Histonvariant h3.3 orkestrerar neurala stamcellsdifferentiering i utvecklingshjärnan | celldöd & differentiering

Histonvariant h3.3 orkestrerar neurala stamcellsdifferentiering i utvecklingshjärnan | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • Utveckling
  • epigenetik

Abstrakt

Under hjärnutvecklingen regleras processen för neurala stamceller (NSC: er) proliferation och differentiering exakt. Bristen i den embryonala hjärnutvecklingen orsakar allvarliga utvecklingsstörningar. Epigenetiska modifieringar spelar kritiska roller för att kontrollera spridning och differentiering i olika typer av stamceller. Histonvarianter, som en av epigenetiska regulatorer, har rapporterats vara associerade med många bioprocesser. Bland olika varianter är H3.3 en av de viktiga epigenetiska regulatorerna, men dess roll i embryonala NSC: er förblir oklar. Här demonstrerar vi att H3.3 i sig är nödvändigt för NSC: s spridning och differentiering. Undertryckning av H3.3 medierad av shRNA orsakar minskning av PAX6-positiva NSC: s proliferation och främjar den för tidiga terminala mitosen och neuronal differentiering. Särskilt reduceras nivån på H4K16ac selektivt i H3.3 knockdown NSC: er. Vi bekräftar vidare att H3.3 interageras direkt med MOF, ett specifikt H4K16-acetyltransferas. Intressant nog ökar H3.3 / MOF nivån på H4K16ac på ett sätt för ömsesidigt samarbete. Emellertid kunde H3.3K36R-mutanten inte öka nivån på H4K16ac. RNA-seq-data visar att GLI1, en transkriptionell regulator, nedregleras i H3.3 knockdown NSC: er. Vidare är neurogenesfenotypen för GLI1-knockdown överensstämmande med H3.3-knockdown. Överuttryck av H3.3, MOF och GLI1 kan rädda den onormala fenotypen orsakad av H3.3-knockdown i den embryonala hjärnan, men H3.1 eller H3.3K36R-överuttryck kan inte rädda det. Sammantaget antyder dessa resultat att H3.3 samarbetar med MOF för att öka nivån på H4K16ac och GLI1 och sedan reglerar NSC: s spridning och differentiering.

Huvudsaklig

Bildandet av normal funktionell däggdjurshjärna kräver exakt reglering av spridning och differentiering av neurala stamceller. 1, 2, 3, 4 I neocortex ger radiella glialceller (RG) celler självförnyande celler och mellanliggande stamceller (IP). IP-celler producerar därefter neuroner. 5, 6 Under utvecklingen förvärvar NSC: erna de specifika neuronala egenskaperna 7 för att producera olika typer av neuroner, som är segregerade till specifika cellskikt för att bilda den grundläggande ramen för hjärnbarken. 8

Epigenetiska modifikationer på histoner eller histonvarianter spelar en viktig roll i DNA-replikationen. De flesta däggdjur innehåller två liknande H3-familjemedlemmar med namnet kanonisk H3 och ersättning H3.3. Histonvarianten H3.3 är i hög grad konserverad evolutionärt. 9 Hos de flesta djur skiljer sig H3.3 från H3 med bara fyra aminosyrasubstitutioner, 10 men det har bekräftats att spela specifika och avgörande roller i regleringen av kromatindynamik och transkription. 11 H3.3 deponeras i transkriberade gener och genreglerande element och betraktas som en symbol för transkriptionsaktiverade gener. 12, 13 Emellertid har tidigare studie också visat att H3.3 är berikad i de förtryckta generna. 14 Dessa fynd indikerar att funktionen av H3.3 i det olika systemet måste undersökas ytterligare. Under utvecklingen innehåller histon H4 en del olika modifieringar efter transkriptionen. Bland dem skiljer Lys16 av histon H4 (H4K16) från andra acetylerade rester: dess fördelning på varje kromosom är medelvärde; 15 bildar det ett block för överföring av histonehypoacetylering och tystnad av genuttrycket. Tidigare studie har visat att H4K16ac är nära förknippad med självförnyelse och differentiering av den embryonala stamcellen. 16 Dessutom är huruvida det finns en övergång mellan H3.3 och H4K16ac för att reglera utvecklingen av den embryonala hjärnan till stor del outforskad.

Det finns tre familjemedlemmar till GLI-transkriptionsfaktorer, men funktionen för olika Gli-proteiner är distinkt. 17 Tidigare studie om GLI1 fokuserar huvudsakligen på dess roll i cancer. 18 Det rapporteras också att GLI1 spelar en viktig roll i remyelineringen. 19 GLI1 är ett aktivt protein under de olika bioprocesserna, och det kan aktiveras av en mängd olika miljöfaktorer såsom DNA-skadorna, 20 och cytokiner. 21 Det kvarstår dock i stort sett okänt om GLI1 påverkar stamcells öde och differentiering i ryggradshjärnan under den tidiga utvecklingen.

För att undersöka funktionen av histon H3.3 i tidig hjärnutveckling, nedreglerar vi dess uttryck i embryonala NSC via inero-elektroporering (IUE) av H3.3 shRNA, och data visar att H3.3-nedslagning minskar spridningen av RG-celler, och ökar förhållandet mellan neuronerna under den kortikala utvecklingen genom att minska acetyleringen på H4K16. Resultaten visar att H3.3 kan interagera med MOF, acetyltransferaset av H4K16 och H3.3 / MOF ökar företagens nivå på H4K16ac på ett ömsesidigt samarbetssätt. Reduktionen av H3.3 minskar också rekryteringen av MOF och minskar sedan nivån på H4K16ac. Den sjunkande nivån för H3.3 och H4K16ac leder till minskning av GLI1-uttrycket, vilket i slutändan kontrollerar spridningen och neuronal differentiering under kortikal utveckling. Tillsammans visar vi en viktig signalförbindelse mellan histonvarianten H3.3, H4-acetylering och GLI1 om regleringen av hjärnutveckling.

Resultat

Histone H3.3 uttrycks i NSC: erna

Tidigare studie har visat att nivån av histon H3.3 generellt ackumuleras med ålder. Emellertid förblir uttrycket av H3.3 under den embryonala utvecklingen outforskat. Vi utförde Western blot för att kontrollera H3.3-expressionsmönstret i hjärnvävnad under olika utvecklingsperioder. Våra resultat visade att uttrycket av H3.3 är dynamiskt under tidig hjärnutveckling. Resultaten visade att histon H3.3 var detekterbar vid E10, och dess uttryck ökades gradvis tills E13, 5. Därefter reducerades uttrycket mellan E15, 5 och P0 (figur la). Uttrycksmönstret för H3.3 var liknande med PAX6, som är en stamcellermarkör. Detta resultat antyder att Histone H3.3 kan spela en nyckelroll i tidig embryonal hjärnutveckling (figur 1b).

Histone H3.3 Uttrycks i embryonala neurala stamceller. ( a ) H3.3 och olika neurogenesmarkörer är närvarande i kortikala lysater uppsamlade vid olika tidpunkter (E10, E13, E15, E17 och P0). ( b ) Ett spridningsdiagram visar förändringstrenden för H3.3 och olika neurogenesmarkörer. ( n = 3; stapel representerar medelvärde ± SEM). ( c ) Ery och E15 embryonala hjärnavsnitt färgades tillsammans med anti-H3.3 och anti-NESTIN antikroppar. Skalstången representerar 25 μm . ( d ) E13- och E15-embryonala hjärnpartier färgades tillsammans med anti-H3.3- och anti-SOX2-antikroppar. Skalstången representerar 25 μm . ( e, f ) I NSC: erna reduceras nivån av H3.3-protein genom shRNA-medierad interferens (H3.3KD # 1: h3f3a- shRNA-1 kombineras med h3f3b- shRNA-1; H3.3KD # 2: h3f3a - shRNA-2 kombineras med h3f3b- shRNA-2). H3.3-protein ökas med h3f3b- WT-överuttryck ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0.01, *** P <0.001; ß -ACTIN tjänat som belastningskontroll). ( g ) Proteinivån för neurala stamcellsmarkörer, inklusive PAX6 och SOX2, reduceras i H3.3-nedfalls-NSC: erna jämfört med kontrollen. Emellertid ökas neuronal differentieringsmarkör TUJ1 ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; p -ACTIN tjänat som lastkontroll). ( h ) Proteinnivåförändringar av PAX6, SOX2 och TUJ1 orsakade av H3.3KD # 2 ( h3f3a- shRNA-2 inriktning på UTR och h3f3b- shRNA-2) knockdown kan vara räddning med H3.3 ( h3f3a ) överuttryck i NSC: er ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; P -ACTIN tjänat som lastkontroll)

Bild i full storlek

I det embryonala cortex visade det immunfärgande resultatet att histon-H3.3-proteinet samlokaliserades med NESTIN- och SOX2-positiva neuronala progenitorceller bosatta i VZ / SVZ vid E13.5 och E15.5 (figur 1c och d). Dessutom fann vi att H3.3 samlokaliserades med NESTIN- och SOX2-positiva odlade NSC: er (kompletterande figur 1a). Eftersom H3.3-proteinet kodades av generna h3f3a och h3f3b samtidigt genererade vi två h3f3a- specifika korta hårnål RNA (shRNA) ( h3f3a shRNA-1 och h3f3a shRNA-2) och två h3f3b- specifika korta hårnål RNA (shRNA) ( h3f shRNA-1 och h3f3b shRNA-2) plasmider. Knockdown-effektiviteten testades och kombinationen av h3f3a shRNA-1 med h3f3b shRNA-1 (H3.3KD # 1) och h3f3a shRNA-2 med h3f3b shRNA-2 (H3.3KD # 2) kunde effektivt tystna H3.3-uttrycket i vivo och in vitro (figur 1e, kompletterande figurer Ib och 1c). Vi konstruerade också H3.3- överuttrycksplasmid för att överuttrycka H3.3-expression i embryonala NSC: er (figur 1e och f). Vi fann att H3.3 knockdown minskade uttrycket av neurala stamcellsmarkörer PAX6 och SOX2, och ökade uttrycket av neurogenesmarkör TUJ1 (figur 1g). H3.3 (h3f3a) överuttryck kunde också rädda den onormala fenotypen orsakad av H3.3 knockdown (h3f3a shRNA-2 inriktning på UTR och h3f3b shRNA-2) (figur 1h). Dessa resultat antyder att H3.3 deltar i processen för tidig neurogenes.

H3.3 reglerar neurala stamfårcellsproliferation

Vi utnyttjade i utero elektroporering (IUE) för att introducera H3.3 shRNA-cocktails med en Venus-GFP i neurala stamceller i utvecklingsbarken i E13.5 musembryon, och hjärnor samlades på E17.5 för fenotypisk analys. Vi fann att nedslagning av H3.3 resulterade i en uppenbar förändring i cellfördelning jämfört med kontroller. Det fanns en signifikant förlust av GFP-positiva celler i proliferationszonen ventrikulär / subventrikulär zon (VZ / SVZ), och de GFP-positiva cellerna i mellanzonen (IZ) minskades också. H3.3-nedslagning orsakade en förstärkning av GFP-positiva celler i den kortikala plattan (CP) (figur 2a och b). För att testa huruvida reduktionen av GFP-positiva celler i VZ / SVZ berodde på minskad neurologiska stamcellernas proliferation, injicerades gravida dammar med BrdU 2 timmar före hjärnans insamling vid E17, 5. Knockdown av H3.3 resulterade i en 40% minskning av BrdU- och GFP-dubbelpositiva celler (figurerna 2c och d), och liknande resultat erhölls in vitro (kompletterande figurer 3a och 3b). Det finns emellertid ingen skillnad mellan kontroll och kanonisk histon H3.1-överuttryck, samtidigt kunde fenotypen orsakad av H3.3-knockdown inte räddas med H3.1-överuttryck (kompletterande figur 2). Våra resultat visade att BrdU och PAX6 dubbel-positiva delande NSC: er i H3.3 knockdown-grupp minskade 42% jämfört med kontrollen (figur 2e och f). Dessa resultat antyder att H3.3 krävs för spridning av NSC: er.

H3.3 reglerar spridningen av NSC: erna. ( a, b ) H3.3-knockdown orsakar GFP-positiva cellpositioneringsförändringar i den embryonala hjärnan. Den tomma shRNA-kontrollen eller H3.3KD-plasmiden elektroporerades till E13.5-embryonala mushjärnor, och fenotypen analyserades vid E17.5. Procentandelen GFP-positiva celler i varje region visas ( n = 3 oberoende experiment; felfält representerar medelvärde ± SEM; * P <0, 05). Skalstången representerar 50 μm . ( c, d ) BrdU-inkorporering reduceras i H3.3 knockdown-plasmider-elektroporerade sektioner. Mushjärnan elektroporerades vid E13, 5 och BrdU (50 mg / kg) injicerades 2 timmar före avlivning vid E17, 5. De vita pilarna indikerar GFP- och BrdU-dubbelpositiva celler. Stapeldiagrammet visar procenttalet av BrdU- och GFP-dubbelpositiva celler relativt de totala GFP-positiva cellerna i VZ / SVZ ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05, staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm . ( e, f ) Procentandelen av GFP + BrdU + PAX6 + -celler minskar i H3.3 knockdown-hjärnor. Mushjärnan elektroporerades vid E13, 5 och BrdU (50 mg / kg) injicerades 2 timmar före avlivning vid E17, 5. De vita pilarna indikerar GFP + BrdU + PAX6 + celler. Stapeldiagrammet visar procenttalet av GFP + BrdU + PAX6 + celler i förhållande till de totala GFP-positiva cellerna i VZ / SVZ ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05; staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 20 μm

Bild i full storlek

H3.3 reglerar neurala progenitorcelldifferentiering och neuronal utveckling

För att bestämma om H3.3 reglerar prematur NSCs terminal mitos för att påverka neurogenesprocessen under embryonisk kortikal utveckling, utfördes BrdU-födelse-datingsexperiment. Som tidslinje administrerades en enda BrdU-injektion (50 mg / kg) till gravida dammar 24 timmar efter IUE, och hjärnorna uppsamlades vid E17, 5 för fenotypanalys. Eftersom endast de NSC: er i S-fasen av mitos kunde absorbera BrdU, var NSC: er i deras slutliga mitotiska uppdelning vid tidpunkten för BrdU-injektionen märkta med BrdU permanent, och de kunde bära BrdU-etiketten under processen med neurogenesen och migrera till CP. Dubbelmärkta (BrdU + GFP +) celler av nyfödda neuroner i CP visade en tvåfaldig ökning av H3.3 knockdown-hjärnor jämfört med kontrollen (figur 3a och b). För att testa huruvida H3.3-knockdown direkt leder till ökad neuronal differentiering, immunofärgade vi elektroporerade hjärnsektioner med neuronala markörer av TUJ1 och MAP2. Förhållandet mellan GFP-TUJ1-dubbelpositiva celler avslöjade att nedslagningen av H3.3 ledde till en signifikant ökning i procentandelen av GFP-märkta celler som också var positiva för TUJ1 (figur 3c och d), och in vitro- experiment visade liknande resultat (kompletterande figurer 3c och 3d). Och kvantifieringen av GFP-MAP2-dubbelpositiva celler avslöjade att H3.3-knockdown ledde till en uppenbar ökning i procentandelen av MAP2 + neuroner (figur 3e och f). Dessa resultat visade att H3.3-knockdown resulterade i en ökning av neuronal differentiering. Ytterligare studie visade att den onormala fenotypen orsakad av H3.3-knockdown inte inducerades av apoptos och neuronal migration (kompletterande figur 4). Vi fann också att den neuronala utvecklingen var onormal i H3.3 knockdown-neuroner. Längden på den neuronala processen i odlade neuroner ökade cirka 1, 5 gånger i H3.3 knockdown-gruppen jämfört med kontrollen (figur 4a – c), och strukturen för den ledande processen var mer komplex i H3.3 knockdown-hjärnan vid E17 (figurer 4d – f) och P15 (figur 4g – i). Alla data indikerar att H3.3 är involverad i neurala stamcellsdifferentiering och neuronal utveckling.

H3.3 Knockdown främjar neurala stamfäderdifferentiering. ( a, b ) Tidslinje för BrdU-födelse-dateringsexperimentet. Bilder visar hjärnavsnitt från kontroll eller H3.3-knockdown-möss immunfargades med en anti-BrdU-antikropp. De vita pilarna indikerar GFP- och BrdU-dubbelpositiva celler. Skalstången representerar 25 μm . Stapeldiagrammet visar procenttalet av BrdU- och GFP-dubbelpositiva celler relativt totala GFP-positiva celler i CP ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05; staplar representerar medelvärde ± SEM). ( c - f ) H3.3 knockdown ökar neuronal differentiering. E17.5-hjärnsektioner färgades för TUJ1 ( c ) eller MAP2 ( e ) efter elektroporering av kontrollen eller H3.3-knockdown-plasmid in i hjärnan vid E13.5. Kvantifieringen av procenttalet av GFP- och TUJ1-dubbelpositiva celler ( d ) eller GFP- och MAP2-dubbelpositiva celler ( f ) i förhållande till de totala GFP-positiva cellerna visas som ett stapeldiagram ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05; staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm

Bild i full storlek

H3.3 Knockdown orsakar onormal neuronal utveckling. ( a - c ) H3.3 reglerar morfologisk mognad av neuroner in vitro . GFP-positiva celler isolerade från 2 dagar efter elektroporationshjärnor med H3.3 knockdown (H3.3KD # 2) och kontroll odlades under 72 timmar. Stapeldiagrammet visar antalet grenpunkt ( b ) och längden på processen ( c ) in vitro . (* P <0, 05, staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 5 μm . ( d - f ) H3.3 reglerar den morfologiska mognaden av neuroner in vivo vid E17, 5. Stapeldiagrammet visar antalet grenpunkt ( e ) och längden på processen ( f ) in vivo . ( n = 11 celler från 3 hjärnor för varje tillstånd; * P <0, 05, ** P <0, 01, staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm . ( g - i ) H3.3 reglerar neuronutvecklingen in vivo vid P15. Stapeldiagrammet visar antalet grenpunkt ( h ) och processens (I) längd in vivo . ( n = 3 oberoende experiment; ** P <0, 01, staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm

Bild i full storlek

H3.3-knockdown minskar H4K16-acetyleringen

Förlust av H3.3 har visat sig ha samband med den onormala kärnmorfologin, 22 vilket antyder att H3.3 kan spela en viktig roll i histonmodifiering. Eftersom H3.3 är associerad med aktiveringen av transkription, upptäckte vi några markörer för transkriptionell aktiveringskromatin (H3K4me3, H3S10p och H4K16ac) med western blot efter H3.3-knockdown för att bestämma om det finns korsning mellan dem. Intressant nog var proteinnivån för H4K16ac, ett kännetecken för hyperaktivt kromatin, signifikant nedreglerat efter H3.3-nedslagning i NSC. Men andra histonmodifieringsnivåer ändrades inte (figur 5a och b). Och immunfärgningen visade att H4K16ac var signifikant minskad i NSC när H3.3 förtrycktes (kompletterande figurer 5a och 5b). För ytterligare studier testade vi om det finns samband mellan H3.3 och H4K16ac genom western blot och immunfärgning. Våra resultat visade att proteinuttrycket för H4K16ac under neurogenesprocessen överensstämde med H3.3. Liksom uttrycksmönstret för H3.3, var H4K16ac detekterbar vid E10, och dess uttryck ökades gradvis tills E13.5. Därefter minskade uttrycket mellan E15, 5 och P0 (figurerna 5c och d). Immunfärgningen visade att H4K16ac samlokaliserades med H3.3, NESTIN och SOX2 (figur 5e). Och vi fann att H3.3 (h3f3a) överuttryck kunde rädda minskningen av H4K16ac orsakad av H3.3-knockdown (figur 5f och g). Ytterligare studie visade att det fanns ett dos-svar-samband mellan H3.3 och H4K16ac. När H3.3 gradvis minskades med olika doser av H3.3 shRNA-cocktail minskades nivån för H4K16ac också (figurerna 5h och i). Således reglerar H3.3 nivån på H4K16ac under hjärnutveckling.

H3.3 Knockdown minskar acetyleringen av H4K16. ( a, b ) Proteinnivåer för olika markörer för transkriptionell aktivering detekteras i H3.3 knockdown NSC: er jämfört med kontrollen. Bland dem är H4K16 selektivt nedreglerad ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C tjänat som lastkontroll). ( c, d ) H4K16ac, H3.3, detekteras vid olika tidpunkter (E10, E13, E15, E17 och P0) i kortikala lysat. Prover för Western blot-analys visas. Ett spridningsdiagram visar förändringstrenden för H4K16ac, H3.3 och olika neurogenesmarkörer ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ß -ACTIN tjänat som belastningskontroll). ( e ) NSC: n isolerades från E12, 5-mösshjärnorna och odlades i det proliferativa mediet under 24 timmar. Cellerna färgades tillsammans med anti-H4K16ac och anti-H3.3 antikroppar; anti-H4K16ac anti-SOX2 antikroppar; anti-H4K16ac och anti-NESTIN antikroppar. Skala bar representerar 25 μm . ( f, g ) Proteinnivåändring av H4K16ac kan räddas genom H3.3-överuttryck i NSC: er ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C fungerade som belastningskontroll). ( h, i ) Nivån för H4K16ac reducerades gradvis genom gradvis ökad dos av H3.3KD # 2-shRNA-medierad interferens i NSC-celler ( n = 3 oberoende experiment; bar representerar medelvärde ± SEM; ** P <0.01; Lamin A / C fungerade som lastkontroll)

Bild i full storlek

H3.3 och MOF främjar acetyleringen i samarbetsrollen

För att testa om reduktionen av H4K16ac berodde på mof- expression eller inte, detekterades Mof mRNA och det fanns ingen signifikant förändring mellan H3.3-knockdown och kontroll (kompletterande figur 5c). Sam-immunutfällningsresultaten visade att H3.3 interagerade direkt med MOF (figur 6a och b). Och Western blot-resultatet visade H3.3 och MOF främjade acetyleringen i samarbetsrollen. När H3.3 och MOF uttrycktes samtidigt i NSC ökades nivån av H4K16ac jämfört med MOF ensam (figur 6c och d). Vi fann också att det fanns ett dos-svar-samband mellan H3.3 och MOF för att främja acetyleringen av H4K16. Nivån av H4K16ac ökades gradvis med den gradvisa ökningsdosen av H3.3 (figur 6e och f). Nivån på H4K16ac förändrades dock inte när H3.1 var överuttryckt (figur 6g – j). Tidigare studie har visat att H3K36me3, en transkriptionell aktiveringsmarkör, är berikad vid H3.3 kontra H3. 23 Våra resultat visade att överuttrycket av H3.3 kunde öka nivån på H3K36me3 (kompletterande figur 5d och 5e). I sin tur främjade förstärkningen av H4K16ac nivån på H3K36me3 (kompletterande figur 5f). H3K36me3 samlokaliserades med H3.3 i NSC: er (kompletterande figur 5g). För att ytterligare undersöka förhållandet mellan H3.3 och MOF konstruerades H3.3-mutant (H3.3K36R) genom att byta aminosyra av Lys36 till Arg36 i H3.3. Det västra resultatet visade att H3.3K36R inte lyckades främja acetyleringen som H3.3-WT (figurerna 7a och b). Vi konstruerade också H4-mutant av H4K16R och H4K16A genom att ändra Lys16 till Arg16 eller Ala16, nivån för H4K16ac minskades när H4K16R eller H4K16A överuttrycktes (figur 7c och d). NSC: er infekterades med H3.3 eller H3.3K36R, och resultaten av immunfärgningen visade att det var signifikant olika fördelning mellan H3.3K36R och H3.3. H3.3 distribuerades mestadels i kärnområdet, men H3.3K36R distribuerades i hela cellområdet. I överensstämmelse med den västra bulten är fluorescensintensiteten för H4K16ac i H3.3-infekterade NSC: er starkare än H3.3K36R-gruppen. Och vi fann också mer onormal nukleär morfologi i Flag-H3.3K36R-infekterade NSC: er jämfört med Flag-H3.3-infekterade NSC: er (figur 7e). Vi observerade också att fördelningen av Flag-H4K16R och H4K16A var olika med H4-infekterade NSC: er. H4 fördelades i kärnområdet och H4K16R och H4K16A distribuerades mestadels i hela cellområdet. Dessutom var distributionen av H3.3 också onormal i H4K16R- och H4K16A-infekterade NSC: er jämfört med H4 (figur 7f). Dessa resultat antyder att modifieringarna av Lys36 av H3.3 och Lys16 av H4 är de viktiga epigenetiska regleringsställena i NSC: er.

H3.3 interagerar direkt med MOF och H3.3 / MOF främjar acetyleringen av H4K16 i samverkansrollen. ( a ) HA-MOF immunutfälldes av Flag-H3.3. De angivna plasmiderna transfekterades till 293T-celler. Proteinlysat delades upp i två delar: en för insatsen och den andra för de angivna flaggmärkta magnetiska pärlor IP. De immunutfällna proteinerna testades med anti-HA-antikroppar för att detektera HA-MOF. ( b ) Flagga-H3.3 immunutfälldes av HA-MOF. De angivna plasmiderna transfekterades till 293 T-celler. De immunutfällna proteinerna undersöktes med antiflagg-antikroppar för att detektera Flag-H3.3. ( c, d ) H3.3 och MOF främjar acetyleringen av H4K16 i samverkansrollen. De indikerade virusen levererades till NSC: er, och proteinnivån för H4K16ac detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C tjänade som belastningskontroll). ( e, f ) H3.3 och MOF främjar acetyleringen av H4K16 i den samverkande dosresponsrollen. De indikerade virusen levererades till NSC, och proteinnivån för H4K16ac detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C tjänade som belastningskontroll). ( g - j ) H3.1 kunde inte främja acetyleringen av H4K16. De indikerade virusen levererades till NSC: er, och proteinnivån för H4K16ac detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; Lamin A / C tjänade som belastningskontroll)

Bild i full storlek

H3.3K36 och H4K16-mutation Påverkar H4K16-acetyleringen. ( a, b ) H3.3K36R kunde inte främja acetyleringen av H4K16 som H3.3-WT. De indikerade virusen levererades till NSC, och proteinnivån för H4K16ac detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C tjänade som belastningskontroll). ( c, d ) Överuttryck av H4K16R eller H4K16A kunde inte främja acetylering av H4K16 i NSC: er. De indikerade virusen levererades till NSC: er, och proteinnivån för H4K16ac detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; Lamin A / C tjänade som belastningskontroll). ( e ) Onormal distribution av Flag-H3.3K36R minskar fluorescensintensiteten för H4K16ac i NSC: er jämfört med Flag-H3.3WT. ( f ) Onormal distribution av Flag-H4K16R (eller H4K16A) kontra Flag-H4WT

Bild i full storlek

GLI-familjemedlemmar är mycket undertryckta i H3.3 knockdown NSC: er

Därefter utförde vi RNA-sekvensering (RNA-sekvens) för att undersöka förändringar av genuttrycket i H3.3-knockdownceller för att analysera de genomomfattande förändringarna med H3.3-dysfunktion. NSC: erna erhölls från E12.5-embryonala cortex, och H3.3 knockdown-viruscocktail eller kontrollvirus levererades in i cellerna. Cellerna odlades under 4 dagar och därefter extraherades RNA för RNA-sekvens. Vulkankartan (figur 8a) och värmekartan (figur 8b) visade att genprofileringens uttryck förändrades mellan H3.3-knockdown och kontroll. Genanalysen avslöjade att transkriptionsnivåer av 1081 gener uppreglerades eller nedreglerades med mer än två gånger mellan H3.3-knockdown och kontrollen. GO-termanalys av nedreglerade gener i prover visade en signifikant berikning av biologiska processer relaterade till NSC: s spridning (till exempel: celldelning, cellproliferation, negativ reglering av neuron-differentiering och mitotisk nukleär uppdelning) (figur 8c). GO-termanalys av uppreglerade gener visade en betydande anrikning av biologiska processer relaterade till neuronal differentiering (till exempel neurogenes, hjärnbarkutveckling, hjärnutveckling, celldifferentiering och dendritutveckling) (figur 8d). Efter ytterligare analys av data från RNA-sekvensen fann vi att alla medlemmar i GLI Zink-fingerfamiljen ändrades mer än två gånger (figur 8e). För att bekräfta om GLI-familjemedlemmarnas uttryck nedreglerades utförde vi realtid-PCR för att upptäcka uttrycket av Gli1 , Gli2 och Gli3 i kontroll och H3.3 knockdown NSC: er. Data visade att det fanns en stark reduktion av Gli1 , Gli2 och Gli3 uttryck. I överensstämmelse med RNA-sekvenseringsresultaten var Gli1 den mest minskade genen bland dem (figur 8f). Dessutom visade de immunhärdande resultaten att GLI1 samlokaliserades med NESTIN- och SOX2 i odlade neuronala progenitorceller, som isolerades från E12.5 mushjärnor och odlades i proliferativt medium under en dag (figur 8g). Dessa resultat indikerar att GLI1 kan vara det nedströms målet för H3.3 som är involverat i tidig neurogenes.

GLI-zinkfingerfamilj undertrycks starkt i H3.3 knockdown NSC: er. ( a, b ) Vulkankartan ( a ) och värmekartan ( b ) visar att genprofilering uttrycks. Genanalys avslöjar att transkriptionsnivåer av 1081 gener uppreglerades eller nedreglerades med mer än två gånger mellan H3.3-knockdown och kontrollen. ( c, d ) Anrikningsanalys för biologisk process. Genontologi (GO) termer förknippade med generna nedreglerade (c) eller uppreglerade ( d ) i H3.3 knockdown NSCs kontra kontrollen. ( e ) RNA-seq-analys visar att mRNA: s uttrycksnivå för GLI-familjemedlemmar är dramatiskt reducerade i H3.3 knockdown-NSC: er jämfört med kontrollen. ( f ) Realtid-PCR-analys av GLI-familjemedlems genuttryck i H3.3 knockdown-NSC: er jämfört med kontrollen ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0.01). ( g ) GLI1 samlokaliseras med NSC: s markörer för NESTIN och SOX2. NSC: er isolerades från E12, 5-mösshjärnorna och odlades i det proliferativa mediet under 24 timmar. Cellerna färgades med anti-GLI1 och anti-NESTIN; anti-GLI1 och anti-SOX2 antikroppar. Skala bar representerar 25 μm

Bild i full storlek

Nivån på GLI1 reglerades av H3.3

Tidigare studie har visat att GLI1 fungerar som en stark transkriptionell aktivator. 24 Därför vill vi veta om GLI1 reglerad av histon H3.3 främjar aktiveringen av transkription sekventiellt i tidig hjärnutveckling. Resultaten visade att nivån av GLI1 minskade när H3.3 var nedslagen i NSC: er (figur 9a och b). Och vi fann att H3.3 (h3f3a) överuttryck också kunde rädda minskningen av GLI1, vilket orsakades av H3.3-knockdown i NSC: er (figur 9c och d). Ytterligare studie visade att det var ett dos-respons-samband mellan H3.3 och GLI1. När H3.3 gradvis minskades med olika doser av shRNA, reducerades även proteinnivån för GLI1 (figur 9e och f). Vi hittade också samarbetsrollen mellan H3.3 och MOF och de båda främjade uttrycket av GLI1 betydligt än MOF själv. När MOF var knockdown minskades uttrycket av GLI1. H4K16R och H4K16A kunde båda minska uttrycket av GLI1 (figur 9g och h). När H3.3 gradvis ökades med olika doser av H3.3WT ökades proteinnivån för GLI1 också (figur 9i och j). Det västra resultatet visade att H3.3K36R inte kunde främja uttrycket av GLI1 i NSC (figur 9k och l). Chip-realtid PCR visade att H3.3, H4 och H4K16ac kunde binda till Gli1- promotorn i NSC: er, men bindningen av H3.3K36R, H4K16R och H4K16A-mutanter till Gli1- promotorn minskades i NSC: er (figur 10a – d) ). Dessa resultat antyder att H3.3 och MOF reglerar uttrycket av GLI1 på ett samarbetsvilligt sätt.

H3.3 reglerar uttrycket av GLI1. ( a, b ) Proteinivån för GLI1 minskas i H3.3 knockdown-NSC: erna jämfört med kontrollen ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; P -ACTIN tjänade som belastningskontroll). ( c, d ) Proteinnivåändring av GLI1 kan vara räddning genom H3.3-överuttryck ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; p -ACTIN tjänat som belastningskontroll). ( e, f ) Nivån av GLI1-protein reducerades gradvis genom gradvis ökad dos av H3.3KD-shRNA-medierad interferens i NSC ( n = 3 oberoende experiment; bar representerar medelvärde ± SEM; * P <0, 05, ** P <0, 01 ; P -ACTIN tjänade som lastkontroll). ( g, h ) H3.3 och MOF främjar uttrycket av GLI1 i samarbetsrollen i NSC: er. De indikerade virusen levererades i NSC-celler, och proteinnivån för GLI1 detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; * P <0, 05, ** P <0, 01; p -ACTIN tjänade som belastningskontroll). ( i, j ) H3.3 och MOF främjar uttrycket av GLI1 i den samverkande dosresponsrollen. De indikerade virusen levererades i NSC-celler, och proteinnivån för GLI1 detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; * P <0, 05, ** P <0, 01; p -ACTIN tjänade som belastningskontroll). ( k, l ) H3.3K36R-mutantövertryck misslyckades med att främja expression av GLI1. De indikerade virusen levererades till NSC: er, och proteinnivån för GLI1 detekterades ( n = 3 oberoende experiment; stapel representerar medelvärde ± SEM; ** P <0, 01; p -ACTIN tjänade som belastningskontroll)

Bild i full storlek

GLI1 deltar i processen för den embryonala neurogenesen. ( a ) Skisskarta visar den olika region som valts för ChIP-realtid-PCR. ( b ) Flagga-H3.3 binder till Gli1- promotorregionen. Emellertid minskades bindningen av Flag-H3.3K36R till varje region jämfört med Flag-H3.3 i NSC: erna ( n = 3 oberoende experiment; staplar representerar medelvärde ± SEM). ( c ) Flagg-H4 binder till Gli1- promotorn och genkroppen. Emellertid minskades bindningen av Flag-H4K16R och Flag-H4K16A till varje region jämfört med Flag-H4 i NSC: erna ( n = 3 oberoende experiment; staplar representerar medelvärde ± SEM). ( d ) H4K16ac binder till regionen av Gli1- promotorn i NSC: erna ( n = 3 oberoende experiment; staplar representerar medelvärde ± SEM). ( e, f ) GLI1-knockdown orsakar Gli1 -shRNA-GFP-cellpositioneringsförändringar i utero. Den tomma shRNA-kontrollen eller GLI1-knockdown-plasmiderna elektroporerades till E13.5-embryonala mushjärnor, och fenotypen analyserades vid E17, 5. Procentandelen Gli1- shRNA-GFP- eller kontroll-GFP-celler i varje region visas ( n = 3 oberoende experiment; felstänger representerar medelvärde ± SEM; * P <0, 05). ( g ) stapeldiagrammet visar att BrdU-inkorporeringen reduceras i GLI1-knockdown-sektioner. Mushjärnan elektroporerades vid E13, 5 och BrdU (50 mg / kg) injicerades 2 timmar före avlivning vid E17, 5. De vita pilarna indikerar GFP- och BrdU-dubbelpositiva celler. Stapeldiagrammet visar procenttalet av BrdU- och GFP-dubbelpositiva celler relativt de totala GFP-positiva cellerna i VZ / SVZ ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05, staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm . ( h, i ) GLI1-knockdown ökar neuronal differentiering. E17.5-hjärnsektioner färgades för TUJ1 efter elektroporering av kontroll- eller GLI1-knockdown-plasmiden in i hjärnan vid E13.5. Kvantifieringen av procenttalet av GFP- och TUJ1-dubbelpositiva celler i förhållande till de totala GFP-positiva cellerna visas som ett stapeldiagram ( n = 3 oberoende experiment; * P <0, 05; staplar representerar medelvärde ± SEM). Skalstången representerar 50 μm . ( j ) Modell för hur H3.3 reglerar nivån för uttrycket H4K16ac och GLI1

Bild i full storlek

GLI1 Deltog i processen för den embryonala neurogenesen

För att undersöka GLI1: s roll i den tidiga embryonala neurogenesen konstruerade vi plasmiderna för GLI1-knockdown och överuttryck för ytterligare studier. Vi använde IUE för att introducera gli1 shRNA i neurala förfäderceller i utvecklingsbarken i E13.5 musembryon, och hjärnor uppsamlades vid E17.5 för fenotypanalys. Vi fann att knockdownen av GLI1 resulterade i en liknande fenotyp som var förenlig med H3.3-knockdownen i cellfördelning jämfört med kontroller. Det fanns en signifikant förlust av GFP-positiva celler i VZ / SVZ och de GFP-positiva cellerna i IZ minskades också. Det var förstärkning av GFP-positiva celler i CP. För att testa om reduktionen av GFP-positiva celler från VZ / SVZ berodde på minskad neurala stamcellernas proliferation, injicerades gravida dammar med BrdU 2 timmar före hjärnans insamling vid E17, 5. Knockdown av Gli1 resulterade i en uppenbar minskning av BrdU- och GFP-dubbelpositiva celler (figur 10e – g). Och kvantifieringen av GFP-TUJ1-dubbelpositiva celler avslöjade att GLI1-knockdown ledde till en uppenbar ökning i procentandelen av GFP-märkta celler som också var positiva för TUJ1 (figur 10h och i). Vi bestämde att GLI1-knockdown kunde minska uttrycket av neurala stamcellsmarkörer PAX6 och öka uttrycket av neurogenesmarkör TUJ1. Och GLI1-överuttryck hade motsatt fenotyp (kompletterande figur 6). Dessa resultat visade att GLI1-knockdown resulterade i en ökning av neuronal differentiering. Slutligen fann vi att H3.3-WT, MOF-WT och GLI1-WT kunde rädda den onormala fenotypen orsakad av H3.3-knockdown, men H3.3K36R kunde inte (kompletterande figurer 7a och 7b). Och andelen av BrdU + GFP + kunde också räddas med H3.3-WT, MOF-WT, GLI1-WT, men inte H3.3K36R (kompletterande figurer 7c och 7d). Dessa resultat antyder att GLI1 fungerar som nedströms H3.3 och deltar i processen för den embryonala neurogenesen.

Diskussion

Histonvarianter, inklusive H2A.Z, H2A.X, macroH2A och H3.3 har rapporterats vara associerade med organbioprocess. 25, 26, 27 Bland dem väcker vårt intresse huruvida H3.3 spelar en roll i tidig kortikal utveckling. H3.3-proteinet kodades av generna h3f3a och h3f3b samtidigt. Tidigare studier visar att h3f3a 28 eller h3f3b 29 knockout orsakar allvarliga utvecklingsstörningar, och knockout-embryona dör. Det antyder att H3.3 krävs för embryonal utveckling. Tidigare studie har visat att H3.3 anrikas i aktivt kromatin med någon kovalent modifiering, 30 och H3.3 reglerar den biologiska processen på ett DNA-syntesberoende eller oberoende sätt. 31, 32

Vi visar att uttrycket av H3.3 är dynamiskt i den embryonala hjärnan. Vi rapporterar här att histonvarianten H3.3 krävs för spridning av de PAX6-postiva NSC: erna in vivo . H3.3 knockdown orsakar den onormala GFP-positiva cellfördelningen via IUE-experiment. Förhållandet mellan BrdU-positiva, proliferativa NSC: er minskade och andelen TUJ1- eller MAP2-positiva neuroner ökades. H3.3 kan också reglera den neuronala utvecklingen i tidig kortikal utveckling. Korsningen av histonmodifieringarna är ofta. 33 Här rapporterar vi i denna studie att det finns övergång mellan H3.3 och H4K16ac överbryggad av MOF, vilket krävs för den embryonala kortikala utvecklingen.

Dessutom har ett kausalt samband mellan H3.3-knockdown och minskningen av H4K16ac påvisats i vår studie. H4K16ac har visat sig vara associerad med många bioprocesser. 34 Funktionen H4K16ac i den embryonala neurogenesen är emellertid oklar. Vi rapporterar att uttrycket av H4K16ac också överensstämmer med uttrycket av H3.3, PAX6 och PCNA. Det är samlokaliserat med NSC: s markörer för NESTIN och SOX2. Samarbetsrollen mellan H3.3 och MOF genom att främja acetyleringen på H4K16 ger en ny vy av histonöverskridandet. Since H3.3 and H4K16ac are critical epigenetic codes and they are conserved in evolution, the crosstalk between H3.3 and H4K16ac bridged by MOF might be applicable to different stem cells. Our study has established a functional link among H3.3, MOF, and H4K16ac in NSCs. This result is supported by experiments showing that the H3.3-WT and MOF overexpression could rescue the abnormal phenotype caused by H3.3 knockdown in vivo and in vitro .

In our study, RNA-seq result shows the downregulated genes in H3.3 knockdown NSCs have a significant enrichment in biological processes related to NSCs proliferation. The upregulated genes exhibit a significant enrichment in biological processes related to NSCs differentiation. Through in-depth analysis, we find the GLI1, a member of the GLI zinc finger family, is regulated by H3.3. GLI1 itself has been shown to be a transcriptional factor in previous study, which may have similar function with H3.3 as a transcription regulator. However, the downstream of the GLI1 requires further study.

Taken together, we report that GLI1 knockdown decreases the proliferation of the NSCs and promotes the augmentation of the differentiated neurons (Figure 10j). The findings about the histone crosstalk in NSCs will strengthen our understanding of the function of epigenetic regulation in the developing brain.

Material och metoder

Mice

ICR pregnant mice were purchased from Vital River. The mice were maintained in standard conditions (12 h light/dark cycles) with food and water provided. All of them were taken care according to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. All animal experiments were approved by the Animal Committee of the Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences.

In utero electroporation

The detail experimental protocols have been described in our previously study. 35 In brief, the ICR pregnant mice (E13.5) were anesthetized by given an injection of pentobarbital sodium, and then the uterine horns were exposed for experiment. 1.5 μ l recombinant plasmid (final concentration 2 mg/ml) mixed with Venus-GFP at a 3:1 mol ratio and fast green (2 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) was microinjected into the fetal brain ventricles. And the mixed plasmid was electroporated into the brain ventricle cells by using an electroporator (BTX ECM830). After electroporation, the pregnant mice were killed at different time point for phenotype analysis. The fetal brains were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) overnight and then dehydrated in 30% sucrose at 4 °C. Different sub-regions of the cortex were identified by cell density and visualized with DAPI nuclear staining. In IUE experiments, brains from at least three independent experiments were collected. Brain sections (at least nine sections) were analyzed by confocal microscopy, and the GFP-positive cell number or multi-marker co-labeled cells in different regions were counted by the confocal microscopy software (ZEISS Zen 2010, Zeiss, Oberkochen, Germany) and Photoshop CS4 software (Adobe Systems Inc., New York, NY, USA). For morphological and quantitative analysis of cultured neurons and IUE brain slides, the number of branches and branch length of the neurons (at least eleven cells) were calculated using confocal microscopy software (ZEISS Zen 2010).

Co-Immunoprecipitation

Cells were washed three times with PBS and suspend with cold lysis buffer with protease inhibitors. The samples were centrifuged at 4 °C, and the supernatants were transferred to another tube. The BCA method was used for measuring the concentration of protein. 200 μ g protein sample was incubated with anti-Flag-tag (or anti-HA-tag) magnetic beads at 4 °C overnight, and the same amount of sample was incubated with anti-IgG magnetic beads for negative control. The supernatant was removed by magnetic rack, and the beads were washed by cold washing buffer three times. After that, the magnetic beads were suspended with 1X protein running buffer, and boiled for 2 min. Each sample was analyzed by Western blot and 20 μ g (10%) protein sample was used as In-put.

ChIP

The NSCs were isolated from E12.5 cortex and infected with lentivirus for 8 hours with 2 μ g/ml polybrene. Twelve hours later, the proliferation medium was changed into a differentiation medium and cultured for 4 days. After that, 1% formaldehyde was used to cross link the chromosome and protein for 15 min at room temperature, and 2.5 M glycine was added to stop the reaction. Cells were rinsed three times with cold PBS and collected in lysis buffer 1 (50 mM HEPES KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% Triton, and protease inhibitor). Then sample was resuspended in lysis buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, and protease inhibitor). After centrifugation, the sample was resuspended and sonicated in lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.1% sodium deoxycholate, and protease inhibitor). After that, each lysate sample was divided into two parts: one was incubated with anti-Flag-tag (or anti-HA-tag) magnetic beads; the other one was incubated with anti-IgG magnetic beads at 4 °C overnight. After washing six times with washing buffer, the beads-antibody-DNA complex was incubated at 65 °C to reverse the covalent histone–DNA bonds. The DNA was extracted and then analyzed by realtime-PCR. The data was analyzed as previous described. 36

Immunostaining

Immunostaining for cultured cells or brain slices was performed according to the following procedure: the samples were washed with PBST (1%Triton X-100 in 1 M PBS), fixed in 4%PFA, blocked by 5%BSA (in 1% PBST), incubated with primary antibodies overnight at 4 °C, and visualized using fluorescence-labeling secondary antibodies.

antikroppar

Anti- beta III Tubulin (MAB1637, Millipore), Anti- beta III Tubulin (T2200, Sigma), anti-NeuN (MAB377), anti-PCNA (SC7907, SANTA CRUZ), anti-PAX6 (AB2237, Millipore, Darmstadt, Germany), anti-H3.3 (MABE872, Millipore), anti-Tri-Methyl-Histone H3(Lys4) (05-1339, Millipore), anti-Histone H3 (4499, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-H4K16ac (07-329, Millipore), anti- β -ACTIN (20536-1-Ap, Proteintech, Rosemont, IL, USA), anti-NESTIN (MAB353, Millipore), anti-SOX2 (3728, Cell Signaling Technology), anti-SOX2 (MAB2018, R&D, Minneapolis, MN, USA), anti-Flag (F1804, Sigma), anti-phospho-Histone H3(Ser10) (3377, Cell Signaling Technology), anti-HA (M20003, Abmart, Shanghai, China), anti-Tri-Methyl-Histone H3(Lys36) (9763, Cell Signaling Technology), anti-BrdU (AB6326, Abcam, Cambridge, UK), anti-GLI1 (SC20687, SANTA CRUZ, Delaware Avenue, CA, USA), IgG (bs0295P, Bioss, Beijing, China), and anti-Caspase3 (9662, Cell Signaling Technology) anti-Lamin A/C (bs1446, bioworld, Nanjing, China).

Cell culture

293FT were cultured in DMEM medium that contained 10% FBS, NEAA, and penicillin/streptomycin.

Lentiviral package DNA and the core DNA was transfected into HEK293FT by GenEscortTMI (Wisegen, Nanjing, China). The supernatant containing the virus was collected at 24, 48, and 72 h post-transfection, and the cell debris was removed by centrifugation at 3000 rpm for 5 min.

NSCs were isolated from E12.5 cortex and seeded in plates, the plates were coated with Poly-D-Lysine (10 μ g/ml, Sigma) and Laminin (10 μ g/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Approximately 1.5 million cells per well were seeded for a 6-well-plate, while 20 000 cells per well were seeded for a 48-well-plate. After growing in the proliferation medium for 12 h, which consisted of 50% DMEM/F12 (Invitrogen), 50% Neurobasal medium (Invitrogen), 0.5% GlutaMAX (Invitrogen), 1% nonessentialamino acids, bFGF (10 ng/ml, Invitrogen), EGF (10 ng/ml, Invitrogen), and 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). Cells were infected with lentivirus by the addition of 2 μ g/ml polybrene to improve the efficacy of infection. Twelve hours later, the proliferation medium was changed into a differentiation medium, which consisted of low glucose DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA), 2% B27, and 1% fetal bovine serum (Invitrogen).

BrdU labeling

For NPC proliferation analysis, BrdU (50 mg/kg) was administered to pregnant female mice for 2 h before collecting the embryonic brains. For the birth-dating experiment, BrdU (50 mg/kg) was administered to pregnant mice 24 h after electroporation, and the embryonic brains were collected three days later for phenotype analysis. For the cell-cycle exit experiment, BrdU (50 mg/kg) was administered to pregnant mice for 24 h before the mouse brains were separated and processed. Then, the brains were co-stained with anti-Ki67 and anti-BrdU antibodies for analysis.

Western blotting

Cells were lysed with RIPA with protease inhibitor on ice for 5 min and the cell debris was eliminate by centrifuged at 4 °C for 5 min. The BCA method was used for measuring the concentration of protein. The protein samples were loaded onto SDS-PAGE gel for electrophoresis, and the bands were transferred to nitrocellulose or polyvinylidene fluoride membranes. The membranes were blocked in 5% nonfat milk in PBS-T (PBS with 0.1% Tween-20) for 1 h at room temperature, and incubated with primary antibody at 4 °C. The different secondary antibodies were used to visualize the bands. In the western data analysis, the gray density of the different protein band is measured using the Odyssey software. The gray density of the target protein band was divided by that of the internal reference protein of the corresponding sample (Lamin A/C or β -ACTIN) to make the corresponding statistical data.

Realtime-PCR

The total RNA was extracted by using the TRIzol (Invitrogen) according to the instructions. FastQuant RT Kit (with DNase, TIANGEN, Beijing, China) was used to get first-strand cDNA. Realtime-PCR was performed on the realtime-PCR machine (ABI 7500, Life Technologies, Singapore).

Confocal imaging and statistical analysis

All images were got by using Zeiss 780 laser scanning confocal microscope and analyzed with Photoshop CS4 (Adobe).

Statistical analyses were performed using T -test (* P <0.05, ** P <0.01). All bar graphs in the figures are shown as the means±SEM

Primers

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

  4. 4.

    Kompletterande figur 4

  5. 5.

    Kompletterande figur 5

  6. 6.

    Kompletterande figur 6

  7. 7.

    Kompletterande figur 7

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Supplementary Information accompanies this paper on Cell Death and Differentiation website (//www.nature.com/cdd)