Identifiering av gener som ger tumörcellresistens till aurora b-kinasinhibitorn, azd1152 | journalen farmakogenomik

Identifiering av gener som ger tumörcellresistens till aurora b-kinasinhibitorn, azd1152 | journalen farmakogenomik

Anonim

Abstrakt

AZD1152 är en mycket selektiv Aurora B-kinasinhibitor som för närvarande genomgår fas I och II klinisk utvärdering hos patienter med akut myelogen leukemi och avancerade fasta maligniteter. Vi har etablerat två AZD1152-resistenta cellinjer från SW620 kolon- och MiaPaCa-bukspottkörtelkarcinomlinjer, som är> 100-faldiga resistenta mot den aktiva metabolitten av AZD1152, AZD1152 HQPA och intressant, korsresistenta mot pan-Aurora-kinasinhibitorn, VX- 680 / MK0457. Med hjälp av helgenommikroarrayanalys och jämförande genomisk hybridisering kunde vi identifiera MDR1 och BCRP som de orsakande generna som ligger till grund för AZD1152 HQPA-resistens i dessa modeller. Dessutom är uppregleringen av någon av dessa gener tillräcklig för att göra tumörtillväxt in vivo okänslig för AZD1152. Slutligen är uppregleringen av MDR1 eller BCRP förutsägbar tumörcellkänslighet för detta medel, både in vitro och in vivo . Uppgifterna ger en genetisk grund för resistens mot Aurora-kinasinhibitorer, som kan användas för att förutsäga kliniskt svar på terapi.

Introduktion

Aurora kinasfamiljen är en samling serin / treoninkinaser som fungerar som nyckelregulatorer för celldelning. Tre Aurora-kinaser (känd som Aurora A, Aurora B och Aurora C) uttrycks i däggdjursceller som var och en har en distinkt biologisk funktion. 1, 2 Aurora A lokaliserar sig för spindelstänger och har en avgörande roll i bipolär spindelbildning. 3 Aurora B, ett kromosompassagerarprotein, lokaliseras till centromerer i tidig mitos och sedan spindelens midzon i anafas, och krävs för mitotisk histon H3-fosforylering, kromosombiorientering, spindelmonteringscheckpunkten och cytokinesis. 4 Aurora C är också ett kromosomalt passagerarprotein och i normala celler är dess uttryck begränsat till testiklarna där det främst fungerar i manlig gametogenes. 5 Eftersom Aurora-kinaserna tjänar väsentliga funktioner i mitos har stor uppmärksamhet ägnats åt att rikta in sig på denna familj kinaser för cancerterapi. Flera små molekylinhibitorer har utvecklats inklusive Hesperadin, ZM447439, VX-680 / MK0457, AZD1152 och MLN8054. 6, 7, 8, 9

AZD1152 är en ny acetanilidsubstituerad pyrazol-aminokinazolin-läkemedel som snabbt omvandlas till det aktiva läkemedlet, AZD1152 HQPA, i human plasma. 10 AZD1152 HQPA är en mycket potent och selektiv hämmare av Aurora B (Ki på 0, 36 n M) jämfört med Aurora A (Ki på 1369 n M) och är inaktiv mot en panel med 50 andra kinaser. 11 AZD1152 hämmar kraftigt tillväxten av humana kolon-, lung- och hematologiska tumörxenografter hos immunbristmöss. Detaljerad farmakodynamisk analys i SW620 kolorektala tumörbärande atymiska råttor behandlade iv med AZD1152 avslöjade en temporär sekvens av fenotypiska händelser i tumörer: övergående undertryckande av histon H3-fosforylering, ackumulering av celler med 4n DNA, följt av en ökning av andelen polyploid (> 4n DNA) celler. Histologisk analys har visat avvikande celldelning samtidigt med en ökning av apoptos i AZD1152-behandlade tumörer. Övergående myelosuppression observerades sekundärt till hämning av proliferation av benmärgen, även om denna effekt var fullt reversibel efter upphörande av AZD1152-behandling. 11

Ett stort hinder som möter vid cancerterapi är utvecklingen av korsresistens av tumörer mot cytotoxiska medel, även för läkemedel som tumörcellerna aldrig utsattes för. Denna fenotyp, känd som multidrugresistens (MDR), observeras ofta efter behandling med läkemedel mot cancer. Även om den molekylära basen för MDR ofta är komplex, har uppreglering av medlemmar i ATP-bindande kassett (ABC) -transporter superfamilien framkommit som en kärna, cell-autonom mekanism som används av tumörceller för att undgå aktiviteten hos en mängd kemoterapeutiska läkemedel som är genomgripande bland första- och andra radens vårdstandarder. Eftersom individer som har misslyckats med tidigare kemoterapi är de som troligtvis får nyare, experimentella mediciner, är MDR-mottaglighet ett betydande hinder i läkemedelsutvecklingen inom onkologi. Den prototypiska ABC-transportören, multidrugresistens 1 (MDR1; även känd som P-glykoprotein eller P-gp; kodad av ABCB1) består av två transmembrandomäner och två nukleotidbindande domäner, som genom hydrolys av ATP transporterar lösta ämnen mot en koncentrationsgradient in i det extracellulära utrymmet. Andra ABC-transportörer, såsom bröstcancerresistensprotein (BCRP, som kodas av ABCG2) uttrycks som halvtransportörer och dimeriseras för att ge en mogen, funktionell enhet. Även om bidraget från BCRP: s resistens mot kemoterapi ännu inte är klart, har uppreglering av MDR1 konsekvent varit prognostiskt för misslyckande av kemoterapi och dålig överlevnad hos individer med akut myelogen leukemi eller myelodysplastiskt syndrom. 12, 13 Vidare är MDR1 associerat med reducerat svar på kemoterapi i en metaanalys av 31 bröstcancerstudier. 14 Som ett resultat har avsevärda ansträngningar investerats i utvecklingen av ämnen som hämmar eller modulerar en eller flera ABC-transportörer. I själva verket utvärderas andra- och tredje generationens hämmare av denna typ som kemosensibiliserande medel i kliniska studier. 15

Även om AZD1152 har visat önskvärd preklinisk effekt och utvärderas i kliniska fas I / II-studier i akut myelogen leukemi och solida tumörer, har potentialen för utveckling av resistens mot AZD1152 inte undersökts. I den aktuella studien har vi genererat två AZD1152 HQPA-resistenta cellodlingsmodeller genom odling av kolon- och bukspottkörtelcancer i närvaro av höga koncentrationer av AZD1152 HQPA under en period av 3 månader. Genom att använda genomomfattande mikroarrayanalys har vi identifierat en förmodad AZD1152 HQPA-resistensgen från varje modell: ABCB1 (som kodar MDR1) och ABCG2 (som kodar BCRP). Dessutom avslöjade jämförande genomisk hybridisering (CGH) ett ökat antal kopior av ABCB1-lokuset i den resistenta varianten av SW620. Känsligheten för AZD1152 HQPA återställs i det annars läkemedelsresistenta derivatet genom siRNA-medierad utarmning av MDR1 eller BCRP eller med små molekylinhibitorer av MDR1 eller BCRP. Vid xentransplantation är dessa modeller eldfasta mot AZD1152-terapi, liksom HCT-15 och AsPC1-xenotransplantat, som uttrycker höga nivåer av MDR1 respektive BCRP. Dessa data antyder att uppregleringen av MDR1 eller BCRP kringgår den biologiska aktiviteten hos AZD1152 och kan begränsa det kliniska svaret på denna förening, särskilt hos patienter som har genomgått tidigare kemoterapi eller som är benägna att MDR.

Resultat

Generering och karakterisering av AZD1152 HQPA-resistenta karcinomlinjer

Genetiska förändringar av funktionsförstärkning som är prognostiska för klinisk läkemedelsresistens mot små molekyler kan identifieras genom att först isolera celler som överlever och sprider sig i en annars dödlig läkemedelskoncentration följt av belysning av de underliggande molekylförändringarna. För att avslöja potentiella mekanismer som cancerceller kan cell-autonomt utnyttja för att undergräva aktiviteten hos hämmare av Aurora-kinaser, försökte vi generera cellinjer som var intrinsiskt resistenta mot AZD1152 HQPA. SW620 tjocktarmscancer och MiaPaCa pankreatiska karcinomceller förökades i närvaro av 1 μM AZD1152 HQPA (∼ 50-faldigt IC50-värdet) under en period av 3 månader. Mindre än 0, 01% av cellerna överlevde denna behandling efter fem passager (data visas inte). Celler som överlevde den initiala selektionsfasen bibehölls antingen i närvaro av 1 μM AZD1152 HQPA under ytterligare 3 månader eller förökades i frånvaro av läkemedel under samma period. Direkt DNA-sekvensering av Aurora B-genen i båda läkemedelsresistenta linjerna bekräftade att ingen mutation hade inträffat under selektion (data visas inte), som har rapporterats för ZM447439-resistenta HCT116-varianter. 16 Vi genomförde därefter genomöverbredd mikroarrayanalys av de föräldra- och läkemedelsresistenta cellerna för att identifiera förändringar av genuttryck som kunde korreleras med resistens mot AZD1152 HQPA. I det läkemedelsresistenta SW620-derivatet (nedan kallat SW620 MDR1 / 3 ) var ABCB1, som kodar MDR1, den mest överuttryckta genen i matrisen och identifierades med två distinkta sonduppsättningar (figur la). Vi observerade också att en andra gen, ABCB4, som kodar MDR3, också uppreglerades i SW620 MDR1 / 3, även om det inte omfattas av ABCB1. Bland genuppsättningen som kodar för kända småmolekyltransportörer är ABCB1 och ABCB4 de enda två som visar mycket differentiellt uttryck (figur Ib). Den uppenbara samregleringen av ABCB1 och ABCB4 var nyfiken med tanke på att dessa gener ligger intill varandra inom ett gemensamt genomiskt lokus på den långa armen på kromosom 7 (7q21.1). Detta antydde att den genomiska regionen innefattande ABCB1 och ABCB4 kan ha förstärkts under selektion i AZD1152 HQPA, vilket resulterade i tandemöveruttryck av dessa transportergener. Vi observerade en ökning av antalet DNA-kopior för både ABCB1 (fem kopior) och ABCB4 (tre kopior) i SW620 MDR1 / 3 relativt föräldra SW620 genom CGH-analys (figur 1c). I SW620 MDR1 / 3 bibehölls kopieringsnummerändringarna för båda generna 3 månader efter borttagande av AZD1152 HQPA från odlingsmediet (figur 1c), vilket indikerar att resistensfenotypen involverade en varaktig genetisk händelse som var förenlig med genamplifiering. MDR1 uppreglerades starkt på proteinnivån i celler som förökades i närvaro av AZD1152 HQPA och bestod även efter att selektionstrycket avlägsnades (figur 1d).

Identifiering av MDR1 och MDR3 som gener amplifierade i ett SW620- derivat valt för resistens mot AZD1152 HQPA. ( a ) mRNA-expressionsvärden för över 14 000 gener plus EST: er (22 000 sonduppsättningar) bestämdes med användning av Affymetrix HG-U133A GeneChips. Data presenteras som vikförändringen i genuttryck för SW620 MDR1 / 3- celler jämfört med de föräldra SW620-cellerna för alla gener vars uttryck ökar 10 gånger eller högre. ( b ) mRNA-expressionsvärden för ABCB1 och ABCB4 jämfört med andra lösta transportörer. ( c ) Kopienumret för ABCB1 och ABCB4 bestämdes med CGH med användning av Affymetrix 100 K SNP-chips i föräldra SW620, SW620 MDR1 / 3 och SW620 MDR1 / 3 efter 3 månader i kultur i läkemedelsfritt medium. Den vertikala gula linjen indikerar positionen för ABCB1-lokuset och den horisontella rosa linjen indikerar normalt DNA-kopienummer (två kopior). Fem kopior av ABCB1 detekterades av tre sonder och tre kopior av ABCB4 detekterades med en enda sond. ( d ) Relativt uttryck av MDRl-proteinet bestämdes genom immunblotanalys. P-aktin användes som en lastkontroll.

Bild i full storlek

I det läkemedelsresistenta MiaPaCa-derivatet (nedan kallat MiaPaCa BCRP ) visade ABCG2, som kodar för BCRP, en 98-faldig induktion genom mikroarrayanalys jämfört med föräldercellerna (figur 2a) och var den enda småmolekyltransportören som visade väsentligt differentiellt uttryck (figur 2b). Även om ingen amplifiering av ABCG2-genen detekterades av CGH (figur 2c), såg vi en stabil induktion av BCRP-proteinet (figur 2d), vilket troligen skulle vara funktionellt eftersom det uttrycktes vid höga nivåer på cellytan av MiaPaCa BCRP jämförde med CD44, som var liknande mellan de föräldra- och läkemedelsresistenta linjerna (figur 2e).

BCRP är den viktigaste xenobiotiska effluxtransportören som är uppreglerad i ett MiaPaCa-derivat valt för resistens mot AZD1152 HQPA . ( a ) Global mRNA-expression i MiaPaCa BCRP- celler bestämdes och presenteras såsom beskrivs i förklaringen i figur la. ( b ) mRNA-uttrycksvärden för ABCG2 jämfört med andra lösta transportörer. ( c ) Kopienumret för ABCG2 bestämdes med CGH med användning av Affymetrix 100 K SNP-chips i föräldra MiaPaCa, MiaPaCa BCRP och MiaPaCa BCRP efter 3 månader i kultur i läkemedelsfritt medium. Den vertikala gula linjen indikerar positionen för ABCG2-lokuset och den horisontella rosa linjen indikerar normalt DNA-kopieringsnummer (två kopior). Två kopior av ABCG2 detekterades av tre sonder. ( d ) Relativt uttryck av BCRP-proteinet detekterat genom immunblotting av totala celllysat framställda från celler av MiaPaCa eller MiaPaCa BCRP p-aktin användes som en proteinbelastningskontroll. ( e ) Expression av BCRP på cellytan för MiaPaCa och MiaPaCa BCRP- celler bestämdes med flödescytometri med användning av anti-BCRP primär antikropp i samband med en PE-märkt get-anti-mus-sekundär antikropp (längst till höger). PE-märkning i bakgrunden bestämdes med användning av celler färgade med PE-märkt sekundär antikropp ensam. PE-konjugerad anti-CD44-antikropp användes som en generell cellytfärg.

Bild i full storlek

Överuttryck av MDR1 och BCRP är tillräckliga för tumörcellresistens mot AZD1152 HQPA

SW620 MDR1 / 3- derivatet krävde ungefär 100 gånger mer AZD1152 HQPA för att hämma fosforylering av Aurora B-substratet, histon H3, än föräldraslinjen (figur 3a). Eftersom MDR1 är en ATP-beroende xenobiotisk transportör, rationaliserade vi att AZD1152 HQPA kan elimineras genom utflöde från det intracellulära facket i SW620 MDR1 / 3, och därmed spara histon H3-fosforylering. Betydligt mindre läkemedel mättes i cytosolen i den resistenta linjen jämfört med föräldra SW620-celler genom LC-MS-analys (figur 3b). PSC-833, en liten molekylinhibitor av MDR1, 17, 18 och MDR3, 19 var effektiv för att vända motståndet hos SW620 MDR1 / 3- celler mot AZD1152 HQPA (figur 3c). Partiell knockdown av MDR1 (∼ 75%) med siRNA delvis återställd hämning av histon H3-fosforylering av AZD1152 HQPA i SW620 MDR1 / 3 (figur 3d), vilket antyder att uppreglering av MDR1 krävs för full resistens mot AZD1152 HQPA i denna modell. Jämfört med föräldrar MiaPaCa-celler krävde MiaPaCa BCRP också signifikant högre koncentrationer av AZD1152 HQPA för att producera en liknande hämning av histon H3-fosforylering (figur 4a). Fumitremorgin C, en selektiv hämmare av BCRP, 20 var tillräcklig för att vända motståndet mot AZD1152 HQPA i MiaPaCa BCRP- derivat (figur 4a). Undertryckning av BCRP med siRNA reverserade också den inneboende resistensen hos MiaPaCa BCRP till AZD1152 HQPA (figur 4b) vilket indikerar att uppreglering av BCRP är orsakssamband bundet till AZD1152 HQPA-resistens. Generellt sett fann vi att siRNA-medierad undertryckning av MDR1 och BCRP var mindre effektiv än farmakologisk hämning vid återställande av AZD1152 HQPA-känslighet. Detta kan antingen förklaras genom ofullständig målnedsläppning eller av närvaron av ytterligare mekanismer som inte är MDR1 eller BCRP.

Inhibering av MDR1 vänder motstånd mot AZD1152 HQPA i SW620 MDR1 / 3- derivat. ( a ) SW620, SW620 MDR1 / 3 och SW620 MDR1 / 3 efter 3 månader i kultur i läkemedelsfritt medium behandlades med AZD1152 HQPA i dosrespons under 90 minuter. Fosforylering av histon H3 vid Ser 10 bestämdes genom immunblotanalys. ( b ) SW620 eller SW620 MDR1 / 3 behandlades med 1 mikrometer AZD1152 HQPA under 4 timmar. Cellerna fraktionerades och AZD1152 HQPA-koncentrationen bestämdes genom LC-MS-analys i respektive provfraktion. ( c ) SW620 MDR1 / 3- celler behandlades under 2 timmar med antingen DMSO eller 1 μM PSC-833 före AZD1152 HQPA i dosrespons under 90 minuter. Fosforylering av histon H3 bestämdes sedan genom immunblotting. ( d ) Effekten av MDR1-knockdown i SW620 MDR1 / 3- derivatet bedömdes genom att transfektera antingen Luciferas (siLuciferas) eller MDR1 siRNA (siMDR1) följt av behandling av de transfekterade cellerna med AZD1152 HQPA under 90 minuter. Immunoblot-analys av MDR1 indikerar att proteinnivåerna reducerades med cirka 75% med siMDR1 jämfört med siLuciferas.

Bild i full storlek

Inhibering av BCRP reverserar resistens mot AZD1152 HQPA i MiaPaCa BCRP- derivat. ( a ) Föräldrar MiaPaCa eller MiaPaCa BCRP- celler behandlades under 2 timmar med antingen DMSO eller 10 μM fumitremorgin C före AZD1152 HQPA i dosrespons under 90 minuter som indikerats. Fosforylering av histon H3 bestämdes sedan genom immunblotting. ( b ) MiaPaCa BCRP- celler transfekterades med antingen siLuciferas eller BCRP siRNA (siBCRP) följt av behandling med AZD1152 HQPA i dosrespons. BCRP siRNA minskade BCRP-uttryck med över 90% jämfört med siLuciferas.

Bild i full storlek

MDR1-uppreglering gör tumörtillväxt eldfast mot AZD1152

Vi uppskattade den minsta intratumorkoncentrationen av AZD1152 HQPA som är nödvändig för hämning av Aurora B genom att beräkna produkten av den inneboende styrkan hos AZD1152 HQPA i SW620 eller SW620 MDR1 / 3 (0, 02 respektive 2 μM) och vikningsförlusten i AZD1152 HQPA vid analys i närvaro av 50% (v / v) musplasma (förlusten i styrka beror antagligen på plasmaproteinbindning; data visas inte). Baserat på denna förutsägelse måste en minimitröskelkoncentration av AZD1152 HQPA på 0, 1 eller 10 μM uppnås i SW620 respektive SW620 MDR1 / 3 xenografts för att producera hämning av histon H3-fosforylering (figur 5a, topppanel). Tumors farmakokinetik utvärderades efter en enda ip-administration av AZD1152 HQPA under en 24-timmarsperiod efter dos. Denna analys visade en minskning av den totala tumören AUC 0-24 timmar i SW620 MDR1 / 3 (155 μM h) xenografts jämfört med föräldrakoorten (319 μM h). Baserat på ovannämnda förutsägelse överskred AZD1152 HQPA-koncentrationer i SW620 MDR1 / 3- tumörerna den lägsta tröskelkoncentrationen under endast en kort period (∼ 6 h), medan i SW620-tumörer uppnåddes koncentrationer över tröskeln under minst 24 timmar (figur 5a, nedre panel). På motsvarande sätt observerades endast en kortvarig hämning av histon H3-fosforylering i SW620 MDR1 / 3 jämfört med föräldra tumörer (figur 5b). Eftersom polyploidisering är en manifestation av att hämma Aurora B under mitos, skulle man förutsäga att AZD1152 måste vara närvarande vid den lägsta tröskelkoncentrationen tillräckligt länge för att tillåta spridande celler i tumören att försöka en enda mitos eller, en period som är ungefär motsvarande en cellcykel ( 15–20 timmar). Fortsatt hämning av Aurora B i föräldra-SW620-xenotransplantat samtidigt med den mycket effektiva aktiviteten som observerats i denna modell, medan den övergående hämningen som observerats i SW620 MDR1 / 3- tumörer ger liten eller ingen antitumoreffekt vid någon dos (jfr. Figur 5b mot figur 5c och d). Tyvärr dämpades de tumörgena egenskaperna hos MiaPaCa BCRP på något sätt under selektion in vitro , och hindrade oss därför från att ytterligare utvärdera dess svar på AZD1152 in vivo.

Förhållande mellan farmakokinetik, farmakodynamik och effekt av AZD1152 HQPA i SW620 mot SW620 MDR1 / 3 xenografts. ( a ) (topppanel) Den projicerade tröskelens intratumorkoncentration som krävs för att hämma xenograft-histon H3-fosforylering uppskattades genom att beräkna produkten av den inre styrkan hos AZD1152 HQPA i en analys av histon H3-fosforylering och vikningsminskningen i styrka av AZD1152 HQPA vid analys i närvaro av 50% (vv −1 ) musplasma. (nedre panel) Intratumors farmakokinetik för AZD1152 HQPA bestämdes vid 0, 2, 8 och 24 timmar efter dos efter en enda intraperitoneal (ip) injektion av 100 mg kg −1 . ( b ) Möss som bär etablerade SW620 och SW620 MDR1 / 3 tumör xenografts gavs en enda dos AZD1152 HQPA (100 mg kg −1, ip), och tre tumörer per tidpunkt skördades. Tumorer extraherades och fosfo-histon H3-nivåer bestämdes genom immunblotting i SW620-tumör (ljusblå) och SW620 MDR1 / 3- tumör (mörkblå) efter behandling med AZD1152. Immunoblots kvantifierades, och data uttrycks som området under kurvan. Medelvärdena från individuella tidpunkter presenteras också ± sem ( c och d ) SW620 och SW620 MDR1 / 3- celler injicerades subkutant i scid -bg-möss. Tumörer storleksanpassades vid ungefär 300 mm 3 och behandling med AZD1152 initierades dag 7 efter inokulering. AZD1152 administrerades i ett qdx2-schema under två cykler (2 dagar på, 5 dagar ledigt) i doser av 50 eller 100 mg / kg / d genom inp-injektion under 2 veckor. Varje punkt representerar medelvärdet ± sd för 10 tumörer.

Bild i full storlek

Överuttryck av MDR1 eller BCRP är prognostiskt för in vitro och in vivo- resistens mot AZD1152

Med tanke på att MDR1 / 3 och BCRP i dessa modeller gav resistens mot anticanceregenskaperna hos AZD1152 både in vitro och in vivo , satte vi oss ut för att fastställa huruvida förekomsten av dessa förmodade Aurora-hämmaresistensgen verkligen var förutsägbar för inre tumörer motstånd. Vi frågade först interna genuttrycksdata från en panel med humana xenografts (data visas inte) för att identifiera tumörmodeller som visade signifikant förhöjda nivåer av ABCB1, (MDR1) eller ABCG2 (BCRP). Bland dessa modeller bekräftades HCT-15 och AsPC1 för att uttrycka MDR1 respektive BCRP på proteinnivå (figur 6a). Det är viktigt att notera att HCT-15 inte visade någon uppreglering av ABCB4 / MDR3 på mRNA-nivån (data visas inte). Vi utvärderade sedan tre representativa Aurora-kinasinhibitorer såväl som paklitaxel, ett känt substrat av MDR1 21 men inte för BCRP, 22 vid kolonibildning och cellproliferationsanalyser i en cellinjepanel som inkorporerade HCT-15 och AsPC1. I allmänhet var de flesta cellinjer ganska känsliga för AZD1152 HQPA som visade IC50-värden inom det låga nanomolära området (4–15 n M; figur 6b). Däremot var SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa BCRP, HCT-15 och AsPC1 signifikant resistenta mot denna förening (ICso-värden på 2, 1, 4 och 2, 2, 0, 63 μM, respektive). Märkligt nog uppvisade pan-Aurora-kinasinhibitorn, VX-680, en liknande aktivitetsprofil i cellinjepanelen, även om resistensgraden för SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa BCRP, HCT-15 och AsPC1 var jämförelsevis mindre. Som förväntat var SW620 MDR1 / 3 och HCT-15, men inte MiaPaCa BCRP eller AsPC1 relativt okänsliga för den naturliga produkten, paklitaxel. Ingen synlig kraftförlust observerades för Aurora A-selektiv förening, MLN8054. Det är viktigt att alla cellinjer som var relativt känsliga för AZD1152 HQPA (SW620, MiaPaCa, HT1080, MDA-MB-231, HCT116, H1299, RS4; 11 och DoHH-2) uttryckte detekterbara mängder varken MDR1 eller BCRP genom immunblotanalys (Figur 6a och data visas inte). Vi bekräftade att BCRP och MDR1 var nödvändiga för resistens mot AZD1152 HQPA i HCT-15 respektive AsPC1 med användning av PSC-833 och fumitremorgin C (figur 6c och d).

Cellinjer som överuttrycker MDR1 eller BCRP är resistenta mot AZD1152 HQPA och VX-680 in vitro. ( a ) Immunoblotting av cellinjer som använts i xenograftstudier visar relativ expression av MDR1 och BCRP. ( b ) En panel med cellinjer utvärderades med avseende på relativ känslighet för AZD1152 HQPA, VX-680, MLN8054 och paklitaxel i en 7-dagars kolonibildning (vidhäftande linjer: SW620, SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa, MiaPaCa BCRP, HT1080, MDA -MB-231, HCT116, H1299, HCT-15, AsPC1) eller livskraft (icke-vidhäftande linjer: RS; 411 och DoHH-2). Cellerna behandlades i dosrespons för att bestämma IC50s. ( c ) HCT-15-celler behandlades med DMSO eller 1 mikrometer PSC-833 under 1 timme före tillsatsen av AZD1152 HQPA vid de angivna koncentrationerna under ytterligare en timme. Totalt och fosfo- (Ser 10 ) -histon H3 bestämdes genom immunblotting. ( d ) AsPC1-celler behandlades med DMSO eller 10 mikrometer fumitremorgin C under 1 timme följt av AZD1152 HQPA såsom beskrivits i c .

Bild i full storlek

När xenograftats i möss var AsPC1 okänslig för AZD1152 i en dos som fullständigt undertryckte tumörtillväxt SW620 (figurerna 7a och b). På liknande sätt minskades tillväxten av HCT-15 kolonkarcinom xenografts genom behandling med antingen AZD1152 eller VX-680 (figur 6e), medan båda terapierna inducerade signifikant tumörtillväxtinhibering i HCT116, en alternativ koloncancermodell (figur 6d), som i DoHH-2 B-cell-lymfomxenografts (figur 6c).

Xenografts som överuttrycker BCRP eller MDR1 är eldfasta mot AZD1152 in vivo . ( a och b ) SW620 ( a ) eller AsPC1 ( b ) tumörer var storlekskopplade och djur administrerades AZD1152 i veckoschema av 50 mg / kg / d, ip, q2d. Dosering genomfördes under en 3-veckors period inom vilken tumörtillväxt bedömdes. ( c - e ) DoHH-2 ( c ), HCT116 ( d ) eller HCT-15 ( e ) tumörer matchades i storlek och AZD1152 administrerades vid 100 mg / kg / d, ip, bid × 3 (eller två cykler för HCT-15, 3 dagar på och 4 dagar ledigt) eller VX-680 vid 50 mg / kg / d, ip, bidar till slut (17–21 dagar beroende på när tumörens slutpunkt uppnås). Betydande antitumoreffekt observerades i SW620 (66% TGI AZD dag 28 ), DOHH-2 (89% TGI AZD dag 26 ; 64% TGI VX dag 26 ) och HCT-116 (71% TGI AZD dag 35 ; 65% TGI VX dag 35 ) men inte i BCRP-uttryckande AsPC1 (24% TGI AZD dag 42 ) eller MDR-1-uttryckande HCT-15 (10% TGI AZD dag 32 ; 5% TGI VX dag 32 ), P <0, 05, mot fordonskontroller . Under de studier som visats i ae, observerades inga tydliga tecken på signifikant viktminskning, uttorkning, brist på skötsel etc.. Data representerar n = 7–10 möss / behandlingsgrupp ± se

Bild i full storlek

Diskussion

Att förstå de molekylära grunden för cancerfenotyper utgör grunden för molekylärriktade, så kallade "personliga" läkemedel som utnyttjar identifierbara genetiska eller epigenetiska känsligheter för terapi. Lika viktigt är att förstå den genetiska grunden för resistens mot terapi, vilket ger ett ytterligare filter för att stratifiera en blivande patientpopulation. På grund av det allestädes närvarande behovet av spridning av celler för cellcykelprogression har hittills lite bevis visat sig för en utsökt genetisk grund för känslighet för neocytotoxiska medel utformade för att rikta in olika viktiga noder i cellcykelmaskineriet. Aurora-kinaserna representerar en sådan klass av molekylära mål som är väsentliga för progression genom mitos, och små molekylinhibitorer av dessa kinaser har en bred antitumoreffektivitet som ännu inte har visat sig diskriminera på grund av cancergenet. 7, 11 Även om det har visats att cancerceller som är bristfälliga i p53 uppvisar accelererad polyploidisering vid behandling med VX-680, tycks detta inte representera genetisk känslighet i sig eftersom celler som innehar vildtyp p53 också är föremål för polyploidiserings-medierad cell död, men kanske med försenad kinetik. Våra data ger genetiska bevis för att indikera att Aurora-kinasinhibitorn, AZD1152, som för närvarande genomgår klinisk utvärdering och potentiellt av en annan klinisk förening, VX-680, kan vara relativt ineffektiv i tumörceller som överuttrycker MDR1 eller BCRP. I detta fall är de genetiska faktorerna som ger resistens kopplade till farmakologin för det terapeutiska snarare än till dess molekylära mål. Detta stöds av upptäckten att Aurora-kinasinhibitorn, MLN8054, är ekvipotent in vitro vid koncentrationer som hämmar både Aurora A och B oavsett MDR1- eller BCRP-status (figur 6b). Nyligen har Girdler et al. 16 rapporterade identifieringen av flera Aurora B-kinasdomänmutationer som uppstår under val av DNA-reparationsdefekt koloncarcinomlinje, HCT116, i ZM447439. Dessa katalytiska domänmutationer var också tillräckliga för att göra celler resistenta mot AZD1152 och VX-680 vilket indikerar att resistens mot dessa medel kan uppstå oberoende av MDR.

MDR-fenotypen som observerades i SW620 MDR1 / 3 resulterar från överuttrycket av MDR1 och / eller MDR3, associerat med den regionala kopienumervinsten vid det genomiska lokuset som innefattar ABCB1 och ABCB4. Föreningen mellan ökat uttryck av MDR1 och ökat antal kopior har rapporterats i förvärvade paklitaxelresistenta ovariecancercellinjer 24 och doxorubicinresistenta bröstcancercellinjer, 25 och kanske inte överraskande observeras samregleringen av MDR3 ofta när MDR1 expression drivs av genamplifiering. 24, 25 Läkemedlen som används för att producera resistensfenotyper i dessa studier flödes från celler av MDR1-transportören, vilket bevisar den selektiva fördelen som beviljas genom MDR1-uppreglering. Data genererade med användning av MiaPaCa BCRP visar vidare att resistens mot AZD1152 HQPA kan uppnås genom en andra genetisk väg: uppregleringen av BCRP. Det är svårt att förena om detta återspeglar en släkt eller genetisk predisposition eller istället helt stokastisk. Det är dock spännande att i denna studie av AZD1152 HQPA-resistenta cellinjer observeras uppreglering av MDR1 i kolonkarcinomlinjer (SW620 MDR1 / 3 och HCT-15), medan pancreaskarcinomlinjer överuttrycker BCRP (MiaPaCa BCRP och AsPC1) .

Till skillnad från MDR1 har BCRP varit relativt undersudierad. Även om den ursprungligen identifierades som en läkemedelsresistensgen av flera laboratorier, 26, 27, 28, 29, är det fortfarande oklart hur betydande en roll den spelar i klinisk läkemedelsresistens. Även om amplifiering av ABCG2-genen har observerats under valet av läkemedelsresistenta cellinjer. 30, 31, 32 CGH-analys indikerar inte en förändring i DNA-kopienummer vid ABCG2-lokuset i MiaPaCa BCRP (figur 2c). Uppreglering av BCRP kan ske oberoende av genamplifiering. 32 Exempelvis visades BCRP ge resistens mot det cyklinberoende kinaset och Aurora-kinasinhibitorn, JNJ-7706621, i celler som förökades i närvaro av läkemedlet. 33 Det är intressant att både BCRP-uttryck och resistens mot JNJ-7706621 vändes fullständigt efter läkemedelsavlägsnande, 33 vilket indikerar att BRCP-medierad resistens inte kräver en genomisk förändring. Aktivering av kärnhormonreceptorer 34 och promotormetylering 35 har visats kontrollera transkriptionen av BCRP. Ytterligare ett lager av regulatorisk komplexitet härrör från studier av doxorubicinresistens, varvid substratspecificiteten för murint BCRP har visat sig förändras genom punktmutation. 36 Den exakta orsaken till uppreglering av BCRP i MiaPaCa BCRP är inte klar. Icke desto mindre antyder våra data att en hållbar genetisk händelse som resulterar i transkriptionell aktivering av denna xenobiotiska transportör skulle kunna stå för dess stabila uttryck och underhåll av den läkemedelsresistenta fenotypen i MiaPaCa BCRP .

En strategi för att övervinna MDR har varit att hämma de relevanta transportörerna med små molekylantagonister som konkurrerar om substratbindning. Även om detta tillvägagångssätt historiskt har gett liten klinisk framgång visade tidiga prototyper av denna klass av hämmare oförutsägbara farmakokinetiska interaktioner med co-administrerade kemoterapier, vilket begränsade förmågan att definiera det terapeutiska fönstret i kombinationen. Nyare små molekylhämmare av MDR utvärderas nu som visar större specificitet samtidigt som potentialen för läkemedels-läkemedelsinteraktioner minimeras. 37 Andra tillvägagångssätt för att neutralisera MDR inbegriper ingrepp på expressionsnivån för ABC-transportergener inklusive hämmare av kärnhormonreceptorer som driver uttrycket av xenobiotiska transportörer, antisense oligonukleotider, siRNA eller ribozymbaserade terapier. Sammantaget är dessa strategier emellertid något experimentella. Våra data bekräftar in vitro principen om att använda antingen små molekyler (figurerna 3c, 4a och 6c och d) eller siRNA (figurerna 3d och 4b) för att undvika ABC-transporterfunktion som ett medel för att återkänna läkemedelsresistenta celler till AZD1152 HQPA . I slutändan bör den rationella utformningen av Aurora-kinasinhibitorer vars aktivitet inte påverkas av MDR göra svårigheterna förknippade med samtidig administrering av ett MDR-reverserande medel.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • E-MEXP-1008
  • GSE7068

Dualitet av intresse

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.