Flodhästsignaler kontrollerar droncaktivitet för att reglera organstorlek i drosofila | celldöd & differentiering

Flodhästsignaler kontrollerar droncaktivitet för att reglera organstorlek i drosofila | celldöd & differentiering

Anonim

ämnen

  • apoptos
  • Drosophila
  • HIPPO-signalering
  • organogenes

Abstrakt

Hippo-vägen kontrollerar orgelstorlek genom flera mekanismer som slutligen reglerar den transkriptionella co-aktivatorn Yorkie (Yki). Nedreglering av Hipposignalering leder till vävnadsöverväxt på grund av Yki-medierad aktivering av målgener, medan överuttryck av vägen utlöser apoptos i utvecklingen av vävnader. Emellertid förstås inte den mekanism som ligger bakom celldöd inducerad av Hippo (Hpo) -aktivering. Vi fann att överuttryck av Hpo leder till induktion av Dronc ( Drosophila Caspase-9 homolog) uttryck och nedreglering av dronc kan undertrycka / blockera Hpo-medierad apoptos. Dessutom undertryckte uppreglering av Dronc-aktivitet starkt överväxten orsakad av Yki-överuttryck, vilket antydde att Hippo-signalering begränsar Dronc-aktiviteten. Hippomedierad celldöd kräver aktiviteten hos initiativtagaren caspase Dronc. Förlust av funktion av dronc i genetiska mosaiker leder till överlevnad av celler och ökad cellproliferation i imaginära skivor. dronc undertrycks transkriptionellt i Yki-överuttryckande celler eller celler som är mutanta för andra Hippo-vägkomponenter som vårtor ( wts ). Vi föreslår att Dronc är ett transkriptionellt mål för Hippos signalväg. Hippo – Dronc-anslutningen har konsekvenser för kontrollen av den totala organstorleken och andra tillväxtreglerande mekanismer som kompensationsspridning och cellkonkurrens.

Huvudsaklig

Hipposignaleringsväg har framkommit som en nyckelstorleksregleringsväg som begränsar cellproliferation och främjar apoptos samtidigt för att reglera organstorlek i flugor och ryggradsdjur. 1, 2 I mitten av Hippo-signalvägen finns en kärnkinaskaskad sammansatt av två serin / treoninspecifika kinaser Hippo (Hpo) 3, 4, 5, 6, 7 och vårtor (Wts), 8, 9 och deras adapter proteiner Salvador 10, 11 och Mob som tumörsuppressor (Mats). 12 Kinaskaskaden inaktiverar oncoprotein Yorkie (Yki), 13 som fungerar som en transkriptionell samaktivator av Hippo-vägen, och svarar på flera uppströmsregulatorer som de FERM-domäner som innehåller proteiner Expanded (Ex) och Merlin (Mer), 14 WW- och C2-domänen som innehåller protein Kibra, 15, 16, 17 och de enskilda trans-membranproteinerna Crumbs (Crb) 18, 19, 20 och Fat. 21, 22, 23, 24 Yki-partners med minst tre transkriptionsfaktorer, Scalloped, Homothorax och Teashirt, 1 för att reglera transkription av gener som reglerar celltillväxt ( myc, bantam ), cellcykelprogression ( cyclinB, cyclinD, cyclinE, e2F1 ) och hämning av apoptos ( diap1 ). Flodhästsignalering reglerar också transkriptionellt flera uppströmskomponenter genom återkopplingsreglering, till exempel mer, ex, fyrkopplade, kibra och crb . 1 Hippo-signalering har med sina flera ingångar och mål uppstått som en pleiotropisk väg som fungerar på ett kontextberoende och vävnadsspecifikt sätt för att reglera organstorlek.

Enligt nuvarande modeller av Hippo-signalering kan aktiverad Hpo binda Sav och fosforylera Wts och dess co-faktor Mats, främja Mats – Wts komplexbildning och ökad Wts kinasaktivitet. Aktiverade Wts / Mats fosforylerar och hämmar Yki. 1 Alternativt kan Hpo, Wts och Ex direkt interagera med Yki på ett fosforyleringsoberoende sätt som leder till cytoplasmisk sekvestrering och hämning av Yki-aktivitet. 1 Förlust av flodhästsignalering orsakar överväxt i organ då mutanta celler sprids snabbare än vilda typceller och är resistenta mot utvecklingsreglerade proapoptotiska signaler, som normalt eliminerar extra celler i ett växande organ. 2 Hyperaktivering av signalering av flodhästar i flugor, genom överuttryck av Hpo, Sav, Mats och Wts har visat sig inducera celldöd och bilda mindre organ. 6, 7, 25 Den proapoptotiska genen gömdes och bantammikroRNA induceras som svar på överuttryck av Hippo-vägkomponenter; emellertid förblir den molekylära mekanismen för Hippo-medierad celldöd oklar. 2 I denna studie undersökte vi gener i den intrinsiska celldödvägen för att identifiera mekanismen för Hpo-medierad celldöd. Våra studier visar att Hippo-vägen reglerar Dronc ( Dro sophila N edd-2-liknande c- aspasortolog till humana Caspase 9) -nivåer för att kontrollera både cellproliferation och cellöverlevnad, för att reglera organstorlek.

Dronc kodar ett caspase (cysteinproteas) som utgör kärnan i apoptotiska celldödsmaskineriet. 26, 27 Caspases syntetiseras som inaktiva zymogener som aktiveras genom proteolytisk klyvning som regleras av hämmaren av apoptos (IAP) proteinfamilj. I flugor säkerställer Drosophila IAP (DIAP1) cellviabilitet genom att direkt binda till caspases och reglera deras aktiviteter på ett ubiquitinberoende sätt. 28 Som svar på apoptotiska stimuli binder Reaper, Hid och Grim (RHG) -proteiner BIR-domänen för DIAP1 vilket resulterar i ubikvitering och proteosomal nedbrytning av DIAP1 och aktivering av kaspas-kaskaden i en mörk ( Drosophila Apaf-1-relaterad mördare aka dAPAF -1, Drosophila apoptosis som främjar faktor-1-liknande adapterprotein) -beroende sätt. Detta involverar initiatören caspase Dronc och effector caspases Drice och DCP1. 28, 29

Både DIAP1 och Dronc uttrycks allmänt, men de har motsatta roller i apoptos. Förlust av diap1 utlöser kaspasmedierad celldöd, medan förlust av dronc blockerar mest apoptos hos flugor. 26, 27, 30 DIAP1 aktiveras av flera mekanismer som auto-aktivering, post-transkriptionell reglering med RHG-proteiner och transkriptionell reglering genom Hippo-vägen. 6, 7 Dronc aktiveras av en autokatalytisk mekanism 31 och post-transkriptionellt av Dark. 32 Dronc-aktivitet regleras av nedbrytande (DIAP1-beroende) och icke-nedbrytande (DIAP1-oberoende) mekanismer. 28 Överuttryck av DIAP1 minskar inte Dronc-nivåerna eller påverkar den katalytiska aktiviteten för Dronc eller mål Dronc för nedbrytning i levande celler. Nedströms om DIAP1 hämmar överuttrycket av p35 (baculovirus-kaspasinhibitorn) Dronc-beroende celldöd, men det hämmar inte Dronc. Här presenterar vi bevis, vilket tyder på att Hippo-vägen reglerar dronc- transkription, och hyperaktivering av Hippo-signalering inducerar Dronc som bidrar till apoptos. Ökad Dronc-aktivitet (via bindning av dess adapter Dark) kan undertrycka överväxterna orsakade av nedreglering av Hipposignaler. Drons förlust av funktion orsakar ökad spridning och minskad apoptos. Sammanfattningsvis antyder våra resultat att Hippos signalkomponenter måste kontrollera Dronc-aktivitetsnivåer för att kontrollera cellproliferation och cellöverlevnad.

Resultat

Överuttryck av Hippo-signalkomponenter inducerar Caspasberoende celldöd

Vi överuttryckte Hpo i de utvecklande eyeantennal-skivorna med GMR-Gal4- drivrutinen (figur 1a). Överuttryck av Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, figur 1b) i GMR-domänen inducerade massiv celldöd (aktiverad tärning, figur 1c och d) utan att störa celldifferentiering eller mönster (ELAV figur 1c) i eyeantennal-skivorna. I näthinnan i näthinnan (∼ 24 timmar APF) fortsatte både fotoreceptor- och pigmentceller att dö försiktigt (figur 1e och f). Som jämförelse inträffar döden hos vild typ av valparhinnor tydligt i pigmentcellerna och runt näthinnegränsen (figur 1i). Jämfört med vuxna ögon av vildtyp (figur 1g), arresteras Hpo-överuttryckande vuxna flugor som farater vid RT, och vid 18 ° C uppvisar små grova ögon (figur 1h). Hpo-överuttryck orsakade apoptos i alla epitelvävnader, till exempel i vingskivorna korta pulser av Hpo-överuttryck med värmechock ( hsp70) -Gal4 orsakade apoptos (figur 1i). Som jämförelse genomgår mycket få celler apoptos i vingskivor av vildtyp (figur 1j). I överensstämmelse med tidigare fynd leder således överuttryck av flodhäst till aktivering av celldöd i alla växande organ. Samuttryck av Yki och Hpo i eyeantennal-skivor ( GMR-Gal4 UASYki, UASHpo ) räddade fullständigt den lilla ögonfenotypen för Hpo-aktivering (kompletterande figur S1). Detta antyder att Hpo utövar sina apoptotiska effekter via den klassiska vägen som involverar Yki-co-aktivator. Genetiska epistas-experiment avslöjade att Hpo verkar uppströms om de pro-apoptotiska generna som i celler som är mutanta för Df (3L) H99 (som avdäcker regionen för RHG- generna), överuttryck av Hpo misslyckas med att inducera apoptos (kompletterande figur S2). Således kräver Hpo pro-apoptotiska gener ( RHG ) för att inducera apoptos (kompletterande figur S2).

Hpo-överuttryck inducerar celldöd. ( a ) GMR-Gal4 UASGFP eyeantennal imaginal skiva som visar GFP reporteruttrycket i GMR domän i ögonskivan. ( b - d ) GMR-Gal4 UASHpo ögonantennala imaginära skivor färgade för ( b ) Hpo, ( c ) aktiverade tärningar (Drice *, röd), Elav (grön) och TOPRO (blå). Drice * markerar döende celler i eyeantennal-skivorna ( d, gråskala). ( e och f ) Mid-pupal retina (∼ 24APF) från GMR-Gal4 UASHpo djur som visar ektopisk celldöd markerad genom uttryck av Drice * ( e röd, f gråskala), fotoreceptorceller markerade av Elav ( e, blå) och cell form markerad med stora skivor (Dlg) ( e, grön). ( f ) Ektopisk celldöd i näthinnan orsakar störningar i näthinnegitteret. ( g och h ) Jämfört med vildtyp ( g ) blir fenotypen av Hpo över uttryckande näthinna ( h ) gradvis sämre och resulterar i utvecklingen av små grova ögon hos vuxna. ( i ) Mellanvalpens näthinna i vild typ som kan jämföras med näthinnan i f markerad med Drice * visar utvecklingsapoptos. ( j - l ) Vilda imaginära skivor av vildtyp ( j ) från larver från tredje instar visar väldigt lite Drice * -uttryck, medan vinge-imaginära skivor från hsp70-Gal4 UASHpo- djur ( k och l ) visar robust induktion av celldöd sett av aktiverat Drice * -uttryck ( i, rött) några timmar efter Hpo-aktivering. Orienteringen av bilder i a - i är anterior till höger och rygg uppåt, och orienteringen av vingens imaginära skivor ( j och l ) är anterior till vänster

Bild i full storlek

Diap1-nivåer förblir oförändrade i Hpo-överuttryckande celler

Med tanke på att Diap1 är ett transkriptionellt mål för Hippo-signalvägen, och de pro-apoptotiska generna verkar uppströms Diap1, testade vi om överuttryck av Hpo leder till nedreglering av diap1- nivåer. Vi fann att i GMR-Gal4 UASHpo eyeantennal-skivor (figur 2e – h) förblir nivåerna av diap1-lacZ (figur 2e) och DIAP1-protein (figur 2f) lik vildtyp (figur 2a och b). Liknande resultat observerades genom överuttryck av Sav, Wts eller samuttryck av en parvis kombination av Sav Wts (Kompletterande figur S3), Hpo Sav (data visas inte) eller Hpo Wts (data visas inte). Därefter testade vi Hpo- svarelementet ( diap1-4.3-GFP ) som återkapitulerar uttrycket av diap1 under Hpo-reglering i eyeantennal och vingskivorna (figur 2j). Överuttryck av Hpo under nub-Gal4 ( nub-Gal4 UASHpo ) (figur 2k – m) orsakar omfattande celldöd i vingskivorna och resulterar i utvecklingen av en liten vinge-fenotyp. 6, 7 nub-Gal4 driver uttryck av transgener i vingpåsen ( nub-Gal4 UASGFP , figur 2n). diap1-4.3-GFP- uttryck förblir oförändrat i nub-Gal4 UASHpo-vingskivor (figur 2k och l). Detta resultat var spännande eftersom celldöd inträffade i Hpo-överuttryckande celler trots normalt DIAP1-uttryck. DIAP1-överuttryck är känt för att blockera apoptos i flera apoptotiska sammanhang (t.ex. överuttryck av Hid). 28 När Hpo-överuttryckande celler inducerade höga nivåer av klyvt Caspase 3 (Casp3 *), en "funktionell avläsning" av Dronc-aktivitet, 33 testade vi Dronc-uttryck i celler som överuttryckte Hpo.

Hpo-överuttryck inducerar Dronc. ( a - d ) Vildtypsuttryck av ( a ) diap1-lacZ, ( b ) DIAP1, ( c ) Hpo och ( d ) Dronc i tredje instar eyeantennal imaginära skivor visas. ( e - h ) GMR-Gal4 UASHpo eyeantennal imaginära skivor som visar uttryck av ( e ) diap1-lacZ , ( f ) DIAP1, ( g ) Hpo respektive ( h ) Dronc. ( i och j ) Vilda imaginära skivor av vild typ som visar normala nivåer av uttryck för ( i ) Dronc och ( j ) Hpo-responselement diap1-4.3GFP . nub-GAL4 UASHpo-vingskivor visar ingen förändring i uttrycket av diap1-4.3GFP (grön k, gråskala l ) och visar induktion av Dronc (röd k, gråskala m ). ( n ) Vildtyps tredje instarsvingnings imaginära skivor som visar uttrycksdomänen för nub-Gal4 markerad med UAS GFP. ( o ) Semi-kvantitativ western blot för att bedöma uttryckningsnivåerna för Dronc. Western blot-analys utfördes på proteinextrakt från vildtyp (WT), GMR-Gal4 UASHpo och GMR-Gal4 UASproDronc eyeantennal imaginal discs. α -Tubulin är belastningskontrollen. Orientering av bilder är identiska i a - h (främre till höger, rygg upp) och i - m (främre vänster). Gula pilspetsar markerar den morfogenetiska furen som sammanfaller med gränsen för GMR-Gal4- uttrycksdomänen

Bild i full storlek

Flodhäst inducerar Dronc och kräver förhöjda Dronc-aktivitetsnivåer för att inducera apoptos

Jämfört med vildtyp (figur 2d och i) inducerar överuttryck av Hpo uppreglering av Dronc-uttryck i eyeantennal ( GMR-Gal4 UASHpo , figur 2h) och vingskivorna ( nub-Gal4 UASHpo , figur 2m). Bedömning av Dronc-proteinnivåer med semi-kvantitativa västra blott stöder ytterligare denna observation (figur 2o). För att förstå Hpo Dronc-interaktionen testade vi effekterna av Dronc-överuttryck (figur 3, kompletterande figur S4). I eyeantennal-skivorna inducerar överuttryck av pro-Dronc ( GMR-Gal4 UASproDronc , figur 3c) celldöd (Casp3 *, figur 3b), utan att påverka nivåerna och lokaliseringen av Hpo (kompletterande figur S4) eller Yki (kompletterande figur S4) . I överensstämmelse med tidigare data verkar de vuxna ögonen i normal storlek och visar en "prickig-pigmenterad öga" -fenotyp (figur 3a). Överuttryck av Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo ) resulterar i en "liten öga" -fenotyp hos vuxen (figur 3d) orsakad av induktion av celldöd (figur 3e) och Dronc (figur 3f) i ögonskivor. Samuttryck av pro-Dronc med Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, UASproDronc , figur 3g – i) orsakar ökad celldöd (figur 3h) jämfört med Dronc (figur 3b) eller Hpo ensam (figur 3e); ackumulering av Dronc (figur 3i) och kärnkraftig Yki-lokalisering (kompletterande figur S4). GMR-Gal4 UASHpo, UASproDronc- larver utvecklas till vuxna vuxna med små ögon och visar ökad celldöd (figur 3g) jämfört med ögon från GMR-Gal4 UASproDronc (figur 3a) eller GMR-Gal4 UASHpo (figur 3d) djur. Således interagerar hpo genetiskt med dronc .

Hpo interagerar genetiskt med Dronc för att reglera celldöd. Fenotyper av överuttryck av GMR-Gal4 UASproDronc , ( d - f ) GMR-Gal4 UASHpo , ( g - i ) GMR-Gal4 UASHpo UASproDronc , ( j - l ) GMR-Gal4 UASDNproDronc och ( m - o ) GMR-Gal4 UASHpo UAS DNproDronc visas. En jämförelse av celldöd inducerad av överuttryck av varje transgen visas genom expression av aktiverad caspase 3 (Casp3 *) -antikropp i tredje instar-eyeantennal-imaginära skivor. ( a, d och g ) Den resulterande vuxna fenotypen av kaspasinduktion visar milda effekter för överuttryck av UASprodronc ( a och b ) som förbättras genom samuttryck av UASHpo ( g och h ). Celldöd inducerad av överuttryck av UASHpo enbart visas i ( d och e ) för jämförelse. ( j - o ) Överuttryck av UASDNproDronc inducerar inte aktiverat kaspasuttryck ( k ) vilket resulterar i en nästan vild typ av vuxna ögonfenotyp ( j ). ( m - o ) Samuttryck av UASHpo och UASDNproDronc kan inte inducera aktiverat kaspas ( n ) under tredje instars larvutveckling vilket resulterar i en fullständig räddning av UASHpo- medierad apoptos i det vuxna ögat (jämför m med d ). ( c, f, i, l och o ) Dessa paneler visar eyeantennal imaginal skivor av de indikerade genotyper färgade för uttryck av Dronc för att bekräfta överuttryck av Dronc transgener. Observera att Dronc-nivåerna uppregleras av överuttryck av UASHpo ( f ). ( p - u ) Vinkade bildskivor från ( p - r ) nub-Gal4 UASHpo och ( s - u ) nub-Gal4 UASHpo UASDronc RNAi färgade för Hpo (grön) och apoptos (TUNEL, röd). nub-Gal4 UASHpo- skivor identifierades med de uppreglerade nivåerna av Hpo-uttryck (grönt) i nub-Gal4- domänen med användning av en antikropp mot Hpo. Observera att den omfattande celldöd orsakad av Hpo över expression ( q och r ) undertrycks av nedreglering av Dronc-nivåer ( t och u ). Nedregleringen av Dronc påverkar emellertid inte Hpo-uttrycket (jämför q med t ). Områdena förstorade i q, r, t, u är lådor i vitt i p och s . Orientering av bilder är identisk i alla paneler

Bild i full storlek

Den katalytiskt inaktiva formen av Dronc fungerar som dominerande negativ och är känd för att undertrycka celldöd i Hid / Reaper-vägen. 27 Vuxna ögon på flugor som överuttrycker dominerande-negativ Dronc ( GMR-Gal4 UASDNproDronc ) verkar fenotypiskt normala (figur 3j), och äldre celldöd induceras inte i dessa eyeantennal skivor (mätt genom uttryck av Casp3 *) (figur 3k). För att testa om apoptos inducerad av Hpo kräver dronfunktion , uttryckte vi tillsammans dominerande-negativ Dronc med Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, DNproDronc ) (figur 3m – o). Celldöd inducerad av Hpo-överuttryck undertrycks fullständigt av uttrycket av dominerande negativt proDronc sett av dramatiskt reducerade nivåer av Casp3 * (figur 3n). Detta resulterar i signifikant räddning av ögat hos vuxna (figur 3m) jämfört med GMR-Gal4 UASHpo enbart (figur 3d), vilket antyder att apoptos inducerad av Hpo kräver ökade nivåer av Dronc-aktivitet eller normal dronc- funktion. I andra utvecklande organ, som i vingskivorna, resulterar överuttryck av Hpo med nub-Gal4 ( nub-Gal4 UASHpo , figur 3p – r) i robust celldöd i vingpåsen (figur 3r) och små vingar hos vuxna. För att testa om överuttryck av Hpo kan inducera celldöd när dronc nedregleras, uttrycktes Hpo tillsammans med dronc RNAi ( nub-Gal4 UASHpo, UASdronc RNAi , figur 3s – u). Celldöd reducerades dramatiskt i dessa vingskivor (figur 3u) inom Hpo-överuttryckande celler. Kvantifiering av nub-Gal4- domäner i vingskivor hos larver som överuttrycker Hpo ( nub-Gal4 UAS-Hpo ) eller samuttryckande Hpo med dronc RNAi ( nub-Gal4 UASHpo, UASdronc RNAi ) visade signifikant räddning av nub-Gal4- domänen och vuxen vingstorlek återställs ( P <0, 05, n = 4, data visas inte). Således kräver apoptos inducerad av Hpo-överuttryck Dronc.

Flodhästvägen nedreglerar Dronc-aktivitetsnivåer för att kontrollera vävnadsstorlek

Därefter frågade vi om förändrade nivåer av Dronc-aktivitet specifikt påverkar Hippo-funktioner som är kopplade till reglering av apoptos, eller om det också påverkar andra Hippo-funktioner som begränsning av cellproliferation. Den transkriptionella samaktivatoren Yki är ett huvudmål hämmas av Hippo-vägen. Jämfört med vild typ (figur 4a – c) resulterar överuttryck av Yki ( GMR-Gal4 UASYki ; figur 4d-f) i överväxt av vuxna ögon (figur 4j) på grund av nedreglering av Hippo-signalering. GMR-Gal4 UASYki eyeantennal-skivor visar nedreglering av Dronc i GMR-uttrycksdomänen (figur 4d) jämfört med vildtypen (figur 4a). Uppreglering av Dronc-aktivitet genom samuttryck av proDronc med Yki ( GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc ; figur 4g – i) orsakade en signifikant minskning av vuxna ögonstorlek (figur 4j). Kvantifiering av ögonstorlek för vuxna underbyggde vår iakttagelse att ökad Dronc-aktivitet signifikant reducerar Yki-inducerad överväxt (figur 4j, n = 5, P <0, 05). Dessa data tyder på att dronc- nivåerna reduceras i celler där Hipposignaleringen är nedreglerad och ökad Dronc-aktivitet kan undertrycka effekterna av nedreglering av Hipposignalering.

Hpo interagerar genetiskt med Dronc för att reglera organstorlek. En jämförelse av Dronc-nivåer, mitotiska siffror och TUNEL-profiler i GMR-Gal4- domänen för ögonblickliga imaginära skivor från vild typ, ( d - f ) GMR-Gal4 UASYki , ( g - i ) GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc och ( k - l ) GMR-Gal4 UASproDronc- djur visas. Jämfört med vildtyp ( a ) regleras Dronc-nivåer i celler som överuttrycker Yki ( d ). ( b och c ) Visa en typisk spridnings- och celldödsprofil för vildtyp-eyeantennal imaginal-skivor, där celler genomgår mitotisk arrestering bakom SMW (andra mitotiska vågen) ( b ). Apoptos induceras inte i detta utvecklingsstadium ( c ). ( e och f ) I GMR-Gal4 UASYki eyeantennal-skivor ökas antalet mitotiska figurer (PH3, e ) signifikant i Yki-överuttryckande celler bakom SMW ( e ), och apoptos induceras inte ( f ). Samuttryck av UASproDronc med UASYki orsakar en minskning av antalet mitotiska figurer bakom SMW ( h ) och inducerar apoptos ( i ). Kontrollskivor som visar överuttryck av UASproDronc färgade för PH3 ( k ) och apoptos ( l ) visas för jämförelse. ( j ) Visar kvantifiering av vuxna ögonstorlek från flugor som överuttrycker UASYki ensamma eller tillsammans med UASDNproDronc ( P > 0, 05) eller UASproDronc ( P <0, 05). Vuxen ögonstorlek mättes genom att räkna det totala antalet ommatidia ( n = 5) för varje genotyp. Förstoring och orientering av bilder är identisk i alla paneler. De gula pilarna anger positionen för den morfogenetiska furen som markerar gränsen för GMR-Gal4- domänen. Alla jämförelser görs i den bakre regionen (dvs. till vänster) av den morfogenetiska furen. Färgreproduktionen för denna siffra är tillgänglig i tidningen Cell Death and Differentiation online

Bild i full storlek

Denna effekt kan antingen bero på de pro-apoptotiska effekterna av Dronc, eller Yki-uttryckande celler kan visa minskad spridning när Dronc är överuttryckt. För att skilja mellan dessa möjligheter markerade vi celler som går in i M-fasen av celldelning med fosfo-Histone H3 (PH3) antikropp och celler som genomgår apoptos med TUNEL. I vildtyp-eyeantennal-skivor är mönstret för celldelning slumpmässigt främre för MF, medan bakom MF, cellerna genomgår cellcykelstopp och delas en gång i den andra mitotiska vågen (SMW, figur 4b). Som jämförelse, inte många celler genomgår apoptos i detta utvecklingsstadium i vildtyp eyeantennal skivor (figur 4c). Överuttryck av Yki ( GMR-Gal4 UASYki ) resulterade i höga nivåer av PH3-uttryck bakom SMW i GMR-domänen, vilket indikerar ektopisk spridning (figur 4e), medan liten apoptos sågs i eyeantennal-skivorna (figur 4f). Överuttryck av enbart pro-Dronc (GMR-Gal4 UASproDronc) visar ingen effekt på PH3-nivåer (figur 4k) och mild påverkan på apoptos (figur 4l) jämfört med vildtyp (figur 4b och c). Samuttryck av proDronc i Yki-uttryckande celler (GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc) visade färre PH3-positiva mitotiska celler (figur 4h) och en dramatisk ökning av TUNEL-märkning (figur 4i), jämfört med GMR-Gal4 UASYki (figur 4e och f). Således kan minskningen av storleken på GMR-Gal4 UASYki, proDronc- ögon tillskrivas både minskad spridning och ökad apoptos i celler där Hipposignalering är nedreglerad.

Dronsaktivitetsnivåer påverkar flodhästfunktionen

Dronc kräver att Dark bildar apoptosom-holoenzym, och de verkar i en återkopplingshämmande slinga för att reglera kaspasaktivering. 32 För att ytterligare undersöka effekten av Dronc-aktivitetsnivåer på regleringen av celldöd uttryckte vi Dronc tillsammans med dess bindande partner Dark. Överuttryck av mörker i de utvecklande eyeantennal-skivorna ( GMR-Gal4 UASDark ) inducerar inte signifikant apoptos. 32 Samuttryck av Dark och Dronc tillsammans (GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASGFP) inducerade massiv apoptos i eyeantennal-skivorna (figur 5a och b) och vuxna ögon (figur 5c). 32 Denna fenotyp är jämförbar med GMR-Gal4 UASHpo- fenotypen (figur 1h). Samuttryck av Dark, Dronc och Hpo ( GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASHpo ) inducerade massiv apoptos i eyeantennal-skivan (figur 5d och e) och vuxen (figur 5f). Denna fenotyp (figur 5d och f) verkar starkare jämfört med kontrollerna (figur 5c) eftersom både fotoreceptor- och pigmentceller så småningom elimineras i djur som tillsammans uttrycker Hpo (figur 5e). I alla experiment där vi tillsammans uttryckte Dark and Dronc observerade vi att Dronc uttrycks starkt i ett band (figur 5a och d) som ungefär motsvarar bandet från Casp3 * (figur 5b och e), vilket indikerar regionen där Dronc aktiviteten är hög. Således tyder våra data på att Hpo-medierad apoptos förbättras av ökad Dronc-aktivitet. Nästa testade vi om Hippo-medierad reglering av cellproliferation påverkas av ökad Dronc-aktivitet (figur 5g – i). Samuttryck av Dark and Dronc med Yki ( GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASYki ) undertryckte fullständigt den växande fenotypen av Yki-överuttryck (figur 5i), på grund av induktion av apoptos (figur 5h) som svar på ökad Dronc-aktivitet (figur 5g) ). Sammanfattningsvis validerar dessa data ytterligare vår hypotes om att Dronc agerar genetiskt nedströms om Hpo, och att hålla Dronc-aktivitetsnivåerna under kontroll är viktiga för Hippo för att reglera både cellförökning och celldöd.

Flodhästvägen reglerar Dronc-aktivitetsnivåer för att kontrollera tillväxt och apoptos. Samuttryck av Dark and proDronc med UASGFP (magenta i a ) (GMR-Gal4 UASGFP, UASDark, UASproDronc) inducerar ( a ) Dronc (gråskala) och ( b ) aktiverad Caspase 3 (Casp3 *) i eyeantennal imaginal skivor, resulterande vid utveckling av små ögon i vuxna flugor ( c ). Effekten av samuttryck av Dark och Dronc med Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, UASDark, UASproDronc) ( d - f ) och Yki (GMR-Gal4 UASYki, UASDark, UASproDronc) ( g - i ) på uttrycket av Dronc ( d och g ) och Casp3 * ( e och h ) på imaginära skivor och i vuxna ögon ( f och i ) visas. Förstoring och orientering av bilder är identisk i alla paneler. Färgreproduktionen för denna siffra är tillgänglig i tidningen Cell Death and Differentiation online

Bild i full storlek

Förlust av dronc inducerar överdrivet spridning och cellöverlevnad

Hittills antyder våra data att minskade Dronc-nivåer sammanfaller med ökad cellproliferation (figur 4d och e). För att direkt testa om dronc påverkar cellproliferation, jämförde vi tillväxthastigheter för vildtyp och dronc- mutanta celler i genetiska mosaiker (figur 6a och b) genererade med eyFLP-systemet. 11 I vildtypskontroller (figur 6a) består det vuxna ögat av ungefär lika många vita och röda celler, vilket indikerar att tillväxthastigheterna för båda cellpopulationerna är jämförbara. De vuxna ögonen mosaik för dronc mutantceller är främst vita (figur 6b). Detta indikerar att dronmutanta celler (figur 6b, vit) sprider sig snabbare än celler av vildtyp (röd) och konkurrerar ut dem. Därefter jämförde vi storleken på dronc-mutantkloner med deras vilda typ tvillingfläckar för tre nollalleler dronc I24 , dronc I29 och dronc 2 i vingskivor för att utesluta effekterna av bakgrundsmutationer. 34 Vi bekräftade också att dronc I24 , dronc I29 och dronc 2 inte lyckades komplettera dronc 51 . Jämfört med vildtypskloner (figur 6c och d) är storleken på dronc I24- mutanta kloner mycket större än deras vildtyp-tvillingfläckar (figur 6e och f), och skillnaden i cellantal är betydande vid bedömning med användning av t - test ( P <0, 003). Samma experiment med dronc I29 och dronc 2 visade liknande skillnad (data visas inte). Vi testade också PH3-uttryck i dronc-mutantkloner (figur 6g – g ″) och fann att förlust av dronc inducerade ektopisk spridning (figur 6g ″). Jämfört med vild typ (figur 6h) uppvisar flodhästmutanter robust överlevnad av extra pigmentceller (figur 6i) i valphinnan vid 20 hAPF. dronc nollmutanter (till exempel dronc 51 , dronc I24 , dronc I29 eller dronc 2 ) visade också extra interommatidiala pigmentceller i valphinnan (figur 6j). 34 Sammantaget visar våra data att dronc påverkar cellproliferation och celldöd i utvecklingen.

dronc- mutanter visar cellöverlevnad. ( a och b ) Visar jämförelse av vildtyp och dronc I29- vuxna mosaikögon gjorda med användning av cl w + -tekniken 11 för att jämföra proliferationsgraden för vildtyp (röd) och dronc- mutant (vita celler). Observera att dronc mosaikögon visar färre röda celler, vilket indikerar att dronc- mutanta celler sprids snabbare än vilda typceller. ( c - f ) Analys av klonstorlekar mellan GFP-negativa kloner och deras vildtyp-tvillingfläckar (GFP-positiva) för vildtyp ( c och d ) och dronc I24- mutanter ( e och f ) visas. Klonstorlekar mättes från imaginära skivor med vingar dissekerade från mitten av tredje instarlarver. Representativa tvillingkloner från vildtyp ( d ) och dronc I24 ( e ) vinge-imaginära skivor visas för referens. ( g - g ″) dronc I29- mutanta kloner (GFP-negativ) inducerar ektopisk cellproliferation (PH3, röd) bakom den andra mitotiska vågen i den eyeantennal skivan. ( g ′ och g ″ ) Högre förstoring av det område som är boxat i g visas i g ′ för att visa extra cellproliferation i mutanta kloner. PH3-uttrycket visas i gråskala i g ″. ( h - j ) Mid-pupal retinae från vildtyp ( h ) wts P2 - / - ( i ) och dronc 51 - / - ( j ) mutanter visas. Cellkonturer i mitten av valphinnorna markeras med Dlg-antikropp. dronc-mutantceller visar överlevnad av extra inter-ommatidialceller som markeras av asterisker (se figur 6j). Pigmentcellerna för en vildtyp ( h ) och en dronc- mutant ( j ) ommatidium är numrerade och markerade med gula linjer. Förstoringen är identisk för vuxna flugor ( a och b ), imaginära skivor ( d, e, g ′ - g ″) och valpar näthinnor i h - j . Fantasiska skivor i paneler g har en lägre förstoring (20 ×)

Bild i full storlek

Våra data tyder på att dronc kan kontrolleras direkt av Hippo-signalering. För att undersöka detta analyserade vi uttrycket av en dronc- transkriptionell reporter ( dronc 1, 7 kb -lacZ ) där 1, 7 kb av dronc genomisk sekvens driver lacZ- uttryck. 35 dronc 1, 7 kb -lacZ uttrycks allestädesvis i vildtyp eyeantennal (figur 7a – a wing) och wing (figur 7e) skivor. Uttrycket av dronc 1, 7 kb -lacZ undertrycks signifikant genom överuttryck av Yki (figur 7c, n = 5, P <0, 033) i GMR-expressionsdomänen ( GMR-Gal4 UASYki, figur 7b – b ″). Jämfört med det starka undertrycket av Dronc i celler som överuttrycker Yki (figur 4d) verkar uttrycket av dronc 1, 7 kb -lacZ inte vara så dramatiskt undertryckt, kanske på grund av uthållighet av p- galaktosidas. I wts- mutantceller undertrycks emellertid uttrycket av dronc 1, 7 kb -lacZ starkt i hela de eyeantennal skivorna (figur 7d – d ″). Överuttryck av Hpo i eyeantennal ( GMR-Gal4 UASHpo, data ej visade) eller vingskiva ( nub-Gal4 UASHpo, figur 7f ′) resulterar i robust induktion av dronc 1, 7 kb -lacZ (figur 7f ′). Således är dronc ett transkriptionellt mål för Hippos signalväg.

Flodhäst reglerar drönstranskription . Tredje instar eyeantennal imaginal skivor från vild typ ( a - a ″), GMR-Gal4 UASYki / dronc 1, 7 kb -lacZ ( b - b ″) och eyFLP; borka 1, 7 kb -lacZ / +; FRT82 wts X1 / FRT82B UbiGFP ( d - d ″), larver färgade med a - ß- gal för att detektera dronc 1, 7 kb -lacZ uttrycksnivåer. ( c ) Kvantifiering av dronc 1, 7 kb - lacZ- nivåer uppmätt med pixelintensitetsvärden för m β- gal-uttryck i GMR- Gal4-domänen från eyeantennala imaginära skivor av vildtyp och GMR - Gal4 UAS Yki- larver ( n = 5, P < 0, 05). Tredje instar-vingens imaginära skivor från vildtyp ( e ) och nub - Gal4 UASHpo / dronc 1, 7 kb− lacZ ( f och f ′ ) larver färgade med α β- gal för att detektera dronc 1, 7 kb−- lacZ uttrycksnivåer. ( g ) Modell för Hippo-vägsmedierad reglering av gener inom den intrinsiska celldödvägen. Under homoeostas begränsar Diap1 aktiveringen av caspaser via proteosomal nedbrytning. I många celler genereras emellertid låga nivåer av aktiva apoptosomkomplex konstant in vivo genom associering av Dronc och Dark. Funktionsförlust av flodhästvägen begränsar uttrycket Hid och Dronc och reglerar Diap1 positivt i levande celler, vilket gör att celler kan sprida sig och undvika apoptos. I naturligt förekommande celldödvägar som kräver Hippo-aktivitet, såsom dödande av interommatidiala celler, kan en dödsframkallande signal aktivera Hpo, som i sin tur kan inducera uttryck och aktivering av Hid och Dronc, samt nedreglering av DIAP1 för att utlösa apoptos . Ett liknande scenario kan förutses för andra situationer som stress (inducerad av överuttryck av Hpo) som inducerar apoptotisk respons. Färgreproduktionen för denna siffra är tillgänglig i tidningen Cell Death and Differentiation online

Bild i full storlek

Diskussion

Under organogenesen är optimala nivåer av Hippo-signalering avgörande för att bibehålla vävnadshomoeostas. Vår analys av regleringen av celldöd genom överuttryck av Hpo (figur 1) 3, 4, 6, 7 avslöjade att Hpo kräver en egen signalväg som involverar den transkriptionella samaktivatoren Yki (kompletterande figur S1) och pro-apoptotiska gener från den intrinsiska celldödvägen för att inducera celldöd (kompletterande figur S2). Vi fann att överuttryck av Sav, Wts eller Hpo inte följer förändringar i Diap1-nivåer (figur 2, kompletterande figur S3). Således är det möjligt att i Hpo-överuttryckande celler kan diap1- nivåer inte förändras påvisbart eller att mer känslig analys kan krävas för att lösa effekterna av Hpo-överuttryck på regleringen av Diap1-uttrycket. Eftersom överuttryck av Sav, Wts eller Hpo orsakade robust induktion av aktiverad Caspase 3 ( Drosophila Drice / Casp3 *), beslutade vi att testa om initiatören caspase Dronc som styr Casp3 * -aktivering regleras av Hippo-vägen. Här visar vi att dronc, Drosophila- homologen från däggdjurs Caspase9 och en medlem av den intrinsiska celldödvägen är ett nytt mål för Hippo-vägen. Vi visar att Hippo-signalering reglerar dronc- nivåer för att kontrollera vävnadsstorlek, och Dronc verkar genetiskt nedströms Hpo. dronc- mutanter visar ökad proliferation och minskad apoptos, en fenotyp som delas av flera tumörundertryckningsgener inom Hippo-vägen (t.ex. hpo, sav, wts ).

Vi presenterar flera bevislinjer som indikerar att Dronc kan vara viktigt för Hippo-funktioner. Först korrelerar nivåerna av Dronc-uttryck och aktivitet med ökade eller reducerade Hippo-aktivitetsnivåer. Dronc induceras när Hpo är överuttryckt (figur 2h och m) och undertrycks när Hipposignaleringen är nedreglerad (figur 4d). Dronc-aktivitet övervakades genom expressionen av aktiverad Casp3 *, som induceras (figur 3b) i celler som visar höga nivåer av aktiv Dronc ( t.ex. i GMR-Gal4 UASproDronc ) och undertrycks (figur 3k) i celler där Dronc-aktiviteten reduceras ( t.ex. i GMR-Gal4 UASDNproDronc ). När Dronc-aktivitet är hög samuttryck av Hpo ( GMR-Gal4 UASproDronc , UASHpo ) leder till ökad celldöd (figur 3h), emellertid, när Dronc-aktivitet reduceras genom överuttryck av UASDNproDronc samuttryck av Hpo ( GMR-Gal4 UASDNproDronc, UASHpo ) kan inte inducera celldöd (figur 3n). För det andra interagerar dronet genetiskt med medlemmar av Hippo-vägen (figur 3 och 4). Genetiska epistasförsök (figur 3j – u) visar att Hpo kräver dronc för att inducera celldöd, och Hpo-medierad apoptos kan undertrycks när dronc nedregleras (figur 3s – u). Således agerar dronc nedströms Hpo. För det tredje undertrycker ökad Dronc-aktivitet de växande fenotyperna för förlust av Hippo-signalering (figur 4g – i). Samuttryck av Yki och proDronc visade att ökade Dronc-nivåer ledde till reducerad cellproliferation och ökad celldöd (figur 4h och i), vilket tyder på att dronc- nivåer måste regleras för att Hippo-vägen ska kontrollera organstorleken. Samuttryck av Dark och Dronc kan undertrycka överväxten fenotyp av Hippo vägen komponenter samt förbättra celldöd inducerad av Hpo överuttryck (figur 5). Dronc Dark-interaktioner visar att Hpo-inducerad celldöd medieras genom Dronc-aktivitet som celldöd (Casp3 *, figur 5e och h) ses endast i cellerna där Dronc är uppreglerad (figur 5d och g). Sammantaget antyder våra data att Hippo-signalvägskomponenterna styr Dronc-aktivitetsnivåer för att kontrollera cellproliferation och cellöverlevnad.

Analys av dronc- förlust av funktion visar att dronc- mutanta celler sprider sig snabbare än deras vildtypgrannar (figur 6a – f). dronc- mutanta celler visar ektopisk celldelning bakom SMW (figur 6g – g ″), vilket indikerar att dronc- mutanta celler fortsätter att delas när vildtypceller har slutat dela. Dessutom visar dronc- mutanta celler extra cellöverlevnad som ses i näthinnan i näthinnan som visar extra interommatidiala celler (figur 6h – j). Således kan dronc krävas för att reglera både cellproliferation och apoptos. Det är intressant att notera att alla alleler av dronc är halvdödliga , och flera av dem får homozygota larver att komma in i en förlängd larvperiod (på upp till 12 dagar) under vilka larverna utvecklar hyperplasi i hjärnloberna, imaginära skivor och cirkulerande hemocyter., melanotiska tumörer och ökad larvkroppsstorlek. 34, 36, 37, 38 Dessa observationer stöder starkt våra fynd att dronmutanter har defekter i kontrollen av cellproliferation, och dessutom finns det minskad apoptos som bidrar till deras mutanta fenotyp.

Andra bevis visar att mutanter av Drosophila APAF-1 ( eller ark eller hac-1) har en tillväxtfördel, eftersom starka arkalleler har identifierats i skärmar som involverar mitotisk rekombination där mutantklonerna ( ark - / - ) var större än vilda -typ tvillingfläckar. 39 Dessa arkmutanter (punktmutationer och deletioner) utvanns från samma skärm som gav två hpo- mutanter. 4 Dessutom visar dessa starka arkmutanter liknande pupilationsdefekter som dronmutanter ; och hyperplasi av hjärnlober och imaginära skivor. 39 Dessa fynd stöder vidare idén att gener som är involverade i reglering av apoptos kan ha tillväxtreglerande funktioner.

Det är intressant att notera att liksom de flesta Hippo-vägkomponenter uttrycks Dronc allestädesvis. Våra fynd visar att dronc är transkriptionellt reglerat av Hippo-vägen - förlust av Hippo-signalering leder till transkriptionell undertryckning av dronc (figur 7b och d), medan Hpo-överuttryck orsakar transkriptionell induktion av dronc (figur 7f). Således är det troligt att förlust av funktionen av Hippo-vägen orsakar drunkundertryck som skyddar mutanta celler från aktivering av kaspaser och bidrar till deras fenomen från överväxt. Överuttryck av Hippo- vägkomponenter uppreglerar å andra sidan dronning av uttryck och aktivering av nedströms effektor-kaspaser (Drice / Casp3 *) som resulterar i celldöd. Sammanfattningsvis visar vi att dronc är ett nytt transkriptionellt mål för Hippo-signalering.

Vi har utvecklat en modell (figur 7) för att förena våra resultat med de nuvarande modellerna av Hippo-medierad reglering av gener i den intrinsiska celldödvägen. Det är känt att flodhästvägen reglerar celldöd genom transkriptionell reglering av Hid, Diapl 3, 6, 7 och bantam miRNA . 1 I normala celler finns det en balans mellan diap1- uttryck och basnivåer av aktiverade caspaser, och Hipposignalering upprätthåller vävnadshomoeostas genom att negativt reglera gömd och dronc , och positivt reglera diap1 (figur 7). När celler upplever stress (t.ex. på grund av överuttryck av Hpo), aktiverar de den proapoptotiska genen gömd och initiatorns kaspas drönar nedströms Hippo-vägen för att utlösa apoptos (figur 7).

Både hos flugor och däggdjur är hyperaktivisering av Hippo- eller MST1 / 2-signalering känd för att inducera apoptos. 1, 40 MST1 / 2 är kända mål för caspases. YAP1 / 2 är dessutom kända för att interagera med p73 via en PDZ-domän i YAP och inducerar apoptotiska målgener. 40 Men dessa mekanismer för att reglera apoptos kan inte bevaras i flugor eftersom platsen för kaspasspjälkning inte bevaras i Drosophila Hpo, 6 och Drosophila Yki inte har den bevarade PDZ-domänen. Således inducerar Hpo-överuttryck i flugor apoptos genom en alternativ mekanism som inte involverar kaspasspjälkning eller p73. Många cell-cell-interaktioner är viktiga för normal utveckling eller initieras som svar på vävnadsskada, till exempel kompensationsproliferation, cellkonkurrens och regenerering. Hippo-vägen har framkommit som en viktig regulator för alla dessa cell-cell-interaktioner och Dronc är kopplad till kompensationsproliferationsresponsen. Våra studier kopplar nu Dronc till Hippo-vägen och tillhandahåller en möjlig mekanism genom vilken Hippo-signalering reglerar cellulära svar i Drosophila . I framtiden kommer det således att vara intressant att undersöka den molekylära mekanismen som ligger bakom Hpo-medierad Dronc-reglering, och om denna interaktion bevaras i högre ryggradsdjur.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

  3. 3.

    Kompletterande figur S3

  4. 4.

    Kompletterande figur S4

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurer Legend

Ordlista

YKI

Yorkie

HPO

Flodhäst

WTS

Vårtor

Mats

Mob som tumördämpare

Ex

Expanderat

Mer

Merlin

Crb

smulor

Sd

Uddig

HTH

Homothorax

Tsh

Teashirt

DIAP1

Drosofila hämmare av apoptosprotein-1

IAP

hämmare av apoptosprotein

Sav

Salvador

GÖMDE SIG

huvudinvolutionsfel

Dronc

Drosophila Nedd-2-liknande caspase

RHG

Reaper, Hid Grim

Mörk

Drosophila Apaf-1 relaterad mördare

Casp3 *

Caspase 3

PH3

Fosfo-Histon H3

MF

morfogenetisk furu

SMW

andra mitotiska vågen

APF

efter pupariumbildning

GLÄFS

Ja-associerat protein

MST

Däggdjur Ste 20-liknande kinase

DLG

skiva stor tumördämpare

PDZ

PSD95, Drosophila (Dlg-1), ZO-1-protein

TUNEL

terminal deoxynukleotidyltransferas DUTP nick-slutmärkning

Drice

Drosophila interleukinomvandlande enzym

UAS

uppströms aktivatorsekvens

GFP

grönt fluorescerande protein

FERM

4, 1 protein, ezrin, radixin, moesin

BIR

Baculovirus IAP Upprepa

GMR

glas multimerisk upprepning

RT

rumstemperatur

Nub

stump

DN

dominerande negativ

DCP-1

Death Caspase-1

Elav

embryonal dödlig, onormal syn

hsp

värmechockprotein

Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Cell Death and Differentiation (//www.nature.com/cdd)