Hsf1 och hsp90 orkestrerar temperaturberoende global transkriptionell ombyggnad och kromatinarkitektur i candida albicans | naturkommunikation

Hsf1 och hsp90 orkestrerar temperaturberoende global transkriptionell ombyggnad och kromatinarkitektur i candida albicans | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • kromatin
  • Svampgener
  • Genexpression
  • Transkription

Abstrakt

Feber är ett universellt svar på infektion, och opportunistiska patogener som Candida albicans har utvecklat komplexa kretsar för att känna och svara på värme. Här utnyttjar vi RNA-seq och ChIP-seq för att upptäcka att värmechocktranskriptionsfaktorn, Hsf1, binder distinkta motiv i nukleosomutarmade promotorregioner för att reglera värmechockgener och gener involverade i virulens hos C. albicans . Följaktligen ökar värmechocken C. albicans värdar cellhäftningen, skador och virulens. Hsf1-aktivering beror på den molekylära chaperonen Hsp90 under basala och värmechockförhållanden, men effekterna är motsatta och kontrolleras delvis på nivån av Hsf1-expression och DNA-bindning. Slutligen visar vi att Hsp90 reglerar globala transkriptionsprogram genom att modulera nukleosomnivåer vid promotorer av stresskänsliga gener. Således beskriver vi en mekanism genom vilken C. albicans reagerar på temperaturen via Hsf1 och Hsp90 för att orkestrera genuttryck och kromatinarkitektur, vilket möjliggör termisk anpassning och virulens.

Introduktion

Jämfört med de miljömässiga ytterligheter som saprober stöter på i naturen, ger däggdjursvärdar relativt stabila nischer för kommensala mikroorganismer och patogener. Icke desto mindre utmanas mikroorganismer som koloniserar däggdjur kontinuerligt med ett mylder av miljöförstörningar såsom temperaturfluktuationer, osmotiska obalanser, oxidativa och svaga syrespänningar, samt näringsämne begränsning 1 . Överlevnad, kolonisering och infektion beror på aktivering av miljöresponsvägar som har finjusterats under evolutionär tid för att driva fysiologisk anpassning 2, 3 .

Potentialen för optimering av kretsar som styr avkänning och svara på värdförhållanden är störst för mikrober som är naturliga medlemmar i kommensala mikrobiom. Detta inkluderar de olika bakterierna som främjar värdens immunfunktion och hälsa, liksom svampar som nyligen har uppskattats för att spela viktiga roller i att definiera kommensala samhällen 4 . Kommensala svampar kan bli opportunistiska patogener som kan orsaka livshotande infektioner. En sådan svamp är Candida albicans , som har utvecklats som en relativt ofarlig kommensal av slemhinnor och matsmältningskanaler hos friska individer. När värdens antimikrobiella försvar komprometteras kan denna jäst orsaka ytliga slemhinneanfektioner hos annars friska individer 5 och upp till 400 000 livshotande systemiska infektioner hos immunkomprometterade patienter per år 6 .

Med feber som ett allestädes närvarande värdsvar på infektion följer det att kapaciteten att känna och svara på termiska led är en av de viktigaste och bevarade stressresponserna i naturen. Värmeschockresponsen kännetecknas av global pausning av översättningsförlängning 7 och ombyggnad av genuttrycksprogram som kännetecknas av induktion av värmechockproteiner (HSP: er), såsom chaperoner som hjälper till i proteinvikning 3 . Huvudregulatorn för detta transkriptionella svar är värmechocktranskriptionsfaktorn (HSF), som bevaras från jäst till människor 8, 9 . Hsf1 är avgörande för livskraft i C. albicans och andra jästar, troligtvis på grund av dess funktion i att möjliggöra kärngenuttrycksprogram 10, 11 . HSF binder till huvudspåret av cis- verkande DNA-sekvensmotiv benämnda värmechockelement (HSE), kännetecknat av tandem-inverterade upprepningar av konsensus-sekvensen 5'-nGAAn-3 '(refs 12, 13). I Saccharomyces cerevisiae moduleras transkription av ∼ 10% av generna som svar på värmechock 3, och nästan 3% av generna är direkt bundna av Hsf1 (ref. 14). Initiering av transkription som svar på förhöjd temperatur påverkas också av nukleosompositionering, med värmechock vilket resulterar i ökad nukleosombeläggning vid undertryckta promotorer och minskad beläggning vid aktiva promotorer 15 .

Cellulär anpassning till termisk spänning moduleras av komplexa funktionella förhållanden mellan Hsf1 och den molekylära chaperonen Hsp90, som påverkar signalering och genuttryck. Som med många chaperoner möjliggör Hsf1 basal expression och temperaturberoende aktivering av Hsp90-kodande gener 16 . Hsp90 styr Hsf1-HSE-regulon genom en autoreguleringskrets 17, 18, vars aktivering är väsentlig för virulens hos C. albicans 19 . Bortom Hsf1 stabiliserar Hsp90 olika cellulära regulatorer 20 och utövar ytterligare kontroll på genuttryck. I Drosophila pausade Hsp90-mål RNA-polymeras II (ref. 21) och i S. cerevisiae försenar borttagning av HSC82 (den konstitutivt uttryckta HSP90- isoformen) nukleosomavlägsnande från GAL1- promotorn 22 . Trots den djupgående påverkan av temperaturberoende reglering av Hsf1 och Hsp90 på virulensegenskaper i svamppatogener 23, 24, 25, har mekanismerna genom vilka dessa globala reglerare organiserar temperaturberoende signalering, genuttryck och virulens förblivit svårfångade. Här använder vi genomskala metoder för att utforska hur C. albicans reagerar på termiska förolämpningar, vilket avslöjar att Hsf1 och Hsp90 styr nukleosompositionering, genuttryck och virulensegenskaper.

Resultat

Hsf1 binder gener som krävs för anpassning av stress och virulens

Med hjälp av kromatinimmunutfällning (ChIP) av TAP-märkt Hsf1 (Hsf1-TAP) följt av sekvensering (ChIP-seq), avsåg vi att identifiera genomens breda direkta mål för Hsf1 i frånvaro (30 ° C) eller närvaro av värme chock (30–42 ° C). Distinkta Hsf1-TAP ChIP-seq-signaler identifierades på 49 genomiska platser i frånvaro av värmechock. Vid värmechock identifierades 104 Hsfl-bindande ställen, inklusive alla 49 observerade i frånvaro av värmespänning (fig. 1 och kompletterande data 1). Vi hänvisar nedan till de 49 platserna som konstitutiva mål och de återstående 55 platserna som värmechockberoende mål. Majoriteten av bindande händelser hittades vid promotorregioner nära transkriptionsstartställen (kompletterande fig. La), med transkription av gener som är närmast Hsfl-bindande platser högt uppreglerade vid värmechock (kompletterande fig. Ib). Våra resultat antyder att Hsf1 konstitutivt binder till en uppsättning målpromotorer före värmechock i väntan på aktivering.

( a ) Venn-diagram som visar antalet Hsf1-toppar i frånvaro (ingen värmechock, blå) eller närvaro (värmechock, rosa) för en värmechock 30–42 ° C. ( b ) GO Slim Mapper-analys utfördes på ChIP-seq-datauppsättningen för att identifiera processerna för alla gener bundna av Hsf1 i frånvaro och närvaro av en värmechock 30–42 ° C. Antalet Hsf1-målgener representerade under varje kategori indikeras. Andra kategorier inkluderar, men är inte begränsade till, respons på läkemedel, cellcykel, respons på kemikalier, organell lokalisering, proteinkatabolisk process, translation, ribosombiogenes, signaltransduktion och cellutveckling. ( c ) Cirkosplott som illustrerar toppar av gener bundna av Hsf1 (systematiska namn) i frånvaro och närvaro av en värmechock 30–42 ° C. Varje cirkel från periferin till kärnan representerar följande: kromosomal placering; normaliserat läsdjup av toppar från otaggade prover, värmechockade prover och obehandlade prover; nyckel tillstånd under vilket toppen är närvarande (obehandlad, obehandlad med värmechock och värmechock); och namn på genbunden. Alla rutor representerar ≥1 topp som faller inom ett 100 kb fönster som inte överlappar varandra.

Bild i full storlek

Många Hsf1-målgener som identifierats i vår studie kodar proteiner som är implicerade i stressresponser såsom molekylära chaperoner, oxidativa stressregulatorer, och ubikvitations- och proteolysfaktorer. Oväntat reglerar Hsf1 sitt eget uttryck och också bundet uppströms gener som krävs för vidhäftning, filamentös tillväxt och patogenes (fig. 1b, c och kompletterande data 2). GO-termanalys av Hsf1-bundna gener avslöjade berikning av kategorierna "proteinvikning" (hypergeometrisk fördelning P = 1.87e − 20) "svar på värme" (hypergeometrisk fördelning P = 0.00074) och "inträde i värden" (hypergeometrisk distribution P = 0, 0052) (kompletterande data 3), vilket antyder att Hsf1 inte bara krävs för att reglera HSP: er som svar på värmechock utan också gener involverade i virulens.

Metagenanalys utfördes för att jämföra regleringen av Hsfl-målgener med konstitutiv och värmeinducerad bindning vid deras promotorer som svar på värmechock. Transkription (RNA-polymeras (Pol) II-beläggning uppmätt med Pol II ChIP-sekv) av gener med konstitutiv Hsfl-bindning ökade dramatiskt som svar på värmechock (kompletterande figur 1c). Detta åtföljs av en drastisk ökning av Hsf1-bindningsnivåer (kompletterande figur 1d), vilket antyder att Hsf1 är kritisk för deras uppreglering under termiska förolämpningar. Däremot visar värmeinducerade Hsfl-mål lägre aktivering som svar på värmechock (kompletterande fig. 1c), med konsekvent lägre nivåer av Hsfl-bindning vid dessa promotorer (kompletterande fig. 1d). Sammantaget antyder dessa observationer att storleken på Hsf1-beroende aktivering under värmechock är beroende av dess bindningsnivå före värmechock.

C. albicans Hsf1-målgener kan också regleras av ytterligare transkriptionsfaktorer. Exempelvis är ALS3 samreglerad av Nrg1 och Tup1 (ref. 26), ALS1- promotorn är bunden av Bcr1, Tec1, Efg1, Ndt80 och Brg1, och ROB1- promotorn är bunden av Tec1, Efg1, Ndt80 och Rob1 (ref 27). Därför testade vi om uppreglering av dessa Hsf1-mål som svar på värmechock beror på Hsf1. För att uppnå detta använde vi en tetO-HSF1 / hsf1 in- stam för att tappa HSF1 och övervakade uttrycket av gener som krävs för termisk anpassning ( HSP90 , HSP104 och HSP21 ) 28, vidhäftning och virulens ( ALS1 och ALS3 ) 29, 30 och bildning av biofilm ( ROB1 ) 27 (Kompletterande bild 2). Utarmning av HSF1 upphävde den värmechockberoende uppregleringen av viktiga HSP : er HSP90 , HSP104 och HSP21 . Vidare fann vi att ALS3 , ALS1 och ROB1 uttryck ökade signifikant som svar på värmechock, och att utarmning av HSF1 minskade denna uppreglering (kompletterande figur 2). Således reglerar Hsf1 uttrycket av inte bara värmechockgener utan också viktiga virulensgener som svar på värmechock.

Hsf1 binder kanoniska och icke-kanoniska värmechockelement

Resultaten av att det finns två klasser av Hsf1-bindande mål (konstitutiva och värmeinducerade), och att Hsf1-aktiveringsnivå är korrelerade med dess bindningsmönster fick oss att söka efter anrikade motiv vid promotorerna för Hsf1-mål. Vi började med de novo- motivupptäckt på hela uppsättningen av Hsf1-bindande platser (200 bp som sträcker sig över toppen av 104 Hsf1-TAP ChIP-seq-toppar) och identifierade en mycket betydande konsensussekvens ( E- värde = 1.5e − 164) ( Fig. 2a). Detta motiv, som överensstämmer med ett mönster av tre inverterade nGAAn-upprepningar, liknar både de mänskliga 31 och S. cerevisiae 14 Hsf1-erkännandemotiven, vilket antyder att C. albicans Hsf1 antagligen fungerar som ett trimeriskt komplex som med andra HSF-homologer 8 . Emellertid innehöll endast 29 av de 104 Hsf1 ChIP-seq-topparna konsensussekvensen TTCnnGAAnnTTC (fig. 2b), vilket indikerar att Hsf1 sannolikt känner igen ytterligare motiv i C. albicans .

( a ) De novo- motivanalys med användning av MEME på Hsf1-bindande platser identifierade denna mycket signifikanta sekvens ( E- värde = 1, 5e − 164). ( b ) stapeldiagram som representerar antalet Hsf1-mål som innehåller ett av fyra motiv identifierade med hjälp av de novo- motivupptäckt och manuell inspektion. ( c ) Histogram som illustrerar antalet olika Hsf1-motiv som finns i Hsf1-bundna (blå) kontra icke-Hsf1-bundna promotorer (röd). ( d ) Hsf1-bindningssignal mätt med Hsf1 ChIP-sek vid promotorer innehållande de angivna Hsfl-motiven under obehandlade (blå) och värmechock (röda) förhållanden. ( e ) stapeldiagram som illustrerar antalet Hsf1-bindande händelser med de angivna motiven. Konstitutivt bundna Hsfl-gener representeras i blått, värmeinducerade Hsfl-gener representeras i rött.

Bild i full storlek

Vi utvidgade vår analys för att söka efter ytterligare sekvenselement. Med hjälp av de novo- motivupptäckt och manuell inspektion fann vi att motiven GAAnnTTC och TTCn 7 TTC (25 respektive 55 av 104, respektive) också är berikade bland Hsf1-bundna regioner (fig. 2b). De tre identifierade motiven finns inom 100 bp från mitten av Hsf1-TAP ChIP-seq-toppar med starka ChIP-seq-signaler (kompletterande figur 3a och kompletterande data 4), vilket indikerar att de är troliga Hsf1-bindande element. Det senare motivet är en kortare version av stegtypen icke-kanonisk HSE (nTTCn 7 TTCn 7 TTC) identifierad i S. cerevisiae 32, medan det tidigare motivet inte har rapporterats för Hsf1 i andra organismer. Det är det mest dominerande motivet bland de tre, närvarande med en högre frekvens bland Hsfl-bundna toppar än S. cerevisiae -stegstypens icke-kanoniska motiv (Fig. 2b). Dessa fynd antyder att C. albicans och S. cerevisiae Hsf1 har besläktade men tydliga bindande affiniteter, och att C. albicans Hsf1 kan binda till nGAAn-element arrangerade i minst tre konfigurationer, förmodligen i olika dimera och trimera former.

Ytterligare 4 879 gener med Hsfl-konsensussekvenserna närvarande i deras promotor identifierades, men ingen detekterbar Hsfl-bindning observerades under våra ChIP-seq experimentella förhållanden (fig. 2c och kompletterande data 4). Dessa gener berikades med avseende på funktioner relaterade till transport, stressrespons, filamentös tillväxt, cellcykel, translation och metabolism, och kan vara bundna av Hsf1 som svar på specifika signaler. Vår analys framhöll också att TTCnnGAAnnTTC- och TTCn7TTCn7TTC-motiv är mycket berikade bland Hsf1-bundna promotorer jämfört med promotorer som har Hsf1-motiv utan Hsf1-bindning (kompletterande figur 3b). Dessutom innehåller majoriteten av Hsf1-bundna promotorer åtminstone en typ av Hsf1-motiv (kompletterande figur 3c). Vi upptäckte också att många Hsf1-mål innehåller flera Hsf1-motiv (till exempel GAAnnTTC upprepar 1 kb uppströms om ATG), med två promotorer ( TSA1B och HSP70 ) med så många som nio motiv (kompletterande fig. 3c), vilket tyder på ett starkt urval tryck för Hsf1-reglering av dessa målgener.

Hsf1 binder till de tre identifierade motiven med olika bindande affiniteter. TTCnnGAAnnTTC-elementet är starkt bundet, medan GAAnnTTC och TTCn7TTC har en reducerad men fortfarande signifikant bindningsaffinitet (Fig. 2d). TTCnnGAAnnTTC-elementet anrikades bland promotorer med konstitutiv Hsfl-bindning, medan värmeinducerade Hsfl-bindande händelser associerades med de andra två motiven med svagare Hsfl-bindande affinitet (Fig. 2e). Konsekvent var nivån av Hsfl bunden vid värmeinducerade promotorer lägre än nivån bunden vid konstitutiva promotorer både i frånvaro och närvaro av värmechock (kompletterande figur 1d). Tillsammans antyder våra resultat att den differentiella bindningsaffiniteten för Hsf1 i frånvaro och närvaro av värme är associerad med konfigurationen av nGAAn-element vid målpromotorer.

Nukleosompositionering reglerar Hsf1-bindning till DNA

Nukleosomer har en djup inverkan på tillgängligheten av DNA för transkriptionsfaktorer och på transkriptionstart 15, och därför försökte vi bestämma om nukleosomer påverkar Hsf1-DNA-bindning. Vid genomiska regioner med Hsfl-bindning tömdes nukleosomer (mätt med histon H3 ChIP-sekv) nära Hsfl-motiv (fig. 3a). Som kontroll undersökte vi nukleosomdensitet vid 104 slumpmässiga genomiska regioner och fann att nukleosomutarmning är specifik för Hsf1-bundna regioner (fig. 3b). Vidare analyserade vi genomiska regioner innehållande en Hsf1-konsensussekvens som inte var bundna av Hsf1 under våra experimentella förhållanden och fann att nukleosomdensitet var konsekvent hög över dessa igenkänningsmotiv (fig. 3c). Tillsammans antyder detta att nukleosompositionering vid Hsf1-motiv påverkar Hsf1: s förmåga att känna igen och binda DNA.

( a, b ) Schematiska diagram som illustrerar nukleosomdensitet (skuggat område) och Hsfl-bindning (linjer) vid ( a ) Hsfl-bindningsställen och ( b ) slumpmässiga genomiska regioner före (blå) och efter (röd) värmechock. ( c ) Nukleosomdensitet runt genomiska regioner innehållande Hsf1-igenkänningskonsensussekvenser med (bundna) eller utan (ej bunden) Hsf1 (bestämd genom Hsf1-TAP ChIP-seq-analys) före (blå) och efter (röd) värmechock. Nukleosom- och Hsf1-TAP-nivåer mättes med Histone H3 respektive Hsf1-TAP ChIP-seq.

Bild i full storlek

Detta resultat fick oss att undersöka om de olika bindningsaffiniteterna vid de tre Hsf1-bindande motiven också medierades genom nukleosomdensitet, men ingen uppenbar korrelation hittades (kompletterande figur 4a). Specifikt skilde sig nukleosomnivåer på både Hsfl-bindningsställen (fig. 3a) och Hsfl-reglerade promotorer (1 kb uppströms om ATG) (kompletterande fig. 4b) inte signifikant vid värmechock, vilket antydde att Hsf1-aktivering och värmechock inte åberopa signifikant nukleosomutkastning vid dessa värmechock-inducerade promotorer.

Värmechock ökar virulensen hos C. albicans in vivo

Våra data visar att Hsf1 binder till gener som är involverade i virulens, vidhäftning och biofilmer under värmechock, men dessa gener kan spela en ännu obestämd roll i termisk anpassning. För att bedöma detta var als3 Δ / als3 Δ och rob1 Δ / rob1 Δ mutanter, tillsammans med deras vildtyps motsvarigheter, värmechockade och cellviabilitet bestämdes av kolonibildande enheter (CFU). Mutanterna uppvisade ingen signifikant värmechockkänslighet jämfört med deras respektive vildtypskontroller (kompletterande figur 5a). Således krävs inte dessa gener för termisk anpassning.

C. albicans har utvecklats hos endotermiska djur som en opportunistisk patogen. Således postulerade vi att det utnyttjar termiska förolämpningar för att uppreglera sitt virulensprogram via Hsf1. Vidare konstaterade våra tidigare studier att en tidigare värmechock skyddar celler från oxidativ stress, vilket kan göra det möjligt för C. albicans att motstå död av värdens immunrespons 18 . För att testa påverkan av värmechock på virulensegenskaper, använde vi de orala epitelcellerna från TR146 som en väletablerad modell för att undersöka vidhäftning och cellskada 33, 34 . Celler grundade med värmechock visade 15% större vidhäftning än celler som odlades vid 30 ° C ensam (Studentens t- test P <0, 05) (Fig. 4a). Detta beror troligen på den Hsf1-beroende uppregleringen av ALS- gener, som är effekterna av epitelhäftning och invasion 35, 36 . Därefter analyserade vi epitelcellskador genom att mäta frisättningen av laktatdehydrogenas (LDH) från TR146-celler. Efter 20 timmars saminkubation ökade skadorna när C. albicans hade fått en tidigare värmechock ( P <0, 05) (fig. 4b). Dessa resultat kan inte tillskrivas morfologiska förändringar under värmechock, eftersom celler kvarstår i jästformen upp till 120 min efter 30–42 ° C värmechock 18 . Våra data antyder att en drastisk värmechock aktiverar ett C. albicans- program associerat med ökad värdcellhäftning och skada.

( a ) Ökad vidhäftning av C. albicans vildtyp (SN95) -celler till TR146-epitelceller efter 30–42 ° C HS. Resultaten representerar procent av vidhäftade celler från 30 ° C odlade celler (ingen HS) eller 30-42 ° C värmechockade celler (HS) jämfört med kontroll CFU: er. Data representerar medelvärden ± sem från två oberoende biologiska replikat. Studenttest, * P <0, 05 jämfört med vildtyp. ( b ) Ökad cellskada av C. albicans vildtyp (SN95) -celler efter 30–42 ° C HS till TR146-epitelceller. Odlingsmedium bedömdes för LDH-frisättning som ett mått på epitelcellskada på TR146-celler efter inkubation med C. albicans odlat vid 30 ° C (ingen HS) eller utsatt för en 15 min 30–42 ° C HS. Data representerar medelvärden ± sem från två oberoende biologiska replikat. Studentt-test, * P <0, 05 jämfört med vildtypen. ( c ) HS ökar virulens i infektionsmodellen G. mellonella . Tjugo larver per behandlingsgrupp injicerades med 2, 5 x 10 5 celler av C. albicans vildtyp (SN95) celler odlade vid 30 ° C (ingen HS) eller utsattes för en 15 min 30–42 ° C HS. PBS användes som en kontroll. Data är representativa för fyra biologiska replikat. Betydelsen bestämdes med användning av Log-rank (Mantel – Cox) -test, med ett P <0, 001 ( d ) HS ökar C. albicans virulens i zebrafiskmodellen för infektion. Nittio sebrafisklarver per behandlingsgrupp injicerades med 15–20 C. albicans vildtyp (SN95) -celler odlade vid 30 ° C (ingen HS), vilda typceller utsattes för en 15 min 30–42 ° C HS eller med en PBS-kontroll. Betydelsen bestämdes med användning av Log-rank (Mantel – Cox) -test med ett P <0, 0001. HS, värmechock.

Bild i full storlek

För att utvärdera effekten av värmechock på virulens, använde vi två komplementära infektionsmodeller, den större vaxmallen ( Galleria mellonella ) och zebrafisken ( Danio rerio ). G. mellonella- larver infekterade med värmechockade C. albicans uppvisade ökad dödlighet jämfört med kontroller ( P <0, 05, Log-rank test) (Fig. 4c). Dessa resultat rekapitulerades med sebrafiskinfektionsmodellen med ökad dödlighet av sebrafisk infekterad med C. albicans- celler som hade fått en tidigare värmechock jämfört med kontroller ( P <0, 05, Log-rank test) (Fig. 4d). Således ökar en akut värmechock virulens i två modeller av Candida- infektion.

Vi bekräftade vidare våra resultat med hjälp av en temperaturförskjutning som närmare sammanställer fysiologiska förhållanden i samband med en febervärd. C. albicans har isolerats från huden, vilket vanligtvis är 33 ° C; det kan sedan bli internaliserat och därefter kan lokal inflammation eller feber höja temperaturen så hög som 41 ° C. Vi konstaterade tidigare att Hsf1 initierar den klassiska värmechockresponsen under långsamma värmeövergångar som skulle härma feber, men också vid skarpa övergångar från 37–42 ° C (ref. 37). För att bestämma om olika temperaturförändringar har jämförbara effekter på virulensegenskaper upprepade vi vidhäftningsanalysen TR146 med en värmechock på 37–42 ° C och fann att vidhäftningen ökade i celler som hade fått en tidigare värmechock, om än inte i samma utsträckning som celler som fick en värmechock 30–42 ° C (kompletterande bild 5b). Effekten av Hsf1 på uttryck av nyckegener för värmechock ( HSP90 , HSP104 och HSP21 ) och virulens ( ALS1 , ALS3, ACE2 och ROB1 ) bibehölls också som svar på en värmechock på 37–42 ° C, men inte samma storlek som med värmechocken 30–42 ° C. (Kompletterande bild 5c). Därför antyder våra data att Hsf1 koordinerar cellulära svar på värdrelevanta värmeskift.

Hsp90 renoverar global transkription under värmechock

Det framväxande paradigmet från decennier av forskning har varit att Hsp90 samverkar fysiskt med Hsf1 för att undertrycka dess aktiveringsfunktion, så att när Hsp90-funktionskapaciteten är överväldigad av förhöjd temperatur eller andra störningar, avlastas förtrycket och Hsf1 aktiverar värmeschockresponsen 18 . Emellertid har nyligen genomförda studier implicerat Hsp90 i direkt reglering av genuttryck genom kromatinombyggnad, RNA-polymeras II-paus och nukleosomavlägsnande vid målpromotorer 21, 22, 38 . För att bedöma effekten av Hsp90 på det transkriptionella svaret på värmechock utförde vi RNA-sekvens i en vildtyp och tetO-HSP90 / hsp90Δ- stam vid 10, 30 och 60 min efter värmechock. I vilda typceller framkallade värmechock snabb, storskalig ombyggnad av genuttryck. Vid 10 min efter värmechock var 766 gener> 2-faldigt uppreglerade, vilket ökade till 1 119 gener med 60 min, vilket representerade ~ 18% av C. albicans genom (kompletterande figur 6a, b och kompletterande data 5). GO-termanalys över de tre tidspunkterna stödde hypotesen att en primär effekt av värmechock är proteinutveckling (kompletterande figur 6c), liksom modulering av gener som är involverade i proteasom / ubiquitination och oxidativt stressrespons. Det bör noteras att C. albicans också uppreglerade gener relaterade till cellcykel, bildning av biofilm och patogenes, i enlighet med våra fynd att en akut värmechock ökar patogenesen (Fig. 4). Värmechock nedreglerade också en stor del av proteinkodande gener i C. albicans , berikade i olika metaboliska processer och ribosombiogenes (kompletterande figur 6a).

Hsp90 hade en djup inverkan på det transkriptionella svaret på värmechock. Efter HSP90- utarmning, 10 min efter värmechock, var endast 358 av 6197 gener> 2-faldiga uppreglerade, jämfört med 766 i vildtypceller, och av dessa var endast 228 vanliga för vildtypsprogrammet (Fig. 5a, b). Dessa gener anrikades för proteinfoldning och återveckning, liknande celler av vildtyp (kompletterande tabell 1). Efter 30 och 60 min efter behandling ökade antalet gener som var uppreglerade> två gånger till 1.056. Dessa gener berikades emellertid för cytoskelettorganisation, kärnkraftsdelning, kromosomsegregation och cellcykelrelaterade processer, vilket förstärkte funktionella förbindelser mellan Hsp90 och cellcykelkontroll vid hög temperatur i S. cerevisiae 39 . Efter 60 minuter hittades en anrikning av ERAD (endoplasmatisk-retikulumassocierad proteinnedbrytning) -vägsgener, medan proteinvikningskategorier inte längre berikades, vilket antyder att den kombinerade spänningen är så skadlig att cellresurserna avleds för att rikta sig mot ofördelade proteiner för degradering. Det bör noteras att nedbrytning av HSP90 i frånvaro av någon stress orsakade uppreglering av 515 gener med> tvåfaldig (Kompletterande data 5). GO-termanalys avslöjar en anrikning av gener som är involverade i metaboliska processer (kompletterande data 6), men ingen berikning av gener som är involverade i allmänna stressresponser. Detta antyder att de transkriptionella effekterna som observerats som svar på HSP90- utarmning inte beror på ospecifik stress från felvikta proteiner. Metaboliska och ribosombiogenesgener förblev nedreglerade vid utarmning av HSP90 under värmechock (fig. 5c). Därför krävs Hsp90 för normal uppreglering av de flesta värmechock-inducerbara gener under värmechock.

( a ) Venn-diagram som visar antalet uppreglerade gener 10, 30 och 60 min efter 30–42 ° C HS i HSP90- nedladdade celler. Överlappning mellan prover illustreras, med det totala antalet gener uppreglerade vid varje tidpunkt representerat under varje tidpunkt. ( b ) Venn-diagram som illustrerar genuttryck överlappning mellan vildtyp och tetO-HSP90 / hsp90Δ- stammar 10 min efter 30–42 ° C HS. ( c ) Uttrycksmönster för tetO-HSP90 / hsp90Δ- stam som odlats i närvaro av 20 μg ml −1 doxycyklin för transkriptionell repression av HSP90 jämfört med samma stam 10, 30 och 60 min efter 30–42 ° C värmechock. Gult representerar större än Log 2- gånger ökning av genuttryck, blått representerar en Log 2- gånger eller större minskning av genuttryck. Kolumner representerar enskilda tidpunkter. ( d ) Histogram som illustrerar effekten av HSP90- utarmning på värmeinducerade expressionsförändringar av Hsfl-målgener. Transkriptionsinduktion (ökning i PolII-nivå) av Hsf1-målgener vid värmechock i frånvaro av HSP90 jämfördes med den i vildtyp, och skillnaderna (induktionsförändring) uttrycks i log 2- skala. HS, värmechock.

Bild i full storlek

En stark temporär signatur ligger till grund för effekten av HSP90- utarmning. Expression av över 75% av Hsfl-målgenerna påverkades drastiskt vid HSP90- utarmning efter 10 minuters värmechock (fig. 5d), och den observerade effekten beror huvudsakligen på förlusten av transkriptionell induktion vid värmechock (kompletterande fig. 7a). Förändringar i uttryck av Hsf1-mål mellan vildtyp och HSP90- nedladdade celler blev emellertid gradvis mindre uttalade efter värmechock (kompletterande figur 7b). Således är Hsp90 avgörande för snabb mobilisering av värmechockresponsen.

Hsp90 modulerar Hsfl-DNA-bindning och -uttryck

Hsp90 är känt för att interagera med Hsf1 i C. albicans och hämmar dess fulla aktivering 18 . Vi förväntade oss därför att Hsf1-bindningen skulle öka vid HSP90- utarmning. I själva verket ökade övergripande Hsf1-TAP ChIP-seq-signaler vid Hsf1-mål vid HSP90- utarmning jämfört med vildtyp (Fig. 6a). Dessutom uppreglerades 18% av Hsf1-mål> 1, 5 gånger vid HSP90- utarmning i frånvaro av värmechock, vilket stödde den etablerade modellen som Hsp90 represserar Hsf1-funktionen i frånvaro av värmechock. Dessa gener berikades för GO-kategorier inklusive svar på värme, proteinutveckling och värmeacclimation (kompletterande tabell 2). I motsats härtill reducerades Hsf1-bindning vid målpromotorer 15 minuter efter värmechock kraftigt efter HSP90- utarmning (fig. 6a), vilket skulle kunna förklara det reducerade uttrycket av Hsfl-målgener under tidig värmechock.

( a ) Utarmning av HSP90 ökar bindningssignalen för Hsf1 i frånvaro av värmechock jämfört med vildtypen. Blått representerar obehandlat, rött representerar värmechockade celler. ( b ) Expression av HSF1 , mätt med RNA-sekv, ökar efter HSP90- utarmning i frånvaro av värmechock. HSF1- uttryck i vildtyp (SN95, WT) eller tetO-HSP90 / hsp90 Δ-stam i frånvaro (-) eller närvaro (+) av 20 μg ml −1 doxycyklin för att undertrycka HSP90- uttryck. Data representerar medelvärden ± sd från tre oberoende biologiska replikat ( c ) Värmeinduktion av HSF1- uttryck i vildtyp (mörkrött) kontra tetO-HSP90 / hsp90Δ (ljusröda) celler under 10, 30 eller 60 min 30–42 ° C värmechock.

Bild i full storlek

Före värmechock är HSF1- uttrycket förhöjt efter HSP90- utarmning (fig. 6b). Detta överensstämmer med ökningen av Hsf1-DNA-bindning och Hsf1-beroende genuttryck som vi observerade. Påfallande avskaffades induktionen av HSF1- uttryck som svar på värmechock som observerades i vilda typceller 10 minuter efter värmechock efter utarmning av HSP90 (fig 6c). Under basala förhållanden undertrycker Hsp90 således Hsf1 så att utarmning av HSP90 inducerar HSF1- expression, bindning och induktion av gener som krävs för proteinomfällning. Emellertid krävs Hsp90 för snabb mobilisering av värmechock-svaret, så att utarmning av HSP90 försvårar induktion av HSF1 vilket leder till ett försenat svar.

Hsp90 upprätthåller nukleosomfria regioner hos promotorer

Med tanke på de slående skillnaderna i globalt genuttryck vid värmechock i vildtyp kontra HSP90- nedladdade celler och upptäckten att nukleosompositionering modulerar Hsf1-bindning till DNA, postulerade vi att Hsp90 kan påverka genuttryck via nukleosompositionering i C. albicans . Med användning av histon H3 ChIP-seq-analys av vildtyp och tetO-HSP90 / hsp90 'fann vi att HSP90- utarmning orsakade nukleosomarrangemang vid Hsfl-reglerade promotorer under både obehandlade och värmechockförhållanden (Fig. 7a, b). Speciellt observerade vi att nukleosomdensitet vid distala promotorregioner minskades. Emellertid ökade nukleosomdensiteten vid den nukleosomutarmade regionen av Hsfl-reglerade gener som överlappar Hsfl-bindande ställen (Fig. 7a, b). Vid nivån för individuella promotorer visade 71 och 87% av Hsfl-reglerade promotorer en ökning i histon-H3-nivåer vid den nukleosomfria regionen efter HSP90- utarmning före respektive efter värmechock (kompletterande fig. 7c, d). Det är viktigt att de ökade histon-H3-nivåerna korrelerade med effekten av HSP90- utarmning på värmeinduktion (mätt i fig. 5c) (kompletterande fig. 7e). Sammantaget antyder dessa fynd att effekten av Hsp90 på Hsf1-DNA-bindning också kan mildras genom förändringar av kromatinkontekst vid promotorer genom att maskera Hsf1-DNA-bindande motiv.

Schematiska diagram som visar nukleosomdensitet i vildtyp (SN95, blå) och tetO-HSP90 / hsp90 (röda) celler, samt Hsf1-TAP-bindande position (grå skugga) vid Hsf1-reglerade promotorer med ( a ) och utan ( b) ) värme shock. ( c ) Värmekarta som illustrerar nukleosomdensitetsförändringar vid HSP90- uttömning 1 kb uppströms och nedströms de indikerade generna klasserna. Gult representerar en ökning och blått representerar en minskning i nukleosomdensitet. ( d ) Histogram som representerar procenten av Hsp90-beroende eller - förtryckta gener reglerade av SAGA eller TFIID jämfört med Hsp90-oberoende gener och genomens bakgrund.

Bild i full storlek

För att bedöma om effekten av Hsp90 på kromatin är Hsf1-specifik eller mer global utvidgade vi analysen till gener med ökat (Hsp90-undertryckt), minskat (Hsp90-beroende) och oförändrat (Hsp90-oberoende) uttryck mätt med PolII ChIP-seq på HSP90- utarmning såväl som till RNA-polymeras II-transkriberade tRNA-gener som en kontroll (kompletterande data 7). Vi identifierade signifikanta effekter på kromatin vid HSP90- uttömning endast bland kategorin av gener med minskat uttryck (Fig. 7c). Påfallande observerades nukleosompositionering primärt vid den nukleosomutarmade regionen men inte den distala promotorn och genkroppen för Hsp90-beroende gener (fig. 7c och kompletterande fig. 7f). Nukleosomutarmade regioner är en kritisk egenskap hos kärnpromotorer för transkriptionsfaktorfunktion och transkriptionsinitiering 40, vilket antyder att Hsp90 orkestrerar genuttryck i C. albicans via nukleosompositionering.

Hsp90 kan modulera nukleosompositionering med flera mekanismer. Först är en av de 143 generna som är Hsp90-förtryckta en ortolog av S. cerevisiae FPR3 , orf19.1030. Denna gen är involverad i nukleosommontering och avsättning 41 . För det andra förträngdes transkriptionsfaktorn, Cbf1, som är involverad i nukleosompositionering i S. cerevisiae 42 vid HSP90- utarmning. För det tredje, 8 av 11 gener som är kända för att koda histoner förtrycks när HSP90 tappas . Dessa gener undertrycktes också vid värmechock, vilket indikerar att Hsp90 krävs för fullt uttryck av histongener och sekvestrering av Hsp90 under värmechock försvårar histongenuttrycket. För det fjärde, genom att identifiera ortologer från S. cerevisiae- gener som kontrolleras av SAGA (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferas) eller TFIID (transkriptionsfaktor II D), upptäckte vi att Hsp90-represserade gener nästan uteslutande kontrolleras av TFIID, medan Hsp90-beroende gener domineras av SAGA (fig. 7d); detta är i linje med SAGA: s roll i regleringen av stressinducerade gener 43 . I både S. cerevisiae och C. albicans interagerar Hsp90 genetiskt med SPT3 , en komponent i SAGA-komplexet 38, 44 . SAGA-acetylater promotornukleosomer, vilket underlättar förskjutning av nukleosomer 45 ; detta antyder att nukleosomtätheten kan öka vid Hsp90-beroende gener på grund av nedsatt funktion av SAGA-komplexet efter Hsp90-kompromiss. Dessa mekanismer är inte ömsesidigt exklusiva och kan alla bidra till påverkan av Hsp90 på transkriptionella svar på cellspänning.

Diskussion

Förmågan att koordinera avkänning och svara på temperatur är en drivkraft för mikrobiell utveckling. Utöver att möjliggöra anpassning till termisk stress, är tillväxt vid fysiologiska temperaturer ett grundläggande krav för patogenes, och däggdjurens endotermi kan ha utvecklats för att begränsa svampinfektioner 46 . Vårt mål var att bestämma om temperaturen modulerar virulens i en patogen som har utvecklats i en relativt stabil termisk miljö. Med RNA-seq och ChIP-seq observerade vi att värmechock inducerar djup transkriptionell ombyggnad i C. albicans , med uppreglering av ∼ 18% av genomet, som till stor del styrs av Hsf1 i samarbete med Hsp90. Många av generna som inducerats av värmechock i C. albicans kodar HSP: er som krävs för att fälla tillbaka termiskt denaturerade proteiner, och komponenter i ubiquitinerings- / proteolysvägen som riktar sig till utbredda proteiner för nedbrytning. Vi observerade också att värmechock inducerar gener involverade i filamentbildning, patogenes och vidhäftning, som visade sig vara direktreglerade av Hsf1 under värmechock (Fig. 1b). Detta inkluderar ALS- familjen av gener som krävs för vidhäftning 29, 30, och ROB1 , en nyckelregulator för biofilmbildning 27 . Vi fann att det transkriptionella programmet inducerat av en värmechock 30-30 ° C i C. albicans är förknippad med ökad värdcellens vidhäftning, värdcellskada och virulens (Fig. 4). Dessa fynd validerades med en mer fysiologiskt relevant värmechock på 37–42 ° C; även om storleken på effekterna på virulensegenskaper var mindre, är det troligt att ytterligare spänningar som uppstått i den mänskliga värden skulle förstärka påverkan av temperaturstress. Tillsammans stöder våra resultat en modell där Hsf1 har utvecklats som en nyckeltemperaturgivare, grundad för att både skydda cellen från termiska förolämpningar och möjliggöra utnyttjande av en komprometterad värd.

Motivanalys av Hsf1-mål visar att de flesta värmeinducerade Hsf1-mål, inklusive ALS1 , ALS3 och ALS4 , innehåller motiven GAAnnTTC och TTCn 7 TTC, medan många konstitutivt bundna Hsf1-mål, inklusive HSF1 , innehåller motivet TTCnnGAAnnTTC (fig. 2e). Detta antyder att Hsf1 kan reglera uttryck av virulensgener via en särskild mekanism från dess reglering av värmechockgener. I motsats till studier i S. cerevisiae 47 fann vi att histonbindningsnivåerna inte förändras signifikant som svar på värmechock (Fig. 3c). Detta antyder tre saker: för det första är Hsf1-bindande platser grundade för bindning; för det andra driver uppreglering av HSF1 under värmechock ökningen av Hsf1-bindning; och för det tredje involverar Hsf1-aktivering inte histonutkastning. Vidare förblir histonnivåer lika vid olika Hsfl-motiv (kompletterande figur 4a, b), vilket antyder att Hsfl-bindande ställen (och följaktligen målgener) är förbestämda av kromatinarkitektur. Reglering på denna nivå antyder att Hsf1 kan ge robusthet som främjar överlevnad i olika fientliga värdnischer och snabba cellulära svar på signaler från värdens immunsystem eller mikrobiota för att initiera övergångar från kommensala till patogena tillstånd.

Kapaciteten hos Hsf1 att orkestrera genuttrycksprogram och cellulär anpassning moduleras av komplexa funktionella förhållanden med Hsp90. Under basala förhållanden leder utarmning av HSP90 till uppreglering av en delmängd av Hsf1-mål (19 av 104): de berikade för proteinvikning och respons på värme (tilläggstabell 2). Detta inträffar sannolikt genom en ökning av HSF1- uttryck och Hsfl-bindning till DNA vid HSP90- utarmning (Fig. 6a, b). Detta passar med modellen som Hsp90 undertrycker Hsf1-funktion 48, 49, 50, och våra tidigare observationer att utarmning av HSP90 inducerar Hsf1-fosforylering och uppreglerar Hsf1-mål 18 . Som svar på värmechock försämrar utarmning av HSP90 det snabba globala transkriptionella svaret, vilket kan bidra till den minskade virulensen hos stammar som tömts av HSP90 i en murin modell av candidiasis 23 . Förseningen kan delvis bero på minskningen av HSF1- induktion som resulterar i en reducerad Hsfl-bindande signal under värmechock vid HSP90- utarmning (Fig. 6a, c). Dessa effekter förvärras sannolikt av ökningen i promotornukleosomdensitet observerad vid HSP90- utarmning vid Hsfl-målgener och gener med Hsp90-beroende uttryck (Fig. 7). Detta överensstämmer med fynd att Hsp90 möjliggör nukleosomavlägsnande från S. cerevisiae GAL1- promotorn och rekryteringen av transkriptionsmaskineri 22, och antyder en bredare roll för Hsp90 i nukleosomarkitekturen.

Sådana förändringar i nukleosomarkitektur inträffar troligen genom flera mekanismer. Först modulerar Hsp90 uttryck för många gener som påverkar nukleosombiologi, inklusive chaperon FPR3 , transkriptionsfaktor CBF1 och histongener. För det andra kan Hsp90 påverka SAGA-komplexets funktion via interaktioner med Spt3 i C. albicans 44 . I S. cerevisiae interagerar Hsp90 med flera komponenter i SAGA-komplexet, inklusive Ada2, Gcn5, Spt3, Spt4 och Spt15 (ref. 38). Histonacetyltransferasaktiviteten hos SAGA-komplexet underlättar promotornukleosomförskjutning 45 . För det tredje, med tanke på att S. cerevisiae Hsp90 interagerar med kromatinombyggnadsfaktorerna Rvb1 / 2, Vps1, Swrl och Aor1 (ref. 38), kan Hsp90 modulera kromatintillstånd genom interaktion med kromatinombyggnadsfaktorer. För det fjärde kan Hsp90 reglera nukleosomutkastning. I överensstämmelse med denna möjlighet förknippas Hsp90 med histon H3.1 och histonkaperon-t-NASP hos däggdjur 51, med utarmning av Hsp90 ökar nivåerna av lösliga H3 och H4 (ref. 52). Den resulterande ökningen i nukleosombeläggning som kan uppstå genom dessa mekanismer skulle hämma transkription 15, med utarmning av HSP90 reducerande expression av över 75% av Hsf1 målgener efter en 10 min värmechock. Således modulerar Hsp90 globala transkriptionella svar på stress via nukleosombeläggning och proteinhomoeostas via repressiva effekter på Hsf1.

Mekanismerna genom vilka kärn eukaryota cellulära regulatorer modulerar värd-patogen-interaktioner börjar först förstås. C. albicans har utvecklat fördjupade mekanismer för att trivas i olika och fientliga miljöer, där det måste motstå värdförsvar och mildra polymikrobiella interaktioner i de mycket konkurrenskraftiga samhällen som blomstrar i kommensala och patogena tillstånd. Den samordnade kontrollen av värmeschockresponsen med ett transkriptionellt program som främjar patogenes antyder att C. albicans , liksom andra liknande patogener har anpassat sig till feberstemperaturer som ett allestädes närvarande värdrespons på infektion, utnyttjande av temperaturskiftet, tillsammans med andra värdsvar, som ett led till att aktivera virulensprogram. Detta ger ett fantastiskt exempel på värmefluktuationer som en drivkraft för värd-patogen samutveckling i svampriket.

metoder

Stammar och tillväxtförhållanden

Alla stammar är listade i tilläggstabell 3. Stammar odlades i YPD (1% jästextrakt, 2% bactopepton, 2% glukos) 53 . För att åstadkomma en omedelbar värmechock på 30-42 ° C odlades cellerna först i YPD vid 30 ° C till exponentiell fas, och därefter avlägsnades hälften av volymen och blandades med en lika stor volym medium som hade förvärmts till 54 ° C i kolvar som hade förvärmts vid 42 ° C. För att åstadkomma en omedelbar värmechock på 37–42 ° C, odlades cellerna i YPD vid 37 ° C till exponentiell fas, varefter hälften av volymen avlägsnades och blandades med en lika stor volym medium som hade förvärmts till 47 ° C i kolvar som hade förvärmts vid 42 ° C. Cellerna lämnades vid 30 eller 37 ° C (obehandlade kontroller) eller odlades vid 42 ° C (värmechock) under de angivna tiderna. Doxycycline (BD Biosciences) tillsattes till YPD-medium i en koncentration av 20 μg ml −1 för att förmedla transkriptionell förtryck från tetO- promotorn.

RNA-seq

För att omfattande studera värmeschockresponsen utförde vi sekvensering av cDNA med hög kapacitet (RNA-seq) gjord av RNA isolerat från C. albicans . C. celler av vildtyp av albicans (CaLC239, SN95) och tetO-HSP90 / hsp90 (CaLC1441) odlades över natten vid 30 ° C i YPD. Stationära faskulturer delades, justerades till en OD 600 på 0, 05 i YPD med eller utan 20 μg ml −1 doxycyklin (BD Biosciences) och odlades under 6 timmar för att säkerställa att HSP90 tappas , men celler är fortfarande livskraftiga 18 . Celler utsattes sedan för en värmechock under 10, 30 och 60 minuter, såsom beskrivits i tillväxtbetingelser. Celler skördades vid 3 000 rpm i 2 minuter vid 4 ° C, tvättades en gång med 1 x PBS och frystes snabbt i flytande kväve. RNA extraherades med Triazol (GibcoBRL: Grand Island, NY), såsom beskrivits tidigare 54 . RNA-integritet analyserades på en Agilent Bioanalyser 2.100 (Stockport, Storbritannien). TruSeq RNA-seq-bibliotek bereddes enligt tillverkarens instruktioner (Illumina, Cambridge, Storbritannien) och sekvenserades på Illumina HiSeq2000-plattformen. Över 80% av råa sekvenser i linje med C. albicans SC5314-genomsekvensen ( Candida Genome Database ) 55 . Genuttrycksanalys utfördes med användning av Partek Genomics Suite-programvara, version 6.6; 2015. Cirka 20 miljoner avläsningar genererades per prov, varav över 80% avbildades till C. albicans ORF. DESeq 56 användes för att normalisera datamängderna och beräkna vikförändringarna och deras statistiska betydelse på basis av tre oberoende biologiska replikat för varje tillstånd (kompletterande data 5). GOSeq användes sedan för att undersöka anrikning av GO-termer 57 .

Chip-seq

C. albikaner som inte är märkta av vildtyp (CaLC239, SN95) och Hsf1-TAP-märkta (CaLC2993) celler odlades till mitten av logfasen (OD 600 0, 6) vid 30 ° C (obehandlad) och utsattes för en 15 min värmechock såsom beskrivits i tillväxtförhållanden. Celler hälldes i 50 ml falkrör innehållande 1, 2 ml 37% formaldehyd upp till 40 ml-märket och inkuberades med mild gungning under 20 minuter vid rumstemperatur, varefter 10 ml 2, 5 M glycin tillsattes för att stoppa tvärbindningen och cellerna blandad i 2 minuter. Celler skördades vid 3 000 varv per minut under 2 minuter vid 4 ° C, tvättades två gånger med iskall 1 x TBS och frystes snabbt i flytande kväve. Kromatin extraherades såsom beskrivits tidigare 58 . I korthet lyserades cellerna i 500 ul FA-lysbuffert (150 mM NaCl) under 3 minuter med användning av en Bullet Blender. Lysis upprepades tre gånger med en inkubation på 3 minuter på is däremellan. Kromatin pelleterades genom centrifugering vid 14 000 rpm under 15 minuter vid 4 ° C och återuppslammades därefter i 500 pl FA-lysbuffert (150 mM NaCl). Sonication användes för att skjuva kromatin-DNA till cirka 100–300 bp i storlek. Kromatinlösning utvanns genom centrifugering vid 14 000 rpm under 30 minuter vid 4 ° C och hölls vid -80 ° C tills användning. Immunutfällning av TAP-märkt Hsf1 utfördes genom att blanda 50 ul kromatin-extrakt med 450 ul FA-lys (150 mM NaCl) och ∼ 15 μl packad IgG Sepharose 6 Fast Flow-matris (GE Healthcare) under 3 timmar vid rumstemperatur på en end-to-end rotator. På liknande sätt exekverades immunutfällning av histon H3 och PolII genom att först blanda 50 ul kromatin-extrakt med 450 mikrolys FA lysis (150 mM NaCl) och 2 μg anti-H3 (Abcam ab1791) eller 2 μl anti-PolII antikroppar (Covance 8WG16) i 1, 5 timmar, följt av inkubering av blandningen med ∼ 15 μl packad protein A Sepharose (GE Healthcare) under ytterligare 1, 5 timmar vid rumstemperatur på en roterande ände. Därefter överfördes IgG eller protein A Sepharose-matris till ett Corning Costar SpinX-centrifugrörfilter och tvättades enligt Fan och kollegor 58 . Immunutfällt kromatin-DNA avlägsnades tvärbindning vid 65 ° C över natt och renades med användning av en QIAGEN PCR-rensningskolonn. Biblioteksförberedelser och multiplex Illumina Sequencing genomfördes såsom beskrivits tidigare 59, 60 . Bibliotek sekvenserades av Illumina HiSeq2500-plattformen. De nukleära och mitokondriella genomsekvenserna och General Feature File för C. albicans isolera SC5314 v.A21-s02-m08-r01 laddades ner från www.candidagenome.org (GenBank-projektets anslutningsnummer PRJNA10701). Illumina-avläsningar anpassades till genomet med hjälp av Bowtie med denna parameter: −5 10 −k 1, --best 61 .

Identifiering av Hsf1-mål

Bindningsställen för Hsf1-TAP identifierades med användning av MACS 62 . MACS-kallade toppar med P- värden <0, 05 inspekterades manuellt och tvivelaktiga bindningsställen (toppar med låg signal i både obehandlade och värmeförhållanden och / eller porträttande av en konstig form) togs bort från ytterligare analys. Kartlägga generna genom deras ATG-position som ligger närmast tillförsäkrade Hsf1-TAP ChIP-seq-toppar, identifierar direkta Hsf1-målgener. Totalt 103 gener identifierades från 104 MACS-toppar från datamängder av obehandlade och värmechockförhållanden (kompletterande data 1).

De novo- motivupptäckten

Sekvenser (200 bp) som sträcker sig över toppen av Hsf1-TAP ChIP-seq-topparna utsattes för de novo- motivanalys med användning av MEME, DREME och HOMER. För utökad analys för att identifiera ytterligare motiv avlägsnades toppar med ett kanoniskt Hsfl-bindande ställe (GAAnnTTC) 100 bp på varje sida av toppen och samma de novo- motivanalys utfördes på de återstående topparna (kompletterande data 4).

Hsf1-bindning och nukleosomdensitet (histon H3) -analys

Hsfl- och histon-H3 ChIP-seq-signaler beräknades genom att räkna antalet sekvensbestämda läsfragment som överlappade inom 20 bp glidande fönster över en 1 kb-region som sträckte sig över toppen av varje topp eller över 1 kb-promotorn och den första 1 kb kodande regionen i varje målgen. Läsantalet normaliserades sedan till det totala antalet mappade läsningar i respektive datamängd. En median togs för varje 20 bp-fönster, och medianen (multiplicerad med en faktor på 1 000 000 för y- skalningsskalning för plottändamål) användes i ChIP-seq-signalplottet för de analyserade topparna, promotorn och kodningsregionerna (-1000 till +1 000 med avseende på ATG). Nukleosomfria regioner identifierades systematiskt med användning av vildtypen obehandlad histon H3 ChIP-seq-data genom att söka efter de lägsta Histone H3-signalerna över 20 bp fönster inom 500 bp uppströms om ATG. Om det identifierade fönstret hade nollhistons H3-signal ställs det första 20 bp grannfönstret med en positiv signal in som gränsen för det nukleosomfria området. Histone H3 signals (normalized to total number of mapped reads) at the identified regions were measured and compared between different samples and expressed as log 2 fold change. To rule out that the observed effect of HSP90 depletion (the increased H3 levels) is not due to a technical artefact, comparative analysis was performed between biological replicates. Two-sample Kolmogorov–Smirnov test was performed between untreated and heat shocked samples (Supplementary Fig. 7d; P values=7.723e−07 and 5.791e−09 for untreated and heat shock comparisons, respectively).

Pol II ChIP-seq analysis

ChIP-seq against RNA polymerase II (Pol II) was used to determine active transcription activities. Transcription level was measured by the number of ChIP-seq fragments (sequencing reads) across the entire open reading frame of a gene normalized first to the length of the gene followed by the total number of mapped reads of a data set. The normalized number, which is similar to RPKM in the RNA-seq analysis, was used in expression comparisons between untreated and heat shock conditions as well as between wild-type and tetO-HSP90/hsp90 Δ strains.

Classification of Hsp90 targets

Gene expression (measured by PolII ChIP-seq) before and after heat shock in strains with or without HSP90 depletion was compared. Genes with lower and higher expression upon HSP90 depletion were classified as Hsp90-Dependent (fold change>-2) and Hsp90-Repressed (fold change>2), respectively, while genes whose expression remain unchanged (fold change between ±0.2 to 0) are referred to as Hsp90-Independent.

QRT-PCR

To monitor gene expression changes in response to heat shock, strains SN95 (CaLC2993, wild-type) and CaLC2998 ( tetO - HSF1/hsf1 Δ) were grown overnight at 30 °C in YPD. Stationary phase cultures were split, adjusted to an OD 600 of 0.2 in 10 ml YPD with or without doxycycline (BD Biosciences) and cultured at 30 °C for 16 h. This was necessary to ensure depletion of Hsf1. Cells were diluted once again to an OD 600 of 0.2 in the same treatment conditions as the 16 h and were grown at 30 °C until mid-log phase (4 h). Cells were subjected to a 15 min 30–42 °C heat shock as described earlier and 50 ml was harvested from each culture at the specified time, centrifuged at 3, 000 rpm for 2 min at 4 °C, and washed once with 1 × PBS before snap freezing in liquid nitrogen. Pellets were stored at −80 °C before extraction. To monitor gene expression upon a 37–42 °C heat shock, wild-type cells (SN95, CalC239) were grown to mid-log phase in YPD at 37 °C before heat shock as described earlier. RNA was isolated using the QIAGEN RNeasy kit and cDNA synthesis was performed using the AffinityScript cDNA synthesis kit (Stratagene). PCR was carried out using the SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich) with the following cycle conditions: 95 °C for 3 min, 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s for 39 rounds, 95 °C for 10 s, 65 °C for 5 s. All reactions were done in triplicate using primers listed in Supplementary Table 4. Transcript levels were normalized to ACT1 . Data were analysed using the BioRad CFX Manager software, version 3.1 (Biorad).

Heat shock survival assays

To test heat shock survival in different mutants, C. albicans rob1 Δ /rob1 Δ (CaLC2739) and als3 Δ /als3 Δ (CaLC3115) mutants, along with their respective wild-type SN152 (CaLC2740) and BWP17 (CaLC3665) (Supplementary Table 3) were grown to mid-log phase in YPD at a starting OD 600 of 0.1. Upon reaching mid-log phase, cells were left untreated or were stressed for one hour with a 30–42 °C heat shock, and CFUs determined by plating onto YPD plates. Viability was calculated as a percentage of survival after a heat shock compared with untreated cells. Experiment was replicated on three separate occasions.

Culture of epithelial cells

The squamous carcinoma of buccal mucosa derived epithelial cell line TR146 was obtained as a gift from Julian Naglik, Kings College London. TR146 cells were routinely grown in DMEM medium containing 10% heat inactivated FBS (Gibco, 16, 000, 044) and × 1 antibiotic-antimycotic (Gibco, 15, 240, 062). When TR146 cells were grown in the presence of C. albicans , antibiotic-antimycotic was replaced with 1% penicillin-streptomycin (Sigma, P4333). Cells were maintained in a humidified incubator at 37 °C, 5% CO 2 . For adhesion, TR146 oral epithelial cell monolayers were grown to confluence in six-well tissue culture plates and serum-starved overnight. For cell damage assays 5 × 10 5 cells were seeded in 24-well plates and cultured for 24 h before experiments.

Cell adherence and damage assays

C. albicans wild-type (SN95, CaLC239) cells were grown to mid-log phase in YPD before subjection to a 15 min heat shock. To determine adhesion, untreated and heat shock treated cells were counted and 100 cells were added to replicate wells containing 1 ml serum-free DMEM for 90 min at 37 °C and 5% CO 2 or plated onto replicate control plates. Non-adherent C. albicans cells were removed by aspiration, wells were washed twice with 1 ml PBS, and overlaid with molten Sabouraud's Dextrose Agar (SDA) at 40 °C (ref. 34). After 24 h at 30 °C the resulting colonies were counted and per cent adherence was calculated as (mean adherent CFU/mean total CFU) × 100. To determine cell damage, untreated and heat shock-treated wild-type (SN95, CaLC239) cells with a fungal:epithelial cell multiplicity of infection of 0.01 (ref. 34) were added to TR146 monolayers and incubated at 37 °C and 5% CO 2 for 20 h. Control wells contained PBS alone. Following incubation, culture supernatant was collected and assayed for LDH using the Cytox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega) according to manufacturer's instructions. Replicate LDH measurements were made on the single well, and the assay was repeated on separate days. All data were analysed using a two-tailed t-test with P <0.05 considered significant.

Galleria mellonella killing assay

Larvae in their final instar (Next Millennium Farms) were injected with C. albicans wild-type (SN95, CaLC239) cells grown at 30 °C or subject to a 15 min 30–42 °C heat shock. Briefly, overnight cultures were adjusted to an OD 600 0.1 in YPD. Cells were grown to mid-log phase before being subjected to the heat shock. C. albicans cells were washed with PBS and cell densities determined by haemocytometer counts. Dilutions were prepared in PBS and cells were injected at 2.5 × 10 5 in 10 μl into the haemocoel via a distinct proleg, with 20 larvae per infection group. Kill curves were plotted and analysed by the Kaplan–Meier method (GraphPad Prism). Log-rank test was used to determine significance.

Zebrafish care and maintenance

Zebrafish were maintained in re-circulating systems (Aquatic Habitats, Apopka, FL) at the University of Maine Zebrafish Facility with a 14/10 h light/dark cycle and water temperature at 28 °C. All zebrafish care and husbandry were performed as described previously 63 . All zebrafish care protocols and experiments were performed in accordance with NIH guidelines under Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol A2012-11- 03.

Wild-type, AB, zebrafish larvae were maintained at a density of 150 per dish in 15 cm petri dishes containing 150 ml of E3 media (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl 2 ; 0.33 mM MgCl 2 ; 2 mM HEPES; pH 6.8). E3 media was supplemented with 0.3 mg l −1 methylene blue for the initial 24 h to inhibit microbial growth. Larvae were cleaned by changing the E3 media daily. Zebrafish were raised in water containing 15 μg ml −1 of 1-phenyl-2-thiourea (PTU) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) to prevent pigmentation.

Zebrafish hindbrain ventricle infection

C. albicans infection in the hindbrain ventricle was performed as previously described 64 . Briefly, Zebrafish at the prim25 stage ( ∼ 36 h post fertilization) were staged according to the method of Kimmel et al . 65 . Before infection larvae were manually dechorionated, and anaesthetized in Tris-buffered tricaine methane sulfonate (tricaine; 200 mg ml −1 ) (Western Chemicals, Inc., Frendale, WA). For each independent experiment, 30 larvae were microinjected with 4 nl of either PBS or 1 × 10 7 cells per ml of C. albicans suspension through the otic vesicle into the hindbrain ventricle to achieve a dose of ∼ 15–20 yeast/larva. Larvae were then screened by microscopy immediately post-infection to ensure correct inoculum sizes and injection location. Data from three independent experiments were plotted. Kill curves were plotted and analysed by the Kaplan–Meier method (GraphPad Prism). Log-rank test was used to determine significance.

Data tillgänglighet

RNA-sequencing data sets are available at ArrayExpress (www.ebi.ac.uk) under accession code E-MTAB-4075. ChIP-seq data sets are available at the NCBI SRA database (//www.ncbi.nlm.nih.gov) under accession code SRP071687. The authors declare that all other data supporting the findings of this study are available within the article and its supplementary information files, or from the corresponding author upon request.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures 1-7, Supplementary Tables 1-4, Supplementary References

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande data 1

    Constitutively bound and heat shock bound Hsf1 targets identified by ChIP-seq.

  2. 2.

    Kompletterande data 2

    GO term processes of all Hsf1 bound genes. Hsf1 targets were catagorised into processes using Candida Genome Database GO Slim Mapper function.

  3. 3.

    Kompletterande data 3

    GO terms of Hsf1 bound genes grouped by specific catagories using Candida Genome Database GO Term Finder function.

  4. 4.

    Kompletterande data 4

    Hsf1 motif analysis. Bioinformatic analysis of C. albicans genome to identify the common Hsf1 motifs identified by ChIP-seq analysis in promoters (1 kb upstream of ATG) of all genes.

  5. 5.

    Kompletterande data 5

    RNA-seq of wild-type and HSP90 depleted cells in the absence and presence of heat shock. Log2 Fold change between conditions tested and transcript levels of each sample for three biological replicates included.

  6. 6.

    Kompletterande data 6

    GO terms of HSP90 depleted genes in the absence of any stress grouped by specific catagories using Candida Genome Database GO Term Finder function.

  7. 7.

    Kompletterande data 7

    RNA polymerase II ChIP-seq in wild-type versus HSP90 depleted cells.

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.