Identifiering av reglerande funktioner för 4-1bb och 4-1bbl vid myelopoies och utveckling av dendritiska celler | naturimmunologi

Identifiering av reglerande funktioner för 4-1bb och 4-1bbl vid myelopoies och utveckling av dendritiska celler | naturimmunologi

Anonim

Abstrakt

Den costimulatory molekylen 4-1BB och dess ligand 4-1BBL kan kontrollera adaptiv immunitet, men här visar vi att deras interaktion också undertryckt myelopoies. Vi fann att 4-1BBL uttrycktes på hematopoietiska stamceller, differentierade vanliga myeloida progenitorer och granulocyt-makrofagprogenitorer, och 4-1BB var inducerbar på aktiverade myeloida progenitorer. Jämnt antal granulocyt-makrofagföräldrar, myeloida linjerceller och mogna dendritiska celler var högre i 4-1BB- och 4-1BBL-bristande möss, vilket tyder på en negativ funktion, och vi bekräftade detta resultat med benmärgschimärer och i in vitro , där frånvaron av interaktioner mellan 4-1BB och 4-1BBL ledde till ökad differentiering till dendritiska cellstamningar. Den regulatoriska aktiviteten medierades av 4-1BBL, med bindning genom 4-1BB som hämmar differentiering av myeloida progenitorer. Således har 4-1BB och 4-1BBL en tidigare okänd funktion för att begränsa myelopoies och utvecklingen av dendritiska celler.

Huvudsaklig

Receptorn 4-1BB (även kallad CD137 och TNFRSF9), en medlem av tumörnekrosfaktorn (TNF) -receptorn "superfamily", identifierades först som en inducerbar costimuleringsmolekyl på aktiverade T-celler 1 . Liganden av 4-1BB (4-1BBL; även kallad CD137L eller TNFSF9), även ett superfamiljelement av TNF, befanns senare uttryckas på aktiverade antigenpresenterande celler såsom B-celler, makrofager och dendritiska celler (DC) 2, 3 . Interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL reglerar immunitet och har föreslagits att "företrädesvis" kontrollera T-cellersvar, på grundval av studier av olika musmodeller av cancer, infektionssjukdom och autoimmun sjukdom 4, 5 . Mycket av den tidiga litteraturen om 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner härstammade från studier med agonistantikroppar mot 4-1BB och 4-1BBL-brist ( Tnfsf9 - / - ) -möss 5, som visade en positiv reglerande funktion i T-cellprimning 6, 7 och föreslog att signaler från 4-1BB kostimulerar T-celler. Däremot har efterföljande data antytt att biologin för 4-1BB är mycket mer komplex än bara positiv reglering av T-cellimmunitet. Splenocyter från 4-1BB-bristfälliga ( Tnfrsf9 - / - ) möss visar hyperproliferation som svar på mitogener 8, och adoptivöverföringsexperiment med antigenspecifika T-celler som inte kan uttrycka 4-1BB har visat förbättrad snarare än undertryckt initial CD4 + och CD8 + T-cell-svar in vivo 9, 10 . Vidare har annan forskning med agonistantikropp mot 4-1BB (anti-4-1BB) visat undertryckande av inflammation och autoimmunitet i många inställningar 11 ; sådana uppgifter kan förklaras av marknadsföring av regleringsmekanismer eller en verklig undertryckande aktivitet.

Även om det ursprungligen ansågs vara exklusivt för T-celler, kan uttrycket av 4-1BB in vivo vara mycket brett. Det har hittats på naturliga mördare (NK) -celler 12 och är också inducerbart på vissa myeloida linjerceller, såsom DC 13, 14, 15, granulocyter 16 och mastceller 17 . Dessutom uttrycker DC och mastceller både 4-1BB och 4-1BBL efter aktivering, eventuellt samtidigt, och tvärbindning av 4-1BB på dessa celler kan reglera cellfunktionen 14, 17 . Tnfrsf9 - / - och Tnfsf9 - / - möss visar inga uppenbara defekter i utvecklingen av T-lymfocyter och B-lymfocyter och lymfoida organ 8, 18, medan transgen uttryck av 4-1BBL under kontroll av promotorn av genen som kodar för huvudhistokompatibilitetskomplex ( MHC) klass II resulterar i selektiv uttömning av B-celler och populationens expansion av Mac-1 + celler 19 . Speciellt visar Tnfrsf9 - / - celler från mjälte, blod och benmärg förbättrad myeloidkolonidannande potential in vitro 8 . Sammantaget antyder dessa resultat möjligheten att 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner är involverade i cellutveckling och differentiering, särskilt i myeloidlinjen. Här rapporterar vi att 4-1BBL uttrycktes på hematopoietiska stamceller (HSC: er) och myeloida progenitorceller, inklusive vanliga myeloida progenitorer (CMP: er) och granulocyt-makrofagprogenitorer (GMP), såväl som differentierande myeloida stamceller, och 4-1BB var inducerbar på de sista cellerna med cytokiner som reglerar myelopoies. Vi fann att interaktionen mellan dessa molekyler funktionellt undertryckte tidiga steg av myelopoies och begränsade differentieringen av monocyter och DC, inklusive konventionella DC (cDC) och plasmacytoid DC (pDC) -linjer. Våra resultat definierar en tidigare oidentifierad regulatorisk funktion för 4-1BB – 4-1BBL-interaktionen i utvecklingen av myeloida linjerceller och DC.

Resultat

Uttryck av 4-1BBL på HSC: er och förfäder

Vi bedömde uttrycket av 4-1BB och 4-1BBL i benmärgen. Karaktäriseringen av benmärgsceller har möjliggjort identifiering av den stegvisa utvecklingen av HSC: er och förfäder 20, 21, 22 . Benmärgsceller grupperades i flera populationer (fig. 1). Dessa inkluderade LSK-celler (lineage-negative (Lin - ) Sca-1 + c-Kit hi interleukin 7-receptor a-negativ (IL-7Ra - )), som omfattar långsiktiga och kortvariga HSC: er och multipotenta förfäder (MPP) ; myeloida föräldrar (Lin - Sca-1 - c-Kit hi IL-7Ra - ), inklusive CMP: er, GMP: er och megakaryocyt-erytrocytprogenitorer (MEP); och vanliga lymfoida progenitorer (CLPs; Lin - Sca-1 lo c-Kit lo IL-7Ra + ). Membranuttryck av 4-1BBL regleras efter bindning till 4-1BB, ett vanligt fenomen i TNF-familjen, troligen genom klyvning från cellmembranet; därför analyserade vi celler från både vildtyp och Tnfrsf9 - / - möss (fig. 1). Vi upptäckte 4-1BBL på långsiktiga och kortvariga HSC: er och MPP: er (Fig. 1a), såväl som CLP: er (Fig. 1b) och CMP: er och GMP: er, men inte på MEP: er (Fig. 1c). Efter differentiering förlorades 4-1BBL-expression på mogna celler i de specifika linjerna (B-celler, T-celler, granulocyter och monocyter) i benmärgen och periferin (kompletterande Fig. 1 online och data visas inte). Således är 4-1BBL tillgängligt på HSC: er och stamfaderceller i benmärgen, vilket antyder en möjlig funktion i tidiga steg av hematopoies.

Flerfärgad färgning av vildtyp (WT), Tnfrsf9 - / - och Tnfsf9 - / - benmärgsceller, med grindning av Lin + celler genom färgning med CD11b, CD3, B220, Ter119, Gr-1 och CD11c och ytterligare karakterisering av Linceller. Öppna histogram, 4-1BB eller 4-1BBL-färgning; grå histogram, isotypkontroller. Siffror i diagram visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten för isotypkontroll (vänster) och 4-1BB eller 4-1BBL (höger). LT, långsiktig; ST, på kort sikt; MP, myeloid förfäder. Data är representativa för tre till fem oberoende experiment.

Bild i full storlek

Vi hittade 4-1BBL på HSC och MPP oavsett om celler härstammade från vildtyp eller Tnfrsf9 - / - möss, men uttryck på CLP, CMP och GMP begränsades huvudsakligen till celler som saknade 4-1BB (fig. 1). Detta resultat indikerar att 4-1BBL på CLP: er, CMP: er och GMP: er aktivt engageras in situ med 4-1BB i benmärgen, men att 4-1BBL på HSC: er och MPP: er kanske inte är aktiva under stabila tillstånd. I linje med idén att 4-1BB och 4-1BBL är involverade i hematopoies, visade analys av antalet stamceller och stamfårceller i benmärgen hos vuxna 4-1BB- eller 4-1BBL-bristande möss ökade procenttal av GMP: er och CD11b + myeloida linjeceller (fig. 2a). Denna upptäckt ledde till den oväntade idén att dessa molekyler har en undertryckande eller hastighetsbegränsande funktion i tidiga steg av myelopoies. Ytterligare att stödja den slutsatsen fann vi högre procentsatser av CD11c hi DC i mjälten i frånvaro av 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner (fig. 2b), vilket huvudsakligen återspeglas av mer CD4 + CD8 - cDC, även om vi fann statistiskt signifikanta skillnader i siffrorna för alla likströmsdelar, inklusive pDC: er (fig. 2c). Dessa data antyder att 4-1BBL på CMP: er eller GMP, eller vid differentierande avkomma av dessa celler, genom ingrepp av 4-1BB, representerar ett hastighetsbegränsande steg i myelopoies som leder till differentiering av DC som ackumuleras i lymfoida organ. Även om CLP uttryckte 4-1BBL hittade vi ingen skillnad i deras steady-state-nummer (Fig. 2a) eller i perifera B-linjerceller (follikulär, marginell zon, B-1a; Fig. 2c) eller T-celllinjen (konventionell T celler, regulatoriska T-celler och NKT-celler; data visas inte) i Tnfrsf9 - / - möss, vilket indikerar att 4-1BBL inte är viktigt i CLP vid normala tillstånd för lymfopoies.

( a ) Flerfärgad färgning av vildtyp, Tnfrsf9 - / - och Tnfsf9 - / - benmärgsceller från 7 till 9 veckor gamla kvinnliga möss för att bedöma frekvensen av stamceller (långsiktiga och kortvariga HSC: er), förfäder (MPP, CLP, CMP, GMP och MEP) och myeloid-lineage celler (CD11b + ) i procent av totala benmärgsceller. Varje symbol representerar en individuell mus; små horisontella linjer mellan symbolerna indikerar medelvärdet. *, P <0, 05 och **, P <0, 01, kontra vildtypskontroll. ( b, c ) Flerfärgad färgning av vildtyp och Tnfrsf9 - / - splenocyter från 10- till 11 veckor gamla kvinnliga möss för att bedöma avstamning. ( b ) Flödescytometri av CD11c och framåt spridning (FSC). Siffror ovan angivna områden indikerar procent CD11c hi- celler. ( c ) Totalt antal av varje cellundergrupp per mjälte; varje stapel är medelvärdet ± sem av åtta möss. Gran, granulocyt; Mac, makrofag. *, P <0, 05 och **, P <0, 01, kontra kontroll. Data är representativa för två till tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Begränsning av myelopoies med 4-1BB på myeloidföräldrar

Källorna till 4-1BB inträffade då. Vi upptäckte inte 4-1BB på någon stamcell- eller stamförepopulation i benmärgen in situ , förutom för en liten procentandel (2-3%) av CLP (fig. 1b). Benmärgs-NK-celler och vissa CD8 + T-celler uttryckte 4-1BB (kompletterande fig. 1 och data inte visade), vilket förmodligen återspeglade perifera aktiverade celler som handlar in och ut från detta organ. Dessa celler kan därför representera en potentiell källa för 4-1BB för att ligera 4-1BBL.

En annan potentiell källa kan vara en differentierande stamfadercell som deltar i cellintrinsik eller cell-extrinsisk reglering, och bristen på upptäckt av 4-1BB i benmärgen in situ kan återspegla mycket kortvarigt uttryck inducerat av cytokiner som främjar myelopoies. För att testa den idén odlade vi renade totala myeloida progenitorer (Lin - Sca-1 - c-Kit hi IL-7Ra - ; Fig. 3a) med en cytokin "cocktail" känd för att stödja in vitro myelopoies (stamcellfaktor, IL- 11, IL-3, trombopoietin och granulocyt-monocyt-kolonistimulerande faktor (GM-CSF)) 23, 24 . De flesta myeloida progenitorer nedreglerade c-Kit-uttryck till mellanliggande mängder efter 1 d och genomgick stegvis differentiering till myeloid-linjeceller (Lin + c-Kit - ) genom en övergångscellpopulation (Lin - c-Kit int och Lin + c-Kit int ; Fig. 3a och kompletterande figur 2a online). Vi hittade också en subpopulation av celler som bibehöll myeloida progenitor-liknande markörer, genom att de var Lin-c-Kit hi, som vi visualiserade från dag 2-6 medan de bibehöll sin ytfenotyp (fig. 3a och kompletterande fig. 2a) . Ytterligare karaktärisering av Lin + -celler visade att 95% var CD11b + (data inte visade) och vissa fick uttryck för F4 / 80 eller Gr-1 vid dag 4 (fig. 3b), vilket indikerade deras differentiering i monocyt- och granulocytlinjerna. De flesta Lin-c-Kit- hi- celler uttryckte immunoglobulinreceptorn FcεRIa, Sca-1 och integrin a4p7, vilket antydde att dessa celler differentierade föregångare till mogna mastceller 25 (fig. 3b).

Flödescytometri av totala myeloida progenitorer (fig. 1) sorterade från vildtyp och Tnfrsf9 - / - benmärg och odlades med stamcellfaktor, IL-11, IL-3, GM-CSF och trombopoietin. ( a ) Lin - IL-7Ra - celler färgade med anti-Sca-1 och anti-c-Kit (Presort) och sedan sorterade som myeloida föräldrar (skisserat område), analyseras sedan ytterligare för avstamningsmarkörer (CD11b, Gr-1 och Ter119) och c-Kit vid 4 d efter cytokinstimulering och uppdelad i fyra grupper (nedan): Lin - c-Kit int (I), Lin + c-Kit int (II), Lin + c-Kit - (III) och Lin - c-Kit hej (IV). ( b ) Karakterisering av Lin + -celler (CD11b + ; ovan) och Lin-c-kit hi- celler (nedan) på dag 4. Siffror i kvadranter (ovan) indikerar procentceller i vardera. ( c ) Uttryck av 4-1BB eller 4-1BBL på olika delmängder (ovan tomter) på dag 3 och dag 4. ( d ) Karakterisering av 4-1BB + -celler i Lin + (CD11b + ) och Lin - c-Kit Hejpopulationer på dag 4 respektive dag 3. Grå histogram ( b - d ), isotypkontroll. Data är representativa för två till tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Vi fann att 4-1BB inducerades på subpopulationer av Lin + -celler, ökande från dag 3 till dag 6 (fig. 3c och kompletterande fig. 2b, c). Dessutom var 4-1BB framträdande på ytan av Lin - c-Kit hi- celler på dag 3, men dess uttryck var mer övergående. Lin + celler som uttryckte 4-1BB var CD11b hi c-Kit int och mest uttryckta F4 / 80, varvid endast 3–5% var Gr-1 + (fig. 3d); därför representerade de myeloida stamceller som differentierade sig i monocytlinjen. Lin-c-Kit hi- celler som uttryckte 4-1BB var FcεRIα + och FcεRIα - och hade låg ytuttryck av Sca-1 och integrin a 4 ß 7 (fig. 3d), vilket bekräftade att 4-1BB också var inducerbar vid differentiering föregångare för mastceller. Vi fann att 4-1BBL uttrycktes på Lin-c-Kit int- populationen genom hela kulturen men nedreglerades nästan fullständigt på Lin + c-Kit int- celler (fig. 3c och kompletterande fig. 2b, c). När cellerna ytterligare differentierades till Lin + c-Kit - celler hittade vi igen 4-1BBL men i lägre mängd. Vi noterade att 4-1BBL också var närvarande på ytan av Lin - c-Kit hi- celler genom kultur. I de flesta fall var 4-1BBL-expression högre på 4-1BB-bristande celler, vilket antydde att aktiv ligering med 4-1BB inträffade i dessa kulturer. När vi odlade myeloida progenitorer med olika cytokinkombinationer som kan stimulera spridning men mindre differentiering, fann vi att både Lin - c-Kit hi och myeloid-linjeceller saknade 4-1BB, och dess uttryck berodde på GM-CSF (Kompletterande Fig . 3 online). Däremot fanns det 4-1BBL på Lin - c-Kit int- cellerna oavsett cytokiner tillagda i kultur (data visas inte).

Således, 4-1BB uttryckt på differentierande myeloida linjerceller och mastcellsförstadier, tillsammans med 4-1BB på benmärgs-bosatta CD8 + T-celler och NK-celler, kunde samarbeta med 4-1BBL på CMP: er, GMP och / eller celler härledda från de förfäder som differentierar sig i monocyt- eller DC-linjen. Till stöd för idén att källan till 4-1BB in vivo förmodligen differentierar myeloid- och mastcellprekursorer och bekräftar förslaget om en reglerande snarare än stimulerande funktion, fann vi att fler Lin - c-Kit hi mastcellprekursorer (fig. 4a) och Lin + c-Kit - myeloida linjerceller (fig. 4b – d) genererades in vitro över tid när renade Tnfrsf9 - / - eller Tnfsf9 - / - myeloida föräldrar differentierades i kultur. För att ytterligare undersöka denna regulatoriska händelse, tillsatte vi en agonistisk antikropp till 4-1BB 26 och ett fusionsprotein av 4-1BB och immunoglobulin (4-1BB – Ig) som levererades i plattbunden form för att tvärbinda 4-1BBL, till myeloidprogenitor kulturer. Agonistisk stimulering av 4-1BB påverkade inte mycket på myelopoies. Däremot resulterade 4-1BB-Ig i mycket mindre ackumulering av Tnfrsf9 - / - myeloida linjerceller, till antal noterade med vildtypceller (Fig. 4c), men kunde inte vända utväxt av Tnfsf9 - / - myeloida föräldrar (Fig. 4d). Således har bindningen av 4-1BB till 4-1BBL på differentierande myeloida progenitorer (CMP: er och GMP) och / eller myeloid-linjerad celler en undertryckande effekt på ackumuleringen av myeloida linjerceller som åstadkommes genom hämmande signalering genom 4-1BBL. Denna åtgärd är analog med publicerade resultat som visar att tvärbindning av 4-1BBL undertrycker differentiering och / eller utväxt av osteoklaster från benmärgsmakrofager som svar på RANKL, liganden för receptor-aktivatorn av transkriptionsfaktorn NF-KB 27, 28 .

Flödescytometri av vildtyp, Tnfrsf9 - / - och Tnfsf9 - / - myeloida progenitorer odlade med cytokiner såsom beskrivs i figur 3. ( a, b ) Lin - c-Kit hi- celler ( a ) och myeloid-avstamning (Lin + c) -Kit - ) celler ( b ) över tiden. ( c, d ) Myeloid-avstamningsceller på dag 4 ( c ) och dag 5 ( d ) efter att myeloida förfäder stimulerades med plattbundna 4-1BB-Ig och kontrollerande humant IgG (hIgG) eller lösligt 3H3 (Anti-4 -1BB) och kontroll-rått IgG. Varje stapel är medelvärdet ± sem av triplikat. **, P <0, 01, kontra kontroll. Data är representativa för två till tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Negativ reglering av myelopoies och DCs med 4-1BB

För att ytterligare visa en undertryckande funktion för 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner i myelopoies in vivo , gjorde vi konkurrerande återbefolkningsexperiment. Vi tappade vildtyp (CD45.1 + ) och Tnfrsf9 - / - (CD45.2 + ) benmärg av B-celler och T-celler och överförde 1: 1 blandningar av benmärgsceller till dödligt bestrålade mottagarmöss (CD45.1 + ). 8 veckor efter rekonstitution var huvudpopulationen av blodmonocyter CD45, 2 + -celler härrörande från Tnfrsf9 - / - benmärg (Fig. 5a). Denna population inkluderade både Gr-1 + och Gr-1 - undergrupper, som föreslås ha en alternativ potential att differentiera till DC och makrofager 29 . Parallellt gynnades utveckling av blodgranulocyter i frånvaro av 4-1BB. Analys av benmärg, i vilken initial myelopoies sker, vilket leder till produktion i blodet, visade vidare en större andel CD11b + Gr-1 + celler av Tnfrsf9 - / - ursprung (Fig. 5b).

( a – e ) Analys av rekonstitutionen av celler i blod och benmärg (efter 8 veckor) och mjälte (efter 10 veckor) i blandad benmärgschimärer utvecklad genom injektion av en 1: 1-blandning av vildtyp (CD45) .1 + ) och Tnfrsf9 - / - (CD45.2 + ) benmärg till dödligt bestrålade vildtypsmöss. ( a ) monocyter (Mo) och granulocyter bland totala vita celler (leukocyter) i blod; monocytundersättningar kategoriseras vidare som Gr-1 + eller Gr-1 - . ( b ) Andel av myeloida linjerceller (CD11b + Gr-1 + ) bland totala leukocyter i benmärg. ( c ) Flödescytometri av cDC: er (vänster) och pDC: er (höger) bland totala splenocyter (ovan), och av cDC-undergrupper i mjälte med grindar på CD11c hi och underkategorisering på basis av CD8- och CD4-uttrycket (nedan). Siffror ovan angivna områden (ovan) eller i kvadranter (nedan) anger procent CD11c hi- celler i vardera. ( d, e ) Totalt antal cellundersättningar i mjälte. Vildtyp, CD45.1 + ; Tnfrsf9 - / - , CD45.2 + . Varje stapel är medelvärdet ± sem av tre till fyra möss. *, P <0, 05, och **, P <0, 01, kontra kontroll (parat Student's t- test). ( f ) Utveckling av myeloida linjerceller på dag 8 efter överföring av CMP: er, sorterade från vildtyp (CD45.1 + ) och Tnfrsf9 - / - (CD45.2 + ) -möss och blandat i ett förhållande av 1: 1, till dödligt bestrålade Rag1 - / - (CD45.2 + ) -möss. Öppna och fyllda cirklar (indikerar vildtyp respektive Tnfrsf9 - / - myeloid-lineage-celler) från samma mottagarmöss är länkade till linjer. P = 0, 038 (parat studentens t- test). Data är representativa för två till tre experiment (medelvärde ± sem).

Bild i full storlek

Till stöd för idén att 4-1BB begränsar homeostasen hos myeloida linjerceller, visade analys av splenocyter att många fler DC: er för både den konventionella linjen (cDC: er, CD11c hi och hög MHC klass II-uttryck, IA / IE hi ) och plasmacytoid avstamning (pDC: er; CD11c lo PDCA-1 + IA / IE int ) härstammade från Tnfrsf9 - / - benmärg (fig. 5c, d). Vi erhöll liknande data med perifera lymfkörtlar (data visas inte). Avsaknaden av 4-1BB gynnade utvecklingen av CD4 + CD8-celler, med en högre procentandel i cDC-populationen (Fig. 5c), även om både CD4 + CD8- och CD4-CD8 + -populationer var större i antal (Fig. 5d) ). Vi hittade ingen skillnad i mognad av DC på basis av uttrycket av CD80, CD86, CD40 och MHC klass II molekyler (data visas inte). Denna upptäckta replikerar och bekräftar den fasta typen av steady-state hos 4-1BB-bristande möss (fig. 2c), även om den undertryckande effekten var större, vilket antagligen återspeglar den högre hastigheten av hematopoiesis i benmärgschimärerna. I lymfoida organ var liknande antal granulocyter (CD11b + Gr-1 hi ), NK-celler (CD3 - NK1.1 + DX5 + ) och CD4 + och CD8 + T-celler härledda från vildtyp och Tnfrsf9 - / - ben märg. Nästan samma mönster av cellutveckling var närvarande i rekombinationsaktiverande gen 1-brist ( Rag1 - / - ) mottagare av oseparerade benmärgsceller (kompletterande figur 4a online) och i kongen möss vid olika tidpunkter (kompletterande figur 4b och data visas inte). Således begränsar 4-1BB utvecklingen av DC som ackumuleras i lymfoida organ under stabil tillstånd och under förhållanden med betydande myelopoies. Noterbart hittade vi också fler B-celler av Tnfrsf9 - / - ursprung i vildtypen och Rag1 - / - mottagare av blandad chimär (fig. 5e och kompletterande fig. 4a, c), ett resultat som inte replikerats i steady-state i möss med 4-1BB-brist (fig. 2c). Detta visar att uttryck av 4-1BBL på CLP (fig. 1) eller deras avkommor kan bli aktiva och undertryckande för B-cellutveckling under förhållanden med betydande lymfopoies.

Expression av 4-1BB på benmärgsceller av vildtyp kompenserade inte för bristen på 4-1BB på knockout-cellerna i de blandade chimärerna. Denna upptäckt antydde att 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner är cellintresse för att differentiera myeloida föräldrar och att 4-1BB-uttryckande T-celler och NK-celler som är bosatta i benmärgen är osannolikt att vara de viktigaste medlarna för reglering. Genom att utvidga den idén fann vi att Tnfrsf9 - / - CMP: er, åtskilda från CLP: er och HSC: er, fortfarande visade förbättrad differentiering i myeloidlinjen i förhållande till vildtyp CMP: er när de överfördes till en T-cell-bristfällig Rag1 - / - -miljö (Fig. 5f ).

Undertryckande av myelopoies och DC-utveckling med 4-1BBL

För att bekräfta att den undertryckande funktionen av 4-1BB vid myelopoies och DC-utveckling berodde på interaktionen med 4-1BBL, och för att ytterligare stödja tanken att varje interaktion kan vara cellintresse för att svara och differentiera förfäderceller genererade vi blandade chimärer med benmärg från Tnfsf9 - / - möss. Replikering av resultaten med Tnfrsf9 - / - benmärg, ungefär 70% av DC i mjälten, av både den konventionella och plasmacytoid-linjen, härleddes från Tnfsf9 - / - benmärg (fig. 6a och kompletterande fig. 4d). På liknande sätt var ungefär fem gånger så många cDC: er i lymfkörtlarna av Tnfsf9 - / - ursprung (Fig. 6b). Dessutom var en större andel CD11b + Gr-1 + celler av Tnfsf9 - / - ursprung närvarande i benmärgen (Fig. 6c). T-celltal var lika; emellertid återigen fann vi förbättrad utveckling av B-celler från Tnfsf9 - / - benmärg (Fig. 6a). Sammantaget visar dessa resultat att vid förhållanden med betydande hematopoies, interaktionen av 4-1BB med 4-1BBL negativt reglerar myelopoiesis och B-lymfopoies i benmärgen och utvecklingen av DC och B-celler som befolkar perifera lymfoida organ.

Rekonstituering av cellpopulationer i blandade benmärgschimärer (vildtyp (CD45.1 + ) eller Tnfsf9 - / - (CD45.2 + )) 8 veckor efter överföring. ( a, b ) Totalt för varje cellundersättning i mjälte ( a ) och i perifera lymfkörtlar (normaliserat för 1 x 10 7 celler; b ). Lymfkörtlar poolades från fyra möss per grupp. ( c ) Myeloid-linjeceller bland totala benmärgs leukocyter. Varje stapel är medelvärdet ± sem av fyra möss ( a, c ). **, P <0, 01, kontra kontroll. Data är representativa för två oberoende experiment.

Bild i full storlek

Reglering av utvecklingen av lungcentralen med 4-1BB

DC är också bosatta i många icke-nmfoidvävnader, såsom lungor, lever, tarmer, njurar och hud 30, 31, och sådana DC: er har föreslagits uppkomma perifert från monocyter under direktinflytande av inflammatoriska cytokiner såsom TNF och GM-CSF 32 33 I synnerhet har lungan DC för både konventionell och plasmacytoid avgränsning som reglerar lunginflammation 34, 35 . Det är anmärkningsvärt att cirka 95% av cDC: er (CD11c hi IA / IE hi ) och 80% av pDC: er (CD11c lo B220 + PDCA-1 + ) i lungorna av blandad vildtyp och Tnfrsf9 - / - benmärgschimärer utvecklade från Tnfrsf9 - / - benmärg (fig. 7a, b), förutom många granulocyter (fig. 7b). Lungens cDC: er hade en omogen fenotyp (CD80 lo CD86 lo CD40 lo IA / IE hej ) oavsett ursprung, även om lungcDC: er hade lågt uttryck för både 4-1BB och 4-1BBL som inte var närvarande på miltcDC: er (fig. 7c, och data visas inte). Dessa resultat tyder på att 4-1BB och 4-1BBL också kan begränsa perifer DC-utveckling, såsom från monocyter i lungan, såväl som att reglera utveckling av myeloidföräldrar i benmärgen.

Rekonstituering av celler i lungorna hos blandade benmärgskimärer (som beskrivs i fig. 5), analyserat efter 10 veckor. ( a ) Flödescytometri av cDC: er och pDC: er (vildtyp (CD45.1 + ) eller Tnfrsf9 - / - (CD45.2 + )). För pDC: er gällde CD11c- int- populationer och karakteriserades sedan ytterligare med PDCA-1 och B220. Antalet ovan angivna områden indikerar procent bland totala lymfocytpopulationer. ( b ) Cellundergruppsnummer (normaliserade för 1 x 10 7 celler). ( c ) Uttryck av ytmarkörer på cDC som härrör från benmärgsceller av vildtyp (heldragna linjer) eller Tnfrsf9 - / - benmärgsceller (streckade linjer). Lungceller samlades från fyra möss. Data är representativa för två experiment.

Bild i full storlek

Interaktionen 4-1BB – 4-1BBL begränsar DC-differentiering

Vi stimulerade sedan vildtyp eller Tnfrsf9 - / - benmärgsceller med GM-CSF in vitro 32 . Detta kultursystem har föreslagits att likna den perifera differentieringen av monocyter i DC: er, med benmärgsföräldrar som övergår från en CD11b - CD11c - fenotyp till en CD11b + CD11c - monocytliknande population före uttryck av CD11c 32, 36 . Vi inducerade 4-1BBL på en andel CD11c- och CD11c + -celler på dag 2 och fann att uttrycket fortsatte till dag 6 (Fig. 8a). Återigen upptäckte vi lätt 4-1BBL endast när 4-1BB inte var tillgängligt för bindning, vilket visade bevis på aktivt engagemang. Ingen 4-1BB kunde visualiseras på dag 2, men den reglerades avsevärt av dag 4 och behölls till dag 6 på en liten andel CD11c-celler och en stor andel CD11c + -celler. Till stöd för förslaget om en aktiv regleringsfunktion genererades mer CD11c hi benmärgs-härledda DC över tiden från Tnfrsf9 - / - benmärg (Fig. 8b). Frånvaron av 4-1BB hade inte någon effekt på mognad (data visas inte). Således uttrycks både 4-1BB och 4-1BBL under differentieringen av benmärgs-härledda DC och deras interaktion begränsar DC-differentiering eller utväxt.

( a ) Flödescytometri av 4-1BB och 4-1BBL på CD11c - eller CD11c + celler genererade genom odling av vildtyp och Tnfrsf9 - / - benmärgsceller med GM-CSF. Skuggade histogram, isotypkontroll. ( b ) Ackumulering av benmärgs-härledda DC: er (CD11b hi CD11c + ) från celler odlade som beskrivits i a . ( c ) Benmärgs-härledda DC: er i poolade triplikatkulturer av sorterade myeloida föräldrar från vildtyp och Tnfrsf9 - / - möss odlade med GM-CSF plus plattbundna (p) eller lösliga (er) 4-1BB – Ig eller kontroll immunoglobulin (hIgG (p)), bedömd på dag 7. Data är representativa för två till fyra experiment.

Bild i full storlek

Slutligen sorterade vi myeloida föräldrar från benmärg och stimulerade dem med GM-CSF 37 . Myeloida progenitorer (CD11b - CD11c - ) differentierade till en monocytliknande fenotyp (CD11b + CD11c - ) och sedan till DCs (CD11b + CD11c + IA / IE hej ) och uttryckte både 4-1BB och 4-1BBL, liknande kulturer av oseparerade benmärgsceller (Kompletterande Fig. 5 online och data visas inte). Återigen var ackumuleringen av DC: er större på dag 7 i Tnfrsf9 - / - myeloida förfödarkulturer än i vilda typkontrollkulturer (fig. 8c). Noterbart, tvärbindning 4-1BBL med plattbunden 4-1BB – Ig resulterade i mindre ackumulering av DC från Tnfrsf9 - / - myeloida föräldrar till antal erhållna med vildtyp av myeloidprogenitorkulturer (fig. 8c). Löslig 4-1BB – Ig, som inte kan tvärbinda 4-1BBL, visade ingen väsentlig effekt. Dessa data bekräftar en undertryckande funktion för 4-1BBL vid kontroll av DC-differentiering.

För att ytterligare definiera mekanismen genom vilken 4-1BBL är hämmande, testade vi om ligeringen av 4-1BBL med 4-1BB – Ig undertryckte intracellulär signalering i benmärgsceller som differentierade till DC. Plattabunden 4-1BB – Ig hämmade fosforylering av kinaset Erk och hämmaren IKBa (kompletterande figur 6a online). Kaseinkinas I är det enda kinas som rapporterats aktiverats av 4-1BBL 27, men vi fann att en hämmare av denna molekyl inte omvänt undertryck medierad av 4-1BB – Ig i myeloidlinje och DC-differentiering (kompletterande fig. 6b, c). Publicerat arbete har dessutom rapporterat att 4-1BBL: s kontroll av osteoklastutveckling från benmärgsmakrofager involverar produktion av IL-10 och interferon-p 28, 38 . Men vi misslyckades också att förändra hämning genom tvärbindning 4-1BBL på myeloida progenitorer genom att blockera dessa cytokiner eller transformera tillväxtfaktor-p (kompletterande figur 6d, e).

Diskussion

Här har vi visat att 4-1BBL uttrycktes på vanliga myeloid- och granulocyt-makrofagprogenitorceller som är grundläggande för myelopoies och att 4-1BB kunde induceras på många undergrupper av differentierande myeloid-linjeceller. Interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL reglerade negativt utvecklingen av myeloida linjerceller från CMP: er och GMP: er och begränsade differentieringen av både konventionella och plasmacytoida linjer av DC: er. Vi fann också att 4-1BBL uttrycktes på vanliga lymfoida progenitorer och undertryckte utvecklingen av B-celler under tillstånd av betydande lymfopoies. Sammantaget visar våra resultat en opåverkad funktion för dessa TNF-superfamiljmolekyler för att kontrollera mycket organiserade vägar för cellutveckling och ger ny insikt i kontrollen av distinkta linjer av immunceller.

Även om 4-1BBL uttrycktes allmänt på HSC: er, antydde konstaterandet att jämnt antal av dessa celler och MPP inte väsentligen förändrades i 4-1BB- eller 4-1BBL-bristande möss antydde att 4-1BBL normalt inte är aktiva på HSC: er. Däremot var antalet GMP: er och steady-state-celler och CD11b + myeloida linjerceller högre in situ i frånvaro av 4-1BB och 4-1BBL. Dessutom visade in vitro- och in vivo- studier med totala myeloida progenitorer eller renade CMP: er fortfarande det undertryckande inflytandet av 4-1BBL på myelopoies. Således drar vi slutsatsen att 4-1BB – 4-1BBL-interaktioner reglerar de tidiga stegen av myelopoiesis, inriktning på CMP: er eller GMP: er och / eller celler som genomgår övergång från dessa celler till myeloid-linjeceller. Emellertid kan 4-1BBL-uttryck på HSC: er fortfarande vara relevant vid vissa inflammatoriska tillstånd, ett ämne som väntar på framtida studier.

När vi "imiterade" 4-1BB-bindningen till 4-1BBL genom att tillhandahålla 4-1BB-Ig i en form som tvärbundet 4-1BBL, undertryckte denna interaktion den förbättrade ackumuleringen av Tnfrsf9 - / - myeloid-linjeceller och DC: er från oseparerade benmärgsceller eller från renade myeloida progenitorer. Däremot hade ligering av 4-1BB med en agonistantikropp ingen effekt. Således är 'omvänd signalering' till och med 4-1BBL ansvarig för reglering, tillhandahållande av data som är komplementära till andra rapporter som beskriver ett liknande fenomen genom 4-1BBL, där det hindras spridning av aktiverade T-celler och benmärgsmakrofager som differentierar sig till osteoklaster 8, 27 28, 39 . Vi bekräftade undertryckande signalering genom att visa hämning av aktivering av de tillväxtfrämjande NF-kB- och Erk-intracellulära vägarna i benmärgsceller som differentierade till DC. Emellertid är arten av de intracellulära signalerna som överförs via 4-1BBL som leder till mindre myelopoiesis inte klar och kommer att behöva ytterligare analys.

Till skillnad från 4-1BBL som upptäcks i benmärgen in situ , var 4-1BB starkt reglerad på förfäderceller, möjligen eftersom 4-1BB i detta scenario fungerar som en typisk ligand snarare än en signalreceptor, passande med idén att dess uttryck kan vara en hastighetsbegränsande faktor för myelopoies. Vi hittade 4-1BB övergående på Lin - c-Kit hej differentierande mastcellprekursorer och också på differentierande myeloida linjerceller (Lin + c-Kit int ), och dess uttryck berodde på GM-CSF. På liknande sätt främjade GM-CSF enbart 4-1BB i myeloida progenitorer som differentierade till DC. Således är det troligt att denna sofistikerade och kortvariga reglering kan förklara varför 4-1BB inte upptäcktes på benmärgsprogitorceller direkt efter isolering.

Våra resultat erhållna med differentierande myeloida linjerceller och DC: er som härrör från oseparerade benmärgsceller eller renade myeloida progenitorer antydde att både 4-1BB och 4-1BBL kan uttryckas med dessa linjer, antingen separat eller tillsammans, vilket ledde till idén om cell -intrinsisk reglering och / eller korsning mellan samma eller alternativa cellsteg. De spatiotemporala interaktionerna mellan 4-1BB och 4-1BBL i benmärgen kan därför vara mycket komplicerade. Även om 4-1BBL verkar vara lättillgängligt, kan 4-1BB levereras av många underpopulationer av celler, antingen på angränsande celler, kanske i specialiserade nischer eller på samma cell på ett cellintresse sätt. Vi fann att den utvidgade utvecklingen av Tnfrsf9 - / - myeloid-lineage-celler parallella med Tnfsf9 - / - myeloid-lineage-celler i blandade benmärgschimärer där vildtypceller (som kunde uttrycka endera molekyl) också svarade, vilket stödde idén om cellinriktad reglering. Dessutom, som totala myeloida föräldrar eller renade CMP: er från Tnfrsf9 - / - möss fortfarande visade förbättrad myeloidlinje och DC-differentiering in vitro och in vivo , gynnar dessa resultat också idén att differentiering av myeloidlinjer och mastcellförstadier är huvudkällan till 4-1BB i benmärgen. Det är emellertid fortfarande möjligt att 4-1BB på bosatta eller återcirkulerande mogna T-celler och NK-celler kan modulera myelopoies, särskilt i vissa inflammatoriska tillstånd.

Vi fokuserade på DC, eftersom dessa celler tros utvecklas huvudsakligen i myeloidlinjen 30, 32, 40 . DC-utveckling är komplex och inte helt förstås. Studier har identifierat en klonogen stamfäder, kallad en "makrofag-DC-stamfader" (Lin - CX3CR1 + c-Kit + ) 41, det vill säga en delmängd av GMP-populationen (på grundval av dess fenotyp av CD34 + FcγRII / III hej ) och ger upphov till monocyter, makrofager och cDC. Ytterligare data har visat att makrofag-DC-progenitorer kan generera cDC: er som ligger i mjälten utan att övergå genom en monocytisk mellanprodukt 42, medan andra rapporter har visat att cDC: er i perifera organ kan härledas från en monocytprekursor 32 . Däremot ger varken makrofag-DC-stamceller eller monocyter upphov till pDC: er, vilket antyder att pDC: er avviker från cDC: er kanske i CMP- eller GMP-stadiet 32, 40 . Vidare har det föreslagits att Flt3 + -celler i antingen CMP- eller CLP-populationen skulle kunna utvecklas till både cDC: er och pDC: er 40, 43 . I frånvaro av 4-1BB eller 4-1BBL hittade vi fler cDC: er och pDC: er i lymfoida och nonlymphoid organ, och fler monocyter genererades i både benmärg och blod. Vi fann också förbättrad utveckling av B-celler i benmärgschimärerna. Sammantaget stöder dessa resultat ytterligare slutsatsen att huvudreglering av myelopoies (och B-lymfopoies) med 4-1BBL sker i benmärgen vid CMP- eller GMP-stadiet, eller i föregångare till B-linjerceller, inklusive CLP.

Perifera vävnad DC kan härledas från separata DC-prekursorer som fröer dessa organ innan de begås till slutdifferentiering till mogna DC 32, 40 . Monocyter kan vara DC-prekursorer och föreslås ge upphov till cDC i nonlymphoid organ 42, 44, 45 . Det är inte klart hur denna process regleras, men cytokinmiljön, och specifikt GM-CSF, kan vara avgörande för monocytdifferentiering 32, 33 . GM-CSF-inducerade benmärgskulturer tros efterlikna stadierna av perifer vävnad DC-differentiering 36, 46 . Vi fann att 4-1BB och 4-1BBL uttrycktes under GM-CSF-driven driven differentiering och att deras interaktion begränsade ansamlingen av benmärgs-härledda DC. Dessutom har de flesta cDC: er i lungan från benmärgschimärer härrört från Tnfrsf9 - / - -populationen . Detta resultat kan delvis vara relaterat till det större antalet blodmonocyter. Den relativa skevningen av lungcDC till förmån för populationer härrörande från Tnfrsf9 - / - celler var emellertid mycket större än för blodmonocyter. Därför föreslår vi att 4-1BB och 4-1BBL också skulle kunna delta i att begränsa mer distala steg för cDC-differentiering som potentiellt uppstår i själva perifera organet.

Sammanfattningsvis har vi visat en tidigare okänd funktion för 4-1BB och 4-1BBL vid myelopoies och utvecklingen av DC: er. Vårt arbete kompletterar publicerade studier av andra TNF-superfamiljmedlemmar som visar att CD27 uttrycks på HSC: er och progenitorceller och att bindningen av CD70 negativt reglerar den myeloidkolonidannande potentialen in vitro och B-lymfopoies in vivo 47, 48, och att lymfotoxin-ß-receptorn uttrycks på mogna DC och bidrar till balansen mellan perifera linjer genom bindande lymfotoxin-a 1 ß2 (ref. 49). Således kontrollerar TNF 'superfamily' inte bara responsen hos mogna lymfoidpopulationer utan också balansen mellan separata celllinjer.

metoder

Möss.

Tnfrsf9 - / - möss och Tnfsf9 - / - möss på C57BL / 6-bakgrund uppföddes vid La Jolla Institute for Allergy and Immunology respektive Emory University. C57BL / 6J (CD45.2 + ), C57BL / 6 Pep3b / BoyJ (CD45.1 + ) och Rag1 - / - möss var från Jackson Laboratories. Alla experiment överensstämde med reglerna från La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care Committee i enlighet med riktlinjerna från Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Studier med Tnfsf9 - / - benmärgsceller utfördes vid Emory University.

Cellavstängningar.

Mjältar och lymfkörtlar och lungvävnad spjälkades under 30 minuter vid 37 ° C med kollagenas D (Roche) och DNas I (Sigma-Aldrich). Benmärg extraherades från tibia och femur i HEPES-buffrat (pH 7, 4) RPMI-1640 medium (Invitrogen) innehållande 1% (vol / vol) FBS (Omega Scientific), och erytrocyter lyserades med lysande buffert för röda blodkroppar (Sigma -Aldrich). Lungceller genomgick densitetsgradientcentrifugering (densitet, 1, 0875 ± 0, 0010 g / cm ^) med Lymfolyte-M (Cedarlane) för separering av levande celler från döda celler och röda blodkroppar.

Reagens.

Följande antikroppar användes: anti-CD16-CD32 (2, 4 G; 553140; BD Bioscience); anti-IL-10R (1B1.3a; 112708; BioLegend), anti-interferon-p (MIB-5E9.1; 508104; BioLegend) och anti-transformerande tillväxtfaktor-p (1D11.16.8; isolerat från ett hybridom från amerikansk Typkultursamling); biotinkonjugerad anti-4-1BB (17B5; 106103) och anti-4-1BBL (TKS-1; 107103; båda från BioLegend); fluoresceinisotiocyanat-konjugerad anti-CD45.1 (A20; 553775), anti-CD45.2 (104; 553772), anti-B220 (RA3-6B2; 553088), anti-CD11b (M1 / 70; 553310) och anti- CD11c (HL3; 553801; alla från BD Bioscience); fluorescein isothiocyanate–conjugated anti-CD3 (145-2C11; 100305), anti-Ter119 (TER-119; 116205), anti-Gr-1 (RB6-8C5 108907) and anti–T cell receptor-β (H57-597; 109206; all from BioLegend); fluorescein isothiocyanate–conjugated anti-CD127 (A7R34; 11-1271) and anti-CD34 (RAM34; 11-0341; both from eBioscience); phycoerythrin-conjugated anti-CD4 (RM4-5; 553049), anti-CD80 (16-10A1; 553769), anti-CD19 (1D3; 553786) and anti-α 4 β 7 (DATK32; 553811; all from BD Bioscience); phycoerythrin-conjugated anti-Sca-1 (E13-161.7; 122507) and anti-CD49b (DX5; 108907; both from BioLegend); phycoerythrin-conjugated anti-CD86 (GL1; 12-0862), anti-IA/IE (M5/114.15.2; 11-5321), anti-CD40 (1C10; 12-0401), anti-FcεRIα (MAR-1; 12-5898), anti-CD16/32 (FcγRII/III; 93; 12-0161) and anti-Flt3 (A2F10; 12-1351; all from eBioscience); phycoerythrin-conjugated and allophycocyanin-conjugated anti–mouse pDC antigen (mPDCA-1; JF05-1C2.4.1; 130-091-962; Miltenyi Biotec); allophycocyanin-conjugated anti-CD11c (HL3; 550261) and anti-Thy-1.2 (53-2.1; 553007; both from BD Bioscience); allophycocyanin-conjugated anti-B220 (RA3-6B2; 103212), anti-c-Kit (2B8; 105812), anti-NK1.1 (PK136; 108709) and anti-Sca-1 (E13-161.7; 122511; all from BioLegend); allophycocyanin-conjugated anti-F4/80 (BM8; 17-4801) and anti-CD127 (A7R34; 17-1271; both from eBioscience); peridinin chlorophyll protein–conjugated anti-CD45.2 (104; 552950) and anti-CD8α (53-6.7; 553036), and peridinin chlorophyll protein–cyanine 5.5–conjugated anti-CD11b (M1/70; 550993; all from BD BD Bioscience); Pacific blue–conjugated anti-Sca-1 (E13-161.7; 122520) and anti-B220 (RA3-6B2; 103227), phycoerythrin-indodicarbocyanine–conjugated anti-c-Kit (2B8; 105809), and phycoerythrin-indotricarbocyanine–conjugated anti-c-Kit (2B8; 105814), anti-CD11b (M1/70; 101216) and anti-CD3 (2C11145-2C11; 100320; all from BioLegend). The fluorescent dye 7-amino-actinomycin D (420401) was from BioLegend, and anti-c-Kit (130-091-224) and anti-biotin (130-090-485) microbeads were from Miltenyi Biotec. All recombinant cytokines were from Peprotech. Human IgG–Fc (0160-14) and rat IgG (KLH/G1-2-2; 0116-14) were from R&D Systems. The fusion 4-1BB–Ig and monoclonal antibody 3H3 (anti-4-1BB) were purified as described 41 . Phycoerythrin-conjugated streptavidin and CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl diester) were from Molecular Probes, and the inhibitor of casein kinase I (CKI-7) was from Sigma-Aldrich.

Immunofluorescence labeling and sorting.

MACS LS columns (Miltenyi Biotec) were used for enrichment of bone marrow by either positive isolation of c-Kit + cells by labeling with anti-c-Kit magnetic beads or negative depletion of lineage-negative cells by labeling with biotin-conjugated antibodies specific for lineage markers followed by anti-biotin magnetic beads. Cells were collected from the enriched bone marrow for further sorting. Cells were gated for flow cytometry or cell sorting as follows: LSK cells, Lin (B220 CD11b CD3 Ter119 Gr-1 CD11c ) Sca-1 + c-Kit hi IL-7Rα ; long-term HSCs, Lin Sca-1 + c-Kit hi IL-7Rα Flt3 Thy-1.2 + ; short-term HSCs, Lin Sca-1 + c-Kit hi IL-7Rα Flt3 + Thy-1.2 + ; MPPs, Lin Sca-1 + c-Kit hi IL-7Rα Flt3 + Thy-1.2 ; myeloid progenitors, Lin Sca-1 c-Kit hi IL-7Rα ; CMPs, Lin Sca-1 c-Kit hi IL-7Rα CD34 + FcγRII/III lo ; GMPs, Lin Sca-1 c-Kit hi IL-7Rα CD34 + FcγRII/III hi ; MEPs, Lin Sca-1 c-Kit hi IL-7Rα CD34 FcγRII/III lo ; CLPs, Lin Sca-1 lo c-Kit lo IL-7Rα + ; monocytes, CD11b hi F4/80 + Gr-1 int ; granulocytes, CD11b hi Gr-1 hi F4/80 ; B cells, CD19 + B220 + ; NK cells, CD3 NK1.1 + DX5 + ; T cells, CD3 + TCRβ + ; CD4 + T cells, CD3 + CD4 + CD11c ; CD8 + T cells, CD3 + CD8 + CD11c ; cDCs, CD11c + IA/IE hi ; spleen and lymph node pDCs, CD11c lo PDCA-1 + IA/IE int ; lung pDCs, CD11c int PDCA-1 + B220 + . A FACSVantage SE DiVa (Becton Dickinson), LSR II (Becton Dickinson) or FACSCalibur (Becton Dickinson) was used with FlowJo software (TreeStar).

Bone marrow chimeras.

Recipient mice (CD45.1 + or CD45.2 + Rag1 −/− ) were treated with two rounds (separated by a 3-hour interval) of irradiation with 5.5 Gy (11 Gy total). Bone marrow cells from wild-type (CD45.1 + ) mice, Tnfrsf9 −/− (CD45.2 + ) mice and Tnfsf9 −/− (CD45.2 + ) mice were labeled with biotin-conjugated anti-B220 and anti-CD3 followed by anti-biotin microbeads. Cells were passed over MACS LS columns and the flow-through fraction (depleted of B cells and T cells) was collected for adoptive transfer. For CMP transfer, wild-type (CD45.1 + ) CMPs and Tnfrsf9 −/− (CD45.2 + ) CMPs were sorted as described above. Mixed bone marrow cells (2.5 × 10 6 of each strain; total, 5 × 10 6 ) or CMPs (2.5 × 10 4 of each strain; total, 5 × 10 4 ) were transferred intravenously 1 d after irradiation. Mice were given antibiotics (neomycin (1.0 mg/ml) and polymyxin-B sulfate (0.1 mg/ml); Sigma-Aldrich) in the drinking water for 2–3 weeks after reconstitution. Reconstitution of each lineage was analyzed at various time points (at 7–16 weeks for unseparated bone marrow transfers or at day 8 for CMP transfer). In mixed chimeras (CD45.1 + plus CD45.2 + ), the number of donor bone marrow–derived cells, particularly T cells, having the same congenic marker as the host-derived cells (CD45.1 + in most cases) was normalized by subtraction of the average number of host bone marrow–derived cells surviving after irradiation (around 3–5% of total CD45 + cells in chimera, with over 90% being T cells). The average number of host bone marrow–derived cells at individual time points was calculated from that of control mice ( n = 3–6) that received only one bone marrow population with a congenic marker different from that of the host. In parallel, the number of donor-derived CD45.2 + myeloid-lineage cells in Rag1 −/− (CD45.2 + ) recipients of 1:1 mixtures of CMPs was normalized by subtraction of the average number of host bone marrow–derived cells from that of three control Rag1 −/− mice irradiated and then injected with PBS.

Myeloid progenitor culture.

Various numbers of cells (typically 2 × 10 4 ) were cultured with Iscove's modified Dulbecco's medium (Gibco) containing 20% (vol/vol) FBS in the presence of the cytokines stem cell factor (20 ng/ml), IL-3 (10 ng/ml), IL-11 (10 ng/ml), thrombopoietin (10 ng/ml) and/or GM-CSF (10 ng/ml). Where indicated, myeloid progenitors were cultured in the presence of plate-bound human IgG–Fc (20 μg/ml) and 4-1BB–Ig (20 μg/ml) or soluble rat IgG (10 μg/ml) and anti-4-1BB (3H3; 10 μg/ml). Alternatively, myeloid progenitors were cultured in the presence of plate-bound human IgG–Fc or 4-1BB–Ig together with antibodies (20 μg/ml) such as rat IgG, anti-IL-10R, anti-interferon-β and anti–transforming growth factor-β, or the inhibitor of casein kinase I (20 μM; CKI-7). Cultures were initiated in 24-well plates with 0.5 ml of medium containing all reagents, including cytokines, antibodies and inhibitor, and 0.5 ml of fresh medium with reagents was added on day 3 and day 6.

Bone marrow–derived DCs.

Bone marrow depleted of T cells and B cells (3 × 10 5 bone marrow cells) was incubated in 24-well plates with Iscove's modified Dulbecco's medium containing 10% (vol/vol) FBS and GM-CSF (20 ng/ml). Cultures were initiated with 0.8 ml of medium, and 0.8 ml of fresh medium with GM-CSF (10 ng/ml) was added on day 3 and day 6. Various numbers of sorted myeloid progenitors (typically 1.0 × 10 5 ) were cultured with same protocol and, where indicated, plate-bound human IgG–Fc (20 μg/ml), 4-1BB–Ig (20 μg/ml) or soluble 4-1BB–Ig (20 μg/ml) was added to the culture.

Immunoblot analysis.

Live cells were lysed for 30 min in ice-cold radioimmunoprecipitation lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (vol/vol) Nonidet P-40, 1% (wt/vol) sodium deoxycholate, 0.1% (wt/vol) SDS, 50 mM NaF and 1 mM Na 3 VO 4 ) containing protease inhibitor 'cocktail' for mammalian tissues (P8340; Sigma-Aldrich). Insoluble material was removed and lysates were used for immunoblot analysis. Protein content was assessed by bicinchoninic acid protein assay (Thermoscientific). Equal amounts of protein (5–15 μg) were separated by 4–12% SDS-PAGE (NuPage Bis-Tris precasting gels), were transferred onto polyvinylidene difluoride membranes (Invitrogen) and were analyzed by immunoblot. All blots were developed with the ECL immunodetection system (Immobilon Western Chemilumiluminescent HRP; Millipore). Antibodies to phosphorylated Erk (9101) and phosphorylated IκBα (9241) were from Cell Signaling Technology, and anti-Erk (K-23; sc-153) and anti-IκBα (C-21; sc-371) from Santa Cruz Biotechnology.

Statistical analysis.

Statistical significance was determined with the two-tailed Student's t -test.

Note: Supplementary information is available on the Nature Immunology website .

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande text och figurer

    Supplementary Figures 1–6