Identifiering av omentin mrna i mänsklig epikardiell fettvävnad: jämförelse med omentin i subkutan, inre mammärarterie periadventiella initiala och viscerala abdominala depåer | internationell journal för övervikt

Identifiering av omentin mrna i mänsklig epikardiell fettvävnad: jämförelse med omentin i subkutan, inre mammärarterie periadventiella initiala och viscerala abdominala depåer | internationell journal för övervikt

Anonim

Abstrakt

Mål:

Syftet med denna studie var att bestämma den relativa fördelningen av omentin och visfatin-mRNA i humant epikardialt, peri-internt mammary, övre bröstkorg, övre abdominal och benvenus subkutan fettvävnad såväl som fördelningen av omentin i nonfat-cellerna och adipocyterna av mänsklig omental fettvävnad.

Bakgrund:

Omentin finns i humant omentum men inte subkutant fett. Omentin och visfatin betraktas som markörer för visceralt magfett.

Forskningsdesign och metoder:

MRNA-innehållet i omentin och visfatin mättes genom qRT-PCR-analys av fettprover avlägsnade från människor som genomgick hjärt- eller bariatrisk kirurgi.

Resultat:

Omentin-mRNA i internt bröstfett var 3, 5%, det i det övre torakala subkutana fettet var 4, 7% medan det i de andra subkutana fettlagren var mindre än 1% omentin i epikardiellt fett. Distributionen av visfatin-mRNA varierade inte mellan de fem depåerna. Omentin-mRNA uttrycktes företrädesvis i icke-fettcellerna i omental fettvävnad eftersom omentin-mRNA-innehållet i isolerade adipocyter var 9% av det i icke-fettceller, och liknande resultat sågs för visfatin. Mängden omentin-mRNA i differentierade adipocyter var 0, 3% och mängden av visfatin 4% av det i icke-fettceller. Mängden omentin-mRNA i preadipocyter var praktiskt taget inte upptäckbar medan visfatinmängden var 3% av den i färskt isolerade icke-fettceller från omental fettvävnad.

Slutsats:

Omentin mRNA finns huvudsakligen i epikardialt och omentalt humant fett medan visfatin mRNA finns i samma utsträckning i epikardialt, subkutant och omental fett.

Introduktion

Omentin är ett protein som tidigare beskrivits som intelektin eftersom det hittades i tunntarmen Paneth-celler från möss 1 och hjärtat, tunntarmen, kolon och tymus hos människor. 2 Lektindelen av namnet härstammar från upptäckten att intelektin är ett lösligt protein som kan binda galaktofuranosylrester som finns i olika mikroorganismer. 2 Omentin / intelektin är ett lipid-flotte-associerat protein i tarmborstens gränsceller 3 och är den humana homologen av Xenopus lectin XL35. 4 Hos människor uttrycks omentin / intelektin i endotelcellerna i aorta, kolon, lever och tymus. 4 Omentin uttrycks i omental men inte subkutan fettvävnad (SAT) hos människor. 5, 6 De cirkulerande nivåerna av omentin är inte direkt förknippade med postprandial glukos hos människor. 7 Fastande cirkulerande nivåer av omentin såväl som omentin-mRNA i omental fett minskas emellertid hos feta män och kvinnor. 8 Detta kan vara viktigt eftersom adiponectin är den enda molekyl som hittills rapporterats vars nivå i fettvävnad minskar i humant fetma. 9, 10 Det vanliga embryologiska ursprunget för omental fett och epikardial fettvävnad 11 fick oss att ifrågasätta om omentin också fanns i epikardialt fett. Visfatin beskrevs ursprungligen som en adipokin närvarande endast i visceral fettvävnad. 12 Därför jämförde vi visfatin- och omentin-mRNA-innehåll i epikardiellt fett med innehållet i andra fettvävnader såväl som mRNA-fördelningen mellan icke-fett- och fettceller plus preadipocyter och in vitro differentierade adipocyter härledda från omental fettvävnad.

Forskningsdesign och metoder

patienter

Det fanns 14 patienter med det metaboliska syndromet (MS) definierat av National Cholesterol Education Programme Adult Treatment Panel III-kriterierna, 13 och 13 patienter med typ 2-diabetes (diabetes mellitus, DM) definierade av American Diabetes Association, varav 14 hade angiografiska bevis på kritisk koronar ateroskleros (CAD) med stenos> 50% vänster huvud- eller> 75% andra artärer, som involverar en, två eller tre kärl som bedöms nödvändiga för elektiv kirurgi med bypass transplantation (CABG) av den behandlande kardiologen och hjärtkirurg. Uteslutningskriterier inkluderade någon historia av HIV och / eller viral hepatit-positiv; en tidigare CABG- eller hjärtventiloperation; kronisk samexistent inflammatorisk sjukdom såsom systemisk lupus erytematos eller reumatoid artrit; farmakologisk glukokortikoid och / eller immunsuppressiv terapi eller hjärtsvikt. Omentalt fett erhölls från 13 sjukligt överviktiga kvinnor som genomgick bariatrisk kirurgi. Studierna hade godkänt lokala institutionella granskningsnämnder och alla involverade patienter gav sitt informerade samtycke.

Fettprover

Fett (0, 2–1 g) erhölls efter öppnande av bröstkorg men före heparinisering och hjärt-lungomgång, från: (1) epikardiellt fett så nära som möjligt till ursprunget till höger kranskärl vid hjärtans bas, (2) subkutant (SAT) främre övre bröstfettet från sternotomisnittet vid manubriumsterni (SAT m. Sterni), (3) fett från den inre bröstväggen runt den inre mammärartären (IMA) mellan dess mittbana och membranet, (4) SAT från bukväggen vid det nedre sternotomisnittet (SAT-buken) och (5) från benets SAT vid skörden av venen. Fettprov trimmades av bindväv och ytliga blodkärl, halverades och förvarades separat vid -80 ° C. Omentalt fett erhölls under laparoskopisk justerbar gastrisk bandkirurgi eller laparoskopisk gastrisk bypass med Roux-en-Y gastroenterostomikirurgi. Preadipocyterna och in vitro- differentierade adipocyterna isolerades från omental fett såsom beskrivits tidigare. 15 De fettfria cellerna och adipocyterna isolerades från omental fett såsom tidigare beskrivits av Fain et al. 16

mRNA-isolering och analyser

Total RNA isolerades enligt proceduren enligt Chomczynski och Sacchi. 17 Isolering av totalt RNA från preadipocyter och differentierade adipocyter utfördes med användning av en RNAeasy Mini Kit enligt tillverkarens protokoll (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). CDNA framställdes med användning av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit från Roche Diagnostics, (Indianapolis, IN, USA) med användning av 62 ng totalt RNA per analys. Kvantifieringen av mRNA åstadkoms med användning av Roche Lightcycler 480 Real-time RT-PCR-system och Universal Probe Library av korta hydrolyslåsta nukleinsyrasonder i kombination med primrarna som föreslogs av deras webbaserade analysdesigncenter (www.universalprobelibrary.com ). Integrerade DNA Technologies (Coralville, IA, USA) syntetiserade primrarna.

Data erhölls som korsningspunktvärden (Cp) erhållna genom det andra derivatmaximumproceduren. Relativ kvantifiering av data baserades på den jämförande Cp-metoden vilket resulterade i förhållandet mRNA mellan två fraktioner som eliminerar behovet av standardkurvor. Den aritmetiska formeln för att beräkna förhållanden från ΔΔCp är baserad på en log 2- skala (2 −ΔΔCp ). Denna procedur är identisk med den jämförande C T- proceduren som beskrivs i ABI PRISM 7700 Sequence Detection System-användarbulletin nr. 2 för kvantitativ RT-PCR förutom att Cp används, eftersom Roche använder övergångspunktproceduren istället för att korsa tröskeln för att beräkna cykler som krävs för detektion av mRNA. Beräkningen av förhållanden antar att antalet målmolekyler fördubblas med varje PCR-cykel. Cp-värdet för varje mRNA korrigerades för det för cyklofilin, som användes som kontrollgenen och återhämtningsstandarden. Det genomsnittliga Cp-värdet för cyklofilin i epikardiellt fett var 26, 6 ± 0, 4 eftersom medelvärdet ± sem på 28 körningar och skilde sig inte signifikant från det för de andra fettdepoterna förutom att Cp-värdet från SAT-buken var i genomsnitt 28, 1 ± 0, 4. Det genomsnittliga Cp-värdet för cyklofilin i omental fettvävnad var 27, 2 ± 0, 3 som medelvärde ± sem av 29 körningar. Det är inte möjligt att direkt jämföra förhållandena för varje gen jämfört med cyklofilin med förhållandena för andra gener på grund av den relativa effektiviteten hos de specifika primrarna och proberna som används för varje gen är olika.

Blodanalyser

Fastande plasmaglukos, glykoslerat hemoglobin (HbA1c), lipider och högkänslig C-reaktiv protein (hsCRP) mättes genom rutinanalyser på sjukhuslaboratoriet.

Midjemått

Midjeomkrets (cm) mättes runt sjukhusklänningens täckta buk mellan nedre revmargen och iliac crest mid midjan medan man stod upp med klackarna tillsammans.

Statistisk analys

En två-svansad Student's t- test användes för att bestämma om skillnader mellan kliniska och metabola variabler var signifikanta vid en P- värde av <0, 05. Statistisk analys av mRNA-värden baserades på Cp-värden före log 2- transformation till förhållanden.

Resultat

Patientdata

De kliniska och metaboliska egenskaperna hos 14 manliga och 13 kvinnliga CAD-patienter visas i tabell 1. Männa hade signifikant högre vikt (vikt) och midja men lägre högdensitetslipoprotein (HDL) -kolesterol, lågdensitetslipoprotein (LDL) -kolesterol och hsCRP än kvinnorna. Det fanns ingen korrelation mellan epikardiell omentin eller visfatin-mRNA och plasma hsCRP i de sammanslagna MS- och DM-patienterna ( r = −0.02, P = 0, 98 och r = −0, 01, P = 0, 95, respektive). Etnicitet, MS, DM, rökning, ålder, kroppsmassaindex (BMI), HbA1c, fastande plasmaglukos, kolesterol och triglycerider skilde sig inte signifikant. Tio av fjorton (71%) MS och sex av tretton (46%) DM-patienter var på statiner medan liknande proportioner var på angiotensinomvandlande enzymhämmare, kalciumkanalblockerare, angiotensinreceptorblockerare, ß-blockerare och / eller antiplateletläkemedel i varje grupp (data visas inte).

Full storlek bord

Omentin-mRNA-uttryck i epikardiala och andra fettvävnader

Uttrycket av omentin mRNA och visfatin mRNA undersöktes hos de 27 patienterna med CAD från vilka vi kunde få epikardialt fett, IMA fettvävnad, SAT m. sterni, buk SAT och ben SAT (figur 1). Det fanns ingen statistisk signifikant skillnad i omentin-mRNA med epikardialt fett mellan de 14 MS- och 13 DM-patienterna (mängden omentin-mRNA i de 14 diabetikerna var 52 ± 52% större än hos de 13 MS-patienterna som medel ± sem), därför data samlades. Liknande resultat sågs för visfatin där mängden visfatin mRNA i diabetespatienterna var 19 ± 20% mindre än hos MS-patienterna. Mängden omentin-mRNA uttryckt som förhållande till cyklofilin i epikardiellt fett från de 14 män var densamma som i den från de 13 kvinnorna (39 ± 4 respektive 39 ± 5) och ett liknande resultat sågs för visfatin (11 ± 2 och 11 ± 3). Därför samlades data för män och kvinnor med och utan diabetes typ 2.

Omentin- och visfatin-mRNA-innehåll i epikardiellt fett jämfört med det runt den inre mammärartären (IMA), det subkutana övre bröstfettet från sternotomisnittet vid manubriumsterni (SAT m. Sterni), det subkutana övre bukfettet vid det nedre sternotomisnittet (SAT-buk) och subkutant benfett vid skördsstället (SAT-benet). Värdena visas som medel ± sem av förhållandena mellan omentin och visfatin-mRNA jämfört med cyklofilin i varje vävnad för de 27 koronarartäromkoppling (CABG) -patienterna. Procentvärdena i den övre halvan av diagrammet är omentin mRNA i de olika fettdepåerna som procent av det i epikardiellt fett och dessa skillnader var statistiskt signifikanta ( P <0, 001). Skillnaderna mellan de andra depåerna var alla signifikanta ( P <0, 001) utom för omentin mRNA i IMA kontra SAT m. sterni. Däremot fanns det inga signifikanta skillnader i visfatin-mRNA-innehåll mellan de fem fettlagren.

Bild i full storlek

Visfatin användes som kontroll eftersom det påstås vara ett protein som företrädesvis utsöndras av visceralt fett. 12 Visfatin mRNA i de fem fettdepåerna var väsentligen identiskt (figur 1). I markant kontrast var mängden omentin-mRNA i epikardiell fettvävnad minst 20 gånger större än i de andra fettdepåerna. Mängden omentin-mRNA i IMA periadventiellt fett var 3, 5%, som i SAT-m. sterni 4, 7%, som i SAT periadventional fett abdominal 0, 6% och att i SAT ben var 0, 08% av det i epikardialt fett (figur 1).

Omentin mRNA-distribution i omentala fettfraktioner

Vi använde omentala fettprov erhållna från sjukligt överviktiga bariatriska patienter, eftersom det inte var möjligt att få dem från CABG-patienterna. Hos 13 kvinnor med en genomsnittlig midjeomkrets på 98 ± 4 cm (medelvärde ± sem, intervall 69–119 cm) var mängden omentin-mRNA 13 gånger större än för cyklofilin. Detta jämförs med en 39-faldig större mängd omentin-mRNA i epikardiell fettvävnad jämfört med cyklofilin vars innehåll inte skilde sig mellan de två vävnaderna.

Den relativa fördelningen av mRNA för omentin och visfatin i nonfat-cellerna jämfört med adipocyter, preadipocyter såväl som adipocyter differentierade in vitro från preadipocyter av mänskligt omental fett som undersöktes hos fyra kvinnor (figur 2). De icke-fettiga cellerna som finns i mänsklig omental fettvävnad klassificeras operativt som SV-cellerna (de som sedimenteras genom centrifugering medan fettcellerna är de som flyter) plus den osmälta fettvävnaden som är kvar efter kollagenas-matsmältningen. 8 Omentin-mRNA-innehållet i fettcellerna var 9% medan det för visfatin var 25% av det i icke-fettcellerna (figur 2). Uttrycket av omentin-mRNA i odlade preadipocyter härrörande från omentala icke-fettceller var mindre än 0, 01% och visfatin var 3% av det i de nyligen isolerade icke-fettcellerna (figur 2). Differentiering av preadipocyter in vitro till adipocytliknande celler förbättrade ackumuleringen av omentin-mRNA men mängden var fortfarande mindre än 0, 3% av den i icke-fettceller (figur 2). Dessa data indikerar att det finns minimal expression av omentin eller visfatin-mRNA i antingen nyligen isolerade fettceller eller in vitro- differentierade adipocyter.

Omentin- och visfatin-mRNA-innehåll i icke-fettceller och adipocyter isolerade från omental fettvävnad såväl som preadipocyter och in vitro- differentierade adipocyter. Uppgifterna visas som medelvärdet ± sem av fyra experiment för icke-fettceller och adipocyter och för fyra experiment som jämför preadipocyter med differentierade adipocyter härledda från omental fettvävnad. Alla värden uttrycks som förhållandet mellan mRNA och det för cyklofilin. Antalet ovanför staplarna för preadipocyter, differentierade adipocyter och nyligen isolerade adipocyter är mängden mRNA uttryckt som procent av det i den icke fettiga cellfraktionen. Omentin-mRNA-innehåll i preadipocyter skilde sig signifikant från det i differentierade adipocyter ( P <0, 025) såväl som i icke-fett- och fettceller ( P <0, 001 för varje). Omentin-mRNA från differentierade adipocyter skilde sig signifikant från det i icke-fettceller ( P <0, 005) och isolerade fettceller ( P <0, 05). Mängden omentin-mRNA i icke-fettceller skilde sig också från den i isolerade fettceller ( P <0, 005). Visfatin-mRNA i preadipocyter skilde sig inte signifikant från det i differentierade adipocyter men skilde sig från det i icke-fettceller ( P <0, 01) och fettceller ( P <0, 025). Mängden visfatin-mRNA i differentierade adipocyter skilde sig från den i antingen icke-fett- eller fettceller ( P <0, 025 för båda jämförelserna). Visfatin-mRNA-innehållet i icke-fettceller skilde sig statistiskt från det i fettcellerna ( P <0, 025).

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie identifierade vi omentin i humant epikardialt fett som ett nytt fynd och bekräftade att omentin mRNA finns i de icke fettcellerna av omental fett, till skillnad från leptin och adiponectin som främst uttrycks i adipocyter. 9, 10 Lokaliseringen av omentin till den fettfria cellfraktionen överensstämmer med rapporten att omentin mRNA lätt upptäcks i endotelceller i blodkärl i viscerala magvävnader. 2, 4 Den föredragna fördelningen av omentingenuttryck i intraabdominalt fett och intrathoracic epicardial men inte det inre torakala väggfettet, såsom visas i denna studie, kan bero på det faktum att blodkärl och adipocyter av epikardialet samt de omentala depåerna uppstår från mesotelceller i tarmens sphlanchopleuriska mesoderm under utvecklingen.

Visfatin beskrevs ursprungligen som en adipokin närvarande endast i visceral fettvävnad. 12 Men vi och andra författare 18, 19 finner att det uttrycks i samma utsträckning i SAT och visceral fettvävnad. Cheng et al. 20 rapporterade att visfatin frisätts av explanter av human epikardial fettvävnad som inkuberas in vitro i ungefär samma utsträckning som av övre buk SAT. Således är våra uppgifter om mRNA-innehåll jämförbara med de senaste rapporterna 18, 19, 20 som indikerar att visfatin är ett adipokin som finns i alla fettdepåer av människor.

Provtagning av de olika fettdepåerna tillät oss att analysera uttrycket av de två adipokinerna i extrathoracic jämfört med intrathoracic fettvävnad och övre buk jämfört med övre thorax SAT. Intressant nog är omentin-mRNA-uttryck liknande i fett runt IMA som det i övre torakala SAT. Däremot minskar det från thorax SAT nedåt till ben SAT. Ben SAT valdes först som ett kontrolldepot för epikardiellt fett först eftersom det ligger an mot adventitia i den safena venen och för det andra eftersom den safena venen inte är benägen att åderförkalkning på dess ursprungliga plats och har rapporterats ha lägre nivåer av periadventitiva inflammatoriska adipokiner än epikardial fett. 21

Omentalt fett från feta människor användes för att titta på det relativa uttrycket av omentin-mRNA i icke-fettceller, adipocyter, preadipocyter och in vitro- differentierade adipocyter eftersom det är det enda viscerala fettvävnadsdepotet hos människor från vilket vi kunde få tillräckliga prover som uttrycker höga nivåer. av omentin-mRNA. Samma cellfraktioneringsexperiment i epikardialvävnad samt en direkt jämförelse av omentinuttryck och distribution i epikardialt och omental fett från samma patient var förbjudna genom etiska och säkerhetsbegränsningar för provstorlek och upphandling under ett operativt förfarande där thorax- och bukhålorna öppnades inte samtidigt. Trots denna begränsning och det faktum att den koronära angiografiska statusen hos de bariatriska kirurgiska patienterna var okänd, var anledningen till att vi använde omental fett från 13 kvinnor med en midjeomkrets på 98 cm var att ungefär midjaomkretsen på 101 cm hos de 13 kvinnorna med CAD .

Yang et al. 5 rapporterade att omentin förbättrade Akt-fosforylering i adipocyter och aktivering av Akt-signalvägen med insulin krävs för stimulering av glukostransport 22 och endotel kväveoxidsyntas i endotelceller. 23 Framtida studier bör undersöka sambandet mellan endotel kväveoxidsyntas-mRNA och omentin-mRNA, eftersom det finns en dysfunktion av endotel kväveoxidsyntas i kranskärlen hos patienter med åderförkalkning. 24 Hypotetiskt kan omentin, som andra periadventiella epikardiala adipokiner, bidra till koronar aterogenes. 25 Det är fortfarande oklart om omentin fungerar som en insulinliknande molekyl under fysiologiska förhållanden. Det bör också inses att mätningar av omentin-mRNA inte nödvändigtvis korrelerar med förändringar i mängden omentin.

Den låga mängden omentin i periadventiell fettvävnad från IMA står i proportion till dess embryologiska härledning från torakmesenkym 26 vilket gör den fenotypiskt mer som SAT trots dess intrathoraciska placering. Denna likhet och de låga nivåerna av proinflammatoriskt, proatherogent adipokinuttryck i SAT från patienter med kritisk CAD jämfört med deras perikoronära epikardiella fett 21 erbjuder en förklaring bland annat för den minskade benägenheten hos IMA till åderförkalkning. 27