Identifiering av cellprocesser som snabbt moduleras som svar på trakeal ocklusion i möss lungor | pediatrisk forskning

Identifiering av cellprocesser som snabbt moduleras som svar på trakeal ocklusion i möss lungor | pediatrisk forskning

Anonim

Abstrakt

Lungutvecklingen fortskrider genom en process som är beroende av mekanisk cellsträckning. Emellertid är denna process inte väl definierad på molekylnivå. Vårt mål var att analysera transkriptomet för fostrets mus lungor globalt efter korta perioder med luftrörelse (TO) för att identifiera cellprocesser som snabbt moduleras som svar på intraluminal stretchökning. Seriell analys av genuttryck (SAGE) användes för att undersöka det globala transkriptomiska svaret från musens prealveolära stadiumslungor till in vivo TO vid 1 och 3 timmar. SAGE-resultat förlängdes genom histo- och immunokemisk undersökning. Baserat på de identifierade 97 TO-modulerade transkripten påpekar våra resultat vidare att kontinuerlig sträckning i utvecklingen av lungor leder direkt till snabba och mycket specifika fenotypiska modifieringar i en betydande andel av lungceller. Vi drar slutsatsen att ökning av intraluminal sträckning under prealveolärt stadium av lungutveckling inducerar en kritisk övergång av lungcellernas fenotyp där det finns en ökning av a-glatt muskelaktin (α-SMA) -innehållande celler tillsammans med en relativ minskning av lipidinnehållande celler .

Huvudsaklig

I slutet av dräktigheten är fetalt lungvolym påverkat av en viktig och kontinuerlig distention som är sekundär till den kontinuerliga intraluminala vätskesekretionen av fostret lungepitel (1). Inom att utveckla lungor sker denna flytande sekvestrering genom den aktiva struphuvudets stängning under apnéen (1), som står för huvuddelen av det sena fostrets liv (2). Onormal förlust av lungvätska är skadligt för lungutvecklingen (3). Faktum är att fetal cervikalsnörstransektion, vilket resulterar i en brist på koordination mellan larynxöppning och membranrörelser, vilket möjliggör överdriven förlust av lungvätska under andningsrörelser hos foster leder till lunghypoplasi (4). På liknande sätt är förlust av larynxtonus (5) och förbikoppling av struphuvudet genom experimentell trakeotomi (6) under fostrets liv båda förknippade med överdriven lungvätskeförlust och allvarlig lunghypoplasi. Däremot kan stimulering av lungtillväxt och utveckling uppnås genom att använda luftrörshindringstekniker i ett lämpligt utvecklingsstadium (7). Genom att sekvestera intraluminal vätska, förstärker fostrets trakeal ocklusion (TO) kontinuerlig sträckning. TO representerar en unik metodik in vivo som underlättar undersökning av de naturliga tredimensionella mekaniska krafterna på lungutvecklingen.

Även om förhållandet mellan graden av fetalt lungutvidgning och lungutveckling är väl etablerat, förstås de involverade mekanismerna inte väl. Vi antar att en ökning av fostrets lungsträcka orsakar en stimulans som snabbt förmedlar genuttryck innan någon förändring i fostrets lungstruktur observeras. För att undersöka mekanismerna som ligger bakom sträckningsinducerad lungmognad skapade vi tidigare en in vivo murin modell av TO som visade en betydande strukturell acceleration av lungväxt och utveckling i prealveolär stadium under en 24-timmarsperiod (8). Med denna modell visade vi nyligen att TO inducerar ett omedelbart cellulärt svar (9). Jämfört med skam-TO och kontroller som inte använts, inducerade TO faktiskt en ökning i proliferation av cellkärnantigen (PCNA) proteinuttryck i differentierade epiteliala luftvägar inom den första timmen efter operationen. Här var vårt mål att analysera transkriptomet för fetala muselungar globalt efter exakt definierade korta perioder med TO för att identifiera cellulära processer som snabbt moduleras som svar på intraluminal sträckningsökning.

För att identifiera den fullständiga modulen av mekaniskt transducerade gener jämförde vi transkriptomer av TO och sham-TO fetala lungor vid 1 och 3 timmar efter operation med seriell analys av genuttryck (SAGE). Transkript uttryckt differentiellt mellan motsvarande tidsbestämda sham-TO- och TO-fetala lungor kategoriserades efter genfunktion. De viktigaste förändringarna som observerats gäller cytoskelett- och metabolismrelaterade transkript. Eftersom pulmonella interstitiella fibroblaster är kända för att presentera en övergång från lipogena till myogena fenotyper efter födseln (10), förlängdes SAGE-resultaten genom histo- och immunokemisk analys av både cellulära lipider och kontraktila interstitiella celler.

MATERIAL OCH METODER

Kirurgisk procedur och vävnadsskörd.

Kommittén för djurskydd vid Laval universitet godkände operationerna. TO utfördes på CD-1-möss vid 16, 5 d graviditet (sen kanalikulär stadium av lungutvecklingen) såsom beskrivits tidigare (8). Fosterets luftstrupe ockluserades med användning av en kirurgisk ligationsklämma. Fostret återfördes till livmodern där graviditeten fortsatte. Kontroll-skam-TO-foster genomgick exakt samma operation för att spara faktiska TO. Dammarna dödades 1 eller 3 timmar efter operationen och opererade foster levererades av kejsarsnitt. Framgången för TO under en så kort tidsram ( dvs. innan grova morfologiska förändringar dyker upp) bekräftades tidigare av observationen av en signifikant ökning av luminal rymdfraktion med bara 1 timme TO när lungorna fixerades med en kirurgisk klämma kvar på plats ( TO-fall) eller läggs till före skörden (skam-TO-fall) (9). Dessutom utsattes fosterhalsen för en noggrann undersökning, såsom beskrivits tidigare (8). Foster lungor skördades, frystes i flytande kväve och förvarades vid -80 ° C. Lungor som användes för SAGE, neutral lipidfärgning och a-SMA-immunfluorescens och a-glatt muskelaktin (α-SMA) kom från olika djur eftersom vävnadsfixeringsprocessen skilde sig åt mellan experimenten.

SALVIA.

SAGE är en metod som ger en översikt över ett provs genaktivitet genom att fånga mRNA och räkna och identifiera dem. De fyra SAGE-biblioteken genererades separat som tidigare beskrivits (11) från poolade fetala lungor (10 i varje experimentell TO- och sham-TO-grupp vid 1 och 3 timmar). Resulterande SAGE-taggar med 15 bp långa matchades i GenBank- och UniGene-databaser för att identifiera motsvarande transkript. Pålitlig tag-till-gen-matchning tillskrives taggar som motsvarade en polyadenylerad sekvens och vars sista 3'-NlaIII-ställe låg på den positiva sekvenssträngen. När en tagg inte uppfyllde dessa kriterier för minst en uttryckt sekvenstagg med en känd poly-A + -svans i UniGene-klustret, ansågs den inte vidare. För att jämföra nivåskillnadsuttrycksnivåer mellan bibliotek normaliserades data till 50 000 taggar per bibliotek. För att upptäcka transkripten uppreglerade eller nedreglerade som svar på TO med mer än en tvåfaldig förändring i taggnivåer användes ett jämförande räknevisningstest (11). Skillnader mellan kontroll- och experimentbibliotek ansågs statistiskt signifikanta vid p <0, 05. Tag-to-gen-matchningar har kategoriserats efter genfunktion baserat på information rapporterad av Gene Ontology och TIGR-webbplatser.

Identifiering av lipidinnehållande celler.

Lipogen cellfenotyp utvärderades specifikt med användning av oljeröd O (ORO) -färgning (12). Lungorna inbäddades i OCT-medium och frystes vid -80 ° C, och sektioner skars. Sektioner fixerades i formalin, sköljdes i vatten, dränkts i propylenglykol och nedsänktes i ORO (FluKa Chemica, Oakville, Kanada) för att färga neutrala lipider (huvudsakligen triglycerider). Sektioner sköljdes i propylenglykol och vatten och försänkades med hematoxylin. Kärnor färgades med Hoechst. Resultaten uttrycktes som förhållandet mellan pixelområdet för ORO-färgning, som autofluorescerar vid 570–580 nm, över pixelområdet för kärnorna (13) för att undvika potentiell förspänning till följd av skillnad i luminalutrymme över vävnadsfraktion mellan skam-TO och TILL grupper. Antalet fetala lungor som analyserades var 11 för 1-h TO, 10 för 1-tim sham-TO, 10 för 3-tim TO, 11 för 3-tim sham-TO, 11 för 24-tim TO, och åtta för 24 -h skam-TO.

Identifiering av celler som innehåller α-SMA.

Indirekt immunfluorescens utfördes på metanolfixerade kryosektioner såsom beskrivits tidigare (14). Mus monoklonal anti-α-SMA-antikropp (klon 1A4, DakoCytomation, Glostrup, Danmark) användes. Sekundär antikropp var diklorotriazinylaminofluorescein-konjugerad get anti-mus IgG-IgM (Chemicon, Temecula, CA). Kärnor färgades med Hoechst. Resultaten uttrycktes som förhållandet mellan pixelområdet för a-SMA-färgning (520–530 nm) över pixelområdet för kärnorna (15). Digitala bilder togs med hjälp av den röda kanalen för att optimera kontrasten. Antalet fetala lungor som analyserades var 10 för 1-h TO och sham-TO, nio för 3-tim TO och 10 för 3-timmar skam-TO. Vi utförde också 3, 3 (1) -diaminobenzidin (DAB) -baserad immunohistokemi för att möjliggöra visualisering av vävnadskontexten för a-SMA-proteinuttrycksmönster. Formalin-fixerade och paraffin-inbäddade lungavsnitt deparaffiniserades i xylen och rehydratiserades i en minskande etanolgradient. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 0, 6% väteperoxid / 100% metanol. Efter blockering (Tris-buffrad saltlösning, 0, 5% bovint serumalbumin, 1, 5% normalt getserum) inkuberades sektioner med anti-α-SMA-antikroppen. Sektionerna inkuberades sedan med biotinylerad sekundär antikropp och avslöjades med ett Vectastain ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Efter inkubering i en streptavidin-peroxidaslösning utvecklades sliderna med DAB. Motverkande utfördes med hematoxylin. Antalet observerade fetala lungor var sex för 1-h TO, fem för 1-tim sham-TO, sex för 3-tim TO, och sju för 3-tim sham-TO. För varje immunfärgning behandlades två kontrollsektioner identiskt förutom att blockerande serum ersatte primär antikropp i en och sekundär antikropp i den andra. Osaklig bakgrund observerades för alla kontroller.

Mikroskopiska analyser.

Randomisering och analyser av lungtsektion genomfördes enligt riktlinjer från Bolender et al. (16) för att minimera observatörens förspänning. I genomsnitt analyserades 10 slumpmässiga fält per foster från minst åtta lungor i var och en av de experimentella och kontrollgrupper som användes för kvantifiering. Data angående ORO-fluorescens och immunofluorescens av a-SMA-protein analyserades genom analys av varians och Scheffé post hoc- test (SAS-programvara) utfördes på de genomsnittliga data från varje djur. Betydelsen bedömdes vid p <0, 05.

RESULTAT

Cirka 39 000–50 000 taggar från vart och ett av de fyra SAGE-biblioteken sekvenserades för totalt 186 189 taggar (tabell 1). Procentandelen taggar som motsvarar kända mRNA-sekvenser i GenBank- och UniGene-databaser var liknande bland de fyra biblioteken (intervall, 32% –39%). Antalet taggar som var närvarande vid en expressionsnivå> 0, 5% var också konsekvent bland de fyra biblioteken (intervall, sex till 12) såväl som antalet av de som visade en uttrycksnivå> 0, 1% (intervall, 63–77).

Full storlek bord

Eftersom våra intressen rör tidigt transkriptionellt svar på ökad intraluminal sträckning under sen lungutveckling jämförde vi TO-bibliotek med motsvarande skam-TO-bibliotek. Totalt moduleras totalt 97 unika taggar signifikant vid 1 och / eller 3 timmar efter TO ( p <0, 05). Vi observerade 66 taggar modulerade efter bara 1 timme av TO: 36 var uppreglerade och 30 nedreglerade. Dessutom observerade vi 60 taggar modulerade med 3 h TO: 27 var uppreglerade och 33 nedreglerade. För att avgränsa de cellulära processerna som snabbt moduleras av TO har olika uttryckta taggar organiserats av funktionella familjer (fig. 1). Baserat på denna klassificering motsvarar taggar som moduleras med 1 och 3 timmar av TO transkript relaterade till sex huvudfunktionella familjer: cellstruktur och rörlighet, metabolism, cellsignalering och kommunikation, cellcykel, RNA- och proteinsyntes, och cell- och organismförsvar. Andra TO-modulerade taggar motsvarar transkript för vilka den biologiska funktionen ännu inte har karakteriserats.

Distribution av TO-modulerade transkript till funktionella familjer. Distribution av funktionella familjer av transkript motsvarande unika SAGE-taggar modulerade av TO jämfört med sham-TO ( p <0, 05). Antalet taggar som moduleras i varje funktionell familj visas inom parentes.

Bild i full storlek

Taggar funktionellt motsvarande cellstruktur och rörlighet (cytoskelett i figur 1) representerar en viktig andel taggar uppreglerade av TO: 47% av taggar uppreglerade med 1 timme TO (17 taggar) och 56% av taggar uppreglerade med 3 timmar TO (15 taggar). Bland de 17 taggarna som var uppreglerade med 1 h TO, förblev 14 högre i TO-biblioteket än i sham-TO-biblioteket vid 3 timmar. Intressant nog var åtta av dessa transkript snabba isoformer av muskelrelaterade proteiner.

Taggar som motsvarar metabolismrelaterade transkript svarar för 25% och 14% av taggarna uppreglerade av TO vid 1 respektive 3 timmar och för 47% och 36% av taggarna nedreglerade av TO vid 1 respektive 3 timmar. . Det huvudsakliga metaboliska svaret som observerats med TO avser uppreglering av glykolys och nedreglering av lipidmetabolismen. Faktum är att sex taggar motsvarande glykolysrelaterade transkript uppreglerades med 1 timme TO. Däremot var lipidmetabolismrelaterade transkript väsentligen nedreglerade av TO: nio taggar vid 1 timme och sex taggar vid 3 timmar. Fyra taggar nedreglerades med 1 och 3 timmar TO och fem taggar nedreglerades endast med 1 timme TO. Taggar motsvarande gener relaterade till andra metabola processer än glykolys och lipider reglerades också upp och ner av både 1 och 3 timmar av TO. De representerar huvudsakligen energimetabolism, men också aminosyror och kolhydratmetabola processer.

Som nämnts tidigare modulerades också taggar motsvarande proteiner relaterade till andra biologiska processer snabbt av TO. Exempelvis reglerades vissa taggar som motsvarade gener relaterade till RNA och proteinsyntes samt cellsignalering av TO vid både 1- och 3-timmars tidpunkter. Omvänt, taggar som motsvarar gener som kodar för cellförsvarsrelaterade proteiner, cellcykel och cellsignalering reglerades ned av TO vid både 1- och 3-timmars tidpunkter. Vi observerade också fyra taggar som motsvarade gener relaterade till RNA och proteinsyntes och en annan motsvarande cytoskeletalt protein som nedreglerades endast vid 1 timme av TO. Slutligen observerade vi få taggar upp- och nerreglerade av både 1 och 3 timmar TO för vilken motsvarande proteinfunktion är okänd.

ORO-färgning visar en temporär ökning av halten neutral lipid (främst triglycerid) från 1 till 24 timmar i både sham-TO och TO-lungorna (fig. 2). Färgningen är begränsad till mesenkym och är praktiskt taget frånvarande i epitel. Vid 1 och 3 timmar observerades ingen signifikant skillnad mellan TO- och skam-TO-grupper (Fig. 2 G ). Emellertid är den neutrala lipidhalten i TO-gruppen efter 24 timmar lägre än för sham-TO-gruppen ( p <0, 05). Myogen fenotyp visualiserades genom a-SMA ljusfält-immunohistokemi (fig. 3 A - D ) och kvantifierades med användning av immunofluorescens (fig. 3 E - H ). a-SMA anses vara en markör för den initiala differentieringen av glatta muskelceller och upptäcks också i alveolära myofibroblaster och mikrovaskulära pericyter (17). En signifikant ökning i densitet av celler som uttrycker a-SMA inträffar i TO-fall i jämförelse med kontroller (fig. 3 I ). Denna ökning observeras 1 timme efter operationen och hålls vid 3 timmar ( p <0, 05). Western blot-analys vid 1 och 3 timmar visar emellertid inte signifikant skillnad i totala mängden a-SMA-protein mellan sham-TO och TO-lungor (data visas inte). I skam-TO-fall är α-SMA-färgning praktiskt taget begränsad till mesenkymet som omger utvecklande luftvägsepitel (fig. 3 B och D ) medan det i TO-gruppen också förekommer inom mesenkymet som omger acini i lungperiferin (fig. 3A och C ).

Bedömning av lipidinnehållande celler i lungan som svar på TO. ORO triglyceridfärgning i musens lungor efter TO ( vänster kolumn ) och sham-TO ( höger kolumn ). Exempel efter 1 timme ( A , B ) och 24 timmar ( C - F ) observerade i både ljusfält ( A - D ) och fluorescens ( E , F ). Kärnor är färgade blått med hematoxylin (ljust fält) och Hoechst (fluorescens). Triglyceridfärgning visas som mörka fläckar i ljust fält och röd i fluorescens. ( G ) Förhållande av pixelområdet för ORO-färgning över pixelområdet för kärnor (medelvärde ± SEM). Stag indikerar signifikant skillnad ( p <0, 05) mellan TO och sham-TO. Pilar , mesenkymala celler; pilspetsar , epitelceller; solida kolumner , TO, öppna kolumner, skam-TO.

Bild i full storlek

Bedömning av celler som innehåller α-SMA i lungan som svar på TO. α-SMA-färgning i musens lungor efter TO ( vänster kolumn ) och sham-TO ( höger kolumn ). Exempel efter 1 timme ( A , B ) och 3 timmar ( C , D ) visualiserade med DAB-baserad immunohistokemi. Exempel efter 1 timme ( E , F ) och 3 timmar ( G , H ) med användning av immunofluorescens i vilka kärnor är färgade blå med Hoechst- och a-SMA-färgning verkar som röd. ( I ) Förhållande mellan pixelområdet för a-SMA över pixelområdet för kärnor (medelvärde ± SEM). Hängslen indikerar signifikant skillnad ( p <0, 05) mellan TO och sham-TO. Pilar , mesenkymala celler; pilspetsar , epitelceller; fasta kolumner , TO; öppna kolumner : sham-TO.

Bild i full storlek

DISKUSSION

SAGE är en väletablerad teknologi som möjliggör snabb och effektiv identifiering samt kvantitativ bedömning av gener uttryckta under utvecklings-, fysiologiska eller patologiska tillstånd (11, 18). Här användes SAGE för att erhålla en framtidsöversikt över cellulära processer som snabbt moduleras i lungan genom pulmonal intraluminal stretchökning till följd av TO.

Andelen taggar som matchar med sekvenser i GenBank- och UniGene-databaserna som rapporteras här överensstämmer med andra SAGE-studier (11, 19, 20). Dessutom har reproducerbarheten av SAGE-metodik fastställts tidigare av oss (21) och av andra (22). Dessutom bekräftar konsekvensen av den differentiellt uttryckta etikettidentifieringen i de fyra oberoende biblioteken giltigheten och reproducerbarheten av SAGE-resultat. Slutligen visar histo- och immunokemi att förändringar som observerats i lipid- och a-SMA-innehållande celler överensstämmer med SAGE-resultat.

Våra resultat visar att transkriptionellt svar på TO utlöses inom 1 timme och upprätthålls till en jämförbar intensitet under minst 3 timmar. Detta överensstämmer med in vitro- studier som visar snabb genreglering och proteinaktivering efter stretch av fetala lungceller i kultur (23). Antalet identifierade transkript modulerade som svar på TO understryker ett snabbt och viktigt transkriptionssvar i lungceller till intraluminal stretchökning. Klassificering av dessa TO-modulerade taggar enligt deras specifika motsvarande generfunktion antyder huvudsakligen att TO inducerar 1) en modifiering av cytoskeletten med en anmärkningsvärd ökning i cellnivåer av snabba muskelisoformer och 2) en metabolisk övergång från cellulär lipidsyntes och ackumulering till glykolys.

Taggar som motsvarar cellstruktur och motilitetsgener representerar en viktig del av alla taggar uppreglerade av TO. Detta antyder att omorganisation av cytoskelett och / eller cellrörlighet sker som svar på mekanotransduktion i lungan. Vid båda undersökta tidspunkterna matchar en väsentlig del av differentiellt uttryckta uppreglerade taggar cytoskeletala transkript. Nästan uteslutande är dessa taggar associerade med kontraktila apparater och motsvarar till stor del aktin -, myosin - och troponinassocierade gener. Således verkar det som mekanotransduktion inducerad av TO stödjer uppreglering av muskelfenotyp.

Undersökning av TO-reglerade taggar som motsvarar metabolismrelaterade transkript antyder att ett snabbt metaboliskt svar inträffar på grund av TO-inducerad mekanotransduktion. Specifikt svarar de sex taggarna som motsvarar transkript relaterade till glykolys, som är uppreglerade med 1 timme TO ( aldolas 1 , enolas 3 , glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas , fosfofruktokinas , fosfoglyceratmutas 2 och pyruvatkinas ) för sex av de 10 enzymerna som är viktiga för metabolism av glukos till pyruvat (tabell 2). Detta antyder att TO stimulerar den glykolytiska vägen i lungceller. Detta förstärks av TO-ökningen i överflöd av snabba isoformer av muskelrelaterade proteiner, som är karakteristiska för glykolytisk vävnad (24). TO-down-reglerade transkript relaterade till lipidmetabolism motsvarar enzymer eller proteiner involverade i syntes, lagring och handel med lipider. Detta antyder att TO är associerat med en nedreglering av både lipidsyntes och lagring i lungceller såväl som med lipidhandelsmodulering. Dessa data föreslår att TO inducerar en metabolisk övergång från cellulär lipidsyntes och ackumulering till glykolys i lungan. Detta stöds av minskningen av lipidinnehållande celler och ökningen i α-SMA-innehållande celler observerade genom immun- och histokemi.

Full storlek bord

Eftersom glykolys är en anaerob jäsningsprocess och energiproduktion genom lipidmetabolism är en oxidativ process, kan den metaboliska omkopplaren som vi rapporterar vara resultatet av TO-inducerad vävnadshypoxi. Det har faktiskt rapporterats att vätskeutvidgning av fosterlungen resulterar i ökad vaskulär resistens och därmed minskat lungblodflödet (25). Det är emellertid osannolikt att ökningen i den lilla luminala rymdfraktionen som observerats efter 1 timme av TO (4, 0 ± 0, 4 mot 2, 7 ± 0, 3 för sham-TO-gruppen; p <0, 01) orsakar signifikant komprimering av blodkärlet (9). Dessutom visar lungor som utsätts för kortvarig TO (fig. 2 och 3) eller för längre sikt TO (24 och 36 timmar) (8) inte någon morfologisk skadlig effekt jämfört med skam-TO-lungor. Dessutom var hypoxi-inducerbara faktorer ( t.ex. HIF-1a, HIF-1p, HIF-2α, HIF-3α) varken upp- eller nedreglerade av TO i vår studie. Sammantaget argumenterar dessa observationer mot en hypoxisk effekt av kortvarig TO i fostrets lunga.

Uttryck av taggar relaterade till olika andra processer moduleras av TO. Dessa taggar rör cellsignalering och cellkommunikation, cellcykel, RNA- och proteinsyntes, och cell- och organismförsvar. Detta bekräftar att ett snabbt, komplext och viktigt lungrespons inträffar efter mekanotransduktion under sen lungutveckling. Transkript som kodar för proteiner relaterade till cell- och organismförsvar står för den viktigaste delen av dessa andra processer modulerade av TO. Det är svårt att hävda om cellförsvarsrelaterade proteins roll i utvecklingslungeprocessen. Intressant nog visade dessa taggar en lägre expressionsnivå i skam-TO-lungor vid 3 timmar än i skam-TO-lungor vid 1 timme. Denna observation ger två möjligheter: 1) TILL påskyndar minskningen av uttrycket av försvarsrelaterade proteiner som normalt sker under lungutveckling och 2) TILL förvärrar minskningen i uttrycket av försvarsrelaterade proteiner till följd av själva operationen. Det är också anmärkningsvärt att betona att bland de 10 olika taggar som motsvarar gener i denna klass är sju relaterade till homeostas, medan endast tre är associerade med immunsvar. Homeostas är en normal process i celler, särskilt de som utsätts för större stimulans, liksom fallet med lungutvidgning till följd av TO. Detta resultat antyder således inte nödvändigtvis en vävnadsskada. Dessutom har det visats att vissa cellförsvarsrelaterade proteiner har, förutom deras skyddande roll, att interagera med andra signalnätverk och påverka resultatet av komplexa utvecklingsprogram, såsom lem (26) och organregenerering (27) ).

Under lungmognad differentierar interstitiella fibroblaster i stor utsträckning antingen en adipogen (lipofibroblasts) eller en myogen (myofibroblasts) fenotypisk väg (28). Myogena och lipogena fenotyper avser celler som uppvisar muskelspecifika respektive fettspecifika gen- och metabolismegenskaper. Det har föreslagits att balans mellan olika fibroblastiska subpopulationer är centralt viktiga för signalering av kommunikation mellan mesenkym och epitel. Denna signalering är känd för att vara en avgörande faktor för lungmognad (10). I livmodern dominerar lipofibroblaster inom den perinatala lungan där de deltar i syntes av extracellulära matrisstrukturer och är tillbehörsceller av typ II pneumocyter i syntes av ytaktiva ämnen (10). Efter födseln minskar dock andelen lipofibroblaster snabbt (10). Dessutom har det föreslagits att alveolär överdistention orsakar en minskning av lipofibroblastantalet (29). Således kan den metaboliska övergången från lipidproduktion och ackumulering till glykolys som observerats här återspegla en ökning av förhållandet myofibroblast / lipofibroblast. Våra histokemiska data antyder att 1 och 3 timmar av TO inte har någon mätbar effekt på lipidinnehållet i mesenkymceller. Dock reducerar 24 timmar TO mängden lipidfenotyp jämfört med kontroller. Denna försening mellan transkriptionell nedreglering och minskning av lipidfenotyp representerar sannolikt tiden för integrationen av den nya naturliga omsättningen av proteiner och dess konsekvens på faktiska närvaro av lipider. Dessutom har TO-fall vid både 1- och 3-timmars tidpunkter betydligt mer mesenkymala a-SMA-innehållande celler än motsvarande tidsstyrda kontrollfall. SAGE-data avslöjar dessutom en uttalad uppreglering av TO av myogena transkript antagligen förknippade med myofibroblaster ( t.ex. a-SMA, myosin lätt kedja, myosin tung polypeptid 4, troponiner C, I och T3 och andra) (tabell 2). Emellertid måste den TO-driven ökningen av myofibroblastisk fenotyp, tillsammans med en relativ minskning av lipofibroblastisk fenotyp i lungmesenkym, bekräftas genom mer direkta funktionella studier.

Denna studie ger en ny omfattande översikt över cellulära processer som snabbt moduleras av pulmonal intraluminal sträckning ökar till följd av TO. Som beskrivs i figur 4 identifierade vi cellulära processer som moduleras av TO före den tidigare rapporterade ökningen i lungstorlek och strukturell mognad som är observerbar 24 timmar efter operationen (8). Sammantaget avgränsade våra data cellulära processer snabbt av TO på en transkriptionell nivå och avslöjade också en ökning av α-SMA-innehållande celler vid 1 och 3 timmar samt en relativ minskning av triglyceridinnehållande celler vid 24 timmar. Denna studie tyder på att kontinuerlig sträckning i en utvecklande lunga leder direkt till snabba och mycket specifika fenotypiska modifieringar i en betydande andel lungceller. Baserat på våra data drar vi slutsatsen att den intraluminala ökningen under det prealveolära stadiet av lungutveckling inducerar en kritisk övergång av lungcellfenotyp där det finns en ökning av α-SMA-innehållande celler tillsammans med en relativ minskning av lipidinnehållande celler . Denna undersökning erbjuder en omfattande översikt över cellulära processer som snabbt moduleras av pulmonal intraluminal stretchökning, vilket ger en grund för ytterligare mekanistisk analys av TO-svar och potentiella nya vägar för att förstå fysiopatologin hos onormal lungutveckling förknippad med medfödd membranbråck, kronisk förlust av fostervatten vätska, eller, oftare, extrem prematuritet.

Sammanfattning och kontextualisering av cellulära processer som moduleras snabbt av TO. TO utfördes i möss vid 16, 5d graviditet, när fosterlungen uppvisar en begränsad storlek och omogen morfologi kännetecknad av ett dåligt ytutbytesområde. SAGE-data ( vit ruta ) avgränsade snabb transkriptionell modulering av gener motsvarande olika cellulära processer som inträffar 1 och 3 timmar efter TO. Dessutom avslöjar immuno- och histokemiska data ( grå rutor ) en ökning av α-SMA-innehållande celler vid 1 och 3 timmar samt en relativ minskning av triglyceridinnehållande celler som svar på 24 timmar TILL, tillsammans med en observerad ökning i lungstorlek och strukturell mognad (8).

Bild i full storlek

Ordlista

a-SMA

a-glatt muskelaktin

BADDA

3, 3 1- diaminobensidin

ORO

oljeröd O

SALVIA

serieanalys av genuttryck

TILL

luftrörelse