Hnrnp l och hnrnp ll modagonistiskt modulerar ptb-medierad skarvning undertryckande av chrna1 pre-mrna | vetenskapliga rapporter

Hnrnp l och hnrnp ll modagonistiskt modulerar ptb-medierad skarvning undertryckande av chrna1 pre-mrna | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Alternativ skarvning
  • RNA-skarvning

Abstrakt

CHRNA1- genen, som kodar för den muskulära nikotiniska acetylkolinreceptor-alfa-subenheten, har en inframe-exon P3A. Införande av exon P3A inaktiverar montering av acetylkolinreceptorunderenheter. En enda nukleotidmutation i exon P3A identifierat i medfødt myastensyndrom orsakar exklusiv inkludering av exon P3A. Mutationen erhåller en de novo- bindande affinitet för ett skarvningsförbättrande RNA-bindande protein, hnRNP LL, och förtränger bindning av en skarvning som undertrycker RNA-bindande protein, hnRNP L. HnRNP L binder till en annan skarvningsrepressor PTB genom det prolinrika området och främjar PTB-bindning till polypyrimidinkanalen uppströms om exon P3A, medan hnRNP LL som saknar det prolinrika området inte kan binda till PTB. Interaktion mellan hnRNP L och PTB hämmar associering av U2AF 65 och U1 snRNP med uppströms respektive nedströms P3A, vilket orsakar en defekt i exon P3A-definitionen. HnRNP L och hnRNP LL modulerar således antagonistiskt PTB-medierad skarvningssuppression av exon P3A.

Introduktion

I högre eukaryoter möjliggör alternativ skarvning exakta regler för genuttryck med ett begränsat antal gener. Nya rapporter visar att that 95% av mänskliga gener genomgår alternativ skarvning 1 . Differentiell pre-mRNA-skarvning koordineras kooperativt genom cis- element som består av exoniska / introniska skarvförstärkare / ljuddämpare (ESEs, ISEs, ESSs och ISSs) och transfaktorer som är tätt reglerade på ett vävnadsspecifikt och utvecklingsstegspecifikt sätt . Biogenes av ribonukleoproteinkomplex (RNP) koordineras alltså med hög tro 2 för att säkerställa att korrekt komplement av RNA och proteiner finns i rätt cell vid rätt tidpunkt. Mutationer som försämrar bildningen av funktionella spliceosomer genom att störa cis- elementen eller genom att kompromissa med RNA-bindning eller katalytisk funktion hos transfaktorer kan vara skadliga för celler orsakar ofta mänsklig sjukdom 2, 3 .

Medfödda myastensyndrom (CMS) uppstår från defekter i gener som kodar för presynaptiska, synaptiska och postsynaptiska proteiner vid neuromuskulär korsning (NMJ) 4, 5 . De flesta CMS är postsynaptiska och de flesta av dessa orsakas av recessiva mutationer i acetylkolinreceptor (AChR) underenhetsgener. CHRNA1 , som kodar för AChR a-underenheten, har ett alternativt skarvt 75-nt inframe-exon P3A mellan exonerna 3 och 4 (fig. Ib) 6 . Endast transkriptet utan exon P3A, P3A (-), kodar en funktionell a-subenhet som integreras i funktionell AChR vid ändplattan 7 . Transkriptet med exon P3A, P3A (+) har 25 extra aminosyror och infogas mellan kodon 58 och 59 i den extracellulära domänen i a-subenheten. Bildandet av en pentamerisk AChR börjar med dimerisering av a-underenheterna och av a-subenheterna via den extracellulära domänen för varje underenhet 8 . Störning av den extracellulära domänen av exon P3A förutsägs förhindra bildning av a- och a-dimererna 9 . Exon P3A är alternativt skarvad i människor, gorillaer, schimpanser och orangutanger, men inte i rhesusapor, gibbons, mandrills, marmosets, hundar och katter 10, 11 . I mänskliga skelettmuskler genereras P3A (-) och P3A (+) transkript i ett 1 ∶ 1-förhållande 12 . P3A (+) -utskriften uttrycks också i de normala och icke-neoplastiska tymuskörtlarna hos myasteniska patienter, men är frånvarande 13 eller uttrycks sällan 14 i tymom. Den funktionella betydelsen av P3A (+) -transkriptet i muskler eller i tymuskörteln har ännu inte klargjorts. Vi rapporterade tidigare att skarvningsregulatorer, hnRNP H 15 och polypyrimidin-bindande protein (PTB) 16 binder till intron 3 uppströms om exon P3A och undertrycker inkludering av exon P3A.

(a) AChR-expression vid patienten och kontrolländplattan visualiserad med peroxidas-märkt a-bungarotoxin. Notera begränsad distribution och dämpat uttryck av AChR vid patientens ändplatta. Stänger = 1 um. (b) Struktur av CHRNA1- genen och två identifierade mutationer. (c) Fyra möjliga transkript i patientens muskler. Endast transkript jag kan skapa en normal α-subenhet. Ett segment som sträcker sig över exon P3A av transkript från aG421- och aR421-alleler amplifieras specifikt med allelspecifik RT-PCR med användning av patientmuskel. Transkript I är inte detekterbart (spår 1 och 2). P3A (-) och P3A (+) transkript amplifieras specifikt med allelspecifik RT-PCR för patientens muskel. Kapslade RT-PCR-produkter som sträcker sig över αG421R digereras av NlaIV, som endast skär vildtypen GG421-fragmentet (spår 4) och lämnar det mutanta αR421-fragmentet osmält (spår 3 och 4). P3A (-) -utskriften uppstår nästan uteslutande från en allel med αR421 (transkript III) (spår 3), medan P3A (+) -utskrifter härrör från båda allelerna (transkript II och IV) (bana 4). Återigen är transkript I inte detekterbart (spår 3 och 4). (d) Allel-specifik RT-PCR i realtid för patientens muskel. ΑP3A23′G> En allel genererar knappt P3A (-) transkript. (e) Uttryck av AChR på HEK293-cellytan introducerad med de angivna a cDNA: erna tillsammans med vildtyp-p, 6 och e-cDNA. Uttrycksnivån för aG421R-AChR är 14, 7 ± 5, 1% av det normala (medelvärde ± SD, n = 3).

Bild i full storlek

HnRNP L är ett rikligt kärnprotein som har identifierats som en global skarvregulator 17 . Förutom sin viktiga funktion i alternativ skarvning 18, 19, 20, 21, spelar hnRNP L också viktiga roller i polyadenylering, vid export av mRNA från gener som saknar introner 22, i intern ribosominföringsplats (IRES) -medierad översättning 23, och i mRNA-stabilitet 24 . Nyligen har hnRNP L-liknande, även känd som hnRNP LL, en nära besläktad paralog av hnRNP L, också identifierats som en regulator för alternativ skarvning i aktiverade T-celler 25 .

Hos en allvarligt drabbad CMS-patient har vi identifierat en kritisk mutation i exon P3A som orsakar exklusiv inkludering av exon P3A i patientens muskel. Här demonstrerar vi en fin moduleringsmekanism för att främja antingen hoppning eller inkludering av exon P3A, som förmedlas av liknande, men antagonistiska, hnRNP L- och hnRNP LL-faktorer. Det är anmärkningsvärt att närvaron eller frånvaron av den prolinrika regionen (PRR) i hnRNP L respektive hnRNP LL är en avgörande avgörande faktor för att utlösa följande skarvningsförtryckningssystem medierat av PTB.

Resultat

Missense- och pseudo-missense-mutationer upptäcks i CMS

En 53-årig man hade allvarliga myasteniska symtom som involverade alla frivilliga muskler sedan födseln, ett dekrementellt elektromyografiskt svar och inga cirkulerande anti-AChR-antikroppar. Han svarade delvis på kombinerad behandling med antikolinesterasläkemedel och 3, 4-diaminopyridin. Hans föräldrar var inte äkta och han hade inga påverkade släktingar på liknande sätt.

En interkostal muskelbiopsi erhölls vid 4 års ålder. På fluorescerande mikroskopi visade patientändplattor (EP) bevarat uttryck av acetylkolinesteras och starkt dämpat uttryck av AChR. På elektronmikroskopi bevarades strukturella integriteten för korsveck och nervterminaler men vissa postsynaptiska regioner var enklare än normalt. Ultrastrukturell lokalisering av AChR med peroxidas-märkt α-bungarotoxin avslöjade markant minskning i täthet och fördelning av AChR på korsveckarna (Fig. 1a). AChR-indexet (definierat som längden på det postsynaptiska membranet som reagerade för AChR-normaliserat för längden på det primära synaptiska klyftan) reducerades till ~ 29% av det normala (tabell 1). Amplituden för miniatyr-EP-potentialer (MEPP) reducerades till ~ 23% av det normala (tabell 1). Antalet kvanta frigjorda genom nervimpuls var normalt. Säkerhetsmarginalen för neuromuskulär överföring hos patienten äventyras således av AChR-bristen.

Full storlek bord

Direkt sekvensering av CHRNA1- , CHRNB1- , CHRND- och CHRNE- generna som kodar för AChRa , p , 6 respektive e- enheterna , avslöjade två heterozygota mutationer i CHRNA1 (fig. 1b). G-till-A-mutationen vid nukleotidposition 1261 förutsäger en glycin-till-argininsubstitution vid kodon 421 i det fjärde transmembrandomänet i a-subenheten (aG421R). Aminosyran, aG421, delades mellan alla humana AChR-subenheter och den är också perfekt bevarad i a-subenheten över alla ryggradsarter (fig. S1a och b). αG421R finns inte i 200 normala alleler eller i tillgängliga SNP-databaser (dbSNP build 137, 1000 Genomes Project och NHLBI ESP). När vi transfekterade AChR a-subenheten cDNA som innehöll G421R-mutation tillsammans med vildtyp ß, δ och ε subenhet cDNA till HEK293-celler, fann vi att expressionsnivån för αG421R-AChR reducerades till ∼ 15% (fig. 1e), vilket underströk patogeniciteten för aG421R-mutationen.

Eftersom förlust-av-funktionsmutationer i AChR-subenhetsgener i allmänhet är recessiva och individer som bär en nollmutation på en enda allel är alltid asymptomatiska, letade vi efter den andra förlust-av-funktionsmutationen i CHRNA1 . Vi kunde inte hitta någon mutation förutom kandidat G-till-A-substitution vid den 23: e nukleotiden i aP3A-exonet (αP3A23′G> A), som förutsäger en arginin-till-histidinsubstitution vid det åttonde kodonet i exon P3A (Fig. 1b). ΑP3A23′G> En mutation var inte närvarande i 200 normala alleler eller i tillgängliga SNP-databaser. Vi spårade αP3A23′G> A och αG421R-förändringar hos familjemedlemmar och fann att dessa två mutationer är heteroalleliska och recessiva (Fig. S1c). Vi antog först att αP3A23′G> A var en sällsynt polymorfism, eftersom ett vildtypstranskript som bär exon P3A inte uttrycktes på cellytan hos transfekterade HEK293-celler och introduktion av αP3A23′G> A räddade inte cellytuttrycket (Fig 1e). Eftersom en uttömmande sökning efter andra mutationer i α-subenheten, inklusive enkel allelanalys med 'konverteringsmetoden 26, inte upptäckte någon ytterligare mutation, undersökte vi effekterna av αP3A23′G> A på pre-mRNA-skarvning.

αP3A23′G> En förbättrar markant inkluderingen av exon P3A i muskler

Allelspecifik RT-PCR för biopsierade muskler avslöjade att aP3A23′G> En mutation förbättrade markant införlivandet av exon P3A i moget mRNA och förhindrade uttryck av det funktionella P3A (-) transkriptet (fig 1c) Allelspecifik realtids-RT-PCR för muskel-mRNA visade på liknande sätt att αP3A23′G> A markant reducerade det funktionella P3A (-) transkriptet, medan en allel som innehöll αG421R genererade P3A (-) transkriptet till liknande nivåer som för normala kontroller (Fig. 1d).

αP3A23′G> A stör en förmodad exonisk skarvljuddämpare

Vi konstruerade en minigen innehållande exonerna 2 till 4 av CHRNA1 (fig. 2a) i pRBG4-däggdjursuttrycksvektorn för att dissekera cis- elementet för skarvning. Vi transfekterade COS-celler med vildtypen och mutanta minigener och bekräftade att minigenerna återkapituerade effekten av den identifierade mutationen på skarvning (Fig. 2a). För att undersöka om den identifierade mutationen stör en ESS eller genererar en ESE introducerade vi fem artificiella mutationer mellan nukleotidpositionerna 22 och 24 (fig. 2a). Alla mutanter förbättrade införlivandet av exon P3A, vilket indikerar att G i position 23 såväl som dess flankerande nukleotider utgör en ESS och aP3A23′G> En mutation stör den.

(a) Struktur av CHRNA1- genen och pRBG4-minigen. Ett 589-bp segment (trasig linje) i intron 3 raderas i pRBG4 minigen. Patientens mutation och fem artificiella mutationer införs i pRBG4 minigen. Förhållanden mellan exon P3A-hoppning kvantifieras genom realtid RT-PCR av COS-celler transfekterade med pRBG4-minigener. (b) pSPL3 minigen innehållande CHRNA1 exon P3A och flankerande introner. Pilspetsar pekar på gränserna för CHRNA1 och pSPL3-vektorn. Förhållanden mellan exonhoppning analyseras med RT-PCR för COS-celler och SH-SY5Y-celler transfekterade med pSPL3-minigener. Stänger och linjer representerar medel- och standardavvikelse (SD) för tre oberoende experiment för både (a) och (b).

Bild i full storlek

Vi infogade också exon P3A och dess flankerande introner mellan de två proprietära konstitutiva exonerna från den modifierade exon-fångstvektorn pSPL3 (fig. 2b) för att testa om mutationen kan rekapitulera den avvikande skarven i ett heterologt sammanhang. AP3A23G> A i pSPL3 upprepade faktiskt det förbättrade igenkänningen av exon P3A i COS- och SH-SY5Y-celler (fig. 2b), vilket antydde att exon P3A och dess flankerande intronsekvenser är tillräckliga för att reglera inkludering eller hoppning av exon P3A. Vi jämförde också skarvningseffektiviteter hos vildtyp P3A-konstruktionen i pSPL3 i COS, SH-SY5Y, HEK293 och HeLa-celler (fig. 2b och data visas inte), och fann att P3A (-) och P3A (+) transkriptioner uttrycktes i ett 1'-förhållande i SH-SY5Y-celler, som i mänsklig skelettmuskel 12 Vi erhöll således ett troget skarvningssystem med SH-SY5Y-celler och pSPL3-konstruktioner för ytterligare mekanistiska analyser.

αP3A23′G> A avbryter bindning av hnRNP L medan det blir bindning av hnRNP LL

Efter att ha identifierat den kritiska cis- delen av skarvning, sökte vi nästa efter en transfaktor ansvarig för att reglera inkludering eller hoppning av exon P3A. RNA-affinitetsrening av det nukleära extraktet framställt från SH-SY5Y-celler med vildtyp P3A-RNA-sonden gav ett ~ 70 kDa-protein (fig. 3a). Analys av det klippta bandet med masspektrometri avslöjade 26 unika peptider som matchade med hnRNP L (Mascot-poängen 343; signifikansgränsen, p <0, 05). Immunoblotting visade att proteinet bundet till vildtyp P3A-exonet verkligen var hnRNP L med en förutsagd molekylvikt av 68 kDa (fig. 3b, spår 1). Som förväntat minskade aP3A23G> A-muterad sond bindningsaffiniteten för hnRNP L (fig. 3b, spår 2). Vi undersökte vidare bindning av andra kandidatskarvningsfaktorer; hnRNP LL, hnRNP K, hnRNP J, SRSF1 (tidigare SF2 / ASF), SRSF2 (tidigare SC35), SRSF5 (tidigare SRp40) och SRSF6 (tidigare SRp55) (Fig. 3b och Fig. S2b). Vi fann att ingen bundet till vildtypssonden, men oväntat fick mutationen de novo bindning för hnRNP LL (fig. 3b, spår 2). Vi löste också RNA-affinitetsrenade proteiner bundna till den mutanta sonden genom masspektrometri och identifierade hnRNP LL med Mascot-poängen 124 (signifikansgränsen, p <0, 05).

(a) Coomassie-blå färgning av RNA-affinitetsrenade produkter med användning av SH-SY5Y-kärnämneekstrakt med biotinylerade RNA-prober. Ett ∼ 70-kDa-protein (pil) detekteras endast med vildtypsonden (wt) men inte med den förvrängda sonden. (b) Immunoblots (IB) sonderas med kandidat-skarvningstransfaktorer. Viltyps exon P3A (wt) binder till hnRNP L (L) och aP3A23′G> A (mut) stör sin bindning. Mutationen får de novo- bindning till hnRNP LL (LL). NE indikerar 10% använt kärnkraftsekstrakt. (c) Deletionsmutagenes för att kartlägga bindningssekvenserna för hnRNP: er L och LL i exon P3A. Understrykningar indikerar förmodande bindande motiv för hnRNP LL (röda linjer) och hnRNP L (tunna och tjocka blå linjer för respektive svaga och starka motiv) 27 . Observera att G-till-A-mutationen de novo genererar ett bindande motiv av CACC för hnRNP: er L och LL. Immunoblots av RNA-affinitetsrenade produkter detekteras med antikroppar mot hnRNP: er L och LL. (d) Mock-, hnRNP L- och hnRNP LL-utarmad SH-SY5Y-kärnekstrakt renades affinitet med RNA-prober och upplöstes genom immunblotting. (e) RT-PCR av vildtyp (wt) och mutant (mut) pSPL3-minigener i SH-SY5Y-celler behandlade med siRNA mot kontroll (siCt), hnRNP L (siL) och hnRNP LL (siLL). Immunoblotting visar nedreglering av hnRNP: er L och LL. (f) Schematisk presentation av en reporter minigen (pSPL3-MS2) och transaktionseffektorer . HnRNP: er L och LL (ovaler) är smälta till det konstgjorda MS2-skiktproteinet (inverterad U-form). MS2-skiktproteinbindande hårnål-RNA är ersatt med det skarvningsreglerande stället för exon P3A för att direkt binda MS2-skiktprotein-smält hnRNP: er L och LL. RT-PCR för pSPL3-MS2-minigener i SH-SY5Y-celler som samtransfekteras med de angivna effekterna. Immunblotting visar uttryck av effek-torer i kärnlysatet hos SH-SY5Y-celler. MS2-L-konstruktionen har 16 ytterligare kodoner som härrör från det multipla kloningsstället jämfört med MS2-LL. Stänger och linjer representerar medelvärdet respektive SD för tre oberoende experiment för paneler (e) och (f).

En komprometterar bindningsaffinitet för en skarvhämmande hnRNP L och får bindningsaffinitet för en skarvförbättrande hnRNP LL. "Rel =" nofollow "> Bild i full storlek

Överlappande bindande motiv är ansvariga för en konkurrenskraftig bindning av hnRNP L och hnRNP LL

Tidigare rapporter antyder att både hnRNP: er L och LL företrädesvis binder till CA-repeterande eller C / A-rika sekvenser 27, 28, 29 . SELEX-studier in vitro av hnRNP L visade att CACA- och ACAC-sekvenser ger hög affinitet och att CACG- och CACC-sekvenser ger bindande motiv med låg affinitet för hnRNP L 27 . Även om det inte finns några SELEX-data för hnRNP LL, föredrar hnRNP LL att binda till CACC-sekvensen i CD45- transkriptet 28, 29 . Viltyps exon P3A bär det CACG-stället med låg affinitet för hnRNP L (fig. 3c). AP3A23′G> En mutation ändrar snarare CACG-stället med låg affinitet till ett CACA-ställe med hög affinitet. Dessutom erhåller denna mutation en CACC-plats med låg affinitet för hnRNP L, som också fungerar som en de novo- bindande plats för hnRNP LL. Följaktligen stör denna mutation det infödda CACG-motivet för hnRNP L och introducerar två nya överlappande CACA- och CACC-motiv för hnRNP L såväl som ett nytt CACC-motiv för hnRNP LL. Affinitetsreningsexperiment visade emellertid att mutationen avskaffar bindning av hnRNP L. Vi dissekerade således den molekylära basen för förlusten av hnRNP L-bindning.

Radering av nukleotider 20 och 21 (Δ20–21) från mutantsekvensen upphäver CACA-motivet med hög affinitet för hnRNP L men behåller CACC-motivet för hnRNPs L och LL (fig. 3c). Affinitetsrening av nukleära extrakt från SH-SY5Y-celler med Δ20-21-sond visade förlust av hnRNP L och förstärkning av hnRNP LL-bindning (fig. 3c, spår 1). På liknande sätt genererar borttagning av nukleotider 24 till 26 (Δ24-26) från mutantsekvensen ett CACACA-motiv med hög affinitet för hnRNP L, men upphäver CACC-motivet för hnRNP LL. Som förutsagt gav sond Δ24–26 upphov till bindning av hnRNP L (spår 2). Dessutom upphäver borttagning av nukleotider 20 till 26 (Δ20-26) från den mutanta sekvensen alla affinitetsmotiv för hnRNPs L och LL, och det binder faktiskt inte till varken hnRNP L eller LL (spår 3). Detta antyder att hnRNP: er L och LL tävlar om bindning till det överlappande stället för den muterade sekvensen i exon P3A, och följaktligen vinner hnRNP LL tävlingen.

För att ytterligare bekräfta den konkurrenskraftiga bindningen av hnRNPs L och LL, uttömde vi hnRNP L eller LL från kärnkraftsekstrakt av SH-SY5Y-celler (fig. S2c) och utförde RNA-affinitetsreningsanalyser. Som vi förutspådde återställde utarmning av hnRNP LL bindning av hnRNP L till den mutanta sonden (fig. 3d, spår 6), vilket underströk en uppfattning att hnRNP LL tävlar med hnRNP L för bindning till den mutanta sonden.

HnRNP L-tystnader och hnRNP LL förbättrar inkluderingen av exon P3A

Därefter undersökte vi effekterna av hnRNPs L och LL på skarvning av exon P3A genom siRNA-medierad nedreglering av hnRNPs L och LL i SH-SY5Y-celler (fig. 3e). Nedreglering av hnRNP L inducerad inkludering av exon P3A i vildtyps minigen (Fig. 3e, spår 3), medan nedreglering av hnRNP LL orsakade hoppning av exon P3A i den mutanta minigenen (spår 6), vilket indikerar att hnRNPs L och LL-funktion som skarvljuddämpare respektive förstärkare. Uttryck av siRNA-resistenta hnRNPs L (si-res L) och LL (si-res LL) tillsammans med siRNA i SH-SY5Y-celler nekade möjliga effekter utanför mål av siRNA (fig. S3a).

Vi bekräftade nästa att hnRNP: er L och LL verkligen fungerar på det identifierade ciselementet och inte på de andra webbplatserna. För detta ändamål kopplade vi hnRNPs L och LL till målet med användning av bakteriofag MS2-skiktproteinet. Vi beredde en effektorkonstruktion som uttrycker MS2-märkt hnRNP L- eller LL-protein (MS2-L respektive MS2-LL) och målminigenkonstruktionen (pSPL3-MS2) innehållande det MS2-bindande stället, som ersatte det inhemska målet. webbplats. Som vi förväntade, främjade hopbindning av hnRNP L till målet hoppning av exon P3A (fig. 3f, spår 5), medan koppling av hnRNP LL inducerade inkludering av exon P3A (spår 6). Brist på skarvningsmoduleringseffekter av hnRNP: er L och LL utan MS2-tagg indikerar att varken hnRNP L eller LL fungerar på de andra platserna (fig. 3f, spår 3 och 4). Vi bekräftade också att MS2-fusionerade hnRNPs L och LL inte hade någon effekt på en minigen som saknade det MS2-bindande stället (pSPL3-nonMS2) (Fig. S3b). Således utövar hnRNP L och hnRNP LL tystnad och förbättrar aktiviteter på den identifierade målsidan.

Den prolinrika regionen av hnRNP L är avgörande för att hoppa över exon P3A

Vi dissekerade nästa funktionella domäner för hnRNPs L och LL som dikterar hoppning och inkludering av exon P3A, respektive. HnRNP L (589 aminosyror; accessionsnummer, NP_001524) och hnRNP LL (542 aminosyror; NP_612403) är paraloger 29 av liknande storlek. De delar en total aminosyraidentitet på 58% och innehåller tre starkt konserverade RNA-igenkänningsmotiv (RRM) (Fig. 4a) 17, 29 . HnRNP LL skiljer sig emellertid i två domäner från hnRNP L: dess N-terminala glycinrika region (GRR) är mindre framträdande, och den saknar den prolinrika regionen (PRR) (fig. 4a). Vi postulerade således att en eller båda av dessa distinkta regioner bestämmer den skarvningsundertryckande aktiviteten hos hnRNP L. För att bevisa detta konstruerade vi en serie raderingsmutanter av hnRNP L och introducerade dem i SH-SY5Y-celler tillsammans med målet pSPL3-MS2-substrat bär det MS2-bindande stället. För att förhindra den eventuella effekten av varje radering på en nukleär lokaliseringssignal introducerade vi kärn-lokaliseringssignalsekvensen för det stora T40-antigenet SV40 vid N-terminaländen av varje konstruktion. Vi fann att borttagning av GRR från MS2-hnRNP L-fusionskonstruktionen (MS2-L-ΔGRR) inte hade någon effekt på hoppning av P3A-exon (fig. 4b, spår 3), medan borttagning av PRR (MS2-L-ΔPRR) orsakade inkludering av P3A-exon (spår 4). Ytterligare borttagningar inklusive RRM2 (MS2-L-ΔR2-ΔPRR) och RRM3 (MS2-L-ΔPRR-ΔR3) förlorade fullständigt skarvningseffekterna av hnRNP L (fig. 4b, spår 5 och 6). Däremot transformerade konstgjord insättning av PRR i hnRNP LL (MS2-LL-PRR) exon P3A-inkluderingsaktiviteten för hnRNP LL till exon P3A-hoppningsaktivitet (fig. 4b, spår 7 och 8). Vi drar slutsatsen att PRR är ansvarigt för exhoppningsaktiviteten för hnRNP L, och exoninkluderingsaktiviteten för hnRNP LL tillskrivs bristen på PRR.

(a) Schematiska domänstrukturer för hnRNP: er L och LL och deras mutanta derivat. Interaktion mellan varje proteinprodukt med PTB indikeras till höger enligt resultaten från panelerna (d) och (e). RRM, GRR och ND indikerar RNA-igenkänningsmotiv, glycinrikt område och inte detekterade respektive. (b) RT-PCR för pSPL3-MS2-produkter efter att de indikerade MS2-märkta transaktionseffektorerna infördes i SH-SY5Y-celler. Stänger och linjer representerar medelvärdet respektive SD för tre oberoende experiment. Immunblotting visar uttryck av effek-torer i kärnlysatet hos SH-SY5Y-celler. (c) Schematiska bindningsställen för hnRNP L och PTB i exon P3A respektive uppströms PPT (ÅÅÅÅ). (d) Interaktion mellan PTB med His-taggad hnRNP L och dess indikerade mutant. Kärnekstrakt av transfekterade SH-SY5Y-celler immunutfälls med anti-His-antikropp och analyseras för interaktion med endogen PTB genom immunblotting (IB). Öppna pilspetsar pekar på den tunga kedjan av IgG (HC) som icke-specifikt fälldes ut. (e) Interaktion mellan PTB med His-taggad hnRNP LL och dess indikerade mutant. Se (d) för procedurer och andra etiketter.

Bild i full storlek

HnRNP L och PTB förhindrar samarbete inkluderande av exon P3A

Nästa frågade vi hur PRR för hnRNP L tillhandahåller exhoppningsaktivitet. Vi rapporterade tidigare att PTB binder till polypyrimidin-kanalen (PPT) av intron 3 och undertrycker inkludering av exon P3A (fig. 4c) 16 . Även om direkt bindning av hnRNP L och PTB tidigare har rapporterats 30, var dess mekanistiska grund för skarvning ännu inte löst. Baserat på våra data antagde vi att PRR för hnRNP L binder till PTB och kooperativt undertrycker inkludering av exon P3A. Vi undersökte således rollen som PRR för hnRNP L på interaktionen med PTB. Histidin-märkt hnRNP L (His-L), dess PRR-raderade variant (His-L-ΔPRR), histidin-taggad hnRNP LL (His-LL) och dess PRR-insatta variant (His-LL-PRR) uttrycktes i SH-SY5Y-celler, och de immunutfälldes med anti-histidin-antikropp i närvaro av RNas. Immunoblotting avslöjade att PTB fälldes ut med His-L men inte med His-L-ΔPRR (fig. 4d). Å andra sidan fälldes inte PTB ut med hnRNP LL (His-LL) utan detekterades med His-LL-PRR (fig. 4e). Dessa resultat indikerar att PRR för hnRNP L möjliggör för hnRNP L att interagera med PTB.

Därefter undersökte vi om de skarvade undertryckande effekterna av PTB och hnRNP L var additiva eller kooperativa. Förbättrad inkludering av exon P3A genom att slå ner både hnRNP L (siL) och PTB (siPTB) liknade det som observerades av siL eller siPTB enbart (fig. S4), vilket antydde att PTB och hnRNP L samarbetar med att hoppa över exon P3A med ingen tillsatseffekt.

HnRNP L – PTB-interaktion försvårar exon-definition E-komplexbildningen för att främja överhoppning av exon P3A

För att ytterligare avgränsa den exakta mekanismen genom vilken hnRNP L-PTB-interaktion orsakar hoppning av exon P3A, använde vi en in vitro- skarvningsanalys med användning av ett HeLa-cellkärnekstrakt. Eftersom PTB binds till PPT uppströms om exon P3A och hnRNP L binder till exon P3A, tillverkade vi två uppsättningar med skarvande substrat, som båda bär antingen vildtyp (wt) eller mutant (mut) -sekvens. Strukturen för en uppsättning var "exon 3-intron 3-exon P3A" (E3P3A-wt och E3P3A-mut), och den för den andra var "exon P3A-intron P3A-exon 4" (P3AE4-wt och P3AE4-mut ). Detta substratsystem kan informera oss om huruvida hnRNP L-PTB-interaktionen påverkar 3 ′ eller 5 ′ skarvplatsen i exon P3A. E3P3A-mut skarvades mer effektivt än E3P3A-wt, medan P3AE4-mut skarvdes lika effektivt som P3AE4-wt (fig 5a). Dessa resultat indikerar att bindningen av hnRNP L till vildtyp-exon P3A undertrycker borttagandet av uppströms intron men inte nedströms intron.

(a) Tidskursdata erhållna från in vitro- skarvning av 32 P-märkta pre-mRNA från E3P3A (vikt och mut) och P3AE4 (vikt och mut) minigener. Skarvningsprodukterna visas schematiskt till höger. Det skarvade mRNA (asterisk) ökas i E3P3A-mut jämfört med E3P3A-wt. Även om intronlariater uppenbarligen ökas i E3P3A-wt, är inte intronlariat och RNA med hög molekylvikt tydligt upplöst för E3P3A, och ökningen av intronlariaten kan inte uppskattas exakt. Dålig upplösning av skarvningsprodukter av E3P3A jämfört med P3AE4 beror sannolikt på bindning av en skarv som represserar PTB. (b) Tidsförloppsanalys av tidig exon-definierad spliceosom (EDE-komplex) som samlas över P3A-exonet av 32 P-märkta substrat (iP3Ai-wt och iP3A-mut) i frånvaro av ATP. Infödda agarosgelelektrofores löser det angivna icke-specifika komplexet H (H) och det exondefinierade E-komplexet (EDE). (c) Schematiska strukturer av MS2-bundna vildtyp (wt) och mutanta (mut) substrat som används för isolering av EDE-komplex. Immunoblotting (IB) och RT-PCR-analyser av renat E-komplex sammansatt på indikerade underlag. PTB var troligtvis bundet till en CUCUCUCU-sekvens i intron 1 av p-globin-MS2 pre-mRNA.

Bild i full storlek

Därefter analyserade vi det tidiga ATP-oberoende komplexet över exonet, tidigare benämnt det exondefinierade E (EDE) -komplexet 31, 32, med ett RNA-substrat bestående av exon P3A och de flankerande intronerna (iP3Ai; Fig. 5b). Vi isolerade EDE-komplexet med användning av MS2-bifogat iP3Ai RNA-substrat och analyserade de associerade faktorerna genom immunblotting och RT-PCR. Vi bekräftade bindningen av hnRNP L till iP3Ai-wt-MS2-sonden och hnRNP LL-bindningen till iP3Ai-mut-MS2-sonden (fig. 5c, spår 2 och 3). Vi fann att iP3Ai-mut-MS2 associerad med U2AF 65 (spår 3), medan kopplingen mellan U2AF 65 och iP3Ai-wt-MS2 var mindre effektiv (spår 2). Däremot iP3Ai-wt-MS2 associerad med PTB (spår 2), medan iP3Ai-mut-MS2 inte kunde associeras med PTB (spår 3). Vi analyserade också associerat U1-snRNA med RT-PCR. Vi upptäckte U1 snRNA med iP3Ai-mut-MS2 och kontroll P-globin-MS2 (fig. 5c, spår 1, 3) men inte med iP3Ai-wt-MS2 (spår 2).

Sammantaget indikerar våra resultat att omkopplingsmekanismen för exon P3A-hoppning och inkludering utlöses av hnRNP L respektive hnRNP LL. I vildtyp CHRNA1 pre-mRNA stabiliserar bindningen av hnRNP L till målsekvensen i exon P3A associering av PTB till uppströms PPT. Den stabiliserade föreningen utesluter bindning av U2AF 65 till PPT och även bindning av U1 snRNP till nedströms 5 ′ skarvplats. Den försämrade definitionen av exon P3A ger således upphov till exon P3A-hoppad mRNA (fig. 6a). I den mutanta CHRNAl- för-mRNA utesluter bindningen av hnRNP LL till mutantsekvensen i exon P3A det konkurrerande hnRNP L, vilket möjliggör associering av U2AF 65 och U1 snRNP till uppströms PPT respektive nedströms 5 'skarvplats; detta leder i sin tur till exon P3A-definitionen som gynnar bildning av exon P3A-inkluderade arter av mRNA (fig. 6b).

Bildning av tidig spliceosomkomplex på CHRNA1- pre-mRNA med alternativt exon P3A visas schematiskt. Stora bokstäver indikerar funktionell bindning av skarvfaktorer, medan små bokstäver representerar komprometterad bindning av skarvningsfaktorer. Sekvensen för punktmutation i exon P3A (aP3A23G> A) är understruket. (a) HnRNP L (L) binder till vildtyps exon P3A och interagerar med PTB genom den prolinrika regionen (PRR), som stabiliserar PTB-bindning till uppströms PPT (ÅÅÅÅ). HnRNP L – PTB-interaktionen förhindrar associering av U2AF 65 (65) till PPT och U1 snRNP (U1) till 5 ′ skarvplatsen. Bildningen av exondefinierat E (EDE) -komplex är således försämrad, vilket leder till att hoppa över exon P3A. (b) aP3A23′G> A-mutationen byter bindning av hnRNP L till hnRNP LL (LL). Brist på PRR i hnRNP LL misslyckas med att stabilisera PTB-bindning till uppströms PPT, vilket tillåter bindning av U1 snRNP (U1) och U2AF 65 (65) på pre-mRNA. Bildningen av det exondefinierade E (EDE) -komplexet underlättar inkludering av exon P3A.

A) -inducerad avvikande exon P3A-inkludering som antagonistiskt regleras av hnRNPs L och LL. "Rel =" nofollow "> Bild i full storlek

Diskussion

Exoniska och introniska mutationer som påverkar cis- verkande skarvningselement har rapporterats vid många sjukdomar 2, 3 . Mer än 16–20% av missense-mutationer av mänskliga felanpassningsgener hMSH2 och hMLH1 förutsägs störa exoniska skarvförstärkare, som modulerar skarvning av transkript som innehåller muterade exoner 33 . Skarvningsmutationer i icke-funktionella exoner har emellertid inte studerats väl eftersom de ofta betraktas som sällsynta polymorfismer. Vi identifierade här en patogen skarvningsmutation (αP3A23′G> A) i ett icke-funktionellt exon P3A från CHRNA1 i en CMS-patient. Således understryker vår studie vikten av att inkludera icke-funktionella exoner i mutationsanalys.

Vi bekräftade exklusiv inkludering av exon P3A i patientens muskel. På grund av brist på tillgängliga humana skelettmuskelcellslinjer, använde vi SH-SY5Y humant neuroblastomcellinje eftersom skarvningsmönstren för våra minigener i SH-SY5Y celler liknade dem i patienten. HnRNP L uttrycks allestädes närvarande och rikligt i nästan alla celltyper, medan framträdande uttryck för hnRNP LL endast har rapporterats i lymfoida celler, aktiverade T-celler och testes 28 . EST-profilen i NCBI UniGene-databasen visar att hnRNP: er L och LL uttrycks på liknande sätt i mänskliga skelettmuskler. De ekvivalenta expressionsnivåerna för hnRNPs L och LL i SH-SY5Y-celler gjorde det möjligt för oss att återkapitulera skarvningsmönstren vi observerade i patientens muskel.

I CHRNA1 exon P3A bibehåller mutationen fortfarande suboptimala bindningsmotiv för hnRNP L men hnRNP LL förhindrar konkurrerande bindning av hnRNP L. Specifika bindande motiv av hnRNP L på CD45 exonerna 4, 5 och 6 19, 28, 34 och de från hnRNP LL på CD45 har exonerna 4 och 6 28, 29 tidigare analyserats. I motsats till händelsen i CHRNA1 binder hnRNPs L och LL icke-konkurrenskraftigt till angränsande platser inom ett enda ljuddämpareelement på CD45 exon 4 och undertrycker skarvning samarbetsvilligt. Konkurrenskraftig bindning av antagoniserande skarvningstransfaktorer till ett identiskt exon har observerats i SMN1 och SMN2 pre-mRNA. SMN1- och SMN2- generna är mycket homologa paraloger som skiljer sig endast vid 6: e nukleotiden i exon 7 i T respektive C. Införandet av SMN1 exon 7 förbättras av SRSF1. T-till-C-substitutionen i SMN2 avskaffar bindning av skarvstimulerande SRSF1 35, 36 och förbättrar bindningen av en skarvhämmande hnRNP Al 37, 38 . I motsats till hnRNPs L och LL i fallet med CHRNA1 pre-mRNA, konkurrerar inte SRSF1 och hnRNP Al om bindning till det överlappande målstället. Konkurrenskraftig bindning av två antagoniserande skarvningstransfaktorer till samma mål är således unik för CHRNA1 exon P3A.

Skarvningsrepressoraktiviteten hos PTB har i stor utsträckning karaktäriserats 39, 40, 41, 42 . Skarvningsrepressoraktivitet av hnRNP L har omfattande undersökts i CD45 pre-mRNA 18, 43, 44 . Vi rapporterar här en ny mekanism för PTB-medierad hämning av exondefinierad spliceosombildning, i vilken hnRNP L underlättar bindning av PTB till uppströms PPT som undertrycker efterföljande associering av U2AF 65 och U1 snRNP i det exondefinierade E-komplexet. Ett annat exempel på PTB-hnRNP-förening har rapporterats för PKM som kodar för pyruvat-kinas-M, där PTB och hnRNPs Al / A2 samarbetar för att utesluta exon 9 för att öka laktatproduktionen i cancerceller 45 . Tillsammans verkar hnRNP-proteiner vara funktionella partners för PTB som binder till uppströms PPT för att hämma bildning av E-komplex och leder till efterföljande skarvningssuppression.

Vi har identifierat unik PRR i hnRNP L som spelar en viktig roll i bindning av PTB till PPT för att undertrycka skarvningsaktivitet. Intressant nog visade en ny rapport att en PRR-innehållande linkerdomän av hnRNP L binder till hnRNP Al på ett RNA-beroende sätt och bindning av båda molekylerna till CD45 exon 4 orsakar hopp över exon 4 46 . På liknande sätt är ett specifikt peptidmotiv och angränsande PRR för Raver1 väsentliga för PTB-medierad skarvningsrepressoraktivitet av Tpm1 pre-mRNA 47 . Till skillnad från hnRNP L är PRR för Raver1 emellertid inte nödvändig för bindning till PTB.

I motsats till hnRNP L har de molekylära mekanismerna för skarvmoduleringsaktivitet för hnRNP LL inte belysts i stor utsträckning. En ny studie rapporterade variationerna i domänstruktur mellan hnRNP: er L och LL, som uppvisar funktionella förändringar 48 . Här bevisar vi först att bristen på PRR står för bristande interaktion mellan hnRNP LL med PTB, vilket destabiliserar PTB-bindning till uppströms PPT. Detta är emellertid osannolikt att det är en exklusiv skarvförbättrande mekanism för hnRNP LL, eftersom sammankoppling av hnRNP LL till exon P3A minskade förhållandet mellan exhoppad transkript längre än en nollbunden kontroll (från 18, 4% till 9, 8% i Fig. 3f, spår 1 och 6). Även om effekten av hnRNP LL på CHRNA1 exon P3A inte är så synlig som effekten av hnRNP L, är hnRNP LL troligen att ha en ännu oidentifierad positiv stimulerande effekt på skarvning.

En viktig fråga är varför människor och stora apor förvärvade alternativ skarvning av CHRNA1- transkript under utvecklingen. Alternativa exoner har utvecklats genom exonisering av retroponerade mobilelement, varigenom nya exoner genereras efter förändringar i icke-kodande regioner i en gen 10, 49 . Exon P3A och dess flankerande introniska region har verkligen uppkommit genom exonisering av det återupptagna däggdjursskärvade upprepade elementet (MIR) 50 . Till skillnad från exoniseringar av Alu- upprepningar, som är vanligt i primater 49, är exoniseringar av MIR: s främst gamla händelser som inträffade för 130 miljoner år sedan hos däggdjur 10 . Eftersom endast mänskliga och stora apor bär exon P3A och eftersom ingen homolog sekvens finns i andra däggdjur, är exonisering av MIR som leder till generering av exon P3A troligen en relativt ny händelse. Förvärv av exon P3A förutsägs vara skadligt för den neuromuskulära signalöverföringen. Mänskliga och stora apor förvärvade dock intelligens, vilket troligen var viktigare än muskelstyrka för överlevnad och reproduktion. Alternativt uttrycks PTB och hnRNP L dominerande vid kärnor nära NMJ för att generera det funktionella P3A (-) transkriptet. Hos däggdjur uttrycks CHRNE som kodar för AChR ε-subenheten endast vid ändplattan för att uppnå ändplattespecifikt uttryck för AChR 51, 52 . Alternativ skarvning av CHRNAl- pre-mRNA för att inkludera eller hoppa över exon P3A kan ha utvecklats som ett ytterligare medel för att uppnå det ändplattespecifika uttrycket av AChR.

metoder

Muskelbiopsier, endeplattstudier och mutationsanalys

Alla mänskliga studier inklusive de experimentella protokollen godkändes av den institutionella granskningsnämnden för Mayo Clinic och den etiska granskningskommittén vid Nagoya University Graduate School of Medicine. En lämplig informerad samtycke erhölls från alla mänskliga försökspersoner som undersökts i denna studie vid Mayo Clinic. Interkostala muskelprover erhölls intakt från ursprung till införande från patienten och kontrollpersoner utan muskelsjukdom som genomgick thoraxkirurgi. AChR och acetylkolinesteras detekterades i kryostatavsnitt genom tvåfärgs fluorescens 53 . EP: er lokaliserades för elektronmikroskopi och analyserades med etablerade metoder 54, 55 . Peroxidas-märkt a-bungarotoxin användes för den ultrastrukturella lokaliseringen av AChR 56 . Miniatyr-EP-potential (MEPP), miniatyr-EP-ström (MEPC) och EP-potential (EPP) -inspelningar utfördes, och uppskattningar av antalet sändarkvanta frigjorda genom nervimpuls erhölls såsom beskrivits tidigare 54, 57 . Vi sekvensbestämde direkt AChR a-, p-, 5- och e-subenhetsgener genom att använda genomiskt DNA isolerat från muskeln som tidigare beskrivits 58 . Genomiskt DNA från enskild allel extraherades från leukocyter med användning av 'omvandlingsmetoden 26' med GMP Genetics.

Uttryck av AChR på HEK293-celler

De humana a-, p-, 6- och e-subenheten cDNA infördes i HEK293-celler och det totala antalet [125I] a-bungarotoxin-bindningsställen uttryckt på cellytan bestämdes såsom tidigare beskrivits 58 .

Konstruktion av pRBG4- och pSPL3-minigener för skarvningsanalys

Vi konstruerade pRBG4 minigenspännande exonerna 2 till 4 av CHRNA1 för att analysera pre-mRNA-skarvning. Vi konstruerade också en annan pSPL3-minigen, som sträcker sig över exon P3A och flankerade intronsekvenser i den modifierade exon-fångstvektorn, pSPL3 (en avbruten produkt av Invitrogen). Naturligt förekommande och artificiella mutationer konstruerades i pRBG4- och pSPL3-minigenerna med hjälp av QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit. Frånvaron av artefakter bekräftades genom sekvensering av hela insatserna.

RT-PCR för skarvningsanalys

Totalt RNA extraherades 40 timmar efter transfektion med användning av Trizol (Invitrogen) eller RNeasy Mini-kit (Qiagen), följt av DNase I-behandling. cDNA syntetiserades med en oligo-dT-primer med användning av Superscript II omvänt transkriptas (Invitrogen) eller ReverTra Ace (Toyobo). Förhållandet mellan P3A (-) -utskriften och det totala CHRNA1- transkriptet beräknades med användning av följande ekvation:

RNA-affinitetsreningsanalys och masspektrometri

Biotinylerade RNA: er syntetiserades in vitro , och RNA-affinitetsreningsanalys utfördes med ett nukleärt extrakt av SH-SY5Y-celler som tidigare 15 . De renade proteinerna fraktionerades på en 10% SDS-polyakrylamidgel och färgades med Coomassie blue eller analyserades genom immunblotting som vi tidigare beskrev 15 . Ett Coomassie-blåfärgat band skars ut från gelén och spjälkades in-gel av Trypsin Gold (Promega) enligt tillverkarens protokoll. För spjälkning i lösning eluerades de RNA-bundna proteinerna i elueringsbuffert (0, 1 M glycin med 2 M urea, pH 2, 9) och spjälkades av Trypsin Gold enligt tillverkarens rekommendationer. Nanoelectrospray tandem massanalys utfördes med användning av ett LCQ Advantage Mass Spectrometry System (Thermo Finnigan). Flera MS / MS-spektra analyserades med Mascot-programversion 2.4.1 (Matrix Science).

Utarmning av hnRNP L och hnRNP LL från kärnkraftsekstrakt

Antikroppsmedierad utarmning av hnRNP L och hnRNP LL från SH-SY5Y-cellkärnekstrakt utfördes med användning av Protein G HP-spinnfälla (GE Healthcare) enligt tillverkarens instruktioner.

siRNA knockdown och minigene skarvning

siRNA: er syntetiserades för att nedreglera hnRNP L, hnRNP LL och PTB av Sigma Genosys: 5'-GAAUGGAGUUCAGGCGAUGTT-3 humanU för human hnRNP L 17, 5'-AGUGCAACGUAUUGUUAUATT-3UUGGUUG för mänsklig PTB 16 . Kontroll-siRNA var AllStar Negative Control siRNA (1027281) av Qiagen. För siRNA-räddningsanalysen köpte vi de mänskliga cDNA-klonerna för HNRNPL (klon ID 6174088) och HNRPLL (klon ID 3502860) från Open Biosystems. Vi klonade varje cDNA i pcDNA3.1 / V5-His TOPO och introducerade fyra tysta mutationer i siRNA-målregionen för vart och ett av hnRNP: er L och LL med användning av QuikChange-platsriktad mutagenes.

Tethered funktionsanalys av hnRNP L och hnRNP LL

Den bundna funktionsanalysen utfördes genom samtransfektion av en reporterminigen och en effektorkonstruktion i vilken en speciell RNA-bindande molekyl fusionerades med bakteriofagen MS2-skiktproteinet så att den binder till det konstgjorda insatta målstället i reporterminigen. För att konstruera en reporterminigen ersatte vi den bakteriofaga MS2-skiktproteinbindande hårnål-RNA-sekvensen (5'-ACATGAGGATCACCCATGT-3 ') för den ursprungliga sekvensen (5'-CACGCCC-3') av exon P3A i CHRNA1 (nukleotidnummer 20 ') –26 ′) i pSPL3 minigen med hjälp av QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit. Vi eliminerade således bindningssekvensen för både hnRNP: er L och LL från exon P3A och introducerade ett artificiellt MS2-skiktproteinmålställe. Vi konstruerade också en pSPL3-nonMS2 minigen som saknar målplatsen för MS2-skiktprotein. Effektorkonstruktioner av hnRNPs L och LL användes med eller utan MS2-skiktproteinet.

Co-immunoprecipitation

Protein-proteininteraktioner studerades genom co-immunoprecipitation (Co-IP) experiment med användning av Nuclear Complex Co-IP-kit (Active Motif) enligt tillverkarens instruktioner i närvaro av RNase A (Ambion). Vi inkuberade 100 μg kärnkraftsekstrakt med 2 μg anti-His-tag-antikropp. Vi inkluderade två IP-kontroller: en med normalt IgG och det andra utan IgG. Vi ökade IP-stringensen genom att öka den slutliga koncentrationen av NaCl upp till 150 mM. Vi skördade bundna molekyler med protein G-pärlor följt av kokning och analyserade dem genom immunblotting med användning av antikroppen mot PTB.

antikroppar

Antikroppar som användes i denna studie var anti-hnRNP L 4D11 (sc-32317, Santa Cruz Biotechnology), anti-hnRNP LL (Aviva System Biology), anti-hnRNP K / J (sc-32307, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-His-tagg (D293-1, Medical & Biological Laboratories), anti-SF2 / ASF (Zymed), anti-SR-proteiner 1H4 (sc-13509, Santa Cruz Biotechnology), anti-GAPDH (Sigma-Aldrich), anti -p-aktin C4 (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), anti-PTB (sc-16547, Santa Cruz Biotechnology) och anti-U2AF 65 MC3 (sc-53942, Santa Cruz Biotechnology).

In vitro- skarvnings- och spliceosomal E-komplexa analyser

In vitro- skarvning utfördes såsom beskrivits tidigare 32 med mindre modifieringar. 32 P-märkt för-mRNA (~ 20 fmol) inkuberades med 3, 5 ul HeLa-cellkärnekstrakt (CilBiotech) under den angivna tiden vid 30 ° C för P3AE4-vikt / mut. Eftersom skarvningseffektiviteten hos E3P3A-wt / mut var dålig vid standardtemperatur 30 ° C förbättrade vi effektiviteten genom att förinkubera reaktionsblandningen under 15 minuter vid 37 ° C. Reaktionsblandningen av 12, 5 ul innehöll 3 mM ATP, 20 mM kreatinfosfat, 20 mM HEPES-NaOH (pH 7, 3) och 3, 5 mM MgCl2. RNA extraherades med fenol, utfälldes med etanol och fraktionerades genom denaturering av 7% eller 10% PAGE. Spliceosomal E complex assay was performed as previously described 32 except of the use of 1 × Tris-glycine and 2% low-melting-point agarose (Invitrogen) submarine gel electrophoresis at 4°C.

MS2-affinity isolation of spliceosomal E complex of exon P3A

One pmol of the RNA probe (MS2-human-β-globin, MS2-iP3Ai-wt, or MS2-iP3Ai-mut) was incubated with 20-fold molar excess of MS2-MBP fusion protein 59, prior to mixing with HeLa nuclear extract. Fifty μl of HeLa nuclear extract was preincubated with 10 μl (bead volume) of amylose resin (New England Biolabs) overnight at 4°C. The purified HeLa nuclear extract was incubated at 37°C for 30 min with a mixture of the RNA probe and the MS2-MBP fusion protein at final concentrations of 60 mM KCl and 25% of HeLa nuclear extract. Ten μl (bead volume) of amylose resin was added and rotated at 4°C for 30 min. The resin was washed four times with wash buffer (20 mM HEPES pH 8.0, 150 mM KCl, and 0.05% Triton X-100), and finally eluted with 10 mM maltose solution and subjected to SDS-PAGE and immunoblot analyses. To detect U1 snRNA, total RNA was purified from the indicated RNA-affinity-isolated spliceosomal E complex using TRI Reagent (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. After making cDNA with ReverTra Ace (Toyobo), U1 snRNA was detected using primers: 5′-GGGGAAGCTTCAGGGGAAAGCGCGAACGCAGTCC-3′ and 5′-GGGGGATCCATACTTACCTGGCAGGGGAGATACC-3′.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.