile phase A (0.1% aqueous formic acid).

The liquid chromatography system was a Waters Acquity UPLC system that consisted of a binary pump, a flow-through-needle sample manager thermostated at 5±2 °C and a column oven set at 45±2 °C (Waters). The tandem mass spectrometer was a Waters Xevo TQ-S triple-quadrupole instrument with an electrospray ionization (ESI) source. A volume of 10 μl of the purified cGAMP was injected onto a HSS T3 column (1.8 μm, 200 Å, 2.1 mm ID × 100 mm) (Waters) running 100% mobile phase A. The mobile phase was changed through a linear gradient to 80% A and 20% B (0.1% FA in acetonitrile) over 5 min. Then, the gradient was changed to 100% B over 0.1 min. Eight minutes after injection, the gradient was returned to 100% A over 0.1 min, and the column was equilibrated for 3.9 min before the next injection, resulting in a total runtime of 12 min. The column flow rate was 400 μl min −1 . The source and desolvation temperatures were set at 150 °C and 600 °C, respectively, and the cone and desolvation nitrogen gas flows were set at 150 l h −1 and 1, 000 l h −1, respectively. The mass spectrometer was operated in both positive and negative ion modes with a capillary voltage of 2.3 kV and a cone voltage of 30 V. The dominant precursor ions were the double charged molecular ions, m/z 338 in ESI(+) and m/z 336 in ESI(−). Several useful transition products were obtained by collision-induced dissociation using argon as collision gas. The transition products measured in ESI(+) were m/z 152 (obtained by applying a collision energy (CE) of 15 eV), m/z 524 (CE 9 eV) and m/z 136 (CE 22 eV). In ESI(−) m/z 134 (CE 18 eV) and m/z 150 (CE 18 eV) were measured. To achieve semi-quantitative results corresponding blank samples were spiked with cGAMP to a concentration of 10 nM (for single point calibration curves) or concentrations of 0.1, 1, 10, 100, 200, 300 and 400 nM (for 7-point calibration curves). The m/z 152 product ion obtained in ESI(+) was used as the primary quantifier.

siRNA mediated knock down

On days 6 and 8 post isolation, monocyte derived macrophages were transfected with a pool of IFI16 specific siRNAs (#HSS105205, 6, 7; Life Technologies or #L-020004-00; Dharmacon) or the respective scrambled siRNA controls (45 nM) using Lipofectamine RNAiMax (Life technologies) according to the manufacturer's instructions, followed by infection or stimulation at day nine or day 10 respectively.

Luciferasanalys

HEK293T overexpressing STING cells were seeded in 6-well plates at a density of 5 × 10 5 cells per well and cultured for 24 h. The cells were transiently transfected with a transfection mixture consisting of DNA and the transfection agent polyethylenimine-max (PEI-max) in a ratio of 1:3. For all experiments, the DNA mixture contained 968.5 ng reporter plasmid containing firefly luciferase under the control of the IFN-β promoter, 31.2 ng reporter plasmid containing Renilla luciferase under the control of the β-actin promoter and 1, 000 ng plasmid DNA of the IFI16-wt, IFI16-PYRIN, IFI16-HIN-A type, cGAS, or eGFP as a control. The DNA and PEI mixtures were mixed and incubated 15 min at room temperature before applied to the cells. Cells were incubated for 18 h and reseeded on 96-well plate coated with poly- L -Lysine (Sigma 3438-100-01) and incubated for 18 h before infusion with cGAMP or digitonin buffer as a control for 10 min. After incubation media was removed and cells were lyzed (Promega E2920) and luciferase and Renilla signal was measured according to manufactory instructions.

Sequencing

Genomic DNA was extracted and purified from THP1 KO cells using DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) followed by PCR amplification with primers designed to cover an area of 350 nucleotide around the gRNA target sequence in the IFI16 gene. PCR fragments were inserted into the TOPO-TA plasmid following the manufactures procedure. At least 10 individual clones from each gRNA target were evaluated by Sanger sequencing (GATC, Germany).

Statistisk analys

For analysis of statistically significant differences between multiple groups of data we used unpaired Student t -test for multiple comparisons using Holm-Sidak. For analysis of three groups of data we used one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test.

Data tillgänglighet

Sequence data that support the findings of this study have been deposited in ENA with the primary accession code PRJEB18609. The data that support the findings of this study are available from the corresponding author on reasonable request.

Ytterligare information

How to cite this article: Jønsson, KL et al . IFI16 is required for DNA sensing in human macrophages by promoting production and function of cGAMP. Nat. Commun. 8, 14391 doi: 10.1038/ncomms14391 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande figurer

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.