Hypotalamiska crh-neuroner orkestrerar komplexa beteenden efter stress | naturkommunikation

Hypotalamiska crh-neuroner orkestrerar komplexa beteenden efter stress | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Neuronal fysiologi
  • Socialt beteende
  • Stress och motståndskraft

Abstrakt

Alla organismer har medfödda beteende- och fysiologiska program som säkerställer överlevnad. För att få maximal adaptiv nytta måste dessa program vara tillräckligt flexibla för att redovisa miljöförändringar. Här visar vi att hypotalamiska CRH-nervceller orkestrerar en miljömässig flexibel repertoar av beteenden som uppstår efter akut stress hos möss. Optisk tystnad av CRH-neuroner stör organisationen av individuella beteenden efter akut stress. Dessa beteendemönster förändras i enlighet med miljön efter stress, men denna miljökänslighet är avstängd av aktivering av PVN CRH-neuroner. Dessa fynd ger bevis på att PVN CRH-celler är en del av en tidigare outforskad krets som matchar exakta beteendemönster till miljösammanhang efter stress. Överaktivitet i detta nätverk i frånvaro av stress kan bidra till miljömässig ambivalens, vilket kan leda till kontext-olämpliga beteendestrategier.

Introduktion

I alla organismer utlöser ett uppfattat hot specifika beteendeförändringar och medföljande fysiologiska svar för att säkerställa överlevnad 1, 2 . De underliggande kretsarna som ansvarar för dessa snabba defensiva beteenden vid början av stress har studerats omfattande 3, 4 . Mindre är känt om beteenden som följer omedelbart efter en stressande händelse. Nuvarande beskrivningar av dessa beteenden indikerar att de är komplexa och olika. de inkluderar beteenden i samband med miljöbedömning, vaksamhet och riskundvikande (det vill säga rörelse, utforskning, neofobi) 5 men också beteenden som är självstyrda och till synes ambivalenta till externa ledtrådar (det vill säga självskötsel) 6, 7, 8 9 Med tanke på de beteendemässiga patologierna som kan utvecklas efter exponering för stressiga situationer 10, kommer en tydligare förståelse för de underliggande neuralkretsarna som kontrollerar beteenden efter en akut stress att ge en ny ram för att studera spiring av stressrelaterade störningar.

Här använde vi en akut, experimentell stress (fotsko) för att starta stressresponsen och studerade sedan hela beteendepertoaren i olika miljösammanhang efter avslutandet av stressen. Vi ansåg att individuella beteenden efter stress är en del av ett bredare beteendemönster som består av flera beteenden 11 som gör att djur kan återvända till spontana beteenden. Vi fokuserade specifikt på kortikotropinfrisättande hormonceller (CRH) i den paraventrikulära kärnan (PVN) i hypotalamus. Dessa celler är ansvariga för att starta den endokrina komponenten i däggdjurets stressrespons 12, men det finns indikationer på att de också kan reglera komplexa beteenden efter stress. Denna idé stöds av rapporter om att elektrisk aktivering av PVN och omgivande regioner initierar självskötsel 7, 8, ett beteende som observerats efter stress hos många arter i både experimentella och naturliga förhållanden 8, 9, 13 . Den kanoniska uppfattningen av PVN CRH-neuroner som endokrina celler som initierar en hormonell kaskad som kan kräva tiotals minuter för att påverka hjärnkretsar 14 är i strid med en roll för dessa celler för att driva snabba beteenden efter stress. Ett mer troligt scenario är att förutom att skicka terminala axoner till blodkärlen i medianeminensen, skickar PVN CRH-neuroner också säkerhetsprojektioner till närliggande hypotalamiska regioner 15 . Dessa rapporter ger ett troligt alternativ genom vilket PVN CRH-neuroner kan kontrollera snabba beteenden efter stress 16 .

Här använde vi cellspecifika verktyg för att direkt rikta in sig på PVN CRH-neuroner 17 och testa hypotesen att dessa neuroner spelar en nyckelroll i att orkestrera komplexa beteenden efter stress. Våra resultat indikerar att: (i) beteenden uppvisar en organiserad struktur efter stress; (ii) denna organisation har distinkta men flexibla temporära funktioner som är känsliga för PVN CRH neuronaktivitet och miljö; (iii) Det finns ett ömsesidigt samband mellan miljökoder och PVN CRH-nervaktivitet vid kontroll av specifikt beteende. Att förstå de specifika noderna som styr beteendesekvensen efter stress kan ge unika insikter som underlättar vår förståelse för hur hjärnan hjälper till att återställa efter stress.

Resultat

Kvantifiera flera beteenden efter stress

För att undersöka effekterna av ett enda avsnitt av stress (fotskock) på musbeteende, kvantifierade vi först alla beteenden under en 15-minuters observationsperiod i hemsidan (HC). Vi kunde urskilja åtta distinkta beteenden: kartläggning, skötsel, grävning, promenader, tugga, uppfödning, frysning och sömn (Fig. 1a). Dessa beteenden verkade slumpmässiga utan tydligt mönster eller förspänning tydligt under observationsperioden (Fig. 1a – g). En annan grupp av möss överfördes till en fotskockkammare, utsattes för en serie fotskockar och återfördes sedan till HC för observation. Även om samma åtta beteenden observerades fanns det ett antal skillnader: Specifikt var det en betydande ökning av grooming (fig. 1b – d, kompletterande fig. 1a, b och kompletterande film 1), uppfödning (fig. 1b, e, f) och promenader (fig. Ib, g, h). Det var en signifikant minskning av grävning och tugga. Kartläggning, sömn och frysning påverkades inte. Nästa gång fokuserade vi på den temporära organisationen av beteenden som ökades efter stress. Före stress uppvisade dessa beteenden ingen tydlig temporär förspänning eller organisation (Fig. 1c – h); mediantiden för ett visst beteende skilde sig inte signifikant från halveringstiden (HT) i observationsperioden (HT = 450 s; Kompletterande Fig. 1c – e). Dessutom visade vård, uppfödning och promenader alla en linjär kumulativ ökning under observationsperioden. Efter stress förändrades inte mediantiden för grooming från HT (Kompletterande Fig. 1c). Det var emellertid en betydande förskjutning i mediatiden för uppfödning (kompletterande fig. 1d) och promenader (kompletterande fig. 1e) mot början av observationsperioden. Dessa observationer indikerar att möss använder samma beteendepalett för individuella beteenden före och efter stress, men organisationen av dessa beteenden och den tid som tilldelas varje beteende är olika. Närmare bestämt, strax efter stress, finns det en förspänning mot utforskande beteenden som avtar under observationsperioden och en pålitlig ökning av grooming beteende. Denna analys ger en mall för ett beteendemönster direkt efter en akut stress, som nu kan användas för att utforska neuralkretsar.

( a ) Kvantifiering av beteendeaktivitet i 15-minuters epokar i hemvård (HC) av naiva möss och möss omedelbart efter fotskocken. Åtta distinkta beteenden är tydliga i naiva (N, vänster) och stressade (S, höger) möss. Varje rad representerar en mus. ( b ) Grooming (naiv: 124, 8 ± 33, 2 s, n = 9 kontra stressad: 294, 0 ± 33, 4 s, n = 9; P = 0, 0024; t- test), uppfödning (naiv: 19, 7 ± 4, 8 s, n = 9 kontra stressad : 64, 7 ± 10, 0 s, n = 9; P = 0, 0012; t- test) och promenader (naivt: 76, 4 ± 14, 2 s, n = 9 kontra stressat: 171, 4 ± 27, 0 s, n = 9; P = 0, 0067; t- test ) ökas efter stress. Grävningstid (naiv: 122, 5 ± 28, 9 s, n = 9 kontra stressad: 7, 5 ± 5, 0 s, n = 9; P = 0, 0012; t- test) och tugga (naiv: 61, 5 ± 21, 1 s, n = 9 kontra stressad: 14, 0 ± 7, 4 s, n = 9; P = 0, 0492; t- test) minskas. Undersökning (naiv: 369, 9 ± 65, 1 s, n = 9 kontra stressad: 282, 8 ± 31, 6 s, n = 9; P = 0, 2463; t- test), sova (naiv: 124, 3 ± 85, 3 s, n = 9 kontra stressad: 59, 5 ± 44, 4 s, n = 9; P = 0, 5096; t- test) och frysning (naiv: 0, 6 ± 0, 6 s, n = 9 kontra stressad: 2, 6 ± 1, 6 s, n = 9; P = 0, 2541; t- test) påverkas inte . ( c - h ) Procentandel av djur som uppvisar angivet beteende vid varje tidpunkt och kumulativa diagram som illustrerar den relativa omfattningen av grooming ( c, d ), uppfödning ( e, f ) och promenader ( g, h ). Skalstänger: c - h, 20%; NS, inte signifikant; * P <0, 05; ** P <0, 01; Felfält ± sem

Bild i full storlek

Fotoinhibition av PVN CRH-neuroner efter stress

Den kraftiga ökningen av grooming efter stress har rapporterats tidigare 7, 18 och det har föreslagits att PVN-neuroner kan kontrollera den exakta tidpunkten för grooming med avseende på andra beteenden 19 . Andra studier rapporterar emellertid att PVN-lesioner inte påverkar grooming efter stress 20 . För att direkt utvärdera bidraget från PVN CRH-nervceller i grooming och besläktade beteenden efter stress, använde vi möss som uttrycker Archaerhodopsin 3.0 i CRH-neuroner (CRH Arch3.0 ) 21 för att dämpa skottning specifikt i PVN CRH-neuroner (fig. 2a – d). Effekterna av ljus på beteende jämfördes alltid med kontroll CRH eYFP- möss 22, 23 (kompletterande film 1). Först, med hjälp av hjärnskivor, bekräftade vi att leverans av gult ljus pålitligt hämmade avfyrning i CRH-neuroner från CRH Arch3.0- möss (frekvens av handlingspotentialer: 7, 7 ± 6, 7% av baslinjen P = 0, 0168, n = 5, upprepade åtgärder envägs variansanalys (ANOVA)). Dessutom observerade vi inga reboundökningar i aktivitet av CRH-neuroner efter avslutad optisk hämning (frekvens av handlingspotentialer: 62, 5 ± 51, 0% av baslinjen, P > 0, 9999, n = 5, upprepade mätningar envägs ANOVA). Därefter exponerades möss för fothock, och kontinuerligt gult ljus levererades in i PVN under HC-observation under 15 minuter (fig. 2e, kompletterande fig. 2a, b och kompletterande film 2). Detta minskade tidskötseln (Fig. 2f – h och tilläggsfiguren. 2c, d), ökad tid på uppfödningen (Fig. 2i – k och Kompletterande Fig. 2e) och promenader (Fig. 2l – n och Kompletterande Fig. 2f) ). Den temporära organisationen av dessa beteenden var emellertid oförändrad (kompletterande bild 3l – n). Andra beteenden påverkades inte av fotoinhibition av CRH-neuroner (kompletterande fig. 2g – k). För att bestämma om de relativa förändringarna i den totala tiden som spenderades på ett visst beteende återspeglade en enkel omfördelning av tid eller om specifika beteenden gynnades efter tystnad av CRH-neuroner undersökte vi den relativa tiden som uppföddes eller gick efter att ha tagit bort den tid som tilldelades grooming. Det fanns en signifikant ökning av fraktionerad tidsuppfödning (Fig. 2k) och promenader (Fig. 2n), vilket indikerade att dessa beteenden företrädesvis ökas efter tystnad av PVN CRH-neuroner. Eftersom stress ökar cirkulerande glukokortikoider (CORT) 12, undersökte vi den potentiella kopplingen mellan CORT och grooming. Blockering av CORT-syntes 1 timme innan fotskocken avstängdes CORT ökar som svar på fotskocken (kompletterande fig. 3a, b), men hade ingen effekt på grooming (kompletterande fig. 3c) eller uppfödning (kompletterande fig. 3d). För att bedöma PVN CRH-neurons roll i regleringen av beteende i frånvaro av stress tystade vi CRH-neuronerna från naiva möss. Vi observerade ingen skillnad i beteendemönstret för möss som svar på optisk hämning i naivt tillstånd (Kompletterande Fig. 4a – d). Sammantaget indikerar dessa observationer att ihållande aktivitet av PVN CRH-neuroner efter fothock är nödvändig för att reglera specifikt beteende, men detta sker oberoende av CORT.

( a ) Cre-beroende AAV-DIO-Arch3.0-eYFP-virus injicerat i PVN. ( b ) Schematiska kartor visar injektionsstället (vänster) och implantationsstället för den lilla hylsan (höger). ( c ) Konfokal bild visar uttryck av Arch3.0-eYFP (grön) och tdTomato (röd) i PVN. ( d ) Leverans av gult ljus till skivan (betecknad med gul ruta) minskar avfyrningen i PVN CRH-nervceller i strömklämman. Nedre, sammanfattande histogram nedan för handlingspotentialer bildar upprepade studier. ( e ) Detaljerad analys visar alla åtta beteenden i CRH eYFP (vänster) och CRH Arch3.0 (höger) djur i en 15-minuters epok direkt efter fotskocken. Varje rad representerar ett djur. ( f ) Histogram visar procent av djur som sköter i varje grupp under observationsperioden på 15 minuter. ( g ) Kumulativ graf illustrerar den relativa skötseln i varje tillstånd. ( h ) Sammanfattningsgrafer visar att grooming hämmas under optisk hämning av PVN CRH-neuroner (CRH eYFP : 181, 4 ± 28, 7, n = 10 mot CRH Arch3.0 : 79.0 ± 11.2, n = 8; P = 0.0080; t- test). ( i ) Histogram visar procent av djur som föddes upp i varje grupp under observationsperioden på 15 minuter. ( j ) Kumulativ graf illustrerar den relativa uppfödningen. ( k ) Uppfödningstiden, som en bråkdel av alla icke-grooming beteenden, ökas under fotohämning (CRH eYFP : 4, 5 ± 0, 8%, n = 10 mot CRH Arch3, 0 : 8, 6 ± 1, 5%, n = 8; P = 0, 0229 ; t- test). ( l ) Histogram visar procentvis promenad i varje grupp under 15-minuters observationsperioden. ( m ) Kumulativ graf illustrerar den relativa promenaden. ( n ) Fraktionerad gångtid ökas också under fotohämning av PVN CRH-neuroner (CRH eYFP : 12, 2 ± 2, 0%, n = 10 mot CRH Arch3, 0 : 22, 0 ± 2, 7%, n = 8; P = 0, 0084; t- test) . Skalstänger: ( c ), 50 μm; ( d ), 2 Hz och 1 s; ( f, g, i, j, l, m ), 20%; NS, inte signifikant, * P <0, 05; ** P <0, 01; Felfält ± sem

Bild i full storlek

Fotoaktivering av PVN CRH-nervceller

För att undersöka effekterna av CRH-neuronaktivering uttryckte vi, i frånvaro av en extern stress, Channelrhodopsin 2 (ChR2) ensidigt i CRH-neuroner (CRH ChR2 ) 21 (fig. 3a-c). I hjärnskivor bekräftade vi att blått ljus inducerar inåtströmmar och spikar i CRH ChR2- nervceller pålitligt vid frekvenser upp till 20 Hz (fig. 3d). För att kontrollera CRH-aktivitet in vivo, implanterade vi en fiberoptisk sond ipsilateral till injektionsstället (kompletterande fig. 5a, b). Som förväntat ökade fotostimulering av PVN i CRH ChR2- möss cirkulerande CORT (fig. 3e) och ökade antalet c-Fos-positiva celler i PVN (kompletterande fig. 5c – e). Därefter fotostimulerade vi naiva (ostressade) CRH ChR2- möss i en observationskammare till vilken möss hade varit vana (HAB). Denna framkallade robusta skötsel (kompletterande figur 6a och kompletterande film 3), med en snabb början. Beteendet upphörde omedelbart när fotostimulering avslutades (kompletterande fig. 6a). För att undersöka effekterna av PVN CRH-aktivering i HAB-miljön och för att bedöma olika beteenden genomförde vi ytterligare experiment under vilka blått ljus levererades under 5 minuter (Fig. 3f). Fotostimulering ökade grooming (Fig. 3g – i) under observationsperioden på 5 minuter. Den minskade också konsekvent både absolut uppfödning (fig. 3j – l och kompletterande fig. 6b) och delvis uppfödning (fig. 3l). Det fanns ingen effekt av fotostimulering på promenader (fig. 3 m – o och kompletterande fig. 6c) eller kartläggning (kompletterande fig. 6d, e). Nästa frågade vi om dessa förändringar i beteende var känsliga för att ändra frekvensen av fotostimulering. Vi observerade en linjär ökning av grooming med ökande frekvenser från 1 till 20 Hz. Detta åtföljdes av en progressiv, frekvensberoende minskning av uppfödningen (kompletterande figur 6f). Optisk stimulering av PVN CRH-neuroner påverkade inte den temporära organisationen av varken skötsel, uppfödning eller promenader (kompletterande fig. 6g-i). Dessa observationer visar att specifik aktivering av PVN CRH är tillräcklig för att öka grooming och minska uppfödningen.

( a ) Konstruktion av Cre-beroende AAV-DIO-ChR2-eYFP-virus. ( b ) Schematiska kartor visar injektion av virus i PVN hos CRH-Cre / tdTomato-möss (vänster) och implantationsstället för den lilla hylsan (höger). ( c ) Konfokal bild visar uttryck för ChR2-eYFP (grön) och tdTomato (röd) i PVN. ( d ) Optisk stimulering i strömklämma (topp) och spänningsklämma (botten) visar leverans av blått ljus pålitligt kontrollerar PVN CRH-nervceller. ( e ) Blodprover som tagits före och 15 minuter efter optisk stimulering börjar öka i CORT-nivåer specifikt i CRH ChR2- möss (CRH eYFP : 0, 528 μg dl −1 ökning, n = 6; mot CRH ChR2 : 5.327 μg dl −1 ökning, n = 5; P = 0, 0316; t- test). ( f ) Detaljerad analys visar mönstret för åtta olika beteenden observerade i CRH eYFP (vänster) och CRH ChR2 (höger) djur under 5 min av optisk stimulering i en observationskammare till vilken möss tidigare var vana vid frånvaro av stress. Varje rad representerar ett djur. ( g ) Histogram visar procent av djur som sköter i varje grupp under optisk stimulering. ( h ) Kumulativ graf illustrerar relativt omfattande grooming. ( i ) Optisk stimulering av PVN CRH-neuroner ökade groomingtiden (CRH eYFP : 6, 8 ± 1, 9 s, n = 12; kontra CRH ChR2 : 112, 6 ± 13, 6 s, n = 11; P <0, 0001; t- test). ( j ) Histogram visar procent av djur som fostrar i varje grupp under optisk stimulering. ( k ) Kumulativ graf illustrerar relativ uppfödning. ( l ) Uppfödningstid som en bråkdel av beteenden som inte är i grooming minskas genom fotostimulering av CRH-neuroner (CRH eYFP : 9, 9 ± 1, 5%, n = 12; mot CRH ChR2 : 5, 4 ± 1, 4%, n = 11; P = 0, 0396; t- test). ( m ) Histogram visar procent av djur som går under den optiska stimuleringen. ( n ) Kumulativ graf illustrerar relativ vandring. ( o ) Fraktionerad gångtid förändras inte genom optisk stimulering (CRH eYFP : 28, 8 ± 3, 4%, n = 12; kontra CRH ChR2 : 28, 7 ± 3, 8%, n = 11; P = 0, 9784; t- test). Skalstänger: c, 50 μm; d, topp: 200 pA och 500 ms, botten: 20 mV och 200 ms; ( g, h, j, k, m, n ), 20%; NS, inte signifikant, * P <0, 05; **** P <0, 0001; Felfält ± sem

Bild i full storlek

PVN CRH-neuroner riktar sig mot en diskret cellpopulation i LH

Axons kollateraler från PVN CRH-neuroner har beskrivits i den laterala hypotalamus (LH) 15 . Dessutom uttrycker PVN CRH-neuroner också mRNA för vesikulär glutamattransporter 2 (VGluT2) 24 vilket ger ett substrat för snabb synaptisk transmission. För att undersöka den förmodade nervkretsen nedströms CRH-nervceller levererade vi blått ljus in vivo under 5 minuter (Fig. 4a) och 2 timmar senare dödade möss och bearbetade hjärnvävnad för c-Fos. Det fanns en ökning av c-Fos-positiva celler i LH (fig. 4b, c). För att direkt testa projektionsbidraget till LH placerades en fiber ensidigt i LH för att stimulera axonterminaler (fig. 4d och kompletterande figur 7a, b). Fotostimulering av fibrerna ökade grooming (Fig. 4d). Ett nätverk av förstärkt gult fluorescerande protein (eYFP) -positiva fibrer med boutonformade strukturer var tydligt i LH (fig. 4e, f och kompletterande figur 8a – c). Det fanns inga eYFP-positiva fibrer i extrahypotalamiska regioner kända för att ta emot input från PVN 25, 26 eller inblandade i grooming beteenden 27 (kompletterande figur 8d – i). För att fråga om PVN CRH-neuroner som projicerar till LH skiljer sig från PVN CRH-neuroner som projicerar till medianeminensen utförde vi ett dubbelt retrograderat spårförsök. Vi injicerade fluorogold i svansvenen (kompletterande fig. 9a) för att märka neuroner med axonutsprång som avslutas utanför blod-hjärnbarriären (endokrin) och injicerade också lysrörspärlor i den periforniska regionen i LH (kompletterande fig. 9b) för att märka cellkroppar som har frisättningsplatser i LH. Fluorogold och retrobeads samlokaliserades i en delmängd av PVN CRH-neuroner i överensstämmelse med hypotesen att enskilda neuroner samtidigt projicerar till medianeminensen och LH (kompletterande fig 9c). För att direkt karakterisera funktionell synaptisk överföring från CRH-axonfibrer till LH-neuroner, erhöll vi in vitro -helcellsinspelningar från LH-neuroner (fig. 4f). Baserat på den snabba latensen, blockad av tetrodotoxin och efterföljande partiell återhämtning i närvaro av 4-aminopyridin 28, drar vi slutsatsen att dessa kopplingar är monosynaptiska. Farmakologiska experiment som visar ett komplett block med AMPA / kainatreceptorantagonisten, 6, 7-dinitroquinoxalin-2, 3-dion (DNQX), indikerar att synapserna är glutamatergiska (fig. 4g-j). Dessutom testade vi effekterna av CRHR1-antagonisten på framkallad överföring och kunde inte se någon effekt på enskilda excitatoriska postsynaptiska strömmar eller tåg av excitatoriska postsynaptiska strömmar (data visas inte). Intressant nog svarade inte alla testade LH-neuroner på fotostimulering. Vi noterade två distinkta undertyper på grundval av elektriska fingeravtryck. Celler med en uttalad fördröjning för att först spika som svar på en depolariserande ströminjektion och ett linjärt ström-spänningsförhållande, svarade inte på optisk stimulering av CRH-fibrer (icke-svarande, fig. 4k). Däremot svarade celler med en högre avfyrningshastighet (fig. 4l) och en framträdande "sag" i membranpotentialen (fig. 4k – n) alltid på fotostimulering (svarare). Dessa observationer visar att PVN CRH-neuroner skickar exciterande, glutamatergiska projektioner till en elektrofysiologiskt distinkt population av neuroner i LH.

( a ) Schematisk för experimentell design. ( b ) c-Fos-positiva celler i LH för CRH eYFP och CRH ChR2 efter fotostimulering i PVN. ( c ) Sammanfattningsdata för c-Fos i LH (CRH eYFP : 100, 5 ± 21, 1, n = 4 mot CRH ChR2 : 318, 8 ± 60, 4, n = 5; P = 0, 0179; t- test). ( d ) In vivo- fotostimulering i LH (20 hz, 5 min) ökar groomingtiden (CRH eYFP : 5, 4 ± 3, 0 s, n = 3; kontra CRH ChR2 : 36, 9 ± 7, 3 s, n = 7; P = 0, 0264; t- test ). ( e ) Schematisk karta och experimentell design av in-vitro helcellinspelningar från LH-neuroner. ( f ) Biocytinfyllda inspelade neuroner i LH (röd) omgiven av ChR2-eYFP-uttrycksfibrer (grön). ( g ) I spänningsklemma (HP = −80 mV) framkallar blått ljus (2–5 ms) snabba inåtströmmar (latens: 4, 7 ± 0, 3 ms) som avskaffas med TTX (baslinje: 103, 1 ± 2, 0 pA kontra TTX: 4, 7) ± 0, 7 pA, n = 8; P <0, 0001; upprepad mätning envägs ANOVA) och delvis återställd genom att öka ljuspulsvaraktigheten (7, 5–10 ms) under applicering av 4-aminopyridin (4-AP) 28, 44 ( 40, 1 ± 9, 0 pA; P <0, 0001 jämfört med baslinjen; P = 0, 0222 mot TTX, n = 8; upprepade mått envägs ANOVA). ( h ) Provspår visar effekter av optisk stimulering på LH-neuronbränning. ( i, j ) oPSC: er påverkas inte av picrotoxin men hämmas potentiellt av DNQX (baslinje: 90, 7 ± 12, 6 pA, picro: 115, 1 ± 17, 6 pA, DNQX: 11, 3 ± 3, 5 pA, n = 6; baslinje mot DNQX, P = 0, 0007; upprepade åtgärder envägs ANOVA). ( k ) Aktuella kläminspelningar av LH-neuroner avslöjar två distinkta elektrofysiologiska profiler. Celler avbildade av grå fyrkant visar inga synaptiska svar på blå ljuspulser; blå cirkel indikerar celler med synaptiska svar. ( l ) Åtgärdens potentiella frekvens – nuvarande relation i svarande / icke-svarande celler ( n = 16; P <0, 0001; tvåvägs ANOVA). ( m ) Differentialhyperpolarisationsinducerad "sag" mellan grupper (icke-responder: 0, 017 ± 0, 024, n = 8; responder: 0, 146 ± 0, 022, n = 8; P = 0, 0016; t- test). Beräkning av indexindex: (Vm max — Vm konstant tillstånd) / Vm max, som svar på −80 pA hyperpolariseringssteg). ( n ) Avfyrningsfrekvens (+60 pA-steg) kontra sagindex i svarande och icke-svarande celler. Skalstänger: ( b ) och ( f ), 50 μm; ( g ) och ( i ), 50 pA och 10 ms; ( h ) och ( k ), 50 mV och 50 ms; NS, inte signifikant; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001; Felstänger, ± sem

Bild i full storlek

Beteendeprofiler efter stress är kontextkänsliga

Organisering av beteenden i en organiserad repertoar efter stress föreslår en medföljd medfödd strategi. För att vara optimal ska denna strategi dock vara känslig för förändringar i djurets miljö. För att testa denna idé genomförde vi experiment där möss mottog en fothock och sedan placerades antingen i en ny miljö (roman) eller observerades i fotskockkammaren (fig. 5a). Uppförandedata jämfördes med djuren placerade i deras HC efter fothocken (Fig. 1). Återigen var alla åtta beteenden tydliga i den nya miljön (fig. 5b), men jämfört med HC, minskade grooming (fig. 5c – e, kompletterande fig. 10a, b och kompletterande film 4) och ökar i både uppfödning (fig. 5f – h) och promenader (fig. 5i – k). Därefter bedömde vi de temporära funktionerna i dessa beteenden. Även om det inte fanns någon skillnad i fördelningen av grooming jämfört med HC, (kompletterande fig. 10d) upprätthölls och gick under längre tid (kompletterande fig. 10e, f) under hela observationsperioden. Möss som hölls i fotskottburet (FS) visade robust frysning omedelbart efter fotskocken (Fig. 5l – n, kompletterande fig. 10g och kompletterande film 5). När detta beteende gradvis försvann, var det en ökning av promenader (fig. 5i – k och kompletterande fig. 10f). Det fanns mindre uppfödning (fig. 5f – h) och skötsel (fig. 5c – e) i fotskocken. Dessa observationer visar att miljön har en djup effekt på beteendemönstret efter stress och antyder underliggande skillnader i den strategi som djuret har antagit för att anpassa dess beteendepalett till sammanhanget.

( a ) Schematisk experiment som visar de två olika miljöerna, den nya kontexten (roman) och fotskockkammaren (FS) omedelbart efter fotskocken. ( b ) Detaljerad analys visar mönstret för beteenden som visas av djuren i olika sammanhang. Varje rad representerar ett djur. De olika miljöerna ändrar beteendemönstret uttryckt av djuret. ( c ) Procentandel djur som sköter vid varje tidpunkt. ( d ) Kumulativa grafer illustrerar den relativa skötseln i olika sammanhang inklusive hemsäkerhet (HC) omedelbart efter stress och jämförs med naiva möss (fig. 1). ( e ) Grooming är den dominerande i HC (streckad linje representerar medelväxtid i HC; Roman: 85, 1 ± 8, 0 s; FS: 49, 3 ± 9, 4 s; Roman mot HC P <0, 0001; FS kontra HC P <0, 0001; n = 9 i varje grupp; enkelriktad ANOVA). ( f ) Procentandel av djur som fostrar vid varje tidpunkt. ( g ) Kumulativa diagram illustrerar den relativa mängden uppfödning i olika sammanhang inklusive HC omedelbart efter spänning och de naiva mössen (Fig. 1). ( h ) Möss spenderar mer tid på uppfödning i roman (prickad linje representerar medeluppfödningstid i HC; roman: 120, 4 ± 16, 0 s; FS: 18, 3 ± 8, 5 s; roman mot HC P = 0, 0097; roman mot FS P <0, 0001; n = 9 i varje grupp; enkelriktad ANOVA). ( i ) Procentandel djur som går vid varje tidpunkt. ( j ) Kumulativa diagram illustrerar den relativa gångtiden i olika sammanhang inklusive HC omedelbart efter stress och i naiva möss (Fig. 1). ( k ) Möss ägnar samma tid på att gå i roman och FS (prickad linje representerar medelvärdetid i HC; roman: 436, 7 ± 25, 2 s; FS: 405, 6 ± 41, 7 s; Roman mot HC P <0, 0001; FS kontra HC P <0, 0001; n = 9 i varje grupp; enkelriktad ANOVA). ( l ) Procentandel djur som fryser vid varje tidpunkt. ( m ) Kumulativa diagram illustrerar den relativa frysningen i olika sammanhang inklusive HC omedelbart efter spänning och de naiva mössen (Fig. 1). ( n ) Frysbeteende var endast signifikant i FS (streckad linje representerar medelfrysningstid i HC; Roman: 19, 5 ± 3, 0 s; FS: 121, 8 ± 32, 0 s; Roman mot FS P = 0, 0021; FS kontra HC P = 0, 0004; n = 9 i varje grupp; enkelriktad ANOVA). Skala staplar: ( c, d, f, g, i, j, l, m ), 20%; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001; Felfält ± sem

Bild i full storlek

Kontext påverkar beteenden som drivs av PVN CRH-fotoaktivering

Därefter bedömde vi miljöns påverkan på beteenden som observerades efter fotoaktivering av PVN CRH-neuroner. Vi fotostimulerade PVN CRH-nervceller i en ny miljö (roman) och fotskockkammare (efter fotskaft) i CRH eYFP och CRH ChR2- möss. Fotostimulering ökade grooming i den nya miljön (Fig. 6a – c) och i fotskockkammaren (Fig. 6d – f). Därefter testade vi om beteendepertoaren som svar på optisk stimulering moduleras av miljöbekännelse genom att jämföra beteende hos möss i nya burar och burar som de hade varit vana vid. Optiskt framkallad groomingtid dämpades gradvis när den presumtiva hotnivån för sammanhanget ökade (Fig. 6g, h), men fördelningen av groomingtiden var oförändrad (Kompletterande Fig. 11a). Den pålitliga minskningen i groomingbeteende från HC till roman till fotskockkammare tyder på att större förtroende för miljön troligen är en positiv signal för groomingbeteende. För att testa denna idé genomförde vi experiment i två grupper av möss. I den första gruppen vanades möss genom att exponera dem för testkammaren på var och en av fem på varandra följande dagar. I den andra gruppen exponerades inte möss för kammaren. Båda grupperna infördes sedan i kammaren och grooming kvantifierades som svar på leverans av blått ljus på var och en av fem på varandra följande dagar (fig. 6i). HAB-djuren visade ingen förändring i det totala körda avståndet (fig. 6j och kompletterande fig. 11b) eller i groomingtid (fig. 6k och kompletterande fig. 11c) som svar på fotostimulering. I kontrast till djur som inte hade HAB, fanns det en minskning av det totala körda avståndet (fig. 6j och kompletterande fig. 11b) och en ökning av grooming (fig. 6k och kompletterande fig. 11c) på var och en av de fem på varandra följande dagarna. CRH eYFP- möss uppvisade endast obetydliga nivåer av skötsel i båda tillstånd (kompletterande fig. 11d). Dessa iakttagelser visar att den upplevda förtroendet för miljön positivt påverkar PVN CRH-driven grooming-beteende.

( a - h ) Identiskt ljusleveransprotokoll (10 hz i 5 min) som används i nya miljöer (Novel) och i FS omedelbart efter fotskockspänning. ( a - c ) Fotostimulering av PVN CRH-neuroner i roman. ( a ) Varje rad representerar ett enskilt djur. ( b ) Histogram som visar procentandel av djur som sköter. ( c ) Kvantifiering av grooming i roman (CRH eYFP : 8, 9 ± 1, 2 s, n = 10; kontra CRH ChR2 : 85, 0 ± 10, 9 s, n = 10; P <0, 0001; t- test). ( d - f ) Optisk stimulering av PVN CRH-neuroner i FS. ( d ) Varje rad representerar ett enskilt djur. ( e ) Histogram som visar procentandelen av djur som sköter. ( f ) Kvantifiering av grooming i FS (CRH eYFP : 6, 4 ± 2, 5 s, n = 10; kontra CRH ChR2 : 40, 1 ± 9, 5 s, n = 10; P = 0, 0031; t- test). ( g ) Kumulativa grafer illustrerar den relativa effekten av olika sammanhang på optiskt framkallade grooming inklusive habituated (HAB) -kontext (data visade i fig. 3). ( h ) Optiskt framkallad groomingtid dämpas gradvis när den presumtiva hotnivån för sammanhanget ökar (roman: 74, 7 ± 7, 9% av HAB, P = 0, 0405 mot HAB; FS: 35, 8 ± 8, 3% av HAB, P = 0, 0013 kontra HAB, P = 0, 0006 kontra roman; n = 10; upprepade mått envägs ANOVA). ( i ) Schematiskt av experiment som visar effekter av habituation på ChR2-inducerad grooming. ( j ) Ökad kännedom om paradigmet orsakar en minskning av baslinjens rörelseavstånd i arenan i icke-HAB (dag 5: 45, 79 ± 10, 78% av dag 1, n = 11; P = 0, 0004 kontra dag 1; parat t- test) ), men inte i HAB-djuren (dag 5: 85, 13 ± 10, 62% av dag 1, n = 5; P = 0, 21 mot dag 1, parat t- test; P = 0, 0431 mot icke-HAB, t- test). ( k ) Optiskt framkallad groomingtid är högre den femte dagen hos möss utan HAB (dag 5: 189, 6 ± 27, 8% jämfört med dag 1, n = 11; P = 0, 0016; parat t- test). I motsats härtill uppvisar HAB-djur invariant svar på optisk aktivering (dag 5: 88, 5 ± 7, 7% jämfört med dag 1; n = 5, P = 0, 323 mot dag1, parat t- test; P = 0, 0316 mot icke-HAB, t- test ). Skala staplar: ( b, e, g ), 20%; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001. Felfält ± sem

Bild i full storlek

PVN CRH-fotoaktivering försvårar lämpliga beteenden

Slutligen frågade vi om förhållandet mellan miljön och beteenden som observerats som svar på stimulering av PVN CRH-neuroner modulerades ömsesidigt. Med andra ord, kan direkt aktivering av PVN CRH-neuroner övercirkulera miljöpoäng? Här jämförde vi det dominerande beteendet i roman- och fotmiljömiljöerna i CRH eYFP och CRH ChR2- djur som svar på fotostimulering. Fotostimulering minskade uppfödningen i den nya miljön (fig. 7a – d och kompletterande fig. 12a – d) och frysning i fotskockkammaren (fig. 7e – h och kompletterande fig. 12e – h). Vi frågade sedan om denna miljööverföringsförmåga hos CRH-neuroner var begränsad till beteenden vi har beskrivit, eller om detta antyder en bredare roll som PVN CRH-neuroner. För att testa denna idé bedömde vi effekterna av CRH-fotostimulering i två allmänt använda beteendestest, det öppna fältet och det nya objektigenkänningen. I det öppna fältet tillbringade CRH ChR2- mössen mindre tid i mitten av det öppna fältet under 5-minuters fotostimuleringsperiod (fig. 7i) men rörelse påverkades inte (kompletterande fig. 12i). Därefter frågade vi om aktivering av PVN CRH-nervceller skulle störa nya utforskningsbeteenden (Fig. 7j). Under observationsperioden på 5 minuter eliminerades den naturliga utforskningen av ett nytt objekt praktiskt taget när CRH-neuroner fotostimulerades (Fig. 7k, l). Dessa observationer indikerar att PVN CRH-neuroner minskar mössens känslighet för kontextuella signaler. Under denna tid använder möss självstyrd groomingaktivitet istället för att uppvisa beteendemönster som överensstämmer med deras miljö.

( a - d ) Optisk stimulering av PVN CRH-neuroner dämpar uppfödning i en ny miljö (roman). ( a ) Varje rad representerar ett enskilt djur. ( b ) Histogram som visar procent av djurens uppfödning. ( c ) Kumulativa diagram visar den relativa omfattningen av uppfödningen. ( d ) Uppfödningstid som en bråkdel av alla beteenden efter uteslutning av tidskrävande tid (CRH eYFP : 13, 6 ± 1, 4%, n = 10; kontra CRH ChR2 : 9, 2 ± 0, 9%, n = 10; P = 0, 0165; t- test) ). ( e - h ) Optisk stimulering av PVN CRH-neuroner stör frysningen i FS. ( e ) Varje rad representerar ett enskilt djur. ( f ) Histogram visar procent av djuren som fryser. ( g ) Kumulativa diagram visar den relativa graden av frysning. ( h ) Kvantifiering av fraktionerad frysningstid om tid som bruksfåran utesluts från analysen (CRH eYFP : 32, 5 ± 5, 7%, n = 10; kontra CRH ChR2 : 15, 8 ± 3, 8%, n = 10; P = 0, 0251; t- test) ). ( i ) Bedömning av rörelse i ett öppet fältprov. Representativa lokomotoriska banplaner under optisk stimulering i CRH eYFP (svart) och CRH ChR2 (blå) möss. Medföljande graf visar CRH ChR2- möss spendera betydligt mindre tid tillbringad i centrumzonen under fotostimulering (CRH eYFP : före: 3, 9 ± 0, 5%, under: 6, 1 ± 0, 5%. Efter: 6, 6 ± 0, 9, n = 16; mot CRH ChR2 : innan : 4, 3 ± 1, 0%, under: 3, 3 ± 0, 8%, efter: 5, 3 ± 0, 8%, n = 14; CRH eYFP under CRH ChR2 under, P = 0, 0291; upprepade mätningar tvåvägs ANOVA). ( j ) Representativa lokomotoriska banplaner under optisk stimulering i CRH eYFP (svart) och CRH ChR2 (blå) möss i ett nytt objekt (grön form) -test. Optisk stimulering minskar utforskningen av ett nytt objekt mätt med latensen för beröring ( k, CRH eYFP : 127, 7 ± 36, 4 s, n = 6; kontra CRH ChR2 : 259, 0 ± 35, 2 s, n = 6; P = 0, 0267; t- test ) och tiden tillbringad i närheten ( l, CRH eYFP : 21, 2 ± 7, 6 s, n = 6; mot CRH ChR2 : 3, 0 ± 2, 8 s, n = 6; P = 0, 0494; t- test). Skalstänger: ( b, c, f, g ), 20%; * P <0, 05; Felfält ± sem

Bild i full storlek

Diskussion

En akut stress kräver ett omedelbart beteendemässigt och fysiologiskt svar 1, 2 . Här kombinerade vi cellspecifikt optogenetisk inriktning med bedömningen av flera beteenden för att visa att PVN CRH-neuroner orkestrerar en komplex repertoar av beteenden efter en akut stress. Denna beteendepertoar kräver inte endokrin signalering, utan förlitar sig snarare på en exciterande, glutamatergisk projektion till en delmängd av nervceller i den periforniska regionen i LH. Även om dessa beteenden är utmärkt känsliga för miljösammanhang, kan den selektiva aktiveringen av CRH-nervceller överstiga miljöledningarna, vilket resulterar i beteenden som verkar inte anpassas till sammanhanget. Dessa fynd ger en ny ram för bedömning av beteenden efter stress och antyder att djur avkalderar sitt beteende efter stress i ett specifikt mönster som påverkas av miljön och aktiviteten hos PVN CRH-neuroner.

PVN CRH-neuroner betraktas som de kanoniska endokrina kontrollerna av stresvaret 12, men de kan också reglera komplexa beteenden efter stress 16 . En av de mest väl studerade beteenden efter stress är grooming 7, och i överensstämmelse med tidigare resultat konstaterade vi pålitliga ökningar av grooming efter stress. Grooming var dock ett av åtta distinkta beteenden som vi kvantifierade. Hos naiva djur var dessa beteenden spontana (det vill säga ingen yttre stimulans) med en tydlig förspänning mot undersökning av HC-miljön. Efter stress inträffade en plötslig omorganisation av det existerande beteendet och en betydande omfördelning av den tid som spenderades på specifikt beteende. Förutom ökningen av grooming, var det också ökningar av promenader och uppfödning. Dessa utforskande beteenden var tydliga tidigt i observationsperioden, men avtog inom några minuter, vilket tyder på att de kan spela en roll i hotbedömningen efter en stressande händelse 5 . Även om alla tre beteenden ökades efter stress minskade fotohämning av CRH-neuroner selektivt grooming och ökade uppfödning och promenader. Samtidigt efterliknade inte fotoaktivering av PVN CRH-nervceller i frånvaro av stress de beteenden som observerades efter stress, utan ökade grooming och minskade uppfödning och promenader. Sammantaget tyder dessa observationer på att avfyra av PVN CRH-neuroner, i avsaknad av omedelbar stress, kan minska beteenden som är förknippade med riskbedömning till förmån för beteenden som är självstyrda. I överensstämmelse med denna idé ökade rekryteringen av dessa celler till och med i miljöer som kräver ökad vaksamhet (ny miljö, FS-kammaren), vilket tyder på att PVN CRH-nervceller är viktiga för att anpassa lämpliga beteenden till miljöens sammanhang.

Optisk rekrytering av CRH-neuroner ökade cirkulerande CORT, men ex vivo- inspelningar visar att axonerna för dessa celler frisätter glutamat vid synapser i den periforniska regionen LH. Vår dubbla retrograderade märkning som visar att en subpopulation av celler i PVN-projekt till båda målen överensstämmer med en tidigare rapport om att neuroendokrina CRH-neuroner skickar grenande säkerheter till intilliggande hypotalamiska regioner 15 ; it is unclear whether double-labelling of some, but not all, CRH neurons represents an under-sampling of the population because of technical limitations, or whether this suggests that information from a seemingly homogenous population of neurons can be routed to different targets depending on the information being conveyed 29 . Our findings that PVN CRH neurons control behaviour independent of their ability to release hormone, CRH is consistent with previous work demonstrating that CRF knockout mice have a normal grooming following stress 30 . This adds to the growing body of work demonstrating that putative collaterals from neuroendocrine cell populations in the hypothalamus can modulate behaviour 31, 32, 33 ; importantly, we provide one of the first demonstrations that presumptive neuroendocrine cells not only modify, but also drive behaviour selection. This may be part of a larger theme suggesting that hypothalamic circuits participate in behaviours that extend beyond those that are strictly need based or homeostatic 34 . Indeed, it appears that the hypothalamus exerts a bottom up control of complex behaviours 35, 36, 37 and that the CRH neurons play an essential role in shifting behavioural attention away from the environment and towards behaviours that are more internally focused.

Recent efforts to establish causal links between behaviour and underlying neural substrates have been extremely fruitful; here we further these efforts but with an important distinction. Rather than examining a single behaviour in isolation, we took an approach built on observations made by early behaviouralists who commented on individual behaviours as one component of a more complex pattern or ethogram of behaviours in the animal's natural environment 11 . In some aspects, the behavioural ethogram we describe is a broader representation of microstructure of individual behaviours that has recently been demonstrated 38 . These authors conclude that the individual elements of a given behaviour represent a library of physical motifs that can be re-purposed and re-sequenced to generate distinct behaviours. As we did not observe any 'new' behaviours after stress, we would put forward a similar analogy here suggesting that individual behavioural traits are indeed re-purposed into more complex behavioural programmes. Our observations provide evidence for a distinct ethogram following stress that is controlled by PVN CRH neurons. This ethogram is exquisitely sensitive to environment, but this sensitivity is muted by activation of PVN CRH neurons.

New insights gained from approaches that establish causal links between innate behaviour and neural circuits are an important step in furthering our understanding of how the brain controls complex behaviour in a changing environment. They also set the stage for further explorations that use circuit-based approaches to better understand neurodevelopmental and psychiatric disorders 39 . By pinpointing an essential node in the brain for controlling behaviours immediately after an acute stress, our observations provide a new model that can be exploited to better understand the circuit function/dysfunction underlying stress disorders. For example, increased arousal and hypervigilance that persist after a traumatic event could be a consequence of rapid decreases in PVN CRH activity after stress. By contrast, the ability of PVN CRH neurons to dampen the impact of environmental cues suggests that increased activity in this cell population may contribute to stereotyped behaviours linked to psychiatric and neurodevelopmental disorders in which individuals eschew their environmental context and turn their focus towards self-directed or internally focused behaviours. Specifically, intense inward focus is a core feature in autism spectrum disorder, depression and anxiety. In each of these conditions, patients exhibit internally focused behaviours ranging from stereotypies to ruminations to negative thinking. Strikingly, repetitive stereotyped behaviours, particularly following exposure to stressful situations are a cardinal feature of autism spectrum disorder 10 . Recent animal models have directed attention towards the amygdala as a key structure that controls the balance between social and stereotyped behaviour 40, 41, but our findings would suggest an expanded model that incorporates PVN CRH neurons in regulating these behaviours, specifically after stress, is warranted.

metoder

djur

All experiments were approved by the University of Calgary Animal Care and Use Committee in accordance with Canadian Council on Animal Care guidelines. Crh-IRES-Cre ( B6(Cg)-Crhtm1(cre)Zjh/J ; stock number 012704) and Ai14 ( B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-TdTomato)Hze/J ; stock number 007914) mice, whose generation has been detailed previously 42, 43, were obtained from Jackson laboratories. Colony maintenance and genotyping was carried out as described previously 17 . For experiments, Crh-IRES-Cre +/+ mice and offspring derived from crosses of homozygous Crh-IRES-Cre and Ai14 genotypes were used. Until the first procedure mice were group-housed, then single-housed on a 12:12 h light/dark schedule (lights on at 07:00 hours) with ad libitum access to food and water.

Injection and implantation

In a stereotaxic apparatus under isoflurane anaesthesia, glass capillaries were lowered into the brain of 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice (anteroposterior (AP), −0.7 mm; lateral (L), −0.3 mm from the bregma; dorsoventral (DV), −4.5 mm from the dura). Recombinant adeno-associated virus (AAV) carrying ChR2-eYFP (Addgene plasmid 20298, pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core), eYFP (Addgene plasmid 20296, pAAV-EF1a-double floxed-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core) or Arch3.0-eYFP (rAAV2-EF1a-double floxed-eArch3.0-eYFP; 5 × 10 11 GC per ml; UNC Vector Core) was pressure injected with Nanoject II apparatus (Drummond Scientific Company) in a total volume of 210 nl. Mice were allowed to recover at least 14 days before further experiments. For in vivo optogenetic experiments, mono fiberoptic cannulas (Doric Lenses) were stereotactically implanted under similar conditions (for Arch3.0: AP, −0.7 mm; L, 0.0 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura, for ChR2 AP, −0.7 mm; L, −0.3 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura; for LH stimulation: AP, −1.2 mm L, −1.0 mm from the bregma; DV, −4.2 from the dura). Animals were allowed to recover for a week and handled ca 5 min daily for 4 consecutive days before all behavioural testing.

For neural tracing experiments, 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice were pressure injected with green retrobeads (Lumafluor) as described above (AP, −1.2 mm; L, −1.0 mm from the bregma; DV, −5.2 mm from the dura) in a total volume of 32 nl. One week later, mice received 100 μl ml −1 of fluorogold (4 mg ml -1 ; Fluorochrome) injection iv Mice were killed and processed for immunohistochemistry after one additional week.

Slice preparation and electrophysiology

Three to five weeks post AAV-injection, mice were anaesthetized via isoflurane inhalation and decapitated. Rapidly dissected brains were immersed in slicing solution (0–4 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 25 D -glucose, 1.25 NaH 2 PO 4, 75 sucrose. A vibratome (Leica) was used to prepared coronal hypothalamic slices (250 μm thickness), which were transferred for 1+hours before recording in artificial cerebrospinal fluid (32 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.5 MgCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4, 10 glucose. Recordings were performed in artificial cerebrospinal fluid (1 ml min −1 perfusion) at 30–32 °C. The following drugs were applied via perfusion pump: DNQX (10 μM, Tocris), picrotoxin (100 μM, Sigma), 4-aminopyridine (4-AP, 500 μM, Tocris) and tetrodotoxin (TTX) (1 μM, Tocris). PVN/LH neurons were identified using differential interference contrast and epifluorescence optics (UVICO, Rapp Optoelectronics) and a camera (AxioCam MRm) on an upright microscope (Zeiss). Borosilicate electrodes (3–5 mΩ tip) were backfilled with recording solution composed of (in mM) 108 K-gluconate, 2 MgCl 2, 8 Na-gluconate, 8 KCl, 1 K 2 -EGTA, 4 K 2 -ATP, 0.3 Na 3 -GTP, 10 mM HEPES, 10 mg ml −1 biocytin. Signals were amplified (Multiclamp 700B, Molecular Devices), low-pass filtered (1 kHz), digitized (10 kHz, Digidata 1322) and recorded (pClamp 9.2) for offline analysis. After recordings, slices were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA; 24 h), incubated with streptavidin-A555 (1:500) and cleared in 50:50 glycerol/tris-buffered saline (TBS), before mounting and confocal imaging.

Optogenetics

For in vitro recordings, a micromanipulator-attached fibre optic cable (105 μm core diameter) delivered light from a laser (for ChR2: 473 nm, OptoGeni 473, IkeCool Corporation; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was placed 1–2 mm away from the target area. Light intensity was calibrated by a Photodiode Power Sensor (Thorlabs). Maximally, 2.5 or 15 mW light (for ChR2 or Arch3.0, respectively) was delivered to the tissue.

For in vivo experiments, the light source (for ChR2: 473 nm, LRS-0473-GFM, Laserglow Technologies; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was connected to the implanted ferrule with a fibre optic cable (200 μm core diameter, Doric Lenses). The lasers were controlled with a manually programmable Master 8 unit (AMPI).

Behavioural assessment

Wild-type mice received a series of footshocks (0.5 mA for 2 s, ten times in 5 min; SMSCK, Kinder Scientific) and their activity was video-recorded for 15 min in the footshock chamber, in a novel environment or in the HC immediately after the footshock. For in vivo optogenetics experiments, mice were handled the 4 days preceding behavioural assessment. Blue light was delivered for 5 min (10 Hz, 10 ms pulse width, 15 mW; 473 nm); in LH stimulation experiments, 20 Hz was used. Yellow light (15 mW) was delivered continuously for 15 or 5 min. Behavioural video analysis was conducted by an individual blinded to subject treatment group using a macro in Microsoft Excel. Walking was noted as the animal changed its location or turned as long as the front paws moved. Freezing behaviour was noted if animal showed no movement for at least 3 s, except respiratory movements.

For c-Fos immunolabelling, animals were killed 2 h after light stimulation. For experiments with Arch3.0, after recovery mice were handled for 4 days and HAB to the experimental condition for 3 additional days. After a similar series of footshock, their behaviour was recorded in their HC under continuous yellow light (15 mW) for 15 min. For assessing the involvement of circulating CORT, metyrapone (75 mg per kg, Tocris Bioscience, dissolved in 50 μl polyethylene glycol) was administered ip 60 min before footshock. For circulating CORT level measurements, baseline blood samples were taken from the tail vein at least 2 h before light stimulation. Second sampling was done 15 min after the onset of light stimulation. CORT level was measured using an ELISA kit (Arbor Assays). To investigate social cues bedding was not replaced in the HC of mice for 10 days prior testing. Experiment subjects were at the age of 16 weeks while conspecific males were 7 weeks old.

immunohistokemi

To prepare fixed brain tissue, mice were anaesthetized with sodium pentobarbital (30 mg kg −1 ) and transcardially perfused with phosphate-buffered saline, followed by 4% PFA in phosphate buffer (4 °C). Brains were placed in PFA 24 h followed by 20% sucrose phosphate buffer. 30 μM coronal brain sections were obtained via cryostat in three series. Rinses were performed before/between incubations with TBS containing triton (TBSt; pH 7.4, with 0.1% Triton X-100), blocking solution (5% normal donkey serum in TBSt) was pre-applied for 1 h and used in subsequent antibody incubations. Rabbit anti-c-Fos Ab5 (1:10, 000 dilution; overnight at room temperature; Calbiochem) primary antibody or rabbit anti-fluorogold (1:10, 000, overnight at room temperature; Chemicon) was used. For fluorogold and c-Fos labelling, biotinylated donkey anti-rabbit secondary antibody (1:500; Jackson ImmunoResearch) and DyLight-405-conjugated streptavidin were used (1:500; Jackson ImmunoResearch) in Crh-IRES-Cre;Ai14 animals, whereas in Crh-IRES-Cre animals, Alexa-555-conjugated donkey anti-rabbit (1:500; Molecular Probes) was utilized. Slide-mounted and coverslipped sections were imaged using a confocal microscope (Olympus BX50 Fluoview and Nikon D-Eclipse C1). For c-Fos assessment, we included the entire rostral-caudal extent of one side of the PVN and the region around the fornix. Immunolabelled nuclei were counted using ImageJ.

Analysis and statistics

Where quantification was made, data are represented as mean±standard error of the mean (sem). Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 6 using paired and unpaired Student's t -test to for two group comparisons, whereas repeated measures one-way and two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison post-hoc test for sequential treatment data. P values less than 0.05 were considered significant.

Data tillgänglighet

The data that support the findings of this study are available from the corresponding author upon request.

Ytterligare information

How to cite this article: Füzesi, T. et al. Hypothalamic CRH neurons orchestrate complex behaviours after stress. Nat. Commun. 7:11937 doi: 10.1038/ncomms11937 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-12

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film 1

    Behavior of CRHeYFP control mice after stress

  2. 2.

    Kompletterande film 2

    Photoinhibition of PVN CRH neurons disrupts behavioral repertoire after stress

  3. 3.

    Kompletterande film 3

    Photostimulation of PVN CRH Neurons initiate grooming

  4. 4.

    Kompletterande film 4

    Behavior in novel environment after stress exposure

  5. 5.

    Kompletterande film 5

    Behavior in unsafe environment after stress exposure

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.