Histonvarianten macroh2a reglerar ca2 + tillströmning genom trpc3- och trpc6-kanaler | onkogenes

Histonvarianten macroh2a reglerar ca2 + tillströmning genom trpc3- och trpc6-kanaler | onkogenes

Anonim

ämnen

  • Kalciumkanaler
  • Histonvarianter
  • onkogenes
  • Övergående potentiella kanaler

Abstrakt

Histonvarianten macroH2A ersätter kanonisk H2A i den angivna regionen av kromatin, där dess införlivning har potential att etablera ett funktionellt distinkt kromatindomän. De transienta receptorpotentialkanoniska (TRPC) -kanalerna är en familj av Ca 2+ -permeabla katjoniska kanaler som styr förändringar i den cytosoliska Ca2 + -koncentrationen. Rätt reglering av Trpc- genuttryck kräver renovering av kromatin, men lite är känt om arten av dessa regleringsprocesser. Här visar vi att macroH2A1 förtrycker två Trpc- familjegen, Trpc3 och Trpc6 , och dämpar Ca 2 + -beroende proliferativa svar i cancer i urinblåsan. MacroH2A1 rekryterar histondeacetylas 1 (HDAC1) och HDAC2 för att underlätta dess ihållande verkan, vilket resulterar i en kompromiss av histonacetylering över Trpc3 och Trpc6- loci. Vidare förstärker macroH2A1-utarmning histonacetylering och Ca 2+ -inflöde, vilket leder till ökad celltillväxt och invasion. Våra data ger ny insikt i TRPC3 / TRPC6-medierad Ca 2 + -signalering och indikerar en central roll för macroH2A1 i att reglera transkriptionskompetensen för Trpc3- och Trpc6- gener.

Introduktion

Den grundläggande upprepande enheten av kromatin är nukleosomkärnpartikeln sammansatt från 147 baspar av DNA lindade runt en oktamer med histoner H2A, H2B, H3 och H4. För att korrekt reglera DNA-associerade processer måste detta nukleära proteinkomplex omorganiseras genom olika ombyggnadsmekanismer, såsom histonmodifieringar, ATP-beroende kromatinombyggnad och histonvariantutbyte. 1, 2 I motsats till kanoniska histoner som uttrycks under S-fasen uttrycks histonvarianter genom cellcykeln och införlivas i kromatin på ett replikationsoberoende sätt. MacroH2A är en av H2A-varianterna och definieras av närvaron av en stor C-terminal nonhistone-domän ansluten till den H2A-liknande domänen. 3 Det finns två huvudsakliga makroH2A-isoformer, makroH2A1 och makroH2A2, som kodas av separata gener. Två nära besläktade subtyper av macroH2A1, macroH2A1.1 och macroH2A1.2, produceras genom alternativ skarvning i icke-histon-domänen. 4, 5 Medan det tidiga arbetet fokuserade på makroH2A: s roll i upprätthållandet av X-kromosominaktivering, implicerar nyare rapporter starkt macroH2A vid tystnad av autosomala gener. 6, 7, 8 För att ytterligare stödja en bredare funktion av macroH2A visade nyligen biokemiska studier att makroH2A-innehållande nukleosomer är eldfasta mot ATP-beroende kromatinombyggnad och histonacetylering och interfererar med bindningen av transkriptionsfaktorer till deras kognat-sekvenser. 9, 10 Det har också föreslagits att macroH2A samarbetar med negativa regulatorer av kromatintranskription. I många av dessa processer utövar macroH2A sin funktion genom fysisk interaktion och rekrytering av kromatinrepressorer, såsom illustreras av histondeacetylas (HDAC), polycomb repressive complex 2 (PRC2) och poly (ADP ribose) polymeras 1 (PARP1). 6, 11, 12, 13 Av speciell relevans för den aktuella studien är histonacetylering direkt kopplad till genaktivering och styrs dynamiskt av de motsatta aktiviteterna av histonacetyltransferas och HDAC. Detta är en potentiellt viktig punkt för vår studie, eftersom den stabila lokaliseringen av HDAC vid makroH2A-nukleosomer hjälper till att upprätthålla ett hypoacetylerat tillstånd av histoner i kromatin och i slutändan inaktiverar transkription.

Kalcium (Ca 2+ ) signalering är avgörande för fysiologiska och patologiska cellresponser inklusive proliferation, migration, genuttryck och kontraktion. 14, 15 Transient receptor potential (TRP) -kanaler utgör en stor och funktionellt mångsidig familj av katjonledande kanalproteiner, som medierar flödet av Ca 2+ över plasmamembranet och in i cytoplasma. 16 TRP-kanoniska (TRPC) -kanaler, en underfamilj av TRP-kanaler i däggdjursceller, innehåller sju medlemmar och kan delas in i tre grupper enligt sekvens och funktionell homologi: TRPC1 / 4/5, TRPC3 / 6/7 och TRPC2. 17 Bland dessa TRPC-kanaler har TRPC3 och TRPC6 ungefär 70% aminosyraidentitet och verkar främst bidra till cancerutveckling och progression. Exempelvis aktiverar TRPC3 / TRPC6-medierad Ca2 + -signalering det kalmodulinberoende proteinkinas och mitogenaktiverade proteinkinas, vilket i sin tur stöder den proliferativa kapaciteten hos cancerceller. 15 Nya studier visade också att TRPC3- och TRPC6-kanaler kan främja hjärthypertrofi och att TRPC3 / TRPC6-överuttryck underlättar utvecklingen av vissa maligniteter. 18, 19, 20, 21 Med tanke på de viktiga rollerna för renovering av kromatin för att upprätta och upprätthålla transkriptionstillstånd för gener är det viktigt att förstå hur Trpc3 / Trpc6- transkription regleras i samband med kromatin.

Här identifierar vi macroH2A1 som en kritisk regulator för TRPC3 / TRPC6-medierat Ca 2+ -inflöde i blåscancercellinjer. Transkription från Trpc3- och Trpc6- generna aktiveras snabbt när makroH2A1 tappas. MacroH2A1 rekryterar HDAC1 och HDAC2 och upphäver därmed histonacetylering vid Trpc3- och Trpc6- generna. Att stödja dessa resultat reducerar makroH2A1-undertryck rekryteringen av HDAC1 och HDAC2 och främjar Trpc3 / Trpc6- transkription, vilket i sin tur höjer intracellulära Ca 2+ -nivåer.

Resultat

MacroH2A1 undertrycker spridning och invasion av cancer i urinblåsan

Som ett första steg mot att studera cellfunktioner hos macroH2A undersökte vi uttrycket av macroH2A1 i mänskliga blåsor och prostatacellinjer genom western blotting. Uttrycksnivåerna för macroH2A1 var högre i de tre urinblåscellinjerna UROtsa, LD611 och RT4 jämfört med en annan blåscellinje J82 (figur la). Prostatcellinjerna LNCaP och MLC uppvisade också förhöjda nivåer av macroH2A1, medan makroH2A1-uttryck var minimal i de två andra cellinjerna PC3 och DU145 (figur la). Eftersom macroH2A har föreslagits för att undertrycka tumörprogression via geninaktivering, 22, 23, 24, kontrollerade vi om makroH2A1-uttrycksgraden är omvänt korrelerad med blåscellsinvasivitet. J82-cellerna som uttrycker låga nivåer av macroH2A1 uppvisade mer invasiv potential jämfört med UROtsa-, LD611- och RT4-celler som visade höga macroH2A1-uttrycksnivåer (figur Ib).

MacroH2A hämmar spridning och invasion av cancer i urinblåsan. ( a ) Blåscellinjer (UROtsa, LD611, RT4 och J82) och prostatacellinjer (MLC, LNCaP, PC3 och DU145) lyserades med RIPA-buffert och utsattes för western blotting. ( b ) De angivna urinblåscellslinjerna lossades och ympades på den övre kammaren belagd med Matrigel och fick sedan invadera mot 10% FBS i den nedre kammaren. Grafen visar det genomsnittliga antalet invaderade celler per fyra fält. ND, inte upptäckt. ( c, d ) Proliferation av kontroll och makroH2A1-utarmad LD611 ( c ) och RT4 ( d ) -celler bestämdes genom MTT-kolorimetriska analyser. Varje stapel representerar medel-sd för fyra replikat i tre oberoende experiment. ( e, f ) Cellinvasionsanalyser utförda som i ( b ) med användning av kontroll- och makroH2A1-utarmade LD611 ( e ) och RT4 ( f ) -celler. Varje stapel i ( b, e, f ) representerar medel-sd för tre replikat i två oberoende experiment. ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Bild i full storlek

För att ytterligare utvärdera rollen för macroH2A1 tappade vi macroH2A1 i LD611- och RT4-cellerna som uttrycker höga nivåer av macroH2A1 och analyserade förändringar i celltillväxt och invasivitet. I denna studie var det viktigt att macroH2A1 tappas under längre perioder, eftersom detta möjliggör studie av progressiva förändringar av cellproliferation under identiska förhållanden. Detta uppnåddes med användning av ett lentiviralt shRNA-infektionssystem. Western blotting och kvantitativ omvänd transkription-PCR (qRT – PCR) bekräftade att stabil transfektion av macroH2A1 shRNA-plasmider effektivt tystade uttrycket av macroH2A1 i cellen (kompletterande figur S1B). MTT-analyser under en period av 8 dagar reproducerbart visade att LD611- och RT4-celler växer mycket snabbare efter nedbrytning av macroH2A1 (figur 1c och d). Nedbrytningen av endogen makroH2A1 ledde också till en signifikant ökning av cellinvasion jämfört med kontrollceller (figur 1e och f). Dessa observationer överensstämmer med hypotesen att macroH2A1 är en av de viktigaste aktörerna som reglerar spridning och invasion av cancer i urinblåsan.

MacroH2A1 styr transkriptionsprogram som styr Ca 2 + -beroende signalvägar

Cellproliferation och invasion är komplexa processer som sannolikt återspeglar många förändringar i flera cellulära vägar. För att få insikt i de funktionella bidrag som gjorts av macroH2A1 i ovanstående resultat utförde vi cDNA-mikroarrayanalyser med RNA genererade från kontroll- eller macroH2A1-utarmade LD611-celler. En jämförelse av de uttömda cellerna och kontrollcellerna indikerade att 41 gener är nedreglerade och 169 gener är uppreglerade minst 1, 5 gånger vid makroH2A1-utarmning (kompletterande tabell S1). Genontologi klassificering av makroH2A1 måltranskript avslöjade en signifikant anrikning i gener som är relaterade till Ca 2+ bindning och endopeptidasaktivitet (figur 2a). För att validera mikroarray-data utförde vi qRT – PCR på 12 gener vars uttryck förbättrades vid makroH2A1-utarmning och som är relaterade till Ca 2+ -bindning. Som sammanfattat i figur 2b fanns det en hög korrelation mellan mikroarray-data och qRT – PCR-resultaten för alla 12 gener. En anmärkningsvärd observation framkom från mikroarray-data var att macroH2A-utarmning ökar uttrycket av Trpc3- och Trpc6- gener, men inte andra Trpc-familjgener (figur 2c), vilket antyder att macroH2A fungerar som en genspecifik regulator för TRPC-kanaler. När Ca 2+ -inflöde jämfördes i de uttömda och kontrollerade LD611- och RT4-cellerna, var en ökning i intracellulära Ca 2+ -koncentrationer uppenbar efter makroH2A1-knockdown (figurerna 2d och e; kompletterande figurer S1C och D). Dessa data implicerar starkt macroH2A1 i regleringen av gener involverade i Ca 2+ -inflöde. I enlighet med detta påstående undertryckte ektopiskt uttryck av macroH2A1.2, en av de två makroH2A1-subtyperna, i LD611-celler uttrycket av gener som kodar för de 12 Ca2 + -bindande proteinerna (figur 2i), särskilt TRPC3 och TRPC6, såsom bekräftats av western blotting (figur 2j). Dessa resultat bekräftades vidare med Ca 2+ tillströmningsanalyser som visade att överuttryck av macroH2A1.2 minskade den intracellulära Ca2 + -koncentrationen (figur 2k). Vid kontroll av om macroH2A1 reglerar Ca 2+ -inflödet genom TRPC3- och TRPC6-kanalerna, fann vi dessutom att tillsatsen av ATP, ett reagens som är känt för att stimulera TRPC-kanaler, 25, 26 inducerade en mer framträdande intracellulär Ca 2+ ökning av macroH2A1-utarmade celler än i kontrollceller (figurerna 2f och g). Sammantaget stöder dessa fynd idén att macroH2A1 påverkar uttrycket av funktionella komponenter i en Ca 2+ tillströmningsväg negativt.

MacroH2A1-utarmning förbättrar transkriptionell potential för Ca 2+ -bindande proteinrelaterade gener. ( a ) MakroH2A1-reglerade gener analyserades med DAVID-bioinformatikresurser (//david.abcc.ncifcrf.gov), och ontologisk klassificering av gener baserade på molekylär funktion presenteras som uppreglerade eller nedreglerade gengrupper. ( b ) För validering av mikroarray-data underkastades 12 gener som är relaterade till Ca 2+ -bindande proteiner och är uppreglerade i macroH2A1-utarmade celler qRT – PCR. Gapdh användes som en intern kontrollgen. Alla expressionsvärden normaliserades till genomsnittet av p-aktin . ( c ) Trpc- genuttryck i kontroll och makroH2A1-utarmade LD611-celler analyserades med qRT – PCR. ND, inte upptäckt. ( d ) Cellextrakt från kontroll- och macroH2A1-utarmade celler immunblottades med antikroppar mot TRPC3 och TRPC6. P-Actin användes som den interna kontrollen för belastning. Analysen utfördes i dubbletter med jämförbara resultat. ( e ) Förändringar i intracellulär cytosolisk Ca 2+ -koncentration efter makroH2A1-utarmning mättes med Ca2 + -känsligt färgämne Fluo-8NW. ( f, g ) Kontroll och makroH2A1-utdelade LD611-celler laddade med Fura-2 AM stimulerades med 100 μM ATP. Representativa spår av Ca 2+ som svar på ATP visas i ( f ), och förändringar i intracellulär Ca 2+ kvantifierades i ( g ). ( h ) LD611-celler transfekterades stabilt med kontroll- eller makroH2A1.2-expressionsvektorer, och uttrycket av macroH2A1.2 vid mRNA- och proteinnivåerna analyserades med qRT – PCR (vänster) och western blotting (höger). ( i ) qRT – PCR utfördes för att kontrollera relativa uttryck av Ca 2+ bindningsrelaterade gener, som nedregleras efter expression av macroH2A1.2. ( j ) TRPC3- och TRPC6-proteinnivåer i kontroll och macroH2A1.2-transfekterad cell utvärderades genom western blotting. ( k ) Den intracellulära Ca2 + -koncentrationen bestämdes som i ( e ), men efter expression av macroH2A1.2. Varje stapel i ( b, c, e, g - i, k ) representerar medel-sd för tre replikat i två oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Bild i full storlek

MacroH2A1 och TRPC3 / TRPC6 uttrycks ömsesidigt i prov från urinblåsan

Våra mikroarray-resultat antydde att macroH2A1 negativt reglerar gener relaterade till Ca 2+ bindande proteiner. Bland dessa gener är Trpc3 och Trpc6 av särskilt intresse på grund av deras kritiska roller för att reglera extracellulärt Ca 2+ -inflöde. För att undersöka om makroH2A1-uttryck omvänt korrelerar med TRPC3 / TRPC6-uttryck i urinblåscancer, analyserade vi deras uttrycksmönster i vävnadsmikroarrayer innehållande 36 blåscancerprover och 12 normala vävnader. Representativa resultat av immunohistokemisk färgning för macroH2A1, TRPC3 och TRPC6 visas i figur 3a. Färgningen för macroH2A1 i majoriteten av tumörvävnader av grad 3 av blåsan (∼ 83%) var svag eller negativ, medan färgningen var måttlig eller stark i de flesta normala (∼ 66%) och lågkvalitativa (grad 1 och 2) tumörvävnader (∼ 57%) (figur 3b, vänster; tilläggstabell S2). Tvärtom detekterades måttlig till stark färgning av TRPC3 i cirka 90% av tumörvävnader i urinblåsan, men endast i cirka 50% av normala vävnader (figur 3b, mitten; kompletterande tabell S2). Måttlig till stark färgningsintensitet för TRPC6 var också tydlig i tumörvävnader av hög kvalitet (grad 3) (figur 3b, höger; kompletterande tabell S2). I överensstämmelse med dessa resultat visade våra Western blot-analyser av tre urinblåsor (LD611, RT4 och J82) och två prostatacancercellinjer (PC3 och DU145) högre uttryck för TRPC3 och TRPC6 jämfört med deras normala motsvarigheter (kompletterande figur S1E). Sammantaget överensstämmer dessa resultat med genuttrycksdata (figur 2) och antyder att låga nivåer av macroH2A1 sammanfaller med förhöjda TRPC3 / TRPC6-uttryck i en stor grupp av tumörprover av urinblåsan.

Immunohistokemisk färgning av macroH2A1, TRPC3 och TRPC6 i vävnadsmikroarray. ( a ) Vävnadsmikrorayer innehållande 36 fall av blåstumör med 12 normala vävnader utsattes för immunohistokemi med antikroppar mot macroH2A1, TRPC3 och TRPC6. Förstoringar med hög effekt visas för representativa immungärvande prover. Bar, 50 μm. ( b ) Immunförhållande poäng av macroH2A1, TRPC3 och TRPC6 i normala och maligna vävnader i urinblåsan. Grafen visar procentandelen av sektioner med olika poäng (negativ, svag, måttlig och stark).

Bild i full storlek

MacroH2A1 försvårar Trpc3 / Trpc6- transkription genom att underlätta rekrytering av HDAC1 / HDAC2 och hämma histonacetylering

Med tanke på visad undertryckning av Trpc3- och Trpc6- generna med macroH2A1 undersökte vi nästa fördelningen av macroH2A1 över Trpc3- och Trpc6- loci genom kromatinimmunutfällningsanalyser (ChIP). Tvärbunden kromatin isolerades från kontroll- och makroH2A1-utarmade celler, och makroH2A1-beläggning undersöktes för två uppströmsregioner (region A och B), transkriptionsstartplats (TSS; region C) och två kodande regioner (regioner D och E) ( Figur 4a; Kompletterande figur S2A). Vi upptäckte höga makroH2A1-signaler uppströms (region A och B) och nedströms (region D och E) för TSS, men minskade signaler vid TSS (region C), både i Trpc3 och Trpc6- loki (figur 4b; kompletterande figur S2B). Dessa observationer överensstämmer med data från nyligen genomgående studier som demonstrerade den minimala närvaron av macroH2A i närheten av TSS. 6

MakroH2A1-beroende samspel mellan HDAC1 och HDAC2 för att undertrycka Trpc6- genen. ( a ) Ungefärliga platser för fem amplikoner på Trpc6- lokuset som används i ChIP-analyserna visas. ( b - e ) LD611-celler tömdes av macroH2A1, och ChIP-experiment utfördes med användning av antikroppar mot macroH2A1 ( b ), H3ac ( c ), HDAC1 ( d ) och HDAC2 ( e ). Utfällningseffektiviteter relativt icke-anrikade insatsprover bestämdes för de fem platserna över Trpc6- lokuset med qPCR med primers avbildade i ( a ) och listade i kompletterande tabell S3. ( f ) qRT – PCR och western blot-analyser visar nivån på TRPC6 i LD611-celler som uttrycker kontroll-shRNA och shRNA som är inriktade på HDAC1 och HDAC2. ( g - i ) ChIP-analyser med användning av en antikropp som känner igen H3ac utfördes på prover från kontrollceller och celler uttömda av HDAC1 och / eller HDAC2. ( j, k ) LD611-celler uttömda av HDAC1 eller HDAC2 underkastades ChIP-analyser av Trpc6- gen med användning av antikroppar mot HDAC2 ( j ) och HDAC1 ( k ). Varje stapel representerar medel-sd för tre replikat i två oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Bild i full storlek

När ChIP-experiment utfördes på makroH2A1-utarmade celler detekterades nästan fullständig förlust av makroH2A1 vid Trpc3- och Trpc6- loci (figur 4b; kompletterande figur S2B). Eftersom makroH2A är känt för att störa histonacetylering bestämdes 10, 11 halterna av H3-acetylering också. Förväntat resultat resulterade i nedbrytning av macroH2A1 i en tydlig ökning av H3-acetylering runt TSS vid Trpc6- lokuset (figur 4c). Intressant nog ökade H3-acetylering över Trpc3- lokuset som svar på makroH2A1-utarmning (kompletterande figur S2C). Dessa data tog upp frågan om vilka HDAC som är ansvariga för de observerade förändringarna i histonacetylering. Det har visats att HDAC1 och HDAC2 direkt kan interagera med det icke-histoniska området med fri makroH2A. 11 Således kan macroH2A bidra till rekryteringen av HDAC1 / HDAC2 och förändra tillståndet av histonacetylering i kromatin. I själva verket stöds de förutspådda rollerna för macroH2A av observationen att HDAC1 / HDAC2-beläggningen vid Trpc3- och Trpc6- loci dämpas signifikant efter makroH2A1-utarmning (figur 4d och e; kompletterande figurer S2D och E). ChIP-experiment på Trpc1- och Trpc4- generna vars uttryck inte påverkades på makroH2A1-utarmning upptäckte mycket låga nivåer av macroH2A1, HDAC1 och HDAC2 i alla reaktioner (kompletterande figurer S3A – C).

Upptäckten att både HDAC1 och HDAC2 upptar vid Trpc3 och Trpc6 loci fick oss att kontrollera om de funktionellt är kopplade till macroH2A-inducerad undertryckning av generna. För detta ändamål transfekterades LD611-celler med lentivirala vektorer som kodar HDAC1 och HDAC2-shRNA individuellt eller samtidigt (kompletterande figur S3D), och därefter mättes effekterna på TRPC3 och TRPC6-uttryck. Från våra qRT – PCR- och western blot-analyser detekterades inga observerbara förändringar i TRPC3 och TRPC6-uttryck efter en enda knockdown av HDAC1 eller HDAC2 (figur 4f; kompletterande figur S2F). Anmärkningsvärt detekterades emellertid mycket högre nivåer av TRPC3 och TRPC6-uttryck när både HDAC1 och HDAC2 tappades (figur 4f; kompletterande figur S2F), vilket indikerar kompensationsmekanismer mellan de två HDAC: erna för att undertrycka Trpc3- och Trpc6- generna.

För att generera ytterligare inblick i funktionen av HDAC1 och HDAC2, bestämde vi om HDAC1 och HDAC2 är ansvariga för macroH2A1-inducerad histondeacetylering vid Trpc3 och Trpc6 loci. När ChIP-experiment utfördes med användning av celler som tömts av HDAC1 eller HDAC2, detekterades ingen mätbar effekt på H3-acetylering (figur 4g och h; kompletterande figurer S2G och H). Emellertid förhöjde utarmning av både HDAC1 och HDAC2 H3-acetyleringsnivåer vid Trpc3- och Trpc6- loci (figur 4i; kompletterande figur S2I), vilket återspeglar återigen kompensationsfunktioner för HDAC1 och HDAC2 vid störande histonacetylering vid dessa två loci. I enlighet med denna idé sammanträdde HDAC1- utarmning från Trpc3- och Trpc6- generna av RNAi med en tydlig ökning av HDAC2-lokalisering, medan HDAC2-utarmning gjorde det för HDAC1-lokalisering, på samma plats (figur 4j och k; kompletterande figurer S2J, K, S3E och F).

HDAC1 och HDAC2 interagerar företrädesvis med macroH2A1-nukleosomer

På grundval av det faktum att makroH2A1-utarmning dämpar rekryteringen av HDAC1 / HDAC2 till Trpc3- och Trpc6- loci, postulerade vi att HDAC1 / HDAC2 kan binda makroH2A1-nukleosomer. För att kontrollera denna möjlighet transfekterades LD611-celler med expressionsvektorer för Flag-macroH2A1.2 och Flag-H2A. Efter att ha bekräftat den ekvivalenta expressionen av konstruktionerna framställdes lösliga kromatinfragment från cellkärnor och digererades med mikrokocknukleas (MNas) för att i huvudsak ge mononukleosomer. Mononukleosomer innehållande ektopisk makroH2A1.2 eller H2A immunutfälldes med anti-Flag-antikropp. Coomassie-blåfärgning bekräftade att renade nukleosomer bibehåller ungefär lika stora mängder ektopisk makroH2A1.2 och H2A (figur 5a). Western blotting av isolerade nukleosomer avslöjade att både HDAC1 och HDAC2 binder makroH2A1.2 nukleosomer och att deras bindning minskar nivån för H3-acetylering (figur 5b). Eftersom det inte fanns någon detekterbar bindning av HDAC1 och HDAC2 till H2A-nukleosomer, var den observerade bindningen av HDAC1 och HDAC2 specifik. Dessutom visade de endogena fria makroH2A1 HDAC1 / HDAC2-bindande egenskaper som var liknande de för makroH2A1-nukleosomer (figur 5c), vilket antyder att HDAC1 och HDAC2 interagerar med makroH2A1-nukleosomer genom makroH2A1.

HDAC1 och HDAC2 binder till den icke-histoniska domänen för macroH2A1. ( a ) LD611-celler transfekterades med kontroll-, H2A- och macroH2A1.2-expressionsvektorer, och mononukleosomer bereddes genom MNas-spjälkning såsom nyligen beskrivits. 35 mononukleosomer innehållande ektopiska histoner renades genom anti-Flag immunutfällning. Histonkompositioner av de renade nukleosomerna analyserades med 15% SDS – PAGE med Coomassie briljantblå färgning. ( b ) LD611-celler transfekterade med de indikerade expressionsvektorerna utsattes för att dra ner med anti-Flag M2 agaros, och de bundna proteinerna detekterades genom western blotting. ( c ) Hela cellextrakt framställdes från LD611-celler och immunutfälldes med anti-macroH2A1-antikropp. Fällningen analyserades genom western blotting med antikroppar mot HDAC1, HDAC2 och macroH2A1 såsom indikerats. ( d ) MacroH2A1.2 inkuberades med GST-full längd HDAC1 eller GST-HDAC1-deletionsmutanter immobiliserade på glutation Sepharose 4B. Efter omfattande tvättning bestämdes närvaron av macroH2A1.2 i pärlorna genom western-blotting med anti-macroH2A1-antikropp. Ingången motsvarar 5% av makroH2A1.2 som används i bindningsreaktionerna. Siffror indikerar aminosyrarester. ( e ) GST-neddragningsanalyser utfördes som i ( d ), men med GST-smälta HDAC2 i full längd eller dess deletionsmutanter immobiliserade på glutathion Sepharose-pärlor. ( f ) HDAC1 och HDAC2 inkuberades med GST-full längd macroH2A1.2 eller GST-macroH2A1.2 deletionsmutanter. Bindning av HDAC1 och HDAC2 analyserades genom western blotting. Spår 1 och 6 representerar 5% av ingången. Stjärnor i ( d - f ) indikerar icke-specifika band.

Bild i full storlek

För att få stöd för bindningsresultaten som beskrivs ovan utförde vi in vitro neddragningsanalyser med användning av bakterieproducerade macroH2A1.2, HDAC1 och HDAC2. Såsom visas i figurerna 5d och e interagerade både GST-HDAC1 och GST-HDAC2 med His-macroH2A1.2, medan GST ensam inte gjorde det. I liknande bindande experiment med tre distinkta regioner av HDAC1 och HDAC2 interagerade de C-terminala regionerna, men inte de N-terminala regionerna och katalytiska domäner, effektivt med macroH2A1.2 (figurerna 5d och e). Vid kartläggning av HDAC1 / HDAC2-interagerande region av macroH2A1.2 var dessutom bindningen av icke-histondomänen (resterna 123–371) lätt detekterbar, men den N-terminala H2A-liknande domänen (resterna 1–122) visade inget uppenbar interaktion med HDAC1 / HDAC2 (figur 5f). Dessutom bundet macroH2A1.2-fragment som innehåller rester 123-180 HDAC1 / HDAC2 lika effektivt som proteinet i full längd, vilket förstärker slutsatsen att den primära HDAC1 / HDAC2-bindande kapaciteten för macroH2A1.2 finns i detta område.

MacroH2A1 driver de observerade cellförändringarna på TRPC3 / TRPC6-beroende sätt

Flera resultat tyder på att macroH2A hämmar celltillväxt och invasion genom att rikta in sig på Trpc3- och Trpc6- gener som kontrollerar Ca 2+ -inflöde. Först, bland generna som är implicerade i Ca 2+ -strömningsvägen , regleras Trpc3- och Trpc6- gener selektivt i makroH2A1-utarmade celler. För det andra förbättras ChIP-signalen för H3-acetylering, ett kännetecken för aktiv transkription, vid Trpc3- och Trpc6- generna efter makroH2A1-utarmning. För det tredje är macroH2A1 nödvändig för rekryteringen av HDAC1 / HDAC2 till Trpc3 och Trpc6 gener. För det fjärde stimulerar makroH2A1-utarmning Ca 2+ -inflöde och ökar den intracellulära Ca2 + -koncentrationen. För att bestämma om de observerade effekterna av macroH2A1 beror på TRPC3 och TRPC6, tappade vi dem i LD611-celler (kompletterande figurer S4A, B och S5A) och mätte celltillväxt och invasion. Som sammanfattat i figur 6a minskade TRPC6-utarmning cellviabiliteten avsevärt, och TRPC3-utarmning gjorde det måttligt. Samtidig utarmning av TRPC3 och TRPC6 gav en mer framträdande reduktion i cellviabilitet (kompletterande figur S5B). De observerade effekterna av tystnad från TRPC3 / TRPC6 försvann till stor del vid samtidig nedbrytning av macroH2A1, vilket bekräftade den funktionella länken mellan macroH2A1 och TRPC3 / TRPC6. I överensstämmelse med resultaten från cellviabilitetsanalyser reducerades LD611-cellinvasionen också kraftigt efter individuell eller samtidig knockdown av TRPC3 och TRPC6 (figur 6b; kompletterande figur S5C). Samtidig undertryckning av macroH2A1 reducerade effekterna av TRPC3 / TRPC6-utarmning på LD611-cellinvasionen. På grundval av dessa observationer föredrar vi en modell där macroH2A1 hämmar celltillväxt och invasion genom att selektivt störa uttrycket av Trpc3 och Trpc6 snarare än andra gener.

Tystnad för TRPC3 / TRPC6 resulterar i förlust av funktionen macroH2A1. ( a ) Cellproliferationsanalyser utfördes i fyrdubbla med användning av celler utarmade av TRPC3, TRPC6 och / eller makroH2A1 såsom anges. Varje stapel representerar medel-sd för fyra replikat i tre oberoende experiment. ( b ) Cellinvasionsanalyser utfördes med användning av celler utarmade av TRPC3, TRPC6 och / eller makroH2A1. Varje stapel representerar medel-sd för tre replikat i två oberoende experiment. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( c ) Modell av Trpc3 / Trpc6- genreglering med makroH2A och HDAC1 / HDAC2. Som svar på repressiva cellulära signaler införlivas macroH2A i Trpc3 och Trpc6 loci. Den icke-histoniska domänen för macroH2A interagerar fysiskt med HDAC1 och HDAC2, och denna interaktion föreslås för att rekrytera HDAC1 och HDAC2 till Trpc3 och Trpc6 loci. Detta leder till histondeacetylering och Trpc3 / Trpc6- gen-tystnad. Se diskussion för mer information.

Bild i full storlek

Diskussion

Även om makroH2A-inducerad gendämpning har varit inblandad i regleringen av cancerinitiering och -progression, börjar exakta mekanismer som kopplar macroH2A till dessa processer bara börja dyka upp. I den aktuella studien använde vi humana blåscancerceller och identifierade macroH2A1 som en nyckelstranskriptionsrepressor för Trpc3- och Trpc6- generna, vars uttryck är avgörande för att upprätta en Ca 2+ -permeabel väg i plasmamembranet. MacroH2A1 stör inte bara spridningen av histonacetylering över Trpc3- och Trpc6- generna, utan underlättar också rekryteringen av HDAC1 / HDAC2 vid generna (se figur 6c). Så vitt vi vet är detta den första studien som ger ett exempel på kromatinombyggnadsprocesser som reglerar expression av jonkanalgener och för att visa den funktionella samverkan mellan macroH2A1 och HDAC1 / HDAC2.

För att undersöka rollen som macroH2A1 som en specifik transkriptionell modulator jämförde vi genuttrycksprofiler för macroH2A1-utarmad blåscancerceller med den för håravtändta celler. Det fanns många förändringar i genuttrycksprofilen för urinblåscancerceller efter makroH2A-utarmning, och molekylfunktionerna hos de förändrade generna berikades särskilt för funktioner som bidrar till Ca2 + -beroende cellproliferativa svar. Bland de mest signifikant förändrade generna valde vi Trpc3 och Trpc6 för ytterligare studier eftersom deras genprodukter är mest direkt associerade med Ca 2+ inträdesväg. Vid undersökning av fem regioner i Trpc3- och Trpc6- generna med ChIP-analyser upptäckte vi makroH2A1-beläggning både uppströms och nedströms generna. Dessa fynd överensstämmer med tidigare studier som indikerar att macroH2A är utbrett över genomet och reglerar transkriptionskompetensen hos kromatin i stor skala. 6, 7, 27

Som ytterligare stöd för en repressiv roll för macroH2A detekterades sammanfallande utseende av H3-acetylering över Trpc3- lokuset under macroH2A1-utarmade förhållanden. Det är emellertid noterbart att TRPC6-transaktivering som observerades i makroH2A1-utarmade celler åtföljdes av H3-acetylering i närheten av TSS. Vi spekulerar i att acetyleringssignalerna runt 5'-ändarna av genen är tillräckliga för att förhindra de repressiva effekterna av macroH2A1, som är fördelad över genen. På basis av våra resultat och resultaten från tidigare studier verkar 10, 11 makroH2A1-medierad gendämpning som vi observerade vara åtminstone delvis genom skydd av histonhalter mot histonacetyltransferasaktiviteter av den icke-histon domänen av macroH2A1. Även om en positiv signal i ChIP-analys med användning av macroH2A1-utarmade celler starkt indikerar närvaron av histonacetylering, kan man hävda att bristen på acetyleringssignalen i kontrollceller kan återspegla en låg tillgänglighet av histonsvansar i macroH2A1-nukleosomer snarare än frånvaron av modifiering. Men det faktum att macroH2A1-utarmning minimerar histonmetyleringar vid H3K4, H3K9 och H3K27 i våra ChIP-experiment minimerar emellertid ett kraftfullt argument mot denna möjlighet (kompletterande figurer S6A – C).

En annan viktig upptäckt av denna studie är att macroH2A1 samarbetar med HDAC1 och HDAC2 för att upprätthålla Trpc3- och Trpc6- generna i ett inaktivt tillstånd. Detta fynd är i linje med tidigare in vitro- data som visar den direkta interaktionen mellan macroH2A och HDAC1 / HDAC2. 11 Dessutom visade våra funktionella studier en uppenbar redundans för HDAC1 och HDAC2 och fastställde att de har kompensationsfunktioner i makroH2A1-medierad förtryck av Trpc3- och Trpc6- gener. Detta konstaterande överensstämmer med att det finns ett tätt samband mellan macroH2A-utbyte och repressiva histonmodifieringar. 28 Även om det är allmänt erkänt att HDAC kan påverka kromatintranskription genom förändringar i hastigheten för histonacetylering, kan vi inte slutgiltigt utesluta en indirekt effekt av HDAC på gentranskription. Emellertid antyder upptäckten att HDAC1 och HDAC2 selektivt förknippas med oacetylerade makroH2A1-nukleosomer starkt att kromatinförtryck genererat av HDAC1 och HDAC2 är beroende av histondeacetylering på deras målställen.

Nyligen har Kapoor et al. 22 rapporterade att transkriptionell förtryckning av CDK8 , en underenhet i mediatorsubkomplexet, är en kritisk komponent för makroH2A-beroende undertryckning av melanomcellproliferation. Således kan det förväntas att CDK8 skulle vara ett potentiellt mål för macroH2A1 i blåscancerceller och skulle vara involverad i makroH2A1-medierad tillväxtundertryckning. Men vid undersökningen av denna möjlighet observerade vi inga effekter av macroH2A1-utarmning på CDK8-uttryck. MacroH2A1-uttryck och dess placering över genomet kommer sannolikt att vara annorlunda i melanomcellerna som användes i CDK8-studien och LD611-urinblåscellerna som användes i denna studie. Det finns också ett varierat uttryck och lokalisering av HDAC1 / HDAC2 i olika cancerceller som kan ha dramatiska effekter på förmågan hos macroH2A att fungera på ett antal mål. Förändringar i cellnivån för macroH2A detekterades också i lungcancer och implicerade i cellproliferation delvis genom att sänka PARP1-proteinnivåerna. 23 Dessa data antyder att makroH2A1-medierat undertryckande av cancercellstillväxt använder flera mekanismer och mål beroende på celltyper, vilket kommer att behöva tas upp mer detaljerat i framtida studier.

Tidigare studier har visat att TRPC3- och TRPC6-kanaler bidrar till tillväxt och spridning av olika typer av cancerceller, som prostata, bröst, lever och hjärna. 18, 19, 20, 21, 29, 30 Den aktuella studien framskrider ytterligare dessa tidigare fynd på cancer i urinblåsan och indikerar att TRPC3 och TRPC6 är nyckelreglerare för Ca 2+ -medierad cellproliferation. I själva verket ger resultaten som beskrivs i denna studie den första demonstrationen att makroH2A1-utbyte och HDAC1 / HDAC2-medierad histondeacetylering vid Trpc3- och Trpc6- generna bidrar till regleringen av Ca 2+ -inflöde. Ändå återstår många intressanta frågor att besvara. Till exempel är det okänt om andra kromatinombyggnadsaktiviteter, utöver det identifierade samspelet mellan macroH2A och HDAC1 / HDAC2, är involverade i bildandet av konstitutivt represserade tillstånd av Trpc3- och Trpc6- gener eller andra Trpc- medlemmar. Eftersom histonacetyltransferas aktiverar kromatintranskription, mittemot rollerna för macroH2A och HDAC1 / HDAC2, bör framtida arbete som undersöker regleringen av Trpc- gener i Ca 2+ -inflöde också fokusera på den konkurrerande effekten av histonacetyltransferaser mot macroH2A och HDAC1 / HDAC2.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer

  2. 2.

    Kompletterande tabell S1

  3. 3.

    Kompletterande tabell S2

  4. 4.

    Kompletterande tabell S3

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Oncogenesis webbplats (//www.nature.com/oncsis).